PL217294B1 - Produkt inżynierii tkankowej (PIT) do rekonstrukcji i regeneracji kości (54) oraz sposób otrzymywania produktu inżynierii tkankowej (PIT) do rekonstrukcji i regeneracji kości - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest produkt inżynierii tkankowej (PIT) do rekonstrukcji i regeneracji kości oraz sposób otrzymywania produktu inżynierii tkankowej (PIT) do rekonstrukcji i regeneracji kości.

Zgodnie z Rozporządzeniem (We) Nr 1394/2007 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 13 listopada 2007 r. w sprawie produktów leczniczych terapii zaawansowanej, „produkt inżynierii tkankowej” oznacza produkt, który:

- zawiera zmodyfikowane komórki lub tkanki lub składa się z takich komórek lub tkanek, oraz jest przedstawiany jako produkt posiadający właściwości regeneracji, naprawy lub zastępowania tkanki ludzkiej lub jest stosowany lub podawany ludziom w takim celu. Produkt inżynierii tkankowej może zawierać komórki lub tkanki pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego, lub pochodzące z obu tych źródeł. Komórki lub tkanki mogą być żywotne lub nieżywotne. Może on także zawierać dodatkowe substancje, takie jak produkty komórkowe, biomolekuły, biomateriały, substancje chemiczne, podłoża lub matryce.

Potrzeba regulacji prawnej dotyczącej produktów inżynierii tkankowej wynikła z postępu w badaniach nad nowymi możliwościami substytucji tkanek posiadającymi dodatkowo walor stymulowania tkanki biorcy do regeneracji. Klasyczna definicja inżynierii tkankowej, najczęściej cytowana w piśmiennictwie naukowym z tego zakresu, sformułowana przez R. Langera i J.P. Vacantiego brzmi następująco: interdyscyplinarna dziedzina angażująca wiedzę z zakresu nauk przyrodniczych oraz inżynierską metodologię w celu uzyskania biologicznych substytutów służących odtworzeniu, podtrzymaniu lub ulepszeniu funkcji tkanek. Produkt inżynierii tkankowej (nazywany dalej w skrócie: PIT) stanowi nową możliwość substytucji tkanek, stanowiącą alternatywę dla autograftów, allograftów i biomateriałów, tj. rozwiązań stosowanych obecnie w medycynie rekonstrukcyjnej. Najczęściej pod pojęciem PIT rozumiany jest produkt składający się z rusztowania (ang.: scaffold) wykonanego z materiału pochodzenia naturalnego bądź wytworzonego przez człowieka, stanowiącego wypełnienie dla brakujących fragmentów tkanki będącego jednocześnie podłożem dla żywych komórek lub tkanek, które stanowią drugi element składowy PIT.

Jeśli chodzi o materiały ceramiczne, z jakich wykonuje się dotychczas implanty z przeznaczeniem do rekonstrukcji kości przygotowywane są one głównie w oparciu o ceramiki fosforanowowapniowe. Jest to podyktowane największym podobieństwem składu chemicznego tych materiałów do naturalnego minerału kostnego. Niestety, wbrew oczekiwaniom, przebudowa takich materiałów w tkance kostnej postępuje bardzo wolno. Doniesienia w czasopismach fachowych wskazują na to, że materiały ceramiczne tego typu pozostają niezresorbowane nawet po okresie dłuższym niż pięć lat od implantacji PIT do tkanek biorcy (Mastrogiacomo, M., A. Muraglia, et al. (2005). “Tissue engineering of bone: search for better scaffold.” Orthod Craniofac Res 8(4):277-84).

Z drugiej strony bardzo zachęcające są wyniki implantacji do tkanki kostnej wszczepów z szkieletu koralowców madreporowych (chemicznie - węglan wapnia) wskazujące, że resorpcja materiału po implantacji śródkostnej jest obserwowana po kilku-kilkunastu miesiącach i, co ważniejsze, stwierdzano po tym czasie obecność tkanki kostnej odtworzonej na podłożu zanikającego w wyniku resorpcji tego rodzaju wszczepu. Efekt ten był jeszcze bardziej zadowalający, gdy na rusztowaniu z koralowca osadzano przed implantacją żywe komórki o potencjale osteogennym (Zhu, L., W. Liu, et al. (2006). Tissue- engineered bone repair of goat-femur defects with osteogenically induced bone marrow stromal cells. Tissue Enq 12(3): 423-33).

Żywe komórki osadzane były na rusztowaniu w warunkach statycznych, czyli przez zwykłe nanoszenie i wypełnianie porów koralowca komórkami. Komórki te wykazywały po naniesieniu na rusztowanie zdolność do przeżycia. Nie jest znany mechanizm podtrzymywania żywotności komórek przez rusztowanie z koralowca. Być może specyficzny skład koralowców madreporowych, które zbudowane są głównie, ale nie jedynie, z węglanu wapnia, sprzyjał podtrzymaniu życia komórek.

Poważnym ograniczeniem w stosowaniu szkieletu koralowca, jako materiału implantacyjnego jest, po pierwsze, ograniczona dostępność tego materiału, będącego produktem koralowców, po drugie zaś, słaba powtarzalność charakterystyki materiałowej, właściwa materiałom pochodzenia naturalnego.

Znany jest z polskiego zgłoszenia patentowego nr P-352601 sposób wytwarzania implantu ceramicznego wykonanego z syntetycznego węglanu wapnia. Zgłaszający odwołują się do doświadczeń wykonanych na zwierzętach potwierdzających dobrą tolerancję tkanek względem otrzymanych materiałów po implantacji in vivo.

PL 217 294 B1

Znany jest z polskiego zgłoszenia patentowego nr P-352600 sposób wytwarzania porowatego tworzywa ceramicznego, zwłaszcza na implanty, którego zarówno właściwości fizyczne jak i struktura porowata umożliwiają przerośnięcie tkanką kostną po implantacji.

Oba cytowane powyżej zgłoszenia doprowadziły do opracowania sposobu otrzymania materiału opartego w co najmniej 90% na węglanie wapnia, czyli materiale bardzo zbliżonym zarówno składem jak i strukturą do szkieletu koralowców. Implant otrzymany takim sposobem doskonale zastępuje ubytki kości i jest resorbowalny w zadawalającym czasie. Wykorzystuje się tu naturalną zdolność organizmu do odbudowy ubytków kości. A odbudowana tkanka wypełnia miejsca po resorbowalnym implancie. Aby tego typu syntetyczny węglan wapnia mógł być zaliczony do kategorii produktu inżynierii tkankowej musiałby zawierać naniesione żywe komórki osteogenne. Komórki te w znaczący sposób przyspieszają rekonstrukcję ubytków kości. Oprócz sił własnych organizmu implant dostarczałby dodatkowe żywe komórki zdolne do proliferacji, a co za tym idzie przyspieszałby proces regeneracji kości. Materiał ten został zbadany pod kątem możliwości zastosowania go jako produktu inżynierii tkankowej. Przeprowadzone wstępne doświadczenia nad możliwością zasiedlania porowatych rusztowań z syntetycznego węglanu wapnia żywymi komórkami o potencjale osteogennym pokazały, że proces ten, prowadzony w warunkach standardowej hodowli komórek in vitro, prowadzi do śmierci komórek. Okazało się, że mimo wysokiego podobieństwa do naturalnego koralowca zbudowanego również głównie z węglanu wapnia, komórki o potencjale osteogennym obumierają na syntetycznym węglanie wapnia. Jest prawdopodobne, że otrzymany w znany sposób syntetyczny węglan wapnia, który zawiera nie więcej niż 10% domieszek, posiada, właśnie przez obecność tych domieszek, właściwości niszczące żywe komórki. Prawdopodobnie z tych właśnie powodów dotychczas nie opisano zastosowania klinicznego syntetycznego węglanu wapnia w rekonstrukcji tkanki kostnej. Nie opisano także próby zastosowania rusztowania wykonanego z syntetycznego węglanu wapnia do otrzymania PIT kości.

Celem wynalazku jest opracowanie produktu inżynierii tkankowej (PIT) do rekonstrukcji i regeneracji kości oraz sposobu otrzymywania produktu inżynierii tkankowej (PIT) do rekonstrukcji i regeneracji kości opartego o rusztowanie z węglanu wapnia otrzymanego według znanych sposobów a równocześnie dostarczającego do organizmu żywe komórki o potencjale osteogennym.

Produkt inżynierii tkankowej (PIT) do rekonstrukcji i regeneracji kości składa się z rusztowania wykonanego w postaci trójwymiarowej, wykonanej z syntetycznego węglanu wapnia kształtki o porowatości otwartej, na którym w warunkach hodowli dynamicznej osadzone są żywe komórki osteogenne, korzystnie komórki biorcy PIT i ewentualnie elementy macierzy pozakomórkowej wytworzone przez te komórki w przedłużonej hodowli. Stosuje się syntetyczny węglan wapnia o zawartości domieszek nie większej niż 10% i o porowatości otwartej, korzystnie o porowatości otwartej od 40% do 95%, przy czym pory mają wielkość od 100 do 500 pm i są połączone między sobą. Węglan wapnia, z którego wykonane jest rusztowanie ma dowolną postać krystalograficzną, korzystnie postać kalcytu lub aragonitu.

Sposób według wynalazku polega na tym, że sporządza się rusztowanie, tj. trójwymiarową, wykonaną z węglanu wapnia kształtkę o porowatości otwartej, na którym w warunkach hodowli dynamicznej osadza się żywe komórki z możliwością kontynuowania tej hodowli uzyskując w ten sposób produkt inżynierii tkankowej, który może być zastosowany do substytucji tkanki kostnej. Stosuje się syntetyczny węglan wapnia o zawartości domieszek nie większej niż 10% i o porowatości otwartej, korzystnie o porowatości otwartej od 40% do 95%, przy czym pory mają wielkość od 100 do 500 pm i są połączone między sobą. Węglan wapnia, z którego wykonane jest rusztowanie ma dowolną postać krystalograficzną, korzystnie postać kalcytu lub aragonitu. Komórki osteogenne są otrzymywane z materiału biologicznego pochodzącego od dawcy, korzystnie będącego równocześnie biorcą PIT tj. mające pochodzenie autogenne. Po izolacji, namnażaniu i ewentualnym różnicowaniu w hodowli in vitro odrywane są od podłoża a następnie w warunkach dynamicznych, tj. z zastosowaniem urządzenia zapewniającego przepływ pożywki przez urządzenie w obiegu zamkniętym, osadzane są na podłożu rusztowania. W tym celu rusztowanie zostaje umieszczone w urządzeniu, zaś komórki dodawane są w postaci zawiesiny w dużej objętości medium hodowlanego o składzie dostosowanym do typu komórek tak, że rusztowanie jest omywane pozostającym w ruchu medium zawierającym komórki. Po osadzeniu komórek w rusztowaniu, tj. po czasie niezbędnym do rozpłaszczenia się komórek na podłożu rusztowania z węglanu wapnia uzyskany produkt hybrydowy może być poddany implantacji do tkanek biorcy, lub utrzymywany w hodowli o stale podtrzymywanym ruchu medium przez dłuższy czas w celu zwiększenia populacji komórek przez ich proliferację na podłożu rusztowania i ewentualną produkcję przez te komórki elementów macierzy pozakomórkowej. Korzystnie jest po uzyskaniu osa4

PL 217 294 B1 dzenia się komórek na rusztowaniu z węglanu wapnia usunąć stosowaną dotychczas pożywkę i zastąpić ją świeżą. Etap wymiany pożywki może być stosowany kilkukrotnie. Uzyskana konstrukcja hybrydowa złożona z rusztowania, osadzonych w nim komórek i ewentualnie elementów macierzy pozakomórkowej wytworzonych przez te komórki w przedłużonej hodowli, stanowi gotowy do implantacji produkt inżynierii tkankowej do rekonstrukcji tkanki kostnej o potencjale w kierunku pobudzenia tkanki kostnej biorcy do regeneracji.

Zastosowanie dynamicznych warunków hodowli zmienia zupełnie odpowiedz komórek. Okazało się, że komórki poddane hodowli w dynamicznych warunkach zachowują swoją żywotność, co potwierdzono w ilościowych testach przeżywalności komórek. W podobnych testach wykazano, że liczba komórek zwiększa się z czasem trwania dynamicznej hodowli na podłożu rusztowania z węglanu wapnia. Stwierdzono również, że dzięki zastosowaniu dynamicznych warunków hodowli możliwe jest równomierne rozmieszczenie komórek w całej objętości dużego rusztowania (np. o średnicy 15 mm i wysokości 5 mm). Rozmieszczenie komórek w rusztowaniu zostało określone i potwierdzone dzięki użyciu technik fluorescencyjnych i uwidocznieniu komórek w mikroskopie fluorescencyjnym.

Komórki osteogenne osadzone w dynamicznych warunkach na podłożu z węglanu wapnia zachowują swój fenotyp (tj. charakterystykę właściwą dla komórek osteogennych), który nie ulega zmianie w czasie hodowli. Charakterystyczny fenotyp komórek został potwierdzony nowoczesnymi metodami biologii molekularnej (RT-PCR).

Stwierdzono, że komórki osteogenne poddane długoterminowej hodowli w warunkach dynamicznych tworzą nową tkankę wewnątrz porów rusztowania. Fakt ten został potwierdzony dzięki obserwacjom wykonanym w skaningowym mikroskopie elektronowym. Ponadto stwierdzono, że nowo powstały produkt zbudowany z rusztowania z węglanu wapnia oraz powstałej w jego wnętrzu tkanki ma nowe właściwości mechaniczne. Mianowicie, nowo-otrzymany produkt ma wyższą wytrzymałość mechaniczną na ściskanie w porównaniu do pustego (niezasiedlonego komórkami) rusztowania. Wynik taki został potwierdzony mechanicznymi testami wytrzymałościowymi przeprowadzonymi na dużych próbkach wykonanych z węglanu wapnia i zilustrowany na rysunku.

Rysunek. Wykres przedstawia wytrzymałość na ściskanie 3D próbek kalcytowych oraz hybrydowego materiału zbudowanego w 3D kalcytu i osadzonych na nim komórek osteogennych.

Dobre właściwości nowego produktu zbudowanego z rusztowania węglanowego oraz osadzonych na nim komórek potwierdzono również w doświadczeniach wykonanych na zwierzętach. Stwierdzono, że po zaimplantowaniu podskórnie u myszy produktu zbudowanego z rusztowania węglanowego oraz osadzonych na nim komórek, dochodzi do powstania w jego wnętrzu tkanki kostnej. Natomiast w przypadku implantacji samych rusztowań efektu tego nie stwierdzono. Obserwacje te zostały potwierdzone metodami histologicznymi oraz fizycznymi.

P r z y k ł a d I. Komórki są izolowane z małych fragmentów tkanki kostnej biorcy (eksplantów) poprzez oczyszczenie mechaniczne w celu usunięcia wszelkich innych poza kostną rodzajów tkanki, rozdrobnienie tych fragmentów na kawałki o wielości ok. 1 mm a następnie poddanie trawieniu enzymatycznemu w roztworze kolagenazy w temp. 37°C przez noc. Tkanki, które uległy strawieniu są następnie usuwane, fragmenty kości zostają przepłukane w roztworze PBS a następnie umieszczone w butelkach hodowlanych w medium hodowlanym o następującym składzie: podłoże DMEM (GIBCO BRL nr katalogowy 22320) wzbogacone inaktywowanym płodowym osoczem bydlęcym (FCS) w stęPL 217 294 B1 żeniu 10%, z dodatkiem antybiotyku w postaci preparatu Antibiotic-Antimycotic (Preparat firmy GIBCO, nr kat.: 15240096, zawierający 10,000 jedn. penicyliny - z wykorzystaniem soli sodowej, tj. peniciliny G, 10,000 pg streptomycyny- z wykorzystaniem siarczanu streptomycyny) i 25 pg amfoteryczny B/ml - w postaci przeciwgrzybiczego preparatu Fungizone® w 0.85% roztworze soli) w stężeniu 1%, L-glutaminy w stężeniu 2 mM (GIBCO BRL), oraz witaminy C w stężeniu 100 pM w postaci kwasu L-fosfo-askorbinowego (SIGMA). Wszystkie elementy procedury prowadzone są w warunkach jałowych. Hodowla prowadzona jest następnie w inkubatorze o stałej wilgotności powyżej 95%, temperaturze 37°C i obecności 5% dwutlenku węgla. Po uzyskaniu konfluencji, komórki są odrywane od podłoża przez trawienie trypsyną a następnie wirowane, liczone w kamerze hematologicznej i zawieszane w pożywce j.w. Jałowe (w wyniku sterylizacji radiacyjnej dawką 25 kGy) rusztowanie w postaci kształtki o porowatości otwartej 75% i średniej wielkości porów ok. 200 pm wykonane z węglanu wapnia w postaci krystalograficznej kalcytu jest inkubowane w pożywce hodowlanej o składzie j.w. przez 48 godzin z lekkim mieszaniem, celem ew. odpłukania resztek-pozostałości procesu technologicznego oraz zwilżenia rusztowania świeżą pożywką hodowlaną bezpośrednio przed założeniem na jego podłożu hodowli komórek. Następnie rusztowanie umieszczane jest w koszyczku w urządzeniu o wymuszonym ciągłym przepływie medium hodowlanego, po czym do urządzenia dodawana jest zawiesina komórek w medium hodowlanym (w dużej objętości medium, korzystnie w 500 ml) w gęstości wg pro₃ porcji - 400 tys. komórek na rusztowanie o kubaturze 125 mm³. Następnie cały układ zostaje umieszczony w inkubatorze o stałej wilgotności powyżej 95%, temperaturze 37°C i obecności 5% dwutlenku węgla. Hodowla trwa 14 dni, cały czas w warunkach ciągłego ruchu medium hodowlanego, przy czym po 7 dniach pożywka zostaje wymieniona na świeże medium o tym samym składzie. Po 14 dniach od momentu założenia hodowli uzyskuje się gotowy do implantacji produkt inżynierii tkankowej w postaci kalcytowego rusztowania zasiedlonego komórkami osteogennymi biorcy.

P r z y k ł a d II. Komórki izolowane są ze szpiku kostnego biorcy, przy czym rozdział komórek przeprowadza się metodą wirowania w Ficollu. Uzyskaną populację komórek umieszcza się w butelkach hodowlanych w medium hodowlanym o następującym składzie: podłoże DMEM (GIBCO BRL) wzbogacone inaktywowanym płodowym osoczem bydlęcym (FCS) w stężeniu 20%, z dodatkiem antybiotyku w postaci preparatu Antibiotic-Antimycotic (Preparat firmy GIBCO, nr kat.: 15240096, zawierający 10,000 jedn. penicyliny - z wykorzystaniem soli sodowej, tj. peniciliny G, 10,000 pg streptomycyny-z wykorzystaniem siarczanu streptomycyny) i 25 pg amfoterycynyB/ml - w postaci przeciwgrzybiczego preparatu Fungizone® w 0,85% roztworze soli) w stężeniu 1%, L-glutaminy w stężeniu 2 mM (GIBCO BRL). Hodowlę prowadzi się w inkubatorze o stałej wilgotności powyżej 95%, temperaturze 37°C i obecności 5% dwutlenku węgla aż do uzyskania konfluencji wymieniając pożywkę co 2-3 dni, za każdym razem odpłukując nieprzylegające komórki. Po uzyskaniu konfluencji, komórki są odrywane od podłoża przez trawienie trypsyną a następnie wirowane, liczone w kamerze hematologicznej i zawieszane w pożywce o składzie j.w. wzbogaconej obecnością witaminy C w stężeniu 100 pM w postaci kwasu L-fosfo-askorbinowego (SIGMA), oraz dexametazonu (Sigma) w stężeniu 10 nM. Wszystkie elementy procedury prowadzone są w warunkach jałowych. Jałowe (w wyniku sterylizacji radiacyjnej dawką 25 kGy) rusztowanie w postaci kształtki o porowatości otwartej 82% i średniej wielkości porów ok. 350 pm wykonane z węglanu wapnia w postaci krystalograficznej kalcytu jest inkubowane w pożywce hodowlanej o składzie j.w. przez 48 godzin z lekkim mieszaniem, celem ew. odpłukania resztek-pozostałości procesu technologicznego oraz zwilżenia rusztowania świeżą pożywką hodowlaną bezpośrednio przed założeniem na jego podłożu hodowli komórek. Następnie rusztowanie umieszczane jest w koszyczku w urządzeniu o wymuszonym ciągłym przepływie medium hodowlanego, po czym do urządzenia dodawana jest zawiesina komórek w medium hodowlanym (w dużej objętości medium, korzystnie w 500 ml) w gęstości wg proporcji - 400 tys. komórek na rusztowanie o kuba₃ turze 125 mm³. Następnie cały układ zostaje umieszczony w inkubatorze o stałej wilgotności powyżej 95%, temperaturze 37°C i obecności 5% dwutlenku węgla. Hodowla trwa 14 dni, cały czas w warunkach ciągłego ruchu medium hodowlanego, przy czym po 7 dniach pożywka zostaje wymieniona na świeże medium o tym samym składzie. Po 14 dniach od momentu założenia hodowli uzyskuje się gotowy do implantacji produkt inżynierii tkankowej w postaci kalcytowego rusztowania zasiedlonego komórkami osteogennymi biorcy.

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Produkt inżynierii tkankowej (PIT) do rekonstrukcji i regeneracji kości, składający się z trójwymiarowego rusztowania na bazie węglanu wapnia z osadzonymi żywymi komórkami osteogennymi, znamienny tym, że stosuje się syntetyczny węglan wapnia o zawartości domieszek nie większej niż 10% i o porowatości otwartej, korzystnie o porowatości otwartej od 40% do 95%, przy czym pory mają wielkość od 100 do 500 pm i są połączone między sobą, na którym w warunkach hodowli dynamicznej osadzone są żywe komórki osteogenne, korzystnie otrzymane z materiału biologicznego pochodzącego od dawcy będącego równocześnie biorcą PIT i ewentualnie elementy macierzy pozakomórkowej wytworzone przez te komórki w przedłużonej hodowli.
2. 2. Produkt według zastrz. 1, znamienny tym, że jako węglan wapnia stosuje się kalcyt lub aragonit.
3. 3. Sposób otrzymywania produktu inżynierii tkankowej (PIT) do rekonstrukcji i regeneracji kości, polegający na osadzeniu żywych komórek osteogennych na rusztowaniu na bazie węglanu wapnia, znamienny tym, że sporządza się trójwymiarowe rusztowanie wykonane z syntetycznego węglanu wapnia, na którym w warunkach hodowli dynamicznej osadza się żywe komórki osteogenne, przy czym stosuje się syntetyczny węglan wapnia o zawartości domieszek nie większej niż 10% i o porowatości otwartej, korzystnie o porowatości otwartej od 40% do 95%, przy czym pory mają wielkość od 100 do 500 pm i są połączone między sobą a komórki osteogenne korzystnie są otrzymywane z materiału biologicznego pochodzącego od dawcy będącego równocześnie biorcą PITa po izolacji, namnażaniu i ewentualnym różnicowaniu w hodowli in vitro odrywane są od podłoża a następnie w warunkach dynamicznych z zastosowaniem urządzenia zapewniającego przepływ pożywki przez urządzenie w obiegu zamkniętym, osadzane są na podłożu rusztowania, przy czym komórki dodawane są w postaci zawiesiny w dużej objętości medium hodowlanego o składzie dostosowanym do typu komórek tak, że rusztowanie jest omywane pozostającym w ruchu medium zawierającym komórki, po czym po osadzeniu komórek w rusztowaniu, tj. po czasie niezbędnym do rozpłaszczenia się komórek na podłożu rusztowania z węglanu wapnia uzyskany produkt hybrydowy może być poddany implantacji do tkanek biorcy, lub utrzymywany w hodowli o stale podtrzymywanym ruchu medium przez dłuższy czas.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że po uzyskaniu osadzenia się komórek na rusztowaniu z węglanu wapnia usuwa się stosowaną dotychczas pożywkę i zastępuje ją świeżą.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że wymianę pożywki stosuje się kilkukrotnie.
6. 6. Sposób według któregokolwiek z zastrz. od 3 do 5, znamienny tym, że jako węglan wapnia stosuje się kalcyt lub aragonit.