PL218248B1 - Zastosowanie aprotyniny z surfaktanem płucnym do wytwarzania leku zapobiegającego infekcjom grypy - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy zastosowania leku do zapobiegania infekcjom wirusów grypy. Wirusy grypy występują w licznych odmianach i charakteryzują się znaczną zmiennością. Zmienność ta dotyczy przede wszystkim białek powierzchniowych wirusa, którymi są hemaglutynina (HA) i neuraminidaza (NA). Białka te uczestniczą w początkowych i końcowych etapach cyklu replikacyjnego wirusa.

Hemaglutynina zawiera struktury rozpoznające komórki docelowe, a konkretnie kwas sjalowy związany odpowiednim wiązaniem z galaktozą w części cukrowej glikoproteidów powierzchniowych. Indukuje to endocytozę cząstki wirusa, ale aby doszło do efektywnego zakażenia wirus musi uwolnić materiał genetyczny (RNA) do cytoplazmy. W procesie tym uczestniczy hemaglutynina i białko M2 wirusa Aby jednak to nastąpiło hemaglutynina musi być zaktywowana poprzez przecięcie przez proteazę komórkową na części HA1 i HA2. Bez tego niemożliwa jest replikacja wirusa, co w praktyce oznacza zatrzymanie infekcji. Jeśli zainfekowany organizm nie replikuje wirusa grypy mamy do czynienia z odpornością na zakażenie.

Najgroźniejsze infekcje powoduje wirus grypy A, którego zmienność wyraża się w istnieniu bardzo licznych odmian HA i NA. Główne typy tych białek oznaczane są literami H i N oraz liczbami: znamy 16 typów HA (III-fil6) i 9 typów NA (N1-N9). Wśród ptaków, w szczególności z rzędu blaszkodziobych, występuje pełny repertuar wirusów grypy. U łudzi skutecznie mogą się replikować i przenosić na innych ludzi tylko wirusy z niektórymi kombinacjami HA i NA. Dotychczas (czyli w ciągu ostatnich 120 lat) zidentyfikowano tylko 5 rodzajów ludzkich wirusów pandemicznych: H1N1, H1N2, H2N2, H3N2 i H3N8, które wywołały 6 pandemii grypy. Na co dzień mamy do czynienia ze zmiennością mutacyjną niższego rzędu, prowadzącą do powstawania setek odmian każdego z typów wirusa Jest to zmienność związana z powstawaniem nowych odmian antygenowych, co skutkuje epidemiami grypy co kilka lat.

Obecnie w Europie występuje wirus A/H3N2 oraz dużo rzadziej A/HlNlpdm09 (tzw. wirus pandemiczny „grypy świńskiej”). Oprócz tego spotyka się zakażenia wirusem grypy B.

Infekcje wirusowe wywołują corocznie epidemie i co kilka lat pandemie, które obejmują swoim zasięgiem miliony ludzi.

Niebezpieczeństwo pojawienia się nowych szczepów, wysoce patogennych, które mogą być bardzo groźne dla zdrowia i życia wielu ludzi ciągle stanowi duże prawdopodobieństwo.

Przykładem mogą być przebyte pandemie wirusów grypy takie jak grypa hiszpańska typ HI NI 1918/1019 r.), która zabiła około 50 milionów ludzi, grypa azjatycka typ H2N2 (1957/1958r), która tylko w samych Stanach Zjednoczonych zabiła ponad 70 000 ludzi. W 1968/69/70 r. miała miejsce pandemia grypy tzw. Grypa HongKong typ H3N2, która tylko w Stanach Zjednoczonych zabiła 34 000 ludzi. Podobna sytuacja miała miejsce również w latach następnych.

W 1997 r. pojawił się wysoce patogenny szczep wirusa typ H5N1, który odznaczał się wysoką śmiertelnością, i tak do maja 2009 r. na 424 ludzi zakażonych wirusem zmarło 261. Szczęśliwie wirus nie był łatwo przenoszony z człowieka na człowieka Wirus ten odznaczał się szczególnymi cechami, infekował nie tylko śmiertelnie kury, lecz również ptactwo wodne, które jest naturalnym nosicielem wirusa grypy. Również śmiertelnie infekował ssaki, w tym świnie i myszki bez uprzedniej adaptacji.

Jak widać z powyższego historycznego zarysu, grypa jest powszechnie występującą chorobą zakaźną o daleko idących konsekwencjach np. w przypadku pojawienia się wysoce patogennego szczepu łatwo przenoszącego się z człowieka na człowieka Przejście infekcji prowadzi najczęściej do eliminacji wirusa, jednakże nie chroni nas to przed kolejnymi zakażeniami innymi szczepami wirusa grypy.

Dotychczasowym sposobem zwalczania grypy, najszerzej stosowanym jest szczepienie profilaktyczne. Jest ono względnie skuteczne u młodych ludzi, ale dużo mniej skuteczne u ludzi powyżej 60 roku życia, a właśnie ci ostatni oraz osoby z defektami immunologicznymi są najbardziej narażeni na komplikacje pogrypowe.

Istnieje również duża grupa dzieci i dorosłych poddanych immunosupresji lub też pozbawionych odporności wskutek leczenia cytostatykami lub poddanych radioterapii. Infekcja grypą stanowi dla nich śmiertelne zagrożenie.

Poza ograniczoną skutecznością szczepień oraz uciążliwością przyjmowania preparatu w postaci iniekcji tzw. wszczepialność średnio wynosi około 10%.

Należy również wspomnieć o dosyć często występujących powikłaniach po szczepieniach, które czasami kończą się śmiercią.

PL 218 248 B1

W ostatnich latach do obrotu dopuszczone zostały dwie grapy leków przeciwgrypowych:

• inhibitory odpłaszczania (blokery kanałów jonowych; amantadyna i rymantadyna; tylko w odniesieniu do wirusa grypy A) oraz inhibitory neuraminidazy (Zanamiwir i Oseltamiwir). Stosowanie tych preparatów jest bardzo ograniczone przez nabywanie oporności wirusów na te leki. Według danych z okresu 2008-2009, 100% wirusów H3N2 było opornych na adamantany, 98,6% wirusów H1N1 na oseltamiwir. Obecnie występujący wirus AJ H1N1pdm09 jest oporny na adamantany, a sporadycznie występuje także oporność na inhibitory neuraminidazy.

Tak więc duża zmienność antygenowa wirusów grypy oraz nabywanie oporności na leki powoduje, że istniejący sposób zapobiegania grypie nie jest wystarczająco skuteczny.

Wynalazek według zgłoszenia oparty jest na zupełnie innym podejściu do rozwiązania problemu, mianowicie wynika z obserwacji, że pewne gatunki ssaków są odporne na infekcje wirusów grypy. Do gatunku tego należą przeżuwacze. W badaniach biochemicznych wykazano, że w płucach i górnych drogach oddechowych wołu występuje względnie duże v-stężenie inhibitora proteaz serynowych - aprotyniny. U świni, gatunku ssaków wrażliwych na infekcje wirusów grypy, w górnych drogach oddechowych i płucach brak jest inhibitora proteaz serynowych o takiej specyficzności, jaką wykazuje aprotynina, która hamuje aktywność trypsyny, chymotrypsyny, plazminy, kalikreiny i pewnych katepsyn. Jak wcześniej już nadmieniono, aby wirus grypy mógł skutecznie dostać się do komórki docelowej gospodarza, musi zaktywować swoje białko powierzchniowe - hemaglutyninę. Ponieważ w swoim genomie nie posiada proteazy serynowej o określonej specyficzności musi posiłkować się protezami gospodarza.

Z naszych badań wynika, że fakt wysokiej ekspresji aprotyniny w górnych drogach oddechowych i płucach jest głównym czynnikiem warunkującym odporność na infekcje wirusów grypy.

Stan techniki.

Podawanie aprotyniny w postaci preparatu areozolowego do leczenia wirusa grypy jest znane ze zgłoszenia patentowego WO 2012/008869 A1.

Podawanie surfactanta płucnego do zapobiegania i leczenia infekcji dróg oddechowych takich jak grypa zostało ujawnione w zgłoszeniu patentowym WO 94/00131 A1.

Mechanizmy działania aprotyniny i surfaktanta płucnego na wirusy grypy opisane przez zgłaszającego znane są z publikacji współautorów:

- Hiroshi Kido i współautorzy: Biol Chem 2004 Nov; 385(11): 1029-34;

- Hiroshi Kido i współautorzy: Curr Pharm Des. 2007; 13(4): 405-14;

- Oleg Zhirnov i współautorzy: Arch Vird. 1994; 135(1-2): 209-16;

- Oleg Zhirkov i współautorzy: Vopv Virusol. 2011 May-Juni; 56(3): 24-8;

- Jiang Shibo i współautorzy: Protein Celi. 2010 Apr. 1(4): 342-54.

Formulacje do podawania jako proszek lub cząsteczki do inhalacji do leczenia lub zmniejszenia zakaźności choroby takiej jak grypa, zostały ujawnione w zgłoszeniach patentowych WO 03/092654 A1 i WO 98/31346.

Przytoczony powyżej stan wiedzy na temat zapobiegania infekcjom grypy nie pokazuje synergizmu i usprawnionej farmakokinetyki działania aprotyniny i surfactanta płucnego przy jednoczesnym ich podaniu, co stanowi nowe rozwiązanie w zapobieganiu infekcjom grypy.

Istota wynalazku.

Wynalazek według zgłoszenia polega na zastosowaniu aprotyniny wraz z surfactantem płucnym do wytwarzania leku zapobiegającego infekcjom wirusów grypy. y Korzystnie lek jest podawany drogą wziewną i korzystnie wytworzony lek podawany jest w postaci proszku. W eksperymentach in vivo wykazano, że zastosowanie aprotyniny wraz z surfactantem było skuteczne przez 8 godzin w dawce cztery razy mniejszej w przeciwieństwie do samej aprotyniny, kiedy to skuteczność ustępowała po dwóch godzinach. Wyniki te świadczą o ewidentnym efekcie synergii tych dwóch substancji.

W eksperymentach in vivo stwierdzono, że aprotynina podawana do górnych dróg oddechowych myszkom DBA/2 (szczepowi bardzo wrażliwemu na wirusa grypy) w ilości 200 KIU zabezpieczała te myszki przed 150 FFU wirusa grypy (HI NI PR6), co stanowiło 5-krotną dawkę LD50 dla tych myszy.

W dalszych badaniach wykazaliśmy, że szczególnie równoczesne podawanie aprotyniny i surfactantu płucnego jest efektywne w profilaktycznym zabezpieczaniu tych myszek przed infekcją grypy.

Efekt synergii działania tych dwóch substancji był zaskakująco wysoki zarówno jeśli chodzi o efektywność działania jak i czas trwania skutecznej ochrony. W eksperymencie in vivo wykazano, że podanie

PL 218 248 B1

KIU aprotyniny razem z 2 mg surfactantu płucnego jest skuteczne w zabezpieczeniu przed 5-krotną dawką LD50 dla wirusa H1N1 PR6.

Wykazano, że zastosowanie aprotyniny razem z surfactantem płucnym było skuteczne przez co najmniej 12 godzin w przeciwieństwie do samej aprotyniny, kiedy to skuteczność ustępowała po 2 godzinach.

Badania według zgłaszanego wynalazku wykazały, że zastosowanie aprotyniny wraz z surfactantem płucnym zdecydowanie zwiększa efektywność działania aprotyniny dając ewidentny efekt synergii oraz kilkakrotnie wydłuża czas działania preparatu. Stanowi to nowe podejście do profilaktycznego zapobiegania infekcjom wirusów grypy.

P r z y k ł a d.

Badania wykonano na myszkach szczepu DB2/2

Pierwszą grupę kontrolną stanowiło 10 myszek tego szczepu, które zainfekowano wirusem grypy PR8 HI NI, który podawano donosowo w dawce 150 FFU (focus forming unit). Ta ilość wirusa stanowi pięciokrotną dawkę LD 50 dla tego szczepu myszek.

Drugą grupę stanowiło 10 myszek, którym podano donosowo 200 KIU (kałhkrein inhibitor units), a następnie po dwóch godzinach 150 FFU wirusa.

Trzecią grupę stanowiło 10 myszek, którym podano 200 KIU aprotyniniy, a po 8 godzinach zainfekowano je 150 FFU wirusa.

Czwartą grupę również stanowiło 10 myszek, którym podano 50 KIU aprotyniny i 0,2 mg surfactantu płucnego, a następnie po dwóch godzinach zainfekowano wirusem w dawkach jak w poprzednich grupach.

Piątej grupie stanowiącej również 10 myszek podano tak jak grupie czwartej czyli 50 KIU aprotyniny i 0,2 mg surfactantu, natomiast infekcję wirusem w dawce 150 FFU dokonano po 8 godzinach.

Stopień natężenia infekcji oceniano poprzez ustalenie spadku wagi zwierząt. Utrata >25% wagi ciała traktowana była jako efekt śmiertelny i zwierzę poddawane było eutanazji. Zwierzęta obserwowano przez 12 dni.

Wyniki badań. Grupa pierwsza kontrolna: badane myszki przeżywały średnio 6 dni. Grupa druga: badane myszki przeżyły 12 dni przy stracie wagi średnio 15%. Grupa trzecia: czas przeżycia średnio 10 dni. Grupa czwarta: czas przeżycia 12 dni bez utraty wagi. Grupa piąta: czas przeżycia 12 dni przy utracie wagi średnio 10%.

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie aprotyniny wraz z surfactantem płucnym do wytwarzania leku zapobiegającego infekcjom wirusów grypy.
2. 2. Zastosowanie według zastrzeżenia 1, znamienne tym, że wytworzony lek podawany jest drogą wziewną.
3. 3. Zastosowanie według zastrzeżenia 1, znamienne tym, że wytworzony lek podawany jest w postaci proszku do inhalacji lub areozolu, jak również poprzez wkraplanie do górnych dróg oddechowych w sposób pozwalający na penetrację leku do górnych dróg oddechowych.