PL218602B1 - Zastosowanie odkofeinowanego ekstraktu z ziaren kawy palonej - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie odkofeinowanego ekstraktu z ziaren kawy palonej do wytwarzania kompozycji do leczenia i profilaktyki chorób lub stanów związanych z dysfunkcją śródbłonka naczyń i/lub uszkodzeniem wątroby. Wynalazek oparty jest na unikatowej zdolności ekstraktu z ziaren kawy palonej do stymulacji endogennej produkcji i uwalniania prostacykliny PGI2 w śródbłonku naczyń, co może przynosić skutki terapeutyczne w chorobach, u których podłoża leży dysfunkcja śródbłonka naczyń, stres oksydacyjny i niewydolność śródbłonkowej syntezy PGI2, oraz w stanach podwyższonego ryzyka zachorowalności na takie choroby. Zastosowanie ekstraktu z ziaren kawy palonej może przynosić profilaktyczne i lecznicze skutki terapeutyczne między innymi w cukrzycy. Wynalazek oparty jest także na unikatowej zdolności ekstraktu z ziaren kawy palonej do działania leczniczego w stanach uszkodzenia wątroby i działania osłaniającego wątrobę w sytuacjach istnienia czynników potencjalnie hepatotoksycznych.

Stan techniki

Istnieje coraz więcej dowodów na to, że kluczową rolę w powstawaniu i rozwoju blaszki miażdżycowej jak również rozwoju cukrzycy i jej powikłań odgrywa dysfunkcja śródbłonka naczyniowego. W świetle dzisiejszego stanu wiedzy dysfunkcja śródbłonka ma znaczenie diagnostyczne, rokownicze i terapeutyczne w miażdżycy i w cukrzycy (Heitzer T, Schlinzig T, Krohn K, Meinertz T, Munzel T. Endothelial dysfunction, oxidative stress, and risk of cardiovascular events in patients with coronary artery disease. Circulation 2001;104:2673-2678; Schachinger V, Britten MB, Zeiher AM. Prognostic impact of coronary vasodilator dysfunction on adverse long-term outcome of coronary heart disease. Circulation 2000;101:1899-1906; Perticone F, Ceravolo R, Pujia A, Ventura G, Iacopino S, Scozzafava A, Ferraro A, Chello M, Mastroroberto P, Verdecchia P, Sehillaci G. Prognostic significance of endothelial dysfunction in hypertensive patients. Circulation 2001;104:191-196; Suwaidi JA, Hamasaki S, Higano ST, Nishimura RA, Holmes DR, Jr., Lerman A. Long-term follow-up of patients with mild coronary artery disease and endothelial dysfunction. Circulation 2000;101:948-954).

Przez dysfunkcję śródbłonka naczyń rozumie się stan czynnościowy śródbłonka, który charakteryzują niedobór czynników naczynioprotekcyjnych i zwiększone wytwarzanie czynników pro-zakrzepowych i prozapalnych (Chlopicki S, Kardiologia po Dyplomie, 2005, tom 4 nr 5, 77-88). Klinicznie, dysfunkcja śródbłonka jest utożsamiana z upośledzeniem aktywności biologicznej NO, którą ocenia się jako upośledzenie naczynio-rozszerzającej aktywności NO. Monitorowanie dostępności biologicznej NO jest możliwe poprzez pomiar zależnej od NO naczynio-rozkurczającej czynności śródbłonka in vivo (Chlopicki S, Kardiologia po Dyplomie, 2005, tom 4 nr 3, 75-81). Upośledzenie aktywności biologicznej NO współistnieje ze stresem oksydacyjnym (Heitzer T, Schlinzig T, Krohn K, Meinertz T, Munzel T. Endothelial dysfunction, oxidative stress, and risk of cardiovascular events in patients with coronary artery disease. Circulation 2001;104:2673-2678) i upośledzoną produkcją śródbłonkowej prostacykliny PGI2 (Kyrle PA, Minar E, Brenner B, Eichler HG, Heistinger M, Marosi L, Lechner K. Thromboxane A2 and prostacyclin generation in the microvasculature of patients with atherosclerosis - effect of low-dose aspirin. Thromb Haemost 1989;61:374-377), choć poziom PGI2 może być podwyższony. Istotnie, wiele lat temu zaproponowano, że nadtlenki lipidów mogą promować rozwój miażdżycy przez selektywne upośledzenie śródbłonkowej syntezy PGI2 i następową aktywację płytek krwi (Gryglewski RJ. Prostacyclin and atherosclerosis. TIPS 1980;1:164-168; Gryglewski RJ. Prostaglandins, platelets, and atherosclerosis. CRC Crit Rev Biochem 1980;7:291-338; Gryglewski RJ, Szczeklik A. Prostacyclin and atherosclerosis - experimental and clinical approach. 1983; 213-226). Ta hipoteza została poparta dowodami doświadczalnymi. Dzisiaj istnieje już wiele dowodów na to, że upośledzenie śródbłonkowej syntezy PGI2 może prowadzić do nadmiernej stymulacji receptorów TP w śródbłonku i w mięśniówce gładkiej przez TXA2, PGH2 albo przez inne eikozanoidy. Te mechanizmy doprowadzają do nadmiernego skurczu naczyń krwionośnych, aktywacji płytek krwi, aktywacji zapalnej śródbłonka i apoptozy śródbłonka. Oznacza to, że upośledzenie śródbłonkowej syntezy PGI2 może wyzwalać lub nasilać procesy zapalne i zakrzepowe w ścianie naczynia - te uważa się dzisiaj za kluczowe w rozwoju miażdżycy (atherothrombosis). Dysfunkcja śródbłonka odgrywa również kluczową rolę w rozwoju cukrzycy (de Jager J, Dekker JM, Kooy A, Kostense PJ, Nijpels G, Heine RJ, Bouter

LM et al.: Endothelial dysfunction and low-grade inflammation explain much of the excess cardiovascular mortality in individuals with type 2 diabetes: the Hoorn Study. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26, 1086-1093). Zgodnie z tym, można sądzić że zdolność niektórych czwartorzędowych związPL 218 602 B1 ków pirydyniowych do stymulacji produkcji PGI2 w śródbłonku może przynosić skutki przeciwmiażdżycowe i przeciwcukrzycowe. Podobnie, w wielu innych chorobach (wyżej wymienionych), w których dysfunkcja śródbłonka odgrywa rolę w ich patogenezie, farmakologiczne zwiększenie produkcji PGI2 przez śródbłonek pod wpływem tych związków może przynosić skutki terapeutyczne i profilaktyczne. Niektórzy z czwartorzędowych związków pirydyniowych mogą również przynosić skutki terapeutyczne we wszystkich innych chorobach, w których skuteczne są analogii prostacykliny takie jak np. uszkodzenia wątroby, nadciśnienie płucne.

Zastosowanie czwartorzędowych związków pirydyniowych o wzorze:

w którym R oznacza grupę NH2, CH3 lub N(H)CH2OH, a X oznacza dopuszczalny farmaceutycznie przeciwjon, do wytwarzania środka naczynioprotekcyjnego do leczenia i/lub profilaktyki stanów lub chorób związanych z dysfunkcją śródbłonka naczyniowego, stresem oksydacyjnym i niewydolnością śródbłonkowej syntezy prostacykliny (PGI2) opisano w publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO2005/067927. Wskazano w szczególności działanie przeciwmiażdżycowe i trombolityczne związków pirydyniowych o powyższym wzorze.

W publikacji WO2004/054535 opisano zastosowanie ekstraktu z kawy odkofeinowanej do wytwarzania kompozycji kosmetycznej/odżywczej/farmaceutycznej do leczenia suchej skóry na drodze stymulacji funkcji wydzielniczej skóry przez podawanie doustne. Przez ekstrakt z kawy rozumie się wszystkie związki otrzymane przez ekstrakcję alkoholem lub mieszaniną woda/alkohol ziaren kawy palonej lub niepalonej i usunięcie kofeiny. Wskazano, że składnikiem czynnym kompozycji nie jest kwas chlorogenny.

W publikacji Tse w J. Pharm. Sci., vol. 80(7), 665-669 (1991) ujawniono działanie farmakologiczne (aktywność cholinergiczna) odkofeinowanego ekstraktu z ziaren kawy palonej. Jako prawdopodobny składnik czynny ekstraktu wskazano obdarzony ładunkiem N1-podstawiony związek pirydyniowy, przypuszczalnie zawierający podstawnik cukrowy, o masie cząsteczkowej ok. 452, rozpuszczalny w wodzie i ekstrahowalny alkoholem, nieobecny w ekstraktach z kawy niepalonej.

W publikacji EP 1362 572 ujawniono kompozycję kosmetyczną mającą zastosowanie do pielęgnacji substancji keratynowych, zwłaszcza włosów, zawierającą jako składnik czynny czwartorzędowe sole pirydyniowe, podstawione na atomie azotu pirydyny grupą alkilową mającą od 1 do 8 atomów węgla, oraz w pozycjach 3 i/lub 4 grupami alkilowymi mającymi 1 do 5 atomów węgla.

W publikacjach R. Stadlera i współpr. w J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 1192-1199 i 1200-1206 badano produkty rozkładu trygoneliny powstające podczas palenia kawy. Jako główny nielotny produkt pirolizy trygoneliny wskazano 1-metylopirydynę oraz związki dialkilopirydyniowe. Zasugerowano potencjalne działanie przeciwnowotworowe związków alkilopirydyniowych, a zwłaszcza 1-metylopirydyny.

Podsumowanie wynalazku

Celem niniejszego wynalazku jest uzyskanie nowego środka o działaniu nacz ynioprotekcyjnym, użytecznego do leczenia i profilaktyki między innymi cukrzycy, miażdżycy, oraz działaniu hepatoprotekcyjnym, użytecznego w leczeniu i/lub profilaktyce uszkodzeń wątroby i stanów lub chorób związanych z uszkodzeniem wątroby.

Nieoczekiwanie okazało się, że pewne związki powstające w wyniku procesów rozkładu termicznego obecnej w kawie trygoneliny, zachodzącego podczas palenia kawy, wykazują właściwości naczynioprotekcyjne dzięki swojej zdolności do polepszania dysfunkcji śródbłonka naczyń poprzez stymulowanie uwalniania endogennej prostacykliny. Mogą one także wywierać działanie hepatoprotekcyjne.

Wynalazek dotyczy zastosowania odkofeinowanego ekstraktu z ziaren kawy palonej do wytwarzania kompozycji do leczenia i/lub profilaktyki chorób związanych z dysfunkcją śródbłonka naczyń lub uszkodzeniem wątroby.

PL 218 602 B1

Krótki opis Figur rysunku

Fig. 1 przedstawia schemat techniki badania działania trombolitycznego leków in vivo wg. Gryglewskiego.

Fig. 2 ilustruje brak znaczącej odpowiedzi trombolitycznej in vivo po dożylnym podaniu nikotynamidu (30 mg/kg) lub kwasu nikotynowego (30 mg/kg).

Fig. 3 ilustruje brak znaczącej odpowiedzi trombolitycznej in vivo po dożylnym podaniu trygoneliny (30 mg/kg).

Fig. 4 przedstawia zapis odpowiedzi trombolitycznej in vivo wywołanej przez dożylne podanie termolizatu trygoneliny (30 mg/kg).

Fig. 5 przedstawia zapis odpowiedzi trombolitycznej in vivo wywołanej przez dożylne podanie chlorku 1-metylopirydyniowego (30 mg/kg) (zapis górny) oraz chlorku 1,4-dimetyIopirydyniowego (30 mg/kg) (zapis dolny).

Fig. 6 przedstawia wpływ termolizatu trygoneliny na hiperglikemię poposiłkową w porównaniu z metforminą i kontrolą nieleczoną.

Szczegółowe ujawnienie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie odkofeinowanego ekstraktu z ziaren kawy palonej, otrzymanego przez ekstrakcję wodą i wysolenie i zawierającego mieszaninę jonowych soli pirydyniowych, do wytwarzania kompozycji do leczenia lub profilaktyki chorób lub stanów wybranych z zakrzepicy, cukrzycy, oraz uszkodzeń wątroby.

Przez „odkofeinowany ekstrakt z ziaren kawy palonej” rozumie się kompozycję związków wyodrębnianych z ziaren kawy palonej przez ekstrakcję wodą, po usunięciu z niej substancji niejonowych, w tym między innymi kofeiny. Ekstrakt taki zawiera mieszaninę jonowych soli pirydyniowych i może dodatkowo zawierać lub nie, trygonelinę. Ekstrakt do stosowania zgodnie z wynalazkiem nie zawiera substancji ekstrahowalnych rozpuszczalnikami niepolarnymi (lipofilowymi).

Odkofeinowany (pozbawiony kofeiny) ekstrakt z ziaren kawy palonej można otrzymać przez ekstrakcję kawy palonej wodą na gorąco, po czym wysolenie, za pomocą obojętnej soli nieorganicznej, np. siarczanu sodu, produktów niejonowych (głównie kofeiny) zawartych w ekstrakcie wodnym, po jego uprzednim ewentualnym zatężeniu.

Odkofeinowany ekstrakt z ziaren kawy palonej można otrzymać również w dowolny inny sposób znany w sztuce, na przykład sposobem takim jak opisane w publikacjach WO2004/054535 i w J. Pharm. Sci., vol. 80(7), 665-669 (1991).

Korzystnie, ekstrakt jest ekstraktem z ziaren kawy palonej, wzbogaconej przed wypalaniem przez dodatek trygoneliny.

Ekstrakt może być otrzymywany z ziaren palonej kawy dowolnego gatunku, w tym kawy Arabica (Coffea arabica), kawy Robusta (Coffea canephora), kawy liberyjskiej (Coffea liberica), kawy wyniosłej (Coffea excelsa), oraz kawy Arabusta (Arabica Robusta). Palenie ziaren kawy jest procesem doskonale znanym i polega na poddawaniu kawy działaniu temperatury ok. 200-300°C. Optymalny czas wypalania kawy zamyka się zwykle w przedziale między 16 a 20 minut.

Odkofeinowanie może być przeprowadzone przed paleniem kawy, dowolnym ze znanych procesów odkofeinowania kawy, n.p. przez nasączenie zielonej kawy w wodzie w celu rozpuszczenia kofeiny, ekstrakcji kofeiny rozpuszczalnikiem (n.p. chlorkiem metylenu lub octanem etylu) lub węglem aktywnym i następnie ponowne moczenie ziaren w odkofeinowanym ekstrakcie wodnym w celu ponownego zaabsorbowania substancji aromatycznych. Inne znane sposoby odkofeinowania polegają na ekstrakcji ziaren dwutlenkiem węgla pod ciśnieniem. Jednak korzystnie odkofeinowaniu poddawany jest ekstrakt otrzymany z ziaren kawy palonej niepozbawionej kofeiny. Korzystnie odkofeinowanie przeprowadza się jednocześnie z usunięciem innych substancji niejonowych przez wysolenie ekstraktu obojętną solą nieorganiczną rozpuszczalną w wodzie, n.p. stałym siarczanem sodu.

Okazało się, że związki pirydyniowe zawarte w odkofeinowanym ekstrakcie z ziaren kawy palonej mają unikatowe własności farmakologiczne związane z ich zdolnością do uwalniania endogennej prostacykliny (PGI2) ze śródbłonka, działanie śródbłonkowe związane z uwolnieniem PGI2, skutkiem czego mogą poprawiać perfuzję tkankową, działać przeciwzakrzepowo, trombolitycznie, przeciwapoptotycznie, oraz działać ochronnie na śluzówkę żołądka i przewodu pokarmowego, a także hepatoprotekcyjnie w leczeniu i profilaktyce uszkodzeń wątroby.

Zaletę tych związków pirydyniowych stanowi fakt, że ich działaniu naczynioprotekcyjnemu prawdopodobnie nie towarzyszy działanie hipotensyjne. Ponadto, działanie trombolityczne nie jest

PL 218 602 B1 związane z bezpośrednim działaniem na płytki krwi. Związki pirydyniowe nie działają również bezpośrednio na aktywność leukocytów.

Bez wiązania się teorią, twórcy niniejszego wynalazku uważają, że obdarzone ładunkiem dodatnim związki pirydyniowe zawarte w odkofeinowanym ekstrakcie określonym w niniejszym zgłoszeniu wiążą się poprzez oddziaływania elektrostatyczne ze związkami anionowymi obecnymi na powierzchni śródbłonka naczyń, takimi jak glikozoaminoglikany. Następstwem tego wiązania może być wywieranie szeregu efektów śródbłonkowych, które mogą mieć pozytywny wpływ z farmakologicznego punktu widzenia. Efektami takimi mogą być uwalnianie NO i/lub prostacykliny, dzięki czemu następować może poprawa dysfunkcji śródbłonka i leczenie lub profilaktyka chorób, u których podłoża leży taka dysfunkcja.

W jednym ze szczególnie korzystnych wykonań wynalazku stanem lub chorobą jest zakrzepica.

W następnym aspekcie stanem lub chorobą jest zakrzepica pochodzenia innego niż miażdżyca tętnic, w szczególności zakrzepica związana z implantacją protez metalowych i protez naczyniowych (stentów), operacją pomostowania aortalno-wieńcowego (CABG), hemodializą, chorobą zakrzepowo-zatorową żył.

W jeszcze innym wariancie wynalazku wykorzystuje się działanie ochronne odkofeinowanego ekstraktu na czynność wątroby, a stanem lub chorobą jest stan uszkodzenia wątroby, w szczególności ostra niewydolność wątroby, przewlekła niewydolność wątroby lub marskość wątroby.

Uszkodzeniem wątroby może też być polekowe uszkodzenie wątroby, spowodowane stosowaniem leków, np. leków sterydowych, środków przeciwgrzybiczych, antybiotyków, leków immunosupresyjnych, itd. Kompozycja zawierająca odkofeinowany ekstrakt z ziaren kawy palonej może być stosowana profilaktycznie w celu osłony wątroby w przypadku stosowania leków działających hepatotoksycznie. Uszkodzeniem wątroby może też być poalkoholowe uszkodzenie wątroby, spowodowane używaniem alkoholu, toksyczne uszkodzenie wątroby, spowodowane działaniem toksycznych czynników chemicznych takich jak na przykład rozpuszczalniki, w tym czterochlorek węgla, chloroform, lub działaniem pestycydów, lub uszkodzenie wątroby spowodowane przez wirusowe zapalenie wątroby.

Leczenie lub profilaktyczne stosowanie zgodnie z wynalazkiem polegać będzie na podawaniu osobie lub pacjentowi kompozycji farmaceutycznej lub preparatu zawierającego odkofeinowany ekstrakt z ziaren kawy palonej w ilości skutecznej terapeutycznie lub profilaktycznie.

Dawkowanie będzie zależeć od rodzaju stanu lub choroby, rodzaju postępowania (lecznicze lub profilaktyczne), stanu pacjenta, jego wieku, i będzie ostatecznie ustalane indywidualnie przez lekarza prowadzącego. Generalnie podawana ilość odkofeinowanego ekstraktu będzie zawarta w zakresie od 0,1 do 10000 mg do podawania w jednej dawce lub w dawkach podzielonych, na przykład od 0,5 mg do 1,125 mg, 1 mg do 1100 mg, 1,25 mg do 1075 mg, 1,5 mg do 1050 mg, 2,0 mg do 1025 mg, 2,5 mg do 1000 mg, 3,0 mg do 975 mg, 3,5 mg do 950 mg, 4,0 mg do 925 mg, 4,5 mg do 900 mg, 5 mg do 875 mg, 10 mg do 850 mg, 20 mg do 825 mg, 30 mg do 800 mg, 40 mg do 775 mg, 50 mg do 750 mg, 100 mg do 725 mg, 200 mg do 700 mg, 300 mg do 675 mg, 400 mg do 650 mg, 500 mg, lub 525 mg do 625 mg. W jeszcze innym wykonaniu dawka ekstraktu zawarta w podawanej kompozycji będzie wynosić między 0,1 mg a 25 mg. W pewnych wykonaniach dawka ekstraktu zawarta w podawanej kompozycji będzie mniejsza niż 100 mg, lub mniejsza niż 80 mg, lub mniejsza niż 60 mg, lub mniejsza niż 50 mg, lub mniejsza niż 30 mg, lub mniejsza niż 20 mg, lub mniejsza niż 10 mg, lub mniejsza niż 5 mg, lub mniejsza niż 2 mg, lub mniejsza niż 0,5 mg.

Wyżej określony odkofeinowany ekstrakt z ziaren kawy palonej zgodnie z wynalazkiem można stosować w postaci kompozycji farmaceutycznych/suplementów diety, w formie do podawania/spożywania doustnego. Formami takimi mogą być typowe formy do podawania doustnego znane w sztuce, takie jak tabletki, kapsułki twarde i miękkie, proszki, roztwory, zawiesiny, itd.

Będą one zawierać typowo stosowane w sztuce nieaktywne substancje pomocnicze do formulacji form farmaceutycznych, takie jak nośniki, wypełniacze, środki wspomagające tabletkowanie, środki smakowo-zapachowe, itp. Każdy z tych środków pomocniczych musi być „dopuszczalny” w sensie zgodności (kompatybilności) z innymi składnikami preparatu, w szczególności z substancją czynną i nie może być szkodliwy dla pacjenta. Nieograniczającymii przykładami materiałów, które mogą być użyte jako dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i wypełniacze są: cukry, takie jak laktoza, glukoza i sacharoza; skrobie, takie jak skrobia kukurydziana i skrobia ziemniaczana; celuloza i jej pochodne, takie jak karboksymetyloceluloza sodu, etyloceluloza, hydroksypropyloceluloza, octan celulozy, celuloza mikrokrystaliczna; sproszkowana tragakanta; poliwinylopirolidon; fosforan wapnia. Formy doustne mogą także zawierać środki smarne i poślizgowe, jak na przykład stearyniany, np. stearynian

PL 218 602 B1 magnezu, talk lub krzemionka; środki rozsadzające, jak np. skrobi glikolan sodowy; lub środki zwilżające, jak np. IauryIosiarczan sodu. Tabletki mogą być powlekane typowymi metodami powłoczkami zwykłymi (drażetki) lub powłoczkami opóźniającymi uwalnianie.

Kompozycja zgodnie z wynalazkiem może zawierać korzystnie od około 90 do 99,995% farmaceutycznego podłoża oraz około 0,005 do około 10% wagowo odkofeinowanego ekstraktu z ziaren kawy palonej zdefiniowanego powyżej. Korzystniej kompozycja zawiera około 0,01 do około 10% wagowo odkofeinowanego ekstraktu z ziaren kawy palonej.

Preparatami ciekłymi do podawania doustnego mogą być roztwory, syropy lub zawiesiny. Odpowiednim nośnikiem może być woda. Mogą one też zawierać typowe środki konserwujące zwykle stosowane dla zapobiegania wzrostu mikroorganizmów, takie jak na przykład parabeny, kwas askorbinowy, timerosal, kwas sorbowy, p-hydroksybenzoesany metylu lub propylu, i inne.

Ekstrakt może być również podawany drogą pozajelitową w postaci wstrzyknięć dożylnych lub podskórnych. Odpowiednimi nośnikami mogą być woda wolna od pirogenów, izotoniczna solanka, bufory fosforanowe, roztwór Ringer'a, nośniki olejowe i inne nietoksyczne zgodne substancje stosowane w technice sporządzania form farmaceutycznych. Mogą one zawierać środki nadające izotoniczność, jak chlorek sodu, cukry lub polialkohole, jak mannitol lub sorbitol, oraz środki stabilizujące i konserwujące.

Kompozycje i preparaty mogą być również podawane drogą wziewną, zwłaszcza w przypadku leczenia obturacyjnej choroby płuc. W takim przypadku mogą być podawane w postaci mikronizowanego proszku lub rozpylanego aerozolu. Mogą być też podawane drogą donosową w postaci rozpylanego aerozolu. Mogą być też podawane doodbytniczo, w postaci kremów, maści, czopków. W każdym przypadku będą zawierać odpowiednie dla danej formy środki pomocnicze, nośniki i podstawy.

Preparaty i kompozycje, w jakich może być podawany odkofeinowany ekstrakt zgodnie z wynalazkiem nie są w żadnym wypadku ograniczone do konkretnych wskazanych tu powyżej form.

Opisy typowych form, technik ich sporządzania oraz stosowanych środków pomocniczych można znaleźć na przykład w monografii Remington: The Science and Practice of Pharmacy, wyd. 21, 2005.

W przypadku stosowania jako suplementu diety/kompozycji odżywczej ekstrakt może być dodawany do preparatów żywnościowych dowolnej postaci, typowo w ilości co najmniej 5% wagowych preparatu żywnościowego.

W przypadku stosowania jako suplementów diety związki pirydyniowe zgodnie z wynalazkiem mogą być dodawane do preparatów żywnościowych dowolnej postaci, typowo w ilości co najmniej 5% wagowych preparatu żywnościowego, ale bez ograniczania się do podanej zawartości.

Jako nieograniczające przykłady można wskazać produkty żywnościowe w postaci ciekłej, emulsji lub past, jak napoje, w tym bezalkoholowe i alkoholowe, napoje mleczne, produkty mleczne takie jak jogurty. Innym przykładem mogą być produkty stałe takie jak na przykład cukierki, gumy do żucia, galaretki, czekoladki, oraz produkty w proszku, na przykład napoje w proszku do rozpuszczania bezpośrednio przed spożyciem.

Związki pirydyniowe zgodnie z wynalazkiem mogą być także dodawane do suplementów witaminowych w postaci stałej, jak tabletki, kapsułki, proszek do rozpuszczania, lub napoju do podawania doustnego, zawierający poza związkiem o wzorze I lub ekstraktem z ziaren kawy palonej typowe składniki suplementów witaminowych.

Poniżej przedstawiono przykłady ilustrujące zastosowanie i działanie farmakologiczne odkofeinowanego ekstraktu zgodnie z wynalazkiem.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1

Wytwarzanie termolizatu trygoneliny

Termolizat trygoneliny otrzymywano przez pirolizę trygoneliny w temperaturze 220°C przez 30 minut (warunki imitujące proces wypalania kawy). Pirolizie poddano trygonelinę umieszczoną (w postaci cienkiej warstwy kryształów) w cienkościennej ampule szklanej, w atmosferze argonu. Otrzymaną mieszaninę produktów pirolizy rozpuszczono w wodzie, roztwór przesączono i poddano ekstrakcji chloroformem. Wodę oddestylowano na wyparce próżniowej, pozostałość wysuszono nad pięciotlenkiem fosforu.

Wstępną analizę produktów pirolizy (termolizatu), przeprowadzoną techniką spektrometrii masowej ToF-SIMS (Time of Flight Secondary Ion Mass Spectrometry) przedstawiono poniżej.

PL 218 602 B1

PL 218 602 B1

Dominujący w widmie kation N-metylopirydyniowy jest prawdopodobnie najbardziej dominującym produktem pirolizy. Innymi obecnymi w znaczących ilościach produktami pirolizy są kationy 1,2 i 1,4-dimetylopirydyniowy, oraz kationy: metylotrygoneliny, (2'-hydroksypirydyno)trygoneliny, N-metylo(pirydyno)pirydynowy, N-metylo(N'metylopirydyno)pirydynowy.

P r z y k ł a d 2

Wytwarzanie odkofeinowego ekstraktu z ziaren kawy palonej

100 g kawy Arabica, palonej (wg. procedury „Medium dark brown”) i zmielonej, zalano wodą o temperaturze około 50°C (1 litr), mieszano przez około 3 minuty i pozostawiono do ochłodzenia (około 30 minut). Mieszaninę przesączono przez lejek Schotta, przesącz ochłodzono do około 10-15°C i zatężono do objętości około 100 ml (wyparka obrotowa, ciśnienie: około 20 mmHg, temperatura: 10-30°C).

Do zatężonego ekstraktu, ogrzewano do około 35-40°C i intensywnie mieszanego, dodano powoli 21 g stałego bezwodnego siarczanu sodowego. Mieszanie kontynuowano do całkowitego rozpuszczenia siarczanu (stężenie otrzymanego roztworu siarczanu: 1,5 mol/l), po czym mieszaninę pozostawiono do ochłodzenia do temperatury pokojowej. Bezpostaciowy osad wydzielony wskutek wysolenia, zawierający głównie kofeinę, odsączono na bibule filtracyjnej, po czym przesącz pozostawiono na 24 godziny w temperaturze około 8°C w celu wydzielenia większości siarczanu. Kryształy siarczanu odsączono, z przesączu usunięto większość wody na wyparce (ciśnienie: około 20 mmHg, temperatura: 20-40°C). Pozostałość, o konsystencji półpłynnej pasty, suszono dwuetapowo. Najpierw pastę zagęszczono (do stanu braku płynności) stosując nadmuch powietrza o temperaturze pokojowej, następnie tak otrzymany produkt suszono do stałej masy pod ciśnieniem około 0,05 mmHg w temperaturze pokojowej.

Otrzymaną stalą substancję rozdrobniono w moździerzu porcelanowym, po czym ekstrahowano etanolem (96%, 2 x 120 ml) w następujący sposób. Zawiesinę stałej substancji w etanolu ogrzewano do około 40°C i intensywnie mieszano mechanicznie w ciągu 20 minut, następnie powoli ochłodzono do temperatury pokojowej i przesączono przez lejek Schotta. Z połączonych przesączów odparowano etanol na wyparce obrotowej (ciśnienie: około 20 mmHg, temperatura: 20-40°C). Pozostałość wysuszono do stałej masy w eksykatorze próżniowym nad P2O5. Otrzymano 1,65 g silnie higroskopijnej stałej substancji, o barwie pomarańczowo-brązowej.

P r z y k ł a d 3

Wiązanie z heparyną jako wskaźnik potencjalnego działania trombolitycznego

Przeprowadzone obecnie przez Zgłaszających badania wykazały, że istnieje korelacja między wiązaniem związku z heparyną, a jego czynnością trombolityczną, oraz że wiązanie związku z heparyną zdeterminowane jest obecnością w jego cząsteczce kationu pirydyniowego. Wiązania ani efektu trombolitycznego nie zaobserwowano w przypadku związków pirydyny nieobdarzonych ładunkiem dodatnim - metabolitów nikotynamidu.

Obecność heparyny w roztworze związków - soli pirydyniowych powoduje zmiany w widmie absorpcyjnym soli pirydyniowej, związane z oddziaływaniem kationów pirydyniowych z ujemnie naładowanymi grupami heparyny. W przypadku heparyny immobilizowanej na sefarozie, która nie rozpuszcza się w wodzie i tworzy zawiesinę, powoduje to obniżenie stężenia soli pirydyniowej w roztworze w wyniku związania jej przez heparynę immobilizowaną. Należy przy tym podkreślić fakt, iż sefaroza jako czynnik immobilizujacy nie wiąże się z solami pirydyniowymi.

Przy dużym nadmiarze heparyny immobilizowanej w stosunku do stężenia soli pirydyniowej, stopień wiązania soli zależy tylko od stężenia heparyny. Pozwala to na oszacowanie stopnia wiązania różnych związków pirydyniowych z heparyną, przy zachowaniu analogicznych stężeń badanych związków pirydyniowych i stałego stężenia heparyny immobilizowanej na sefarozie, oraz określonej metodyki pomiarowej.

Metodyka pomiaru wiązania badanych związków z heparyną immobilizowaną.

Do wodnej zawiesiny heparyny immobilizowanej (25 mg/ml) dodawano wodne roztwory wybranych związków pirydyniowych (20:200 μΜ), przygotowane przy użyciu wody ultraczystej z systemu

Millipore-Milli-Q. Roztwory mieszano około 1 min. a następnie odwirowywano przez 4 min. z szybkością obrotową 13 000 obr./min., używając do tego celu mikrowirówki FORCE 1418 firmy Labnet Int. (USA). Widma badanych związków pirydyniowych w nadsączu zbierano spektrofotometrycznie, a następnie porównywano je z widmami wodnych roztworów związków pirydyniowych bez dodatku heparyny. Stopień wiązania heparyny z badanymi solami (podawany w %) określa się na podstawie

PL 218 602 B1 różnic stężeń związków w nadsączu po odwirowaniu i w roztworze bez dodatku heparyny. pH roztworów wynosiło około 7. Wszystkie pomiary przeprowadzono w temperaturze pokojowej.

Widma UV-VIS badanych roztworów zbierano używając dwuwiązkowego spektrofotometru Perkin Elmer Lambda 40 wyposażonego w przystawkę termostatującą.

Heparyna immobilizowana na sefarozie CL-6B została zakupiona w Amersham Pharmacia Biotech (Sweden). Sefaroza CL-6B pochodziła z firmy Sigma.

Wyniki pomiarów stopnia wiązania wybranych związków z heparyną immobilizowaną. Wyniki dla kilku wybranych związków pirydyniowych i metabolitów nikotynamidu przedstawiono w tabelach poniżej.

PL 218 602 B1

Tabela 2. Stopień wiązania 3-podstawionych związków pirydyniowych oraz wybranych metabolitów nikotynamidu o znanej aktywności trombolitycznej z heparyną immobilizowaną.

Badany związek	Stopień wiązania	Odpowiedź trom- bolityczna
o1 N 1 ch3	1 -metylonikotynamid MNA+	> 45 %	tak
N 1 ch3	1-metylo-N’- (hydroksymety- lo) nikotyn amid MNAF-	> 35 %	tak
O1· N 1 CH3	l-metylo-3- acetylopirydyna MAP-	> 25 %	tak
ο1- N 1 H	kwas nikotynowy NC	> 40 %	brak
c/-·· N 1 0	N-tlenek nikotynamidu Ν-ΟΧ	> 10 %	brak
0 oV 1 ch3	1 -metylo-2-pirydono-5- karboksamid 2-PYR	> 5 %	brak
fi1 N	nikotyn amid NA	« 0 %	brak

PL 218 602 B1

Tabela 3. Stopień wiązania trygoneliny i wybranych produktów jej rozkładu termicznego z heparyną immobilizowaną na sefarozie

Badany kation pirydyniowy	Stopień wiązania	Odpowiedź tromboli- tyczna
C/'“ N 1 CK3	trygonelina Tryg	«0 %	brak
0 N 1 CH3	1 -metylopirydyna MP+	> 25 %	tak
CH, ó N 1 CH3	1,4-dimetylopirydyna 14-DMP+	> 20 %	tak
Q N CH3 1 3 ch3	1,2-dimetylopirydyna 12-DMP+	> 15 %	-
CH, 0 cy- N 1 ch3	4-metylotiygonelina 4MeTryg	> 5 %	-
H?C N 3 1 ch3	2-metylotrygonelina 2MeTryg	> 5 %	-

PL 218 602 B1

Przedstawione w Tabeli 2 wyniki wskazują, że czwartorzędowe sole pirydyniowe przejawiają tendencję do wiązania z heparyną, co może implikować ich zdolność oddziaływań ze śródbłonkiem naczyniowym i być odpowiedzialnym za ich efekt terapeutyczny. W przypadku związków przedstawionych w Tabeli 2 ich terapeutyczny efekt, w szczególności efekt odpowiedzi trombolitycznej jest już szeroko udokumentowany (patrz patent WO 2005/067927 A2) i przeciwstawiony niewiązaniu innych, nie kationowych metabolitów nikotynamidu, które jednocześnie nie wykazują znaczącego efektu trombolitycznego.

Wyniki przedstawione w Tabeli 3 wskazują, że czwartorzędowe sole pirydyniowe przejawiają tendencję do wiązania z heparyną, co może implikować ich zdolność oddziaływań ze śródbłonkiem naczyniowym i być odpowiedzialnym za ich efekt terapeutyczny.

Można więc wysnuć wniosek, że istnieje duże prawdopodobieństwo wystąpienia silnego efektu trombolitycznego dla wszystkich kationowych produktów rozpadu trygoneliny w termolizacie i ekstrakcie z wypalonej kawy. W przypadku dwóch ze związków, badanych obiema metodami, 1-metylopirydyny i 1,4-dimetylopirydyny, wiązaniu z heparyną rzeczywiście towarzyszy efekt trombolityczny. Choć nie można oczekiwać prostej korelacji między tymi efektami, wyniki dotychczas uzyskane wskazują na brak znaczącej odpowiedzi trombolitycznej w przypadku związków kompletnie niewiążących się z heparyną. Istotną bowiem rolę w procesach wiązania polianionu z kationem odgrywa ładunek dodatni na atomie azotu w pierścieniu pirydyniowym. Związki, które posiadają bardziej „rozbudowane” podstawniki związane z atomem azotu np. grupę propylową lub benzylową, wiążą się gorzej lub nie wiążą się w ogóle z heparyną w stosunku do N-metylopodstawionych pochodnych. W przypadku związków o charakterze jonów obojnaczych ładunek ujemny cząsteczki może znosić efekt dodatniego centrum na pierścieniu pirydyniowym (np. trygonelina).

P r z y k ł a d 4

Pomiar czynności trombolitycznej

Aktywność trombolityczną badano metodą opisaną przez Gryglewskiego i współpr., (Gryglewski RJ, Korbut R, Ocetkiewicz A, Stachura J. In vivo method for quantitation for anti-platelet potency of drugs. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 1978;302:25-30), przedstawioną schematycznie na Fig. 1.

Szczury, wagi około 300-350 g, w znieczuleniu ogólnym (tiopental 95 mg/kg i.p.), po wstępnej heparynizacji (800 jed./kg i.v.) są kaniulowane. Kaniule umieszczone w tętnicach są podłączone: z lewej tętnicy szyjnej do czujnika ciśnienia; z prawej tętnicy szyjnej przez ogrzewany (37°C) przewód do pompy perystaltycznej, która przetacza krew tętniczą do krążenia pozaustrojowego, gdzie omywa ona (1.5 ml/min) pasek kolagenu o długości 3 cm zawieszony na dźwigni auksotonicznej izotonicznego przekaźnika (Harvard 386) zaopatrzonego w sprężynowy amortyzator. Pasek kolagenowy jest wycięty ze ścięgna Achillesa królika. Po omyciu paska krew powraca poprzez zbiorniczek kompensacyjny połączony z lewą żyłą udową do krążenia zwierzęcia. W czasie superfuzji paska kolagenu na jego powierzchni tworzy się zakrzep zbudowany z agregatów płytek krwi uwięzionych w sieci włóknika (mikroskopowo uwidocznionej metodą Weigerta).

Po 20-30 minutach superfuzji krwią paska kolagenu waga zakrzepu (nieustannie monitorowana) stabilizuje się na poziomie 70-100 mg i na tym plateau pozostaje do końca doświadczenia, to znaczy przez 3-5 godzin o ile eksperymentator nie wstrzyknie dożylnie zwierzęciu aktywnego leku. Jeśli lek działa trombolitycznie to następuje spadek wagi zakrzepu. Ciśnienie tętnicze i waga zakrzepu są nieustannie równolegle rejestrowane. Ten układ pozwala więc na badanie działania trombolitycznego i hipotensyjnego działania leku (Fig. 1).

Analiza odpowiedzi trombolitycznej w tym układzie doświadczalnym może być uzupełniana przez pomiar poziomu 6-keto-PGF_1a, TXB₂ i PGE₂ w osoczu krwi tętniczej. W tym celu pobiera się próbki krwi (500 μΐ) do eppendorfek z indometacyną i EDTA (stężenia końcowe odpowiednio -10 μΜ, mM). Następnie próbki krwi są wirowane przez 5 minut (2.000 x g) i przetrzymywane (-70°C) do oznaczenia. Poziomy prostanoidów można oznaczać stosując dostępne komercyjnie kity ELlSA (Cayman Chemical Co, Ann Arbor, MI).

Dożylne podanie termolizatu trygoneliny otrzymanego w sposób opisany w przykładzie 1 wywoływało odpowiedź trombolityczną u szczurów rasy Wistar z krążeniem pozaustrojowym. Po jednorazowym wstrzyknięciu 30 mg/kg termolizatu odpowiedź trombolityczna była długotrwała, osiągała swoje plateau na poziomie 35 ± 3,5% już około 30 min. po wstrzyknięciu i pozostawała na podobnym poziomie przez 2-3 godziny doświadczenia. Odpowiedź trombolityczną obserwowano też dla chlorku 1-metylopirydyniowego postulowanego jako główny produkt pirolizy trygoneliny. Chlorek 1,4-dimetyloPL 218 602 B1 pirydyniowy powoduje odpowiedź trombolityczną zbliżoną do termolizatu. W przeciwieństwie do termolizatu, ani nikotynamid ani kwas nikotynowy ani trygonelina (każdy w dawce do 30 mg/kg) nie wywoływał znaczącej odpowiedzi trombolitycznej. Odpowiedzi trombolityczne wywołane przez nikotynamid, lub kwas nikotynowy były krótkotrwałe (krótsze niż 15-20 minut) i ich maksimum wynosiło odpowiednio zaledwie 9 ± 0,6% i 5 ± 0,9%. Trygonelina nie wywoływała żadnej odpowiedzi trombolitycznej. Wyniki badania efektu trombolitycznego przedstawiono na Figurach 2 do 5.

P r z y k ł a d 5

Czynność termolizatu trygoneliny w szczurzym modelu cukrzycy typu II i zespołu metabolicznego

Szczury Zucker fatty rats (fa/fa) stanowią szeroko stosowany model genetycznie uwarunkowanej otyłości, oporności na insulinę i zaburzeń metabolizmu triglicerydów, odpowiadający cukrzycy typu II i zespołu metabolicznego. Charakterystycznym objawem patologicznym w rozwijającej się oporności na insulinę jest wygórowana poposiłkowa odpowiedź na podanie glukozy. U ludzi wyprzedza ona rozwój jawnej cukrzycy typu II, jest czynnikiem prognostycznym cukrzycy i powikłań sercowo-naczyniowych cukrzycy. Wygórowana poposiłkowa odpowiedź na podanie glukozy jest obecna również u szczurów Zucker fatty (fa/fa).

Szczury Zucker fatty rats (fa/fa) (Crl:ZUC(Orl) - Lepra) w wieku 10 tygodni w grupach po n=3-4 karmione były p.o. przez 7 dni termolizatem trygoneliny, otrzymanym w sposób opisany w przykładzie 1 (100 mg/kg) lub metforminą (500 mg/kg). Grupa kontrolna nie była leczona. Po 7 dniach podawana była glukoza w dawce 2 g/kg (i.p.) i analizowana poposiłkowa hiperglikemia w następujących punktach czasowych. 0, 15, 30, 60 i 90 minut po podaniu glukozy. Jak przedstawiono na Fig. 6, termolizat trygoneliny (100 mg/kg) zmniejszał hiperglikemię poposiłkową w stopniu porównywalnym do metforminy (500 mg/kg). Termolizat trygoneliny ma więc działanie przeciwcukrzycowe.

Terapia termolizatem trygoneliny nie wpływała przy tym na poziom trójglicerydów ani na poziom wolnych kwasów tłuszczowych, które wynosiły odpowiednio dla grupy kontrolnej i leczonej termolizatem: 3,5 ± 0,2, 1,3 ± 0,09 mmol/l oraz 4,1 ± 0,3, 1,4 ± 0,07 mmol/l.

Dla znawcy oczywiste będzie, że efektu farmakologicznego analogicznego jak dla termolizatu trygoneliny oczekiwać można dla ekstraktu z ziaren kawy palonej, zawierającego produkty termicznego rozkładu trygoneliny.

Claims (8)

1. Zastosowanie odkofeinowanego ekstraktu z ziaren kawy palonej, otrzymanego przez ekstrakcję wodą i wysolenie i zawierającego mieszaninę jonowych soli pirydyniowych, do wytwarzania kompozycji do leczenia lub profilaktyki chorób lub stanów wybranych z zakrzepicy, cukrzycy, oraz uszkodzeń wątroby.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym stanem lub chorobą jest zakrzepica o innym podłożu niż miażdżyca tętnic, w szczególności związana z implantacją protez metalowych i protez naczyniowych (stentów), operacją pomostowania aortalno-wieńcowego (CABG), hemodializą, chorobą zakrzepowo-zatorową żył.

3. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym stanem lub chorobą jest uszkodzenie wątroby.

4. Zastosowanie według zastrz. 3, w którym stanem lub chorobą jest ostra niewydolność wątroby, przewlekła niewydolność wątroby lub marskość wątroby.

5. Zastosowanie według zastrz. 3, w którym uszkodzeniem wątroby jest polekowe uszkodzenie wątroby, poalkoholowe uszkodzenie wątroby, toksyczne uszkodzenie wątroby lub uszkodzenie wątroby spowodowane przez wirusowe zapalenie wątroby.

6. Zastosowanie według zastrz. 1 do 5, w którym kompozycja ma postać do podawania doustnego.

7. Zastosowanie według zastrz. 1 do 5, w którym kompozycja ma postać do podawania pozajelitowego.

8. Zastosowanie według zastrz. 1 do 7, w którym odkofeinowanym ekstraktem z ziaren kawy palonej jest ekstrakt otrzymany z kawy wzbogaconej przed wypalaniem przez dodatek trygoneliny.