PL223475B1 - Sposób otrzymywania produktu inżynierii tkankowej do rekonstrukcji i regeneracji tkanki kostnej i produkt inżynierii tkankowej - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania produktu inżynierii tkankowej do rekonstrukcji i regeneracji tkanki kostnej i produkt inżynierii tkankowej. Bardziej szczegółowo wynalazek przedstawia sposób wytwarzania produktu inżynierii tkankowej w warunkach hodowli komórek in vitro na podłożu materiału resorbowalnego. Produkt jest złożony prawie całkowicie ze składników naturalnych, wytworzonych przez naniesione na materiał komórki. Jeżeli komórki pochodzą od dawcy, który jest jednocześnie biorcą wszczepu, produkt taki jest zbudowany wyłącznie z jego własnego materiału biologicznego. Taki skład zapewnia pełną zgodność immunologiczną, która nie występuje w przypadku przeszczepów materiału biologicznego pochodzącego od obcego dawcy lub, co często się zdarza w aktualnej praktyce klinicznej, materiał biologiczny jest pochodzenia zwierzęcego.

Efektywna regeneracja ubytków kości jest kluczowym zagadnieniem klinicznym [1-4]. Ubytki w kościach powstają najczęściej w wyniku zapalnych zmian osteolitycznych, chirurgicznego usunięcia guzów nowotworowych czy patologicznej regeneracji złamań. Potrzeba regeneracji kości dotyczy pacjentów leczonych metodami chirurgii onkologicznej, ortopedii, laryngologii. Kontrolowana nadbudowa kości jest niezbędna także przy operacjach odtwórczych stosowanych w chirurgii szczękowotwarzowej.

W praktyce klinicznej stosuje się nie w pełni satysfakcjonujące metody wspomagania regeneracji kości lub utrzymywania jej funkcji mechanicznych. Złotym standardem jest autologiczny przeszczep kości [5-7]. Jest to fragment własnej kości pacjenta pobrany ze miejsca zdrowego i wprowadzony w miejsce ubytku. Taka transplantacja gwarantuje odtworzenie się tkanki w miejscu uszkodzenia, nie jest z nią związania reakcja immunologiczna przeciw przeszczepowi ani ryzyko przeniesienia zakażeń [8]. Niestety wykorzystanie tej metody wiąże się z przeprowadzeniem dwustopniowej operacji u danego pacjenta i okaleczenia w miejscu pobrania [9, 10]. Alternatywną techniką wykorzystywaną klinicznie jest wprowadzenie do ubytku wszczepu allogennego, czyli kości pobranej od dawcy, najczęściej zmarłego [11]. Istnieje wtedy ryzyko przeniesienia zakażeń od dawcy do biorcy i nie jest zagwarantowana regeneracja tkanki w miejscu ubytku. Powszechne jest też użycie syntetycznych materiałów (ceramik, polimerów lub metali) jako wypełniaczy oraz czynników wzrostu osadzonych na materiałach wspomagających regenerację tkanek [12]. Ważna jest w takim wypadku odpowiednia biokompatybilność materiałów, ich właściwości mechaniczne, a także integracja z prawidłowymi tkankami. Niestety nie ma dostępnego materiału, który spełniałby wszystkie powyższe wymagania.

W odpowiedzi na zapotrzebowanie kliniczne i dotychczas niesatysfakcjonujące metody regeneracji ubytków kości powstała nowa interdyscyplinarna dziedzina medycyny regeneracyjnej, jaką jest inżynieria tkankowa. Z definicji celem inżynierii tkankowej jest stworzenie substytutów biologicznych do odbudowy, utrzymania lub ulepszenia funkcji tkanek [13]. Produktami inżynierii tkankowej mogą być żywe, zmodyfikowane lub nie, komórki zdolne spełniać wymaganą funkcję odtwórczą, czynniki wzrostu lub komórki osadzone w podłożu. Produktem inżynierii tkankowej kości będzie zatem każda struktura zbudowana z nośnika, w którym umieszczone są komórki osteogenne lub np. czynniki wzrostu aktywne w stosunku do tkanki kostnej uwalnianie z biomateriałów [14]. Takie produkty mogą być przygotowywane w czasie hodowli komórek w warunkach in vitro przed operacją danego pacjenta

[15], przygotowywane w czasie operacji (np. poprzez połączenie wszczepianego rusztowania z k omórkami izolowanymi ze szpiku kostnego [16] lub z bogato płytkowym osoczem [17, 18]) albo przeszczepiane do ciała pacjenta struktury wytworzonej w jego ciele, „inkubatorze”, przed właściwą oper acją odtwórczą kości [19, 20]. W inżynierii tkankowej kości szczególną uwagę zwraca się na wytrzymałość produktu odpowiednią dla miejsca jego przeznaczenia. Większość produktów otrzymanych na podłożu dostępnych biomateriałów, np. ceramik oraz polimerów, ze względu np. na kruchość, jest przeszczepiana w rejony tkanki kostnej nieprzenoszące wysokich obciążeń. Produkt inżynierii tkank owej (Tissue Engineered Product - TEP) jest pojęciem prawnym wprowadzonym w dyrektywie Komisji Europejskiej: Nr 1394/2007 (Produkty lecznicze terapii zaawansowanej), regulującej m.in. zasady wprowadzania produktów tego typu na rynek.

Żywą część wszczepu przeznaczonego do regeneracji kości stanowią komórki, które pochodzą najczęściej z własnego organizmu pacjenta. Zadaniem komórek osadzonych w rusztowaniach jest wytwarzanie tkanki lub czynników pobudzających okoliczne tkanki do regeneracji miejsca uszkodzenia po wszczepieniu. W danym układzie doświadczalnym musi być zagwarantowane prawidłowe osadzenie komórek oraz możliwość wytworzenia przez nie charakterystycznego fenotypu, czyli zróżnicowania w kierunku komórek osteogennych. W pełni aktywne komórki osteogenne syntetyzują charakteryPL 223 475 B1 styczne składniki macierzy pozakomórkowej, głównie kolagen typu I. W doświadczeniach wykorzystuje się prekursorowe komórki osteogenne izolowane z tkanki kostnej [21] lub komórki macierzyste mezenchymalne izolowane ze szpiku kostnego [22], tkanki tłuszczowej [23] czy błon płodowych/pępowiny [24, 25].

Trójwymiarowy charakter wzrostu tkanki kostnej, tworzonej przez komórki, zapewniają rusztowania zbudowane z materiałów syntetycznych lub naturalnych. W inżynierii tkankowej kości bierze się najczęściej pod uwagę materiały ceramiczne lub polimerowe, a także ich kompozyty. Dużą uwagę zwraca się obecnie na materiały degradowalne, które zanikają w określonym czasie po wszczepieniu [26]. Degradowalne poliestry, takie jak polimery kwasu mlekowego lub glikolowego, są przyjęte do użycia klinicznego jako materiały wszczepialne (nici chirurgiczne, śruby ortopedyczne) [27]. Z tego też względu są szeroko badane jako podłoża dla inżynierii tkankowej [28]. Do produkcji rusztowań dla inżynierii tkankowej najczęściej wykorzystuje się polimer kwasu mlekowego (PLA), polimer kwasu L-mlekowego (PLLA) lub ich kopolimery z kwasem glikolowym (PL(L)GA) [29, 30]. Najważniejszą korzyścią wynikającą z użycia wymienionych poliestrów jest to, że produkty degradacji materiałów (kwas mlekowy lub glikolowy) są metabolizowane (resorbowane) w przebiegu naturalnych przemian metabolicznych [31]. Mniej korzystną cechą charakterystyczną tych materiałów jest ich niska wytrzymałość oraz mała wydajność przylegania do nich komórek osteogennych w hodowlach in vitro.

Trwają prace doświadczalne nad optymalizacją rusztowań polimerowych wykorzystujące zarówno zmiany w ich składzie, jak i architekturze [32]. Różne stosunki składu kopolimerów polikwasu mlekowego oraz polikwasu glikolowego (PLA i PGA) oraz napełniacze np. cząstki nieorganiczne, takie jak fosforany/węglany wapnia, związki krzemu, mają korzystnie wpłynąć na cechy materiałów jako rusztowań dla inżynierii tkankowej [33-36]. Takie zmiany mogą potęgować różnicowanie się komórek w kierunku w pełni aktywnych komórek osteogennych [37-39]. Modyfikacja materiałów kolagenem [40, 41], przyłączanie reszt aminowych [42], tworzenie struktur o większym powinowactwie do połączeń z białkami [43] zwiększają przyleganie komórek do powierzchni polimerów. Wytrzymałość materiałów zwiększa się dodając do nich nanocząstki (np. nanorurki węglowe [44]).

Udowodniono, że architektura podłoża ma istotne znaczenie dla znajdujących się w nim komórek osteogennych. Budowa włóknista podłoża zwiększa proliferację i różnicowanie komórek osteogennych w kontakcie z nim, zapewne poprzez podobieństwo do włókien w strukturze natywnej tkanki kostnej. Udowodniono, że nanometryczny charakter włókien rusztowania wzmaga różnicowanie i m ineralizację osteoblastów [45], że sposób uporządkowania włókien i ich średnica mają wpływ na rozpłaszczanie, proliferację i różnicowanie osteoblastów [46]. Opracowano metodę produkcji (elektrospining) rusztowań zbudowanych z włókien polimerów i ich modyfikacji, dzięki której otrzymuje się trójwymiarowe struktury o różnych wymiarach włókien i porów [47, 48].

Ważnym elementem praktycznego wykorzystania polimerów jako wszczepialnych podłoży dla inżynierii tkankowej kości jest ich prawidłowa sterylizacja. Wybór rodzaju sterylizacji ma znaczący wpływ na kształt próbki, ciężar cząsteczkowy polimeru, a przez to też na cytotoksyczność materiału [49-51].

Opisane metody optymalizacji materiałów pod względem zmian w ich składzie, architekturze i sposobu sterylizacji mają dodatkowo korzystnie wpłynąć na szybkość i charakter degradacji rusztowań [35, 52-56]. Szybkość degradacji materiału syntetycznego po wszczepieniu jest najczęściej nieprzewidywalna, a bardzo istotna klinicznie dla prawidłowego działania wprowadzonego wszczepu. Nadmiar produktów degradacji (kwasów mlekowego i glikolowego) obniża przeżywalność wszczepionych komórek i działa toksycznie na okoliczne tkanki poprzez silne obniżenie pH w rejonie wszczepu [57-59]. Na przykład u około 6% pacjentów wystąpiła reakcja wokół ciała obcego w miejscu implantacji materiałów poliestrowych do kości [57]. Mimo to, klasyczne wykorzystanie produktów inżynierii tkankowej, otrzymywanych na podłożach poliestrowych, przewiduje degradację materiałów po wszczepieniu produktów do ciała pacjenta.

W 2000 roku w pracy poglądowej Hutmacher wyróżnił jako możliwe dwie strategie otrzymywania produktu inżynierii tkankowej na podłożu materiałów degradowalnych [60]. W pierwszej rusztowanie-podłoże do transplantacji komórek stanowi zasadniczą, (tj. funkcjonalną w znaczeniu kształtu i wytrzymałości) część wypełnienia ubytku tkankowego od momentu zasiedlenia komórkami poza ustrojem (in vitro) aż do momentu zastąpienia tkanką biorcy odtwarzającą się po implantacji. Natomiast zgodnie z drugą strategią tkanka (uzyskana in vitro w bioreaktorze) poprzez wytworzenie macierzy pozakomórkowej przez komórki rozmieszczone w rusztowaniu, w znacznym stopniu zastępuje degradujące rusztowanie tak, że jest zdolna do przenoszenia obciążeń mechanicznych, które wyj4

PL 223 475 B1 ściowo przenosi rusztowanie. W cytowanej pracy podane są odnośniki do prac pokazujących prace doświadczalne na rzecz drugiej strategii, opublikowane w nich wyniki są jednak bardzo odległym do niej odniesieniem.

Długotrwałe hodowle komórek na materiałach resorbowalnych były przeprowadzane dotyc hczas przez grupy badawcze zajmujące się inżynierią tkankową naczyń krwionośnych i zastawek [61, 62], chrząstki [63, 64] oraz kości [65, 66]. Wykazano na przykład wzmożone różnicowanie linii komórek osteogennych (hFOB), któremu towarzyszył 70% ubytek podłoża zbudowanego z kolagenu i glikozaminoglikanów (składniki naturalne) po 5 tygodniach hodowli in vitro [65]. Po 12 tygodniach hodowli tkanki chrzęstnej na podłożu poliglikolidu otrzymano strukturę tkankową o wytrzymałości m echanicznej równej 40% tkanki natywnej [63].

Wytwarzanie produktu inżynierii tkankowej w czasie długotrwałej hodowli in vitro, wymaga wspomagania komórek osadzonych na zanikającym rusztowaniu, do tworzenia tkanki. Głównym składnikiem macierzy pozakomórkowej tkanki kostnej jest kolagen typu I. Wspomaganie produkcji kolagenu uzyskuje się eksperymentalnie przez dodawanie związków biochemicznych, takich jak np. kwas askorbinowy [67, 68], czynniki wzrostu dodawane do pożywek hodowlanych lub uwalniane sto pniowo z rusztowań [65, 69] lub poprzez mechaniczną stymulację komórek [70]. Bardzo silnym fizjologicznym stymulatorem syntezy i dojrzewania kolagenu jest kwas mlekowy, wytwarzany w wysokich stężeniach w ranach lub niedotlenionych tkankach [71, 72]. Stymulujący efekt działania kwasu mlekowego na produkcję kolagenu był dotychczas potwierdzony w hodowlach fibroblastów in vitro [73-75]. Kolagen I był np. syntetyzowany w ilości o 70% większej w hodowlach fibroblastów ścięgna po dod aniu do pożywek kwasu mlekowego niż w hodowlach kontrolnych [76].

Dotychczas wpływ kwasu mlekowego, dodawanego lub uwalnianego z podłoży resorbowalnych, na syntezę kolagenu I przez komórki osteogenne nie był badany. Udowodniono jedynie wpływ ham owania syntezy czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) przez kwas mlekowy w hodowlach osteoblastów in vitro [77], w przeciwieństwie do innych, stymulowanych kwasem populacji komórek (komórki śródbłonka [78], makrofagi [79]).

W zgłoszeniu patentowym WO2009076594 (opubl. 2009-06-18) opisano kompozyty kostne/kolagenowe oraz ich zastosowanie. Kompozyt obejmuje kość i kolagen, przy czym kolagen jest traktowany kwasem, po czym sieciowany poprzez odwodnienie termiczne pod ciśnieniem powyżej 40 MPa, bądź pod działaniem czynnika sieciującego (pochodnej kwasu cytrynowego).

W zgłoszeniach patentowych US20040037813 (opubl. 2004-02-26), US20080038352 (opubl. 2008-02-14) opisano kolagen otrzymany metodą elektroprzędzenia, sposób jego wytwarzania oraz zastosowanie do formowania tkanek metodami inżynierii tkankowej. Tkanka wytwarzana metodami inżynierii tkankowej może obejmować wytwarzanie syntetyczne określonych organów lub tkanek, które mogą być implantowane do organizmu biorcy. Kolagen może być także połączony z innymi cząsteczkami, których zadaniem jest dostarczenie substancji do obszaru implantacji wytworzonego kolagenu. Kolagen bądź kolagen/zawiesina komórkowa ulegają osadzeniu elektrolitycznemu na substracie, tak by uformowały określone tkanki lub narządy.

W opisie patentowym US6730252 (opubl. 2004-05-04) opisano metodę osadzania topionego materiału do konstruowania bioresorbowalnych rusztowań trójwymiarowych z bioresorbowalnych polimerów takich jak polikaprolakton (PCL) lub z kompozytów bioresorbowalnych polimerów i ceramiki, takich jak polikaprolakton/hydroksyapatyt (PCL/HA). Inkorporacja bioresorbowalnych ceramik do wytwarzania hybrydy/materiału kompozytowego podporowego powoduje, że następuje pożądana degradacja i kinetyka resorpcji. Materiał kompozytowy według wynalazku charakteryzuje się podwyższoną biokompatybilnością oraz integracją z tkankami twardymi umożliwiając podwyższenie początkowego osadzania białek surowicy. Zasadowe produkty resorpcji kompozytu przeciwdziałają także tworzeniu niekorzystnego środowiska dla komórek tkanek twardych spowodowanych obniżonym pH. Rusztowania znajdują zastosowanie w inżynierii tkankowej, w szczególności w inżynierii tkankowej kości oraz chrząstki.

W zgłoszeniach patentowych WO2006106506 (opubl. 2006-10-12) oraz US20090074832 (opubl. 2009-03-19) przedstawiono rusztowanie medyczne, sposób jego wytwarzania oraz jego zastosowanie. Przedmioty według wynalazku zawierają elementy wytwarzane metodą elektroprzędzenia, posiadające ciągłe bądź skokowe zmiany współczynnika porowatości, średniego rozmiaru porów, wagi w stosunku do objętości oraz innych parametrów różnicujących kolonizację komórkową poprzez ułatwienie/restrykcję migracji określonych typów komórek w głąb podłoża. Rozwiązanie według wynalazku dostarcza także sposobu wytwarzania oraz zastosowania produktu w regeneracji tkanek.

PL 223 475 B1

W zgłoszeniu patentowym P-385197 (opubl. 2009-11-23) opisano produkt inżynierii tkankowej (PIT) do rekonstrukcji i regeneracji kości oraz sposób otrzymywania produktu inżynierii tkankowej (PIT) do rekonstrukcji i regeneracji kości. Sposób polega na tym, że sporządza się trójwymiarowe rusztowanie, wykonane z syntetycznego węglanu wapnia, na którym w warunkach hodowli dynamicznej osadza się żywe komórki osteogenne, przy czym stosuje się syntetyczny węglan wapnia o zawa rtości domieszek nie większej niż 10% i o porowatości otwartej, korzystnie o porowatości otwartej od 40% do 95%, przy czym pory mają wielkość od 100 do 500 pm i są połączone między sobą. Komórki osteogenne korzystnie są otrzymywane z materiału biologicznego, pochodzącego od dawcy, będącego równocześnie biorcą PIT, a po izolacji, namnażaniu i ewentualnym różnicowaniu w hodowli in vitro odrywane są od podłoża, a następnie w warunkach dynamicznych z zastosowaniem urządzenia zapewniającego przepływ pożywki przez urządzenie w obiegu zamkniętym osadzane są na podłożu rusztowania. Komórki dodawane są w postaci zawiesiny w dużej objętości medium hodowlanego o składzie dostosowanym do typu komórek. Produkt inżynierii tkankowej (PIT) do rekonstrukcji i reg eneracji kości charakteryzuje się tym, że jako rusztowanie stosuje się syntetyczny węglan wapnia o zawartości domieszek nie większej niż 10% i o porowatości otwartej, korzystnie o porowatości otwartej od 40% do 95%, przy czym pory mają wielkość od 100 do 500 pm i są połączone między sobą. Na rusztowaniu, w warunkach hodowli dynamicznej osadzone są żywe komórki osteogenne, korzystnie otrzymane z materiału biologicznego, pochodzącego od dawcy będącego równocześnie biorcą PIT.

W publikacji Eulsik Yoon et al. [80] opisano sposób otrzymywania produktu inżynierii tkankowej do rekonstrukcji i regeneracji tkanki kostnej, w którym na biodegradowalne podłoże z kopolimeru 85/15 PLGA naniesiono żywe komórki tłuszczowe o potencjale osteogennym. Komórki były hodowane in vitro, w okresie 1, 7 i 14 dni, a następnie produkt wprowadzano do organizmu biorcy. Stwierdzono, że 14-dniowy okres hodowli in vitro przed implantacją zwiększa potencjał osteogenny produktu i ma wpływ na zdolność regeneracji kości. Autorzy badali potencjał osteogenny komórek tłuszczowych, nie poświęcając uwagi problemom związanym z podłożem z PLGA, które jest integralną częścią produktu i, w związku z tym, wywiera istotny wpływ na skuteczność implantacji. Jak wspominano wyżej, po wszczepieniu produktów do ciała pacjenta niekontrolowany miejscowy wzrost stężenia produktów degradacji (kwasów mlekowego i glikolowego) obniża przeżywalność wszczepionych komórek i działa toksycznie na okoliczne tkanki poprzez silne obniżenie pH w rejonie wszczepu. Przedłużający się stan zapalny wywołany zakwaszeniem może doprowadzić do nieprawidłowej funkcji lub utraty wprowadzonego wszczepu.

Istnieje zatem potrzeba uzyskania sposobu otrzymywania produktu inżynierii tkankowej opartego na doprowadzeniu w warunkach in vitro - na etapie poprzedzającym wprowadzenie produktu do tkanek biorcy - do silnie zaawansowanej degradacji materiału sztucznego (polimerów i/lub kopolim erów kwasu mlekowego). Stanowi to istotną przewagę nad sytuacją, w której degradacja materiału syntetycznego następuje in vivo, po wszczepieniu do tkanek biorcy i jej tempo i przebieg jest najczęściej nieprzewidywalny. Z drugiej strony, zdegradowane rusztowanie staje się niezdolne do przenoszenia obciążeń mechanicznych, co w konsekwencji może uczynić niemożliwym wprowadzenie produktu do organizmu.

Celem niniejszego wynalazku było ograniczenie wykorzystania materiału wytworzonego przez człowieka, który może wywoływać efekty niepożądane w miejscu implantacji, wyłącznie do etapu tworzenia ostatecznego produktu w warunkach in vitro. W rozwiązaniu według wynalazku degradacja materiału jest przy tym wykorzystywana do stymulacji tworzenia tkanki i w opisanych warunkach doświadczalnych jest w pełni kontrolowana, a otrzymany produkt charakteryzuje się wytrzymałością m echaniczną odpowiednią do przeprowadzenia implantacji.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób otrzymywania produktu inżynierii tkankowej do rekonstrukcji i regeneracji tkanki kostnej, w którym na biodegradowalne podłoże o rozwiniętym kształcie, z mieszaniny polimerów/kopolimerów kwasu mlekowego, ewentualnie modyfikowanych dodatkiem napełniaczy, nanosi się żywe komórki o potencjale osteogennym lub inne komórki zdolne do wydzielania kolagenu typu I. Komórki z pobranych od dawcy tkanek izoluje się, po czym hoduje się je w medium odpowiednim dla danego typu komórek w warunkach in vitro, do czasu osiągnięcia w hodowli odpowiedniej liczby komórek, korzystnie 70-80% konfluencji, następnie komórki odrywa się od podłoża, zawiesza w odpowiednim dla danego typu komórek medium hodowlanym i zlicza się gęstość komórek, po czym rusztowania przesycone medium hodowlanym umieszcza się w urządzeniu o wym uszonym ciągłym przepływie medium hodowlanego lub umieszcza w studzienkach płytek hodowlanych,

PL 223 475 B1 po czym do urządzenia lub studzienek płytki hodowlanej dodaje się zawiesinę komórek w medium hodowlanym w odpowiedniej gęstości, a następnie cały układ umieszcza się w inkubatorze o stałej wilgotności powyżej 95%, temperaturze 37°C i obecności 5% dwutlenku węgla. Sposób według wyn alazku charakteryzuje się tym, że dalszy etap hodowli prowadzi się przynajmniej przez 21 dni, do m omentu, gdy z materiału uwolni się co najmniej 50% kwasu mlekowego, przy czym w przypadku hodowli w urządzeniu o wymuszonym ciągłym przepływie medium hodowlanego po upływie co najmniej 7 dni, w których przynajmniej raz pożywka zostaje wymieniona na świeże medium o takim samym składzie, produkty przenosi się do studzienek płytek hodowlanych, w których kontynuuje się hodowlę.

Korzystnie jest, gdy jako podłoże stosuje się polimery i kopolimery kwasu mlekowego, wybrane spośród PLA, D-PLA, L-PLA, LD-PLA i kopolimery blokowe, szczepione lub statystyczne wymienionych odmian PLA ze sobą i z PGA, PEG (poli(glikol etylenowy)) i PCL.

Korzystnie do podłoża dodaje się napełniacze w postaci zdyspergowanego proszku krystalicznych lub bezpostaciowych soli kwasu mlekowego wybranych spośród: mleczanu wapnia, mleczanu sodu, mleczanu potasu, mleczanu magnezu stanowiących dodatkowe źródło kwasu mlekowego. Można także stosować napełniacze ceramiczne w postaci nanocząstek lub mikrocząstek w postaci proszku lub granul ceramicznych, szczególnie stechiometrycznych i niestechiometrycznych fosforanów wapnia, węglanów wapnia, tlenków krzemu oraz materiałów wielofazowych z tych grup.

Korzystnie stosuje się modyfikacje podłoża w postaci dodatków uwalniających czynniki wzrostu, przy czym polimery i kopolimery są korzystnie z napełniaczem w postaci proszku lub granul demineralizowanej matrycy kostnej.

Korzystnie jest, gdy nanoszonymi komórkami są komórki o potencjale osteogennym, a zwłaszcza izolowane z tkanki kostnej, lub komórki progenitorowe, w tym mezenchymalne komórki izolowane z tkanki tłuszczowej, szpiku kostnego, krwi obwodowej, tkanek płodowych i/lub komórki o potencjalnie angiogennym, a zwłaszcza izolowane ze śródbłonka naczyń, komórki progenitorowe, i/lub komórki o fenotypie osteoklastów.

Korzystnie jest, gdy komórkami osadzonymi w rusztowaniu są wspólnie komórki o różnym fenotypie i różnym potencjale.

Korzystnie jest, gdy nanoszonymi komórkami są komórki izolowane z tkanek ssaczych, korzystnie ludzkich, wykazujących zgodność gatunkową, a w przypadku zastosowania produktu u człowieka, korzystnie w układzie autogennym.

Korzystnie jest, gdy komórkami budującymi podłoże są dowolne komórki produkujące macierz pozakomórkową charakterystyczną dla tkanki łącznej.

Wynalazek obejmuje także produkt inżynierii tkankowej do rekonstrukcji i regeneracji tkanki kostnej, który stanowi biodegradowalne podłoże o rozwiniętym kształcie, z mieszaniny polimerów/kopolimerów kwasu mlekowego, ewentualnie modyfikowanych przez dodatek napełniaczy, z żywymi komórkami o potencjale osteogennym lub innymi komórkami zdolnymi do wydzielania kolagenu typu I, charakteryzujący się tym, że jest złożony w co najmniej 80% z macierzy komórkowej wytworzonej in vitro przez komórki osadzone w tym rusztowaniu sposobem według wynalazku.

Produkt według wynalazku jest przeznaczony do zastosowania do implantacji w miejscach ubytków tkanki kostnej lub tkanki miękkiej w zależności o d typu użytych komórek, zwłaszcza u ssaków.

Zgodnie ze sposobem według wynalazku podłoże w środowisku medium hodowlanego uwalnia kwas mlekowy w wyniku hydrolizy, co pobudza komórki osadzone w podłożu stanowiącym rusztowanie do produkcji kolagenu typu I będącego podstawowym składnikiem macierzy pozakomórkowej. Tym samym kwas mlekowy uwalniany z polimerów kwasu mlekowego wspomaga i steruje tempem formowania włókien kolagenowych. Wzmożona produkcja kolagenu prowadzi do formowania się włókien kolagenowych stanowiących podłoże do proliferacji komórek, których aktywność intensyfikuje dalszą degradację podłoża skutkującą dalszym uwalnianiem kwasu mlekowego i wspomaganą przez obecność tego kwasu produkcję kolagenu typu I oraz wzrost udziału macierzy pozakomórkowej w uzyskiwanym produkcie, w wyniku czego dochodzi do substytucji wyjściowego rusztowania wytworzoną dzięki produktowi jego degradacji tkanką w warunkach in vitro przed wprowadzeniem produktu do tkanek biorcy. Stężenie uwalnianego kwasu mlekowego nie może przekroczyć stężenia toksycznego dla komórek.

Ostateczny produkt jest złożony prawie całkowicie ze składników naturalnych, wytworzonych przez naniesione na materiał komórki.

PL 223 475 B1

Pomimo tego, że proponowany produkt inżynierii tkankowej jest uzyskiwany w warunkach laboratoryjnych, ma on cechy przeszczepu autogennego, uważanego za złoty standard w chirurgii transplantacyjnej. W przypadku, gdy komórki pochodzą od dawcy, który jest jednocześnie biorcą wszczepu, produkt taki jest zbudowany wyłącznie z jego własnego materiału biologicznego przez co skład zapewnia pełną zgodność immunologiczną, która nie występuje w przypadku przeszczepów materiału biologicznego pochodzącego od obcego dawcy lub, co często się zdarza w aktualnej praktyce klinic znej, materiał biologiczny jest pochodzenia zwierzęcego.

Załączone figury pozwalają na lepsze wyjaśnienie istoty wynalazku.

Figura 1 przedstawia rusztowanie wyjściowe przed hodowlą (skanningowy mikroskop elektronowy),

Figura 2 przedstawia rusztowanie z tkanką po 2 tygodniach hodowli dynamicznej (skanningowy mikroskop elektronowy),

Figura 3 przedstawia 8-tygodniową hodowlę komórek osteogennych na podłożu rusztowania modyfikowanego krzemionką w postaci mikrocząstek.

Figura 4 przedstawia 8-tygodniową hodowlę komórek osteogennych na podłożu rusztowania modyfikowanego krzemionką w postaci nanocząstek.

Figura 5 przedstawia eksplanty produktów inżynierii tkankowej po 4-tygodniowej hodowli in vivo.

Figura 6 przedstawia tkankę łączną z widocznymi naczyniami krwionośnymi wypełniającą eksplant poliestrowy modyfikowany nanokrzemionką (barwienie hematoksyliną i eozyną).

Figura 7 przedstawia tkankę łączną z widocznymi naczyniami krwionośnymi wypełniającą eksplant poliestrowy modyfikowany mikrokrzemionką (barwienie hematoksyliną i eozyną).

Figura 8 przedstawia włókna kolagenowe wypełniające eksplant (barwienie czerwienią syriuszową, w świetle spolaryzowanym).

Figura 9 przedstawia wykres obrazujący stężenie kwasu mlekowego w medium hodowlanym znad rusztowań z komórkami.

Figura 10 przedstawia wykres obrazujący liczbę komórek osteogennych na rusztowaniach poliestrowych w poszczególnych dniach hodowli.

Figura 11 przedstawia ilość osteokalcyny w hodowlach komórek na rusztowaniach w 14 i 21 dniu hodowli w przeliczeniu na liczbę komórek.

Figura 12 przedstawia ilość kolagenu w hodowlach na rusztowaniach w badanych punktach czasowych.

Figura 13 przedstawia przestrzenie między włóknami rusztowania wypełnione strukturą tkankową (skanningowy mikroskop elektronowy).

Figura 14 przedstawia zaawansowaną degradację włókien rusztowania polimerowego (skanningowy mikroskop elektronowy).

Figura 15 przedstawia ilość kolagenu typu I w przeliczeniu na liczbę komórek osteogennych w hodowli 21-dniowej w zależności od stężenia kwasu mlekowego w medium hodowlanym.

Figura 16 przedstawia ilość kolagenu typu I w hodowli komórek osteogennych bez i w obecności kwasu mlekowego w medium hodowlanym.

Figura 17 przedstawia ekspresję genu dla kolagenu typu I w hodowli komórek osteogennych bez i w obecności kwasu mlekowego w medium hodowlanym.

Figura 18 przedstawia ilość kolagenu typu I w hodowlach fibroblastów w poszczególnych dniach hodowli.

Figura 19 przedstawia ilość kolagenu typu I w hodowlach fibroblastów w hodowlach z kwasem mlekowym i witaminą C lub tylko z kwasem mlekowym.

P r z y k ł a d y:

P r z y k ł a d 1. Ogólny przykład sposobu wytwarzania produktu

Rusztowanie przygotowuje się z mieszaniny odpowiednich polimerów/kopolimerów lub polim erów/kopolimerów modyfikowanych przez dodatek napełniaczy. Następnie gotowe rusztowanie sterylizuje się radiacyjnie (dawką 25 kGy) i warunkach sterylnych przechowuje do czasu przygotowywania produktu. Komórki izoluje się z pobranych od dawcy tkanek (np. kości, szpiku kostnego, krwi obwodowej, tkanki tłuszczowej, naczyń krwionośnych, tkanki łącznej). Następnie komórki hoduje się w medium odpowiednim dla danego typu komórek (np. w przypadku hodowli komórek izolowanych z tkanki kostnej medium składa się z podłoża DMEM (GIBCO BRL nr katalogowy 22320) wzbogaconego inaktywowanym płodowym osoczem bydlęcym (FCS) w stężeniu 10%, z dodatkiem antybiotyku w postaci preparatu Antibiotic-Antimycotic (Preparat firmy GIBCO, nr kat.: 15240096, zawierający 10,000 jedn. penicyliny z wykorzystaniem soli sodowej, tj. penicyliny G, 10,000 gg streptomycyny z wykorzystaniem

PL 223 475 B1 siarczanu streptomycyny) i 25 pg amfoterycynyB/ml - w postaci przeciwgrzybiczego preparatu Fungizone® w 0,85% roztworze soli) w stężeniu 1%, L-glutaminy w stężeniu 2 mM (GIBCO BRL), oraz witaminy C w stężeniu 120 pM w postaci kwasu L-fosfo-askorbinowego (SIGMA)). Hodowlę wyizolowanych komórek prowadzi się w naczyniach hodowlanych w warunkach in vitro w inkubatorze o stałej wilgotności powyżej 95%, temperaturze 37°C i obecności 5% dwutlenku węgla, do czasu osiągnięcia w hodowli odpowiedniej liczby komórek - korzystnie 70-80% konfluencji. Komórki odrywa się następnie od podłoża używając roztworów kolagenazy, a następnie trypsyny, zawiesza w odpowiednim dla danego typu komórek medium hodowlanym i zlicza się gęstość komórek. Rusztowania przesycone medium hodowlanym umieszcza się w koszyczku w urządzeniu o wymuszonym ciągłym przepływie medium hodowlanego lub umieszcza w studzienkach płytek hodowlanych, po czym do urządzenia lub studzienek płytki hodowlanej dodawana jest zawiesina komórek w medium hodowlanym w odpowiedniej gęstości (np. 0,5 mln komórek na rusztowanie 5x5x5 mm). Cały układ zostaje umieszczony w inkubatorze o stałej wilgotności powyżej 95%, temperaturze 37°C i obecności 5% dwutlenku węgla. Urządzenie o wymuszonym ciągłym przepływie medium hodowlanego umieszcza się na mieszadle magnetycznym, prędkość obrotów mieszadła utrzymuje się na poziomie około 60 rpm. W przypadku wykorzystania urządzenia o wymuszonym ciągłym przepływie medium hodowlanego hodowla trwa 14 dni, przy czym po 7 dniach pożywka zostaje wymieniona na świeże medium o takim samym składzie. Następnie produkty są przenoszone do studzienek płytek hodowlanych, w których toczy się da lszy etap produkcji do czasu osiągnięcia wymaganej degradacji materiału polimerowego (gd y z materiału uwolni się 80% kwasu mlekowego). W przypadku hodowli wyłącznie w studzienkach płytek hodowlanych produkty są przechowywane w w/w warunkach do czasu osiągnięcia wymaganej degradacji materiału polimerowego (gdy z materiału uwolni się 80% kwasu mlekowego). Medium hodowlane wymieniane jest w czasie produkcji dwa razy w tygodniu. Po tym etapie produkt jest gotowy do zastosowania. W celu kontroli jakości produktów ocenia się stopień degradacji metodą opisaną w przykł adzie 2. Następuje także ocena jakości utworzonej tkanki (np. do wyboru w zależności od rodzaju tkanki: ocena ilościowa liczby komórek (PicoGreen), zróżnicowania komórek (stężenie osteokalcyny, aktywność fosfatazy zasadowej), aktywności genów (real-time PCR), ilość macierzy pozakomórkowej (oznaczenie ilości hydroksyproliny, ilości kolagenu typu I), organizacja macierzy pozakomórkowej (ocena mikroskopowa).

P r z y k ł a d 2. Oznaczenie ilości kwasu mlekowego

Oznaczenie ilości kwasu mlekowego pozostałej do wydzielenia pozwala na określenie stopnia degradacji rusztowania kostnego.

Sposób oznaczania stopnia degradacji rusztowania kostnego:

Próbkę rusztowania kostnego o znanej masie początkowej, świeżo przygotowanego lub po okresie hodowli komórkowej, odsączamy i płuczemy dwukrotnie w 10 krotnym nadmiarze wody destylowanej przez 5 minut. Pozostałość nierozpuszczalną w wodzie odsączamy i suszymy w temperaturze 40°C przez 24 godziny. Dokładnie wysuszoną próbkę ważymy, a następnie dodajemy kwas siarkowy o stężeniu 20% wagowych, o masie 5 razy większej od masy zważonej próbki po wysuszeniu, i pozostawiamy do dokończenia hydrolizy w 40°C na okres 24 godzin. Następnie w tak otrzymanej próbce oznaczamy stężenie kwasu mlekowego według jednego ze znanych sposobów:

A. Kwas mlekowy oddestylowujemy pod próżnią (120°C, 1,5 kPa) a następnie miareczkujemy destylat za pomocą mianowanego roztworu wodorotlenku sodu stosując fenoloftaleinę jako wskaźnik.

B. Próbkę zobojętniamy do pH 7, rozcieńczamy odpowiednio do metody i oznaczamy stężenie jonów mleczanowych za pomocą chromatografii cieczowej HPLC.

C. Próbkę zobojętniamy do pH 7, rozcieńczamy odpowiednio do metody i oznaczamy stężenie jonów mleczanowych za pomocą odpowiedniej elektrody pomiarowej np. firmy EDGE.

Dzieląc otrzymany wynik przez wynik otrzymany ze świeżo przygotowanego rusztowania o takiej samej masie początkowej otrzymujemy stopień degradacji rusztowania.

P r z y k ł a d 3. Sposób otrzymywania produktu inżynierii tkankowej w czasie długotrw ałej hodowli in vitro komórek osteogennych na podłożu materiału poliestrowego (PLLA-PLGA niemodyfikowane i modyfikowane krzemionką w postaci nanocząstek lub mikrocząstek)

Mieszaninę polimerów PDLLA-PLGA i PLL A rozpuszcza się 1,4-dioksanie oraz dodaje porogen (NaCl) o średnicy ziaren 250-500 pm w ilości 270 mg na próbkę. Następnie mieszaninę zamraża się w ciekłym azocie i liofilizuje przez minimum 10 dni. Po zliofilizowaniu próbki (325 mg każda) prasuje się w formach pod ciśnieniem 80 kG/cm . Następnie z próbek wypłukuje się NaCl przez co najmniej

PL 223 475 B1 dni, zmieniając wodę dwa razy dziennie. Po upływie tego czasu próbki rusztowań suszy się przez 24 godziny na powietrzu, a następnie w próżni przez kolejnych 8 godzin. Tak otrzymuje się rusztowania niemodyfikowane. Aby otrzymać rusztowania modyfikowane krzemionką w postaci nanocząstek do mieszaniny wyjściowej polimerów dodaje się nanokrzemionkę o wielkości cząstek 10 nm lub krzemionkę o mikrometrycznych wielkościach ziaren (10 pm).

Jałowe (w wyniku sterylizacji radiacyjnej dawką 25 kGy) wyjściowe rusztowanie w postaci walca jest odpowietrzane w warunkach sterylnych. Rusztowanie wypełnione medium hodowlanym (skład podany poniżej) przechowuje się przez 48 h w temp. 37°C, w celu zwilżenia rusztowania świeżą pożywką hodowlaną przed założeniem na jego podłożu hodowli komórek.

Komórki są izolowane z małych fragmentów tkanki kostnej biorcy (eksplantów) poprzez oczyszczenie mechaniczne w celu usunięcia wszelkich innych poza kostną rodzajów tkanki, rozdrobnienie tych fragmentów na kawałki o wielkości ok. 1 mm, a następnie poddanie trawieniu enzymatycznemu w roztworze kolagenazy w temp. 37°C przez noc. Tkanki, które uległy strawieniu są następnie usuwane, fragmenty kości zostają przepłukane w roztworze PBS, a następnie umieszczone w butelkach hodowlanych w medium hodowlanym o następującym składzie: podłoże DMEM (GIBCO BRL nr katalogowy 22320) wzbogacone inaktywowanym płodowym osoczem bydlęcym (FCS) w stężeniu 10%, z dodatkiem antybiotyku w postaci preparatu Antibiotic-Antimycotic (Preparat firmy GIBCO, nr kat.: 15240096, zawierający 10,000 jedn. penicyliny - z wykorzystaniem soli sodowej, tj. penicyliny G, 10,000 pg streptomycyny - z wykorzystaniem siarczanu streptomycyny) i 25 pg amfoterycynyB/ml w postaci przeciwgrzybiczego preparatu Fungizone® w 0,85% roztworze soli) w stężeniu 1%, L-glutaminy w stężeniu 2 mM (GIBCO BRL), oraz witaminy C w stężeniu 120 pM w postaci kwasu L-fosfo-askorbinowego (SIGMA). Wszystkie elementy procedury prowadzone są w warunkach jałowych. Hodowla prowadzona jest następnie w inkubatorze o stałej wilgotności powyżej 95%, temperaturze 37°C i obecności 5% dwutlenku węgla. Po uzyskaniu konfluencji, komórki są odrywane od podłoża przez trawienie trypsyną, a następnie wirowane, liczone w kamerze hematologicznej i zawieszane w pożywce j w.

Rusztowania umieszczane są w koszyczku w urządzeniu o wymuszonym ciągłym przepływie medium hodowlanego, po czym do urządzenia dodawana jest zawiesina komórek w medium hodowlanym (w dużej objętości medium np. w 500 ml) w gęstości wg proporcji - 300 tys. komórek na rusztowanie. W jednym urządzeniu znajdują się rusztowania jednego typu (np. modyfikowane lub niem odyfikowane rusztowania PLGA). Następnie cały układ zostaje umieszczony w inkubatorze o stałej wilgotności powyżej 95%, temperaturze 37°C i obecności 5% dwutlenku węgla. Hodowla trwa 14 dni, cały czas w warunkach ciągłego ruchu medium hodowlanego, przy czym po 7 dniach pożywka zostaje wymieniona na świeże medium o tym samym składzie. Wtedy też badana jest przeżywalność komórek na wybranych losowo rusztowaniach. Hodowla na pozostałych rusztowaniach toczy się do 14 dnia hodowli. Po tym czasie uzyskuje się produkt w postaci rusztowania w części zdegradowanego, wypełnionego żywymi komórkami osteogennymi i wytworzoną przez nich macierzą pozakomórkową (fig. 1 i 2) (W przykładzie nr 4 opisano sposób i skutki implantacji produktu otrzymanego na tym etapie do tkanek zwierząt eksperymentalnych).

Rusztowania przekłada się z urządzenia o wymuszonym ciągłym przepływie medium hodowlanego do sterylnych warunków statycznych tj. do płytek hodowlanych. Medium wymieniane jest na świeże 2 razy w tygodniu. W ciągu hodowli następuje widoczna makroskopowo i mikroskopowo d egradacja materiału oraz towarzyszące jej tworzenie się tkanki. Po 8 tygodniach hodowli, poprzedzonej 2-tygodniową hodowlą w ciągłym przepływie medium, uzyskuje się produkt o zupełnej dezintegracji rusztowania. Drobiny materiału połączone są zwartą strukturą tkankową (fig. 3 i 4). Zaawansowaną degradację materiału modyfikowanego potwierdza się chromatografią z wykluczeniem objętości (SEC).

P r z y k ł a d 4. Weryfikacja zachowania produktów opisanych w przykładach 1. oraz 3. poprzez obserwację po implantacji do tkanek zwierząt doświadczalnych

Otrzymane produkty o silnie zaawansowanej degradacji poddaje się obserwacji w tkankach zwierząt doświadczalnych (opis otrzymywania produktów zawiera przykład 1. oraz 3.). Ponieważ produkty zawierają żywe komórki ludzkie, do obserwacji zastosowano zwierzęta pozbawione odporności typu komórkowego (myszy SCID). Po znieczuleniu na grzbiecie myszy wykonuje się dwa cięcia i preparuje tkanki w celu umieszczenia produktu. Implant kontrolny (bez komórek), przechowywany 48 h przed implantacją w medium hodowlanym w warunkach sterylnych wszczepia się po jednej stronie grzbietu, produkt inżynierii tkankowej po przeciwnej.

PL 223 475 B1

Implantację kontynuuje się do 4 lub 13 tygodnia. Po eksplantacji w danym czasie przeprowadza się testy ilościowe i jakościowe wszczepów oraz porównanie implantów doświadczalnych i kontrolnych. Po 4-tygodniowej implantacji podskórnej wszczepy wykonane z materiałów poliestrowych modyfikowanych krzemionką o mikrometrycznych wielkościach ziaren (zarówno zasiedlone jak i niezasiedlone komórkami) są spójne (fig. 5), silnie unaczynione i zintegrowane z tkankami zwierząt.

Implanty doświadczalne i kontrolne nie różnią się pod względem wielkości. Po 13-tygodniowej implantacji materiały zasiedlane komórkami cechują się silniejszym zaawansowaniem degradacji m ateriałów w stosunku do materiałów niezasiedlanych komórkami. Wprowadzenie komórek do rusztowania spowodowało jego szybszą degradację, co było obserwowane w postaci dużo mniejszej objętości eksplantu oraz w badaniu ilościowym chromatografii z wykluczeniem objętości. Produkty przygotowane na podłożu poliestrowym modyfikowanym nanokrzemionką cechują się spójną budową, próbki zasiedlone i niezasiedlone komórkami nie różnią się makroskopowo od siebie. Po obu czasach hodowli in vivo nie obserwuje torebki łącznotkankowej wokół rusztowań ani makroskopowych cech zapalenia.

W obrębie badanego produktu po obserwacji in vivo stwierdza się obecność dobrze unaczynionej zorganizowanej tkanki łącznej, która wypełnia pory materiałów obu typów (fig. 6 i 7). Włókna kolagenowe świecące w świetle spolaryzowanym są uwidocznione w barwieniu czerwienią Syriusza (fig. 8).

W celu potwierdzenia obecności tkanki wytworzonej przez komórki wchodzące w skład wszczepionego produktu, w przypadku implantów z poliestru bez modyfikacji wykonano dodatkowo barwienia immunohistochemiczne na skrawkach mrożeniowych uzyskanych z eksplantów pobranych po 13 tygodniach i utrwalonych w paraformaldehydzie. Używając specyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko ludzkiemu kolagenowi typu I, ludzkiej osteopontynie oraz ludzkiej osteokalcynie, zbadano lokalizację tych białek. Zastosowana metoda immunocytochemiczna opierała się na kilkuetapowej reakcji wykorzystującej przeciwciała I i II - rzędowe oraz system biotyna/awidyna sprzężonych z fluorochromem FITC. Preparaty były zamykane w specjalnym medium z dodatkiem DAPI wiążącego się z chromatyną i wybarwiającą jądra komórkowe, co ułatwiało lokalizację materiału komórkowego. Obserwacje prowadzono w mikroskopie świetlnym oraz fluorescencyjnym. Uzyskano pozytywne wyniki analizy lokalizacji ludzkiego kolagenu typu I, osteokalcyny oraz osteopontyny, co wskazuje na przeżycie przeszczepionych komórek, stanowiących element składowy produktu, i ich zdolność do produkcji macierzy pozakomórkowej po implantacji in vivo.

P r z y k ł a d 5. Długotrwała hodowla in vitro komórek osteogennych na podłożu materiału poliestrowego (PLA)

Próbki otrzymano na drodze elektroprzędzenia w następujący sposób: przygotowano roztwór polimeru w chloroformie w szczelnym naczyniu szklanym z mieszadełkiem magnetycznym. Roztwór wprowadzono do strzykawki i umieszczono strzykawkę w pompce strzykawkowej, wylot strzykawki podłączono wężykiem do metalowej dyszy stanowiska do otrzymywania włókien na drodze elektroprzędzenia. Do dyszy podłączono zasilacz wysokiego napięcia i włączono pompkę strzykawkową. Podawany przez pompę roztwór polimeru pod wpływem wytworzonego pola elektrycznego zastaje elektrycznie naładowany. Występujące w cieczy ładunki elektryczne są przyspieszane w polu elektrycznym wytworzonym pomiędzy dyszą a otoczeniem. Powoduje to wyciąganie strugi cieczy i formowanie się cienkich włókien. Włókna te, na skutek parowania rozpuszczalnika, ulegają zestaleniu. P owstałe włókna zbierane są na uziemionej elektrodzie zbiorczej.

Przygotowane rusztowanie zanurza się w etanolu 70% na 1 h i lekko wytrząsa w celu oczyszczenia przed hodowlą komórkową. Wysuszone rusztowanie przesyca się pożywką hodowlaną (skład podany poniżej). Po 24 h wymienia się pożywkę na świeżą.

Komórki są izolowane z małych fragmentów tkanki kostnej biorcy (eksplantów) poprzez oczys zczenie mechaniczne w celu usunięcia wszelkich innych poza kostną rodzajów tkanki, rozdrobnienie tych fragmentów na kawałki o wielkości ok. 1 mm, a następnie poddanie trawieniu enzymatycznemu w roztworze kolagenazy w temp. 37°C przez noc. Tkanki, które uległy strawieniu są następnie usuwane, fragmenty kości zostają przepłukane w roztworze PBS, a następnie umieszczone w butelkach hodowlanych w medium hodowlanym o następującym składzie: podłoże DMEM (GIBCO BRL nr katalogowy 22320) wzbogacone inaktywowanym płodowym osoczem bydlęcym (FCS) w stężeniu 10%, z dodatkiem antybiotyku w postaci preparatu Antibiotic-Antimycotic (Preparat firmy GIBCO, nr kat.: 15240096, zawierający 10,000 jedn. penicyliny - z wykorzystaniem soli sodowej, tj. penicyliny G, 10,000 pg streptomycyny - z wykorzystaniem siarczanu streptomycyny) i 25 pg amfoteryczny B/ml w postaci przeciwgrzybiczego preparatu Fungizone® w 0,85% roztworze soli) w stężeniu 1%,

PL 223 475 B1

L-glutaminy w stężeniu 2 mM (GIBCO BRL), oraz witaminy C w stężeniu 120 pM w postaci kwasu L-fosfo-askorbinowego (SIGMA). Wszystkie elementy procedury prowadzone są w warunkach jałowych. Hodowla prowadzona jest następnie w inkubatorze o stałej wilgotności powyżej 95%, temperaturze 37°C i obecności 5% dwutlenku węgla. Po uzyskaniu konfluencji, komórki są odrywane od podłoża przez trawienie trypsyną a następnie wirowane, liczone w kamerze hematologicznej i zawieszane w pożywce jw.

Rusztowania umieszczane są w studzienkach sterylnych płytek hodowlanych. Komórki zawieszone w medium hodowlanym nakrapla się na rusztowania w gęstości 50000 na rusztowanie. Hodowla komórek trwa w warunkach opisanych powyżej, po 48 h następuje wymiana pożywki na opisane powyżej medium hodowlane wzbogacone deksametazonem (10 nM/ml) oraz beta-fosfoglicerolem (10 mM). Po 3, 7, 14 i 21 przeprowadza się testy biochemiczne określające stężenie kwasu mlekowego uwalnianego z rusztowania do medium hodowlanego (fig. 9). W tych dniach kontroluje się także liczbę komórek osteogennych hodowanych na rusztowaniach (fig. 10).

W drugim i trzecim tygodniu hodowli bada się ilość osteokalcyny - markera zróżnicowania komórek w kierunku dojrzałych komórek charakterystycznych dla tkanki kostnej (fig. 11).

Stopniowe tworzenie tkanki bada się oceną ilości kolagenu zawartego w hodowli na rusztowaniach po 7, 14 i 21 dniach hodowli (fig. 12). Oznaczenie ilościowe wykonuje się na podstawie ilości hydroksyproliny w hydrolizacie z hodowli.

Komórki i macierz pozakomórkowa zarasta przestrzenie między włóknami rusztowania (fig. 13). Towarzyszy temu zaawansowana hydroliza włókien materiału polimerowego (fig. 14).

P r z y k ł a d 6. Działanie kwasu mlekowego w medium hodowlanym na komórki osteogenne izolowane z ludzkiej tkanki kostnej

Komórki są izolowane z małych fragmentów tkanki kostnej biorcy (eksplantów) poprzez oczyszczenie mechaniczne w celu usunięcia wszelkich innych poza kostną rodzajów tkanki, rozdrobnienie tych fragmentów na kawałki o wielkości ok. 1 mm, a następnie poddanie trawieniu enzymatycznemu w roztworze kolagenazy w temp. 37°C przez noc. Tkanki, które uległy strawieniu są następnie usuwane, fragmenty kości zostają przepłukane w roztworze PBS, a następnie umieszczone w butelkach hodowlanych w medium hodowlanym o następującym składzie: podłoże DMEM (GIBCO BRL nr katalogowy 22320) wzbogacone inaktywowanym płodowym osoczem bydlęcym (FCS) w stężeniu 10%, z dodatkiem antybiotyku w postaci preparatu Antibiotic-Antimycotic (Preparat firmy GIBCO, nr kat.: 15240096, zawierający 10,000 jedn. penicyliny - z wykorzystaniem soli sodowej, tj. penicyliny G, 10,000 pg streptomycyny - z wykorzystaniem siarczanu streptomycyny) i 25 pg amfoteryczny B/ml w postaci przeciwgrzybiczego preparatu Fungizone® w 0.85% roztworze soli) w stężeniu 1%, L-glutaminy w stężeniu 2 mM (GIBCO BRL), oraz witaminy C w stężeniu 120 pM w postaci kwasu L-fosfo-askorbinowego (SIGMA). Wszystkie elementy procedury prowadzone są w warunkach jałowych. Hodowla prowadzona jest następnie w inkubatorze o stałej wilgotności powyżej 95%, temperaturze 37°C i obecności 5% dwutlenku węgla. Po uzyskaniu konfluencji, komórki są odrywane od podłoża przez trawienie trypsyną a następnie wirowane, liczone w kamerze hematologicznej i zawieszane w pożywce jw.

Komórki są umieszczane w gęstości 30000/cm studzienek jałowych płytek hodowlanych w medium. Hodowla komórek trwa w warunkach opisanych powyżej. Po 48 h następuje wymiana pożywki na opisane powyżej medium hodowlane wzbogacone deksametazonem (10 nM/ml) oraz betafosfoglicerolem (10 mM) oraz kwasem L-mlekowym w stężeniach 0, 6.25, 7.5, 12.5, 15, 25, 30, 50, 60, 100 mM w odpowiednich grupach badawczych. Hodowla trwa 21 dni, przy czym 2 razy w tygodniu pożywka zostaje wymieniona na świeże medium o tym samym składzie. Po 3, 7, 14 oraz 21 dniach od rozpoczęcia hodowli komórek w płytkach hodowlanych następują oznaczenia ilościowe. Zostają oznaczone: przeżywalność komórek (test XTT), ich liczba (na podstawie ilości DNA, test PicoGreen), aktywność enzymatyczna fosfatazy zasadowej, ilość osteokalcyny w supernatancie, ilość kolagenu typu I (test ELISA), ilość transkryptu mRNA dla wybranych białek (kolagen typu I, fosfataza zasadowa, osteokalcyna) w porównaniu do ilości mRNA dla genu GAPDH.

Dodatek kwasu mlekowego w stężeniach powyżej 30 mM wywołuje efekt toksyczny na komórki osteogenne, oznaczony testem przeżywalności oraz testem ilości DNA. Po dodaniu niższych stężeń kwasu mlekowego przeżywalność jest podobna lub nieco niższa od kontroli. Aktywność fosfatazy zasadowej oraz ekspresja genu dla fosfatazy zasadowej po dodaniu kwasu mlekowego do medium hodowlanego jest porównywalna z kontrolą w przeliczeniu na liczbę komórek. Ilość osteokalcyny i ek spresja genu dla osteokalcyny w hodowlach komórek w obecności kwasu mlekowego jest wyższa od

PL 223 475 B1 kontroli w przeliczeniu na liczbę komórek. Ilość kolagenu I w hodowli (oznaczona testem ELISA) jest wyższa od kontroli (fig. 15) w przeliczeniu na liczbę komórek.

Ilość kolagenu typu I w hodowli komórek osteogennych jest kilkakrotnie wyższa niż w kontroli dla badanych punktów czasowych w przeliczeniu na liczbę komórek (wybrane stężenie kwasu L-mlekowego w medium - 25 mM) (fig. 16).

Ekspresja genu dla kolagenu typu I w hodowli komórek osteogennych jest kilkakrotnie wyższa niż w kontroli dla badanych punktów czasowych, w stosunku do genu kontrol nego (GAPDH) (wybrane stężenie kwasu L-mlekowego w medium 25 mM) (fig. 17).

P r z y k ł a d 7. Działanie kwasu mlekowego w medium hodowlanym na fibroblasty izolowane z ludzkiej tkanki łącznej

Komórki są izolowane z małych fragmentów tkanki łącznej (z jamy stawowej) poprzez oczyszczenie mechaniczne w celu usunięcia naczyń krwionośnych i tkanki tłuszczowej. Oczyszczone tkanki rozdrabniane są na fragmenty o wielkości ok. 1 mm, a następnie poddanie trawieniu enzymatycznemu w roztworze kolagenazy w temp. 37°C przez noc. Zawiesina jest filtrowana (0,2 pm) w celu odzyskania fibroblastów. Filtrat jest oczyszczany dwukrotnie za pomocą wirowania w roztworze PBS. Komórki znajdujące się na dnie naczynia do wirowania są umieszczane w medium hodowlanym w butelkach hodowlanych. Medium ma następujący skład: podłoże DMEM (GIBCO BRL nr katalogowy 22320) wzbogacone inaktywowanym płodowym osoczem bydlęcym (FCS) w stężeniu 10%, z dodatkiem antybiotyku w postaci preparatu Antibiotic-Antimycotic (Preparat firmy GIBCO, nr kat.: 15240096, zawierający 10,000 jedn. penicyliny - z wykorzystaniem soli sodowej, tj. penicyliny G, 10,000 pg streptomycyny - z wykorzystaniem siarczanu streptomycyny) i 25 pg amfoterycynyB/ml - w postaci przeciwgrzybiczego preparatu Fungizone® w 0,85% roztworze soli) w stężeniu 1%, L-glutaminy w stężeniu 2 mM (GIBCO BRL). Wszystkie elementy procedury prowadzone są w warunkach jałowych. Hodowla prowadzona jest następnie w inkubatorze o stałej wilgotności powyżej 95%, temperaturze 37°C i obecności 5% dwutlenku węgla. Po uzyskaniu konfluencji, komórki są odrywane od podłoża przez trawienie trypsyną a następnie wirowane, liczone w kamerze hematologicznej i zawieszane w pożywce jw.

Komórki są umieszczane w gęstości 30000/cm studzienek jałowych płytek hodowlanych. Hodowla komórek trwa w warunkach opisanych powyżej. Po 48 h następuje wymiana pożywki na opis ane powyżej medium hodowlane wzbogacone witaminą C w stężeniu 120 pM w postaci kwasu L-fosfoaskorbinowego (SIGMA) oraz kwasem L-mlekowym w stężeniu 25 mM lub nie w odpowiednich grupach badawczych. Hodowla trwa 21 dni, przy czym 2 razy w tygodniu pożywka zostaje wymieniona na świeże medium o tym samym składzie. Po 3, 7, 14 oraz 21 dniach od rozpoczęcia hodowli komórek w płytkach hodowlanych następują oznaczenia ilościowe. Zostają oznaczone: przeżywalność komórek (test XTT), ich liczba (na podstawie ilości DNA, test PicoGreen), ilość kolagenu typu I (test ELISA), ilość białka całkowitego w hodowli (oznaczenie Pierce'a).

Dodatek kwasu mlekowego w stężeniu 25 mM nie wywołuje efektu toksycznego na fibroblasty. Ilość kolagenu I w hodowli (oznaczona testem ELISA) jest wyższa w hodowli w medium z dodatkiem kwasu mlekowego niż w kontroli w przeliczeniu na liczbę komórek (fig. 18). Ilość białka całkowitego jest równa w obu hodowlach.

P r z y k ł a d 8. Działanie kwasu mlekowego w obecności lub nieobecności kwasu askorbinowego w medium hodowlanym na fibroblasty izolowane z ludzkiej tkanki łącznej

Komórki są izolowane z małych fragmentów tkanki łącznej (z jamy stawowej) poprzez oczyszczenie mechaniczne w celu usunięcia naczyń krwionośnych i tkanki tłuszczowej. Oczyszczone tkanki rozdrabniane są na fragmenty o wielkości ok. 1 mm, a następnie poddanie trawieniu enzymatycznemu w roztworze kolagenazy w temp. 37°C przez noc. Zawiesina jest filtrowana (0,2 pm) w celu odzyskania fibroblastów. Filtrat jest oczyszczany dwukrotnie za pomocą wirowania w roztworze PBS. Komórki znajdujące się na dnie naczynia do wirowania są umieszczane w medium hodowlanym w butelkach hodowlanych. Medium ma następujący skład: podłoże DMEM (GIBCO BRL nr katalogowy 22320) wzbogacone inaktywowanym płodowym osoczem bydlęcym (FCS) w stężeniu 10%, z dodatkiem antybiotyku w postaci preparatu Antibiotic-Antimycotic (Preparat firmy GIBCO, nr kat.: 15240096, zawierający 10,000 jedn. penicyliny - z wykorzystaniem soli sodowej, tj. penicyliny G, 10,000 pg streptomycyny - z wykorzystaniem siarczanu streptomycyny) i 25 pg amfoterycyny B/ml - w postaci przeciwgrzybiczego preparatu Fungizone® w 0,85% roztworze soli) w stężeniu 1%, L-glutaminy w stężeniu 2 mM (GIBCO BRL). Wszystkie elementy procedury prowadzone są w warunkach jałowych. Hodowla prowadzona jest następnie w inkubatorze o stałej wilgotności powyżej 95%, temperaPL 223 475 B1 turze 37°C i obecności 5% dwutlenku węgla. Po uzyskaniu konfluencji, komórki są odrywane od podłoża przez trawienie trypsyną a następnie wirowane, liczone w kamerze hematologicznej i zawieszane w pożywce jw.

Komórki są umieszczane w gęstości 30000/cm studzienek jałowych płytek hodowlanych w medium. Hodowla komórek trwa w warunkach opisanych powyżej. Po 48 h następuje wymiana pożywki na opisane powyżej medium hodowlane wzbogacone kwasem L-mlekowym w stężeniu 25 mM oraz wzbogacone lub niewzbogacone witaminą C w stężeniu 120 pM w postaci kwasu L-fosfoaskorbinowego (SIGMA) w odpowiednich grupach badawczych. Hodowla trwa 21 dni, przy czym 2 razy w tygodniu pożywka zostaje wymieniona na świeże medium o tym samym składzie.

Dodatek witaminy C do medium zawierającego kwas mlekowy jest niezbędny, aby utrzymać przeżywalność fibroblastów w długotrwałej hodowli (na podstawie oznaczeń liczby komórek określonych ilością DNA (PicoGreen) w 3, 7, 14 oraz 21 dniach od rozpoczęcia hodowli) (fig. 19).

Potencjalne zastosowania kliniczne produktu:

Do wypełnień ubytków kostnych np.: powstałych w wyniku resekcji guzów, w przypadkach zaburzenia zrostu kostnego oraz do uzupełnienia tkanki kostnej w przypadkach zaniku tkanki (np. w wyniku osteolizy wokół implantów), w chirurgii stomatologicznej w sytuacji niedoboru podłoża kostnego do wprowadzenia implantów (augmentacja wyrostków zębodołowych), w otolaryngologicznych operacjach rekonstrukcyjnych.

Do rekonstrukcji tkanek miękkich, np. jako wypełnienie tkanki podskórnej w medycynie estetycznej, jako opatrunek ran oparzeniowych, w rekonstrukcji skóry, do operacji przepukliny jako materiał alternatywny do siatek syntetycznych, jako materiał wypełniający zmiany naczyniowe, jako materiał wyjściowy do uzyskania substytutu więzadła lub ścięgna.

Literatura

1. Irwin, R.B., M. Bernhard, and A. Biddinger, Coralline hydroxyapatite as bone substitute in orthopedic oncology. Am J Orthop (Belle Mead NJ), 2001.30(7): p. 544-50.

2. Marino, J.T. and B.H. Ziran, Use of solid and cancellous autologous bone graft for fractures and nonunions. Orthop Clin North Am. 41(1): p. 15-26; table of contents.

3. Menick, F.J., Nasalreconstruction. Plast Reconstr Surg. 125(4): p. 138e-50e.

4. O'Fearraigh, P., Review of methods used in the reconstruction and rehabilitation of the maxillofacialregion. J Ir Dent Assoc. 56(1): p. 32-7.

5. Pape, H.C., A. Evans, and P. Kobbe, Autologous bone graft: properties and techniques. J Orthop Trauma. 24 Suppl 1: p. S36-40.

6. Sajjadian, A., R. Rubinstein, and N. Naghshineh, Current status of grafts and implants in rhinoplasty: part I. Autologous grafts. Plast Reconstr Surg. 125(2): p. 40e-49e.

7. Klijn, R., et al., A meta-analysis of histomorphometric results and graft healing time of various biomaterials compared to autologous bone used as sinus floor augmentation material in humans. Tissue Eng Part B Rev.

8. Shegarfi, H. and O. Reikeras, Review article: bone transplantation and immune response. J Orthop Surg (Hong Kong), 2009. 17(2): p. 206-11.

9. Banwart, J.C., M.A. Asher, and R.S. Hassanein, Iliac crest bone graft harvest donor site morbidity. A statistical evaluation. Spine (PhilaPa 1976), 1995. 20(9): p. 1055-60.

10. Heneghan, H.M. and J.P. McCabe, Use of autologous bone graft in anterior cervical decompression: morbidity & quality of life analysis. BMC Musculoskelet Disord, 2009. 10: p. 158.

11. John, S., et al., A Retrospective Analysis of Anterior Calcaneal Osteotomy with Allogenic Bone Graft. J Foot Ankle Surg.

12. Brandoff, J.F., J.S. Silber, and A.R. Vaccaro, Contemporary alternatives to synthetic bone grafts for spine surgery. Am J Orthop (Belle Mead NJ), 2008. 37(8): p. 410-4.

13. Langer, R. and J.P. Vacanti, Tissue engineering. Science, 1993. 260(5110): p. 920-6.

14. Shen, H., et al, An injectable scaffold: rhBMP-2-loadedpoly(lactide-co-glycolide)/hydroxyapatite composite microspheres. Acta Biomater. 6(2): p. 455-65.

15. Kon, E., et al., Autologous bone marrow stromal cells loaded onto porous hydroxyapatite ceramic accelerate bone repair in critical-size defects of sheep long bones. J Biomed Mater Res, 2000. 49(3): p. 328-37.

PL 223 475 B1

16. Yamasaki, T., et al., Bone-marrow-derived mononuclear cells with a porous hydroxyapatite scaffold for the treatment of osteonecrosis of the femoral head: a preliminary study. J Bone Joint Surg Br. 92(3): p. 337-41.

17. Yoshimi, R., et al., Self-assembling peptide nanofiber scaffolds, platelet-rich plasma, and mesenchymal stem cells for injectable bone regeneration with tissue engineering. J Craniofac Surg, 2009. 20(5): p. 1523-30.

18. Qiu, J., et al., [Clinical study on PRP in improving bone repair]. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi, 2009. 23(7): p. 784-7.

19. Vacanti, C. A., et al., Replacement of an Avulsed Phalanx with Tissue-Engineered Bone. N Engl J Med, 2001.344(20): p. 1511-1514.

20. Warnke, P.H., et al., Man as living bioreactor: fate of an exogenously prepared customized tissue- engineered mandible. Biomaterials, 2006. 27(17): p. 3163-7.

21. Wozniak, P., et al., Candidate bone-tissue-engineered product based on human-bonederived cells and polyurethane scaffold. Acta Biomater, 2009.

22. Papadimitropoulos, A.B., A., Wendt, D., Barbero, A., Martin, I., Expansion of human bone marrow stromal cells within porous scaffolds under perfusion. European Cells and Materials, 2007. 14: p. 83.

23. Mizuno, H., Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review. J Nippon Med Sch, 2009. 76(2): p. 56-66.

24. Hou, T., et al., Umbilical cord Whartons Jelly: a new potential cell source of mesenchymal stromal cells for bone tissue engineering. Tissue Eng Part A, 2009. 15(9): p. 2325-34.

25. In't Anker, P.S., et al., Isolation of mesenchymal stem cells offetal or maternal origin from human placenta. Stem Cells, 2004. 22(7): p. 1338-45.

26. Ge, Z., Z. Jin, and T. Cao, Manufacture of degradable polymeric scaffolds for bone regeneration. Biomed Mater, 2008. 3(2): p. 022001.

27. Athanasiou, K.A., et al., Orthopaedic applications for PLA-PGA biodegradable polymers. Arthroscopy, 1998. 14(7): p. 726-37.

28. Yu, N. Y., et al., Biodegradable poly(alpha-hydroxy acid) polymer scaffolds for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 93(1): p. 285-95.

29. Tsuji, H., Poly(lactide) stereocomplexes: formation, structure, properties, degradation, and applications. Macromol Biosci, 2005. 5(7): p. 569-97.

30. Lu, J.M., et al., Current advances in research and clinical applications of PLGA-based nanotechnology. Expert Rev Mol Diagn, 2009. 9(4): p. 325-41.

31. Barrett, D.G. and M.N. Yousaf, Design and applications of biodegradable polyester tissue scaffolds based on endogenous monomers found in human metabolism. Molecules, 2009. 14(10): p. 4022-50.

32. Noga, D.E., et al., Synthesis and modification of functionalpoly(lactide) copolymers: toward biofunctional materials. Biomacromolecules, 2008. 9(7): p. 2056-62.

33. Li, H., Chang, Jiang, pH-compensation effect of bioactive inorganic fillers on the degradation of PLGA. Composites Science and Technology, 2005. 65(14): p. 2226-2232.

34. Rezwan, K., Chen, Q.Z., Blaker, J.J., Boccaccini, AR., Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials, 2006. 27(18): p. 3413-3431.

35. Ara, M., Watanabe, M., Imai, Y., Effect of blending calcium compounds on hydrolytic degradation of poly(DL-lactic acid-co-glycolic acid). Biomaterials, 2002. 23(12): p. 2479-83.

36. Carpizo, K.H., et al., Pretreatment of poly(l-lactide-co-glycolide) scaffolds with sodium hydroxide enhances osteoblastic differentiation and slows proliferation of mouse preosteoblast cells. Plast Reconstr Surg, 2008. 121(2): p. 424-34.

37. Green, D., Walsh, D., Yang, X., Mann, S., Oreffo, R., Stimulation of human bone marrow stromal cells using growth factor encapsulated calcium carbonate porous microspheres. Journal of Materials Chemistry, 2004.

38. Rhee, S.H., J.Y. Choi, and H.M. Kim, Preparation of a bioactive and degradable poly(epsilon-caprolactone)/silica hybrid through a sol-gel method. Biomaterials, 2002. 23(24): p. 4915-21.

39. Green, D. W., et al., Augmentation of skeletal tissue formation in impaction bone grafting using vaterite microsphere biocomposites. Biomaterials, 2009. 30(10): p. 1918-27.

PL 223 475 B1

40. Shen, H., et al., Combining oxygen plasma treatment with anchorage of cationized gelatin for enhancing cellaffinity ofpoly (lactide-co-glycolide). Biomaterials, 2007. 28(29): p. 4219-30.

41. Zhao, J.H., et al., Improving the cell affinity of a poly(D,L-lactide) film modified by grafting collagen via a plasma technique. Biomed Mater, 2006. 1(4): p. 247-52.

42. Janorkar, A.V., et al., Grafting amine-terminated branched architectures from poly(L-lactide) film surfaces for improved cell attachment. J Biomed Mater Res B Appl Biomater, 2007. 81(1): p. 142-52.

43. Woo, K.M., V.J. Chen, and P.X. Ma, Nano-fibrous scaffolding architecture selectively enhances protein adsorption contributing to cell attachment. J Biomed Mater Res A, 2003. 67(2): p. 531 -7.

44. Lahiri, D., et al., Carbon nanotube reinforcedpolylactide-caprolactone copolymer: mechanical strengthening and interaction with human osteoblasts in vitro. ACS Appl Mater Interfaces, 2009. 1(11): p. 2470-6.

45. Woo, K.M., et al., Nano-fibrous scaffolding promotes osteoblast differentiation and biomineralization. Biomaterials, 2007. 28(2): p. 335-43.

46. Badami, A.S., et al., Effect of fiber diameter on spreading, proliferation, and differentiation of osteoblastic cells on electrospun poly(lactic acid) substrates. Biomaterials, 2006. 27(4): p. 596-606.

47. Ifkovits, J.L., H.G. Sundararaghavan, and J.A. Burdick, Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture. J Vis Exp, 2009(32).

48. Jang, J.H., O. Castano, and H.W. Kim, Electrospun materials as potential platforms for bone tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev, 2009. 61(12): p. 1065-83.

49. Holy, C.E., et al., Optimizing the sterilization of PLGA scaffolds for use in tissue engineering. Biomaterials, 2001. 22(1): p. 25-31.

50. Montanari, L., et al., Gamma irradiation effects on poly(DL-lactictide-co-glycolide) microspheres. J Control Release, 1998. 56(1 -3): p. 219-29.

51. Cordewene, F.W., et al., Cytotoxicity ofpoly(96L/4D-lactide): the influence of degradation and sterilization. Biomaterials, 2000. 21(23): p. 2433-42.

52. Cotton, N.J., Egan, M. J., Brunelle, J. E., Composites of poly(DL-lactide-co-glycolide) and calcium carbonate: in vitro evaluation for use in orthopedic applications. J Biomed Mater Res A, 2008. 85(1): p. 195-205.

53. Lam, K., Nieuwenhuis, P., Molenaar, I., Esselbrugge, H., Feijen, J., Dijkstra, PJ., Schakenraad, JM. Biodegradation of porous versus non-porous poly(L-lactic acid) films. J Mater Sci Mater Med, 1994. 5: p. 181 -189.

54. Dong, Y., et al., Degradation behaviors of electrospun resorbable polyester nanofibers. Tissue Eng Part B Rev, 2009. 15(3): p. 333-51.

55. Oh, S.H., S.G. Kang, and J.H. Lee, Degradation behavior ofhydrophilizedPLGA scaffolds prepared by melt-molding particulate-leaching method: comparison with control hydrophobic one. J Mater Sci Mater Med, 2006. 17(2): p. 131-7.

56. Shive, M.S. and J.M. Anderson, Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres. Adv Drug Deliv Rev, 1997. 28(1): p. 5-24.

57. Bostman, O., Hirvensalo, E., Makinen, J., Rokkanen, P., Foreign-body reactions to fracture fixation implants of biodegradable synthetic polymers. J Bone Joint Surg Br, 1990. 72(4): p. 592-6.

58. Martin, C., Winet, H., Bao, J. Y., Acidity near erodingpolylactide-polyglycolide in vitro and in vivo in rabbit tibial bone chambers. Biomaterials, 1996. 17(24): p. 2373-2380.

59. Mikos, A.G., et al., Host response to tissue engineered devices. Adv Drug Deliv Rev, 1998. 33(1 -2): p. 111 -139.

60. Hutmacher, D.W., Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage. Biomaterials, 2000. 21(24): p. 2529-43.

61. Dong, Y., et al., Distinctive degradation behaviors of electrospun polyglycolide, poly(DL-lactideco-glycolide), andpoly(L-lactide-co-epsilon-caprolactone) nanofibers cultured with/without porcine smooth muscle cells. Tissue Eng Part A. 16(1): p. 283-98.

62. Zund, G., et al., The in vitro construction of a tissue engineered bioprosthetic heart valve. Eur J Cardiothorac Surg, 1997. 11(3): p. 493-7.

PL 223 475 B1

63. Ma, P.X. and R. Langer, Morphology and mechanical function of long-term in vitro engineered cartilage. J Biomed Mater Res, 1999. 44(2): p. 217-21.

64. Seidel, J.O., et al., Long-term culture of tissue engineered cartilage in a perfused chamber with mechanical stimulation. Biorheology, 2004. 41(3-4): p. 445-58.

65. Keogh, M.B., O.B. FJ, and J.S. Daly, A novel collagen scaffold supports human osteogenesis- applications for bone tissue engineering. Cell Tissue Res. 340(1): p. 169-77.

66. Neuss, S., et al., Long-term survival and bipotent terminal differentiation of human mesenchymal stem cells (hMSC) in combination with a commercially available three-dimensional collagen scaffold. Cell Transplant, 2008. 17(8): p. 977-86.

67. Blanek, T. J. and B. Peterkofsky, The stimulation of collagen secretion by ascorbate as a result of increased proline hydroxylation in chick embryo fibroblasts. Arch Biochem Biophys, 1975. 171(1): p. 259-67.

68. Yamamoto, I., et al., Collagen synthesis in human skin fibroblasts is stimulated by a stable form of ascorbate, 2-O-alpha-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid. JNutr, 1992. 122(4): p. 871 -7.

69. Cai, D.Z., et al., Biodegradable chitosan scaffolds containing microspheres as carriers for controlled transforming growth factor-betal delivery for cartilage tissue engineering. Chin Med J (Engl), 2007. 120(3): p. 197-203.

70. Gebken, J., et al., Hypergravity Stimulates Collagen Synthesis in Human Osteoblast-Like Cells: Evidence for the Involvement of p44/42 MAP-Kinases (ERK1/2). J Biochem, 1999. 126(4): p. 676-682.

71. Gladden, L.B., Lactate metabolism: a new paradigm for the third millennium. J Physiol, 2004. 558(Pt 1): p. 5-30.

72. Ghani, Q.P., et al., Regulatory role of lactate in wound repair. Methods Enzymol, 2004. 381: p. 565-75.

73. Yalamanchi, N., et al., Flexor tendon wound healing in vitro: lactate up-regulation ofTGFbeta expression and functional activity. Plast Reconstr Surg, 2004. 113(2): p. 625-32.

74. Comstock, J.P. and S. Udenfriend, Effect of lactate on collagen proline hydroxylase activity in cultured L-929 fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA, 1970. 66(2): p. 552-7.

75. Green, H. and B. Goldberg, Collagen and Cell Protein Synthesis by an Established Mammalian Fibroblast Line. Nature, 1964. 204: p. 347-9.

76. Klein, M.B., et al., Flexor tendon wound healing in vitro: the effect of lactate on tendon cell proliferation and collagen production. J Hand Surg Am, 2001. 26(5): p. 847-54.

77. Spector, J. A., et al., Osteoblast expression of vascular endothelial growth factor is modulated by the extracellular microenvironment. Am J Physiol Cell Physiol, 2001. 280(1): p. C72-80.

78. Hunt, T.K., et A)., Aerobically derived lactate stimulates revascularization and tissue repair via redox mechanisms. Antioxid Redox Signal, 2007. 9(8): p. 1115-24.

79. Constant, J.S., et al., Lactate elicits vascular endothelial growth factor from macrophages: a possible alternative to hypoxia. Wound Repair Regen, 2000. 8(5): p. 353-60.

80. Eulsik Yonn, Sanjay Dhar, Daniel E.Chun, Nareg A.Gharibjanian, Gregory R.D.Evans, In Vivo Osteogenic Potential of Human Adipose-Derived Stem Cells/Poly Lactide-Co-Glycolic Acid Constructs for Bone regeneration in a Rat Critical-Sized Calvarial Defect Model, Tissue Engineering, 2007, vol. 13, No 3, p. 619-627.

Claims (17)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania produktu inżynierii tkankowej do rekonstrukcji i regeneracji tkanki kostnej, w którym na biodegradowalne podłoże o rozwiniętym kształcie, z mieszaniny polimerów/kopolimerów kwasu mlekowego, ewentualnie modyfikowanych przez dodatek napełniaczy, nanosi się żywe komórki o potencjale osteogennym lub inne komórki zdolne do wydzielania kolagenu typu I, przygotowane tak, że komórki z pobranych od dawcy tkanek izoluje się, po czym hoduje się je w medium odpowiednim dla danego typu komórek w warunkach in vitro, do osiągnięcia w hodowli 70-80% konfluencji, po czym odrywa się je od podłoża, zawiesza w odpowiednim dla danego typu komórek medium hodowlanym i zlicza się gęstość komórek, po czym rusztowania przesycone medium hodowPL 223 475 B1 lanym umieszcza się w urządzeniu o wymuszonym ciągłym przepływie medium hodowlanego lub umieszcza w studzienkach płytek hodowlanych, do urządzenia lub studzienek płytki hodowlanej dodaje się zawiesinę komórek w medium hodowlanym w odpowiedniej gęstości, a następnie cały układ umieszcza się w inkubatorze o stałej wilgotności powyżej 95%, temperaturze 37°C i obecności 5% dwutlenku węgla, znamienny tym, że dalszy etap hodowli prowadzi się przynajmniej przez 21 dni, do momentu, gdy z materiału uwolni się co najmniej 50% kwasu mlekowego, przy czym w przypadku hodowli w urządzeniu o wymuszonym ciągłym przepływie medium hodowlanego po upływie co najmniej 7 dni, w których przynajmniej raz pożywka zostaje wymieniona na świeże medium o takim samym składzie, produkty przenosi się do studzienek płytek hodowlanych, w których kontynuuje się hodowlę.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako podłoże stosuje się polimery i kopolimery kwasu mlekowego wybrane spośród: PLA, D-PLA, L-PLA, LD-PLA i kopolimery blokowe, szczepione lub statystyczne wymienionych odmian PLA ze sobą i z PGA, PEG (poli(glikol etylenowy)) i PCL.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się podłoże z napełniaczami w postaci zdyspergowanego proszku krystalicznych lub bezpostaciowych soli kwasu mlekowego, wybranych spośród: mleczanu wapnia, mleczanu sodu, mleczanu potasu, mleczanu magnezu, stanowiących dodatkowe źródło kwasu mlekowego.
4. 4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się podłoże z napełniaczami ceramicznymi w postaci nanocząstek lub mikrocząstek w postaci proszku lub granul ceramicznych, wybranych spośród stechiometrycznych i niestechiometrycznych fosforanów wapnia, węglanów wapnia, tlenków krzemu oraz materiałów wielofazowych z tych grup.
5. 5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się podłoże z dodatkiem substancji uwalniających czynniki wzrostu, przy czym polimery i kopolimery są korzystnie z napełniaczem w p ostaci proszku lub granul demineralizowanej matrycy kostnej.
6. 6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że nanoszonymi komórkami są komórki o potencjale osteogennym, a zwłaszcza izolowane z tkanki kostnej, lub komórki progenitorowe, w tym mezenchymalne komórki izolowane z tkanki tłuszczowej, szpiku kostnego, krwi obwodowej, tkanek płodowych i/lub komórki o potencjalne angiogennym, a zwłaszcza izolowane ze śródbłonka naczyń, komórki progenitorowe, i/lub komórki o fenotypie osteoklastów.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że komórkami osadzonymi w rusztowaniu są wspólnie komórki o różnym fenotypie i różnym potencjale.
8. 8. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że nanoszonymi komórkami są korzystnie komórki izolowane z tkanek ssaczych, korzystnie ludzkich, wykazujących zgodność gatunkową, a w przypadku zastosowania produktu u człowieka korzystnie w układzie autogennym.
9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że komórkami budującymi podłoże są dowolne komórki produkujące macierz pozakomórkową charakterystyczną dla tkanki łącznej.
10. 10. Produkt inżynierii tkankowej do rekonstrukcji i regeneracji tkanki kostnej, który stanowi biodegradowalne podłoże o rozwiniętym kształcie, z mieszaniny polimerów/kopolimerów kwasu mlekowego, ewentualnie modyfikowanych przez dodatek napełniaczy, z żywymi komórkami o potencjale osteogennym lub innymi komórkami zdolnymi do wydzielania kolagenu typu I, znamienny tym, że złożony jest w co najmniej 80% z macierzy komórkowej wytworzonej in vitro przez komórki osadzone w tym rusztowaniu sposobem określonym w zastrzeżeniu 1.
11. 11. Produkt według zastrz. 10, znamienny tym, że podłoże stanowią polimery i kopolimery kwasu mlekowego, wybrane spośród PLA, D-PLA, L-PLA, LD-PLA i kopolimery blokowe, szczepione lub statystyczne wymienionych odmian PLA ze sobą i z PGA, PEG i PCL.
12. 12. Produkt według zastrz. 10, znamienny tym, że podłoże zawiera napełniacz wybrany spośród zdyspergowanego proszku krystalicznych lub bezpostaciowych soli kwasu mlekowego wybranych spośród: mleczanu wapnia, mleczanu sodu, mleczanu potasu, mleczanu magnezu stanowiących dodatkowe źródło kwasu mlekowego.
13. 13. Produkt według zastrz. 10, znamienny tym, że podłoże zawiera napełniacz ceramiczny wybrany spośród nanocząstek lub mikrocząstek w postaci proszku lub granul ceramicznych, szczególnie stechiometrycznych i niestechiometrycznych fosforanów wapnia, węglanów wapnia, tlenków krzemu oraz materiałów wielofazowych z tych grup.
14. 14. Produkt według zastrz. 10, znamienny tym, że komórkami o potencjale osteogennym są komórki izolowane z tkanki kostnej, lub komórki progenitorowe, w tym mezenchymalne komórki izolowane z tkanki tłuszczowej, szpiku kostnego, krwi obwodowej, tkanek płodowych i/lub komórki o poten18

    PL 223 475 B1 cjale angiogennym, a zwłaszcza izolowane ze śródbłonka naczyń, komórki progenitorowe, i/lub komórki o fenotypie osteoklastów.
15. 15. Produkt według zastrz. 10, znamienny tym, że komórkami są wspólnie komórki o różnym fenotypie i różnym potencjale.
16. 16. Produkt według zastrz. 10, znamienny tym, że komórkami są komórki izolowane z tkanek ssaczych, korzystnie ludzkich, wykazujących zgodność gatunkową, a w przypadku zastosowania produktu u człowieka korzystnie w układzie autogennym.
17. 17. Produkt według zastrz. 10, znamienny tym, że komórkami są dowolne komórki produkujące macierz pozakomórkową charakterystyczną dla tkanki łącznej.