PL213855B1

PL213855B1 - Zestaw do wykrywania albo przeżyciowego izolowania bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus w analizowanej próbce

Info

Publication number: PL213855B1
Application number: PL383366A
Authority: PL
Inventors: Wlodzimierz Przewodowski
Original assignee: Inst Hodowli I Aklimatyzacji Roslin
Priority date: 2007-09-16
Filing date: 2007-09-16
Publication date: 2013-05-31
Also published as: PL383366A1

Abstract

Zestaw do wykrywania obecności bakterii w analizowanej próbce charakteryzuje się tym, że zawiera zasadniczo ziarnisty immunosorbent posiadający powierzchnię aktywowaną chemicznie ze złotem koloidalnym i immobilizowanymi przeciwciałami specyficznymi wobec wybranego antygenu bakteryjnego. Ujawniono zastosowanie zestawu do wykrywania albo przeżyciowego izolowania wybranych bakterii.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zestaw immunosorpcyjny do wykrywania albo przeżyciowego izolowania bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus w analizowanej próbce mający zastosowanie w przemyśle spożywczym i rolnictwie.

Dekstran, którego przykładem jest popularnie stosowane złoże Sephadex, jest naturalnym hydrożelem, o bardzo mocno rozwiniętej powierzchni. Podobnie jak powierzchnie szklane, dekstran pokrywają grupy hydroksylowe, przez co może być aktywowany chemicznie (Jurado i Jarrett 2003, Karmarkar i in. 2006), bądź też na drodze reakcji fotochemicznej (Kim i in. 1999). Powszechnie stosowanym sposobem aktywacji chemicznej dextranu (Sephadex) jest stosowanie CNBr (Jurado i Jarrett 2003) oraz poprzez aminację środkami takimi jak np. APTES. Znany jest również sposób oksydacji ziaren Sephadex przez stosowanie NaIO4 (Miksa i in. 2004). Jest to bardzo dobre podłoże do immobilizacji i enzymów (Bilkova i in. 1997, Goncalves i in. 1999), pozwalające jednocześnie na oczyszczanie i separację białek oraz innych biomolekuł (Kaseda i in. 2001, Karmarkar i in. 2006). Złoże Sephadex jest również powszechnie wykorzystywane bez dodatkowych modyfikacji powierzchni do oczyszczania różnego rodzaju biomolekuł w filtracji żelowej (Bilkova i in. 1999).

Chitozan, będący deacetylowaną formą chityny jest użytecznym podłożem zarówno dla enzymów (Krajewska 2004, Luo i in. 2005, Yang i in. 2006), DNA (Cai i in. 2002) i przeciwciał (Lei i in. 2003, Deng i in. 2004). Ze względu na obecność pierwszorzędowych grup aminowych i grup hydroksylowych może być modyfikowany chemicznie aldehydem glutarowym (Krajewska 2004) oraz złotem koloidalnym (Huang i Yang 2003, Luo i in. 2004). Ponadto posiada wiele cennych właściwości biologicznych (np. biodegradowalność, biokompatybilność, bioaktywność) i chemicznych (polikation, hydrożel), przez co stanowi środowisko mające korzystny wpływ na trwałość i aktywność związanych białek (Cai i in 2002, Denkbas i in 2002, Borges i in 2005). Celem wynalazku jest uzyskanie czułego immunosorbentu o dużej powierzchni sorpcyjnej do szybkiego wyłapywania komórek bakteryjnych bezpośrednio w ekstrakcie tkankowym.

Pierwszym przedmiotem wynalazku jest zestaw do przyżyciowego wykrywania bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus obecności w analizowanej próbce, charakteryzujący się tym, że zawiera ziarnisty immunosorbent poli węglowodanowy lub mineralny mający postać szklanych mikrokulek o wielkości od 10 do 40 μm, posiadający powierzchnie aktywowaną chemicznie z osadzanym kowalencyjnie złotem koloidalnym i immobilizowanymi przeciwciałami specyficznymi wobec wybranego antygenu bakteryjnego wobec Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, przy czym przeciwciała specyficzne wobec bakterii uzyskuje się poprzez prowadzenie immunizacji z wykorzystaniem antygenu bakteryjnego otrzymanego z komórek bakterii poprzez przemywanie bakterii roztworem buforowym wybranym spośród roztworu buforowego glicyna - HCl lub roztworu buforowego glicyna - NaOH. Równie korzystnie Zestaw według wynalazku charakteryzuje się tym, że przeciwciała są dodatkowo wyznakowane znacznikiem. W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku zestaw według wynalazku charakteryzuje się tym, że znacznik jest wybranym spośród: złota koloidalnego, enzymu, barwnika fluorescencyjnego lub fluorochromu. Korzystniej zestaw według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera dodatkowo składniki pokarmowe dla immobilizowanych komórek bakteryjnych. Najkorzystniej zestaw według wynalazku charakteryzuje się tym, że składniki pokarmowe wybiera się spośród: pożywek selektywnych, półselektywnych lub mineralnych.

Drugim przedmiotem wynalazku jest zastosowanie zestawu zdefiniowanego w pierwszym przedmiocie wynalazku do wykrywania albo przeżyciowego izolowania wybranych bakterii.

W niniejszym wynalazku uzyskano dogodny immunosorbent poprzez wykorzystanie materiału ziarnistego w postaci złoża Sephadex (lub mikrosfer szklanych), które pokrywano kowalencyjnie chitozanem i złotem koloidalnym uprzednio modyfikując chemicznie (poprzez APTES, aldehyd glutarowy i aminocysteinę). Sam w sobie Sephadex (lub mikrosfery szklane) są materiałami stosunkowo tanimi, łatwo dostępnymi i funkcjonalnymi. Oba złoża mają postać mikrocząsteczek kilku do kilkudziesięciokrotnie większych od wielkości bakterii i są od nich znacznie cięższe. Cecha taka pozwala na wykorzystanie tych zalet do wiązania i ekstrakcji bakterii i innych biomolekuł (wirusów, białek, itd.) z badanego roztworu bez stosowania dodatkowych urządzeń typu wirówka. Istotne zalety jakie uzyskano w niniejszym wynalazku to: możliwość wiązania różnych biomolekuł na powierzchni złota koloidalnego, który jako podłoże sorbcyjne niesie ze sobą wiele korzystnych cech, zwiększona powierzchnia sorbcyjna podłoża, możliwość kowalencyjnego unieruchomienia immunoglobulin i innych biomolekuł, Sephadex jako hydrożel w postaci mikrosfer aktywowanych przeciwciałami na dane bakterie, pozwala

PL 213 855 B1 na łatwy i szybki kontakt niesionych przeciwciał z interesującymi nas bakteriami. Niemodyfikowane cząsteczki złoża Sephadex dosyć długo dekantują. Po „obciążeniu” ich warstewką złota koloidalnego okludującą na powierzchni Sephadex-u, osadzenie na dnie wszystkich mikrocząsteczek zajmuje zaledwie 2-3 minuty. Nie trzeba więc stosować dodatkowych czynności typu odwirowywanie na wirówce, żeby przepłukać i oddzielić mikrosfery z zanieczyszczonego roztworu.

P r z y k ł a d 1. Sephadex lub mikrosfery szklane ze złotem koloidalnym

Porcję oczyszczonych mikrosfer aktywowano chemicznie w temperaturze w zakresie 4-37°C każdorazowo traktując przez 15-60 minut trzykrotną objętością odpowiedniego roztworu modyfikującego i płucząc pięciokrotnie dziesięcioma objętościami 2 x dest. H2O po każdym z etapów modyfikacji. Stosowano kolejno 0,5-25% roztwór APTES w 96% etanolu, 0,06-25% wodny roztwór aldehydu glutarowego, 0,001-1% roztwór chitozanu w 0,01% kwasie octowym, 0,0001-1 M wodny roztwór cysteaminy oraz roztwór złota koloidalnego o gęstości optycznej OD = 0,05-10,0. Mikrosfery szklane aktywowano chemicznie, osadzono złotem koloidalnym, i immobilizowano przeciwciałami j.w.

P r z y k ł a d 2. Wykrywanie bakterii przez immunosorpcję na ziarnach Sephadex (lub mikrosferach szklanych).

Mikrosfery Sephadex ze złotem koloidalnym pokrywano przeciwciałami IgG anty-Cms (0,0005-5 mg/ml) w 0,001-2 M buforze boranowym pH 9,2 i inkubowano 30 minut do 2 godzin w temperaturze w zakresie 4-37°C. Po usunięciu nadmiaru niezwiązanych przeciwciał, w celu zablokowania pozostałej powierzchni mikrosfer dodano dwie objętości 0,1-15% roztworu albuminy wołowej, przepłukano trzykrotnie 10-cioma objętościami roztworu TBS-BSA pH 8,2 i umieszczono w temperaturze 4°C.

Sporządzano ekstrakt z tkanki bulw ziemniaka podejrzanych o infekcję bakteriami Cms i dodano bufor 1xPBS pH 7,4 w stosunku 1:1. Do oddzielnych probówek Eppendorf wpipetowano po 2 ml roztworu i dodano po 10-50 μΐ ziaren immunosorbenta (Sephadex ze złotem koloidalnym pokrytych przeciwciałami anty-Cms przygotowanych jak w przykładzie 1). Całość inkubowano 15 minut - 2 godzin w temperaturze pokojowej łagodnie kołysząc, aby utrzymać mikrosfery w roztworze. Po zatrzymaniu mieszania i samoistnej sedymentacji, usunięto roztwór znad ziaren Sephadex i płukano przy pomocy buforu 1xPBS pH 7,4 z 0,05% Tween 20 usuwając w ten sposób nadmiar niezwiązanych bakterii. Czynność powtarzano ponownie dwukrotnie, a następnie bakterie pułapkowane na ww. immunosorbentach oceniano dwoma sposobami:

testem przyżyciowym przez wysianie mikrosfer bezpośrednio na pożywkę półselektywną lub immunoenzymatycznie stosując jako znacznik koniugat IgG anty-Cms z enzymem alkaliczną fosfatazą i inkując z roztworem substratowym z substratem dla AP - pNPP dokonując pomiarów absorbancji przy λ = 405 nm po 1, 2 i 4 godzinach inkubacji.

Test z użyciem mikrosfer szklanych przeprowadza się analogicznie jak dla ziaren Sephadex.

Zalety opisanego testu:

- szybki kontakt mikrosfer z bakteriami

- test umożliwia ocenę przyżyciową bakterii Cms poprzez bezpośrednie wysianie bakterii wyłapanych na powierzchni immunosorbenta na podłożu selektywnym

- uzyskane w ten sposób bakterie są pozbawione obecności innych drobnoustrojów obecnych w tkance, które przy bezpośrednim powiewie rosnąc o wiele szybciej niż interesujące nas bakterie, tłumią ich wzrost. Na podstawie uzyskanych wyników mogę stwierdzić jedynie nieznaczny udział obcych bakterii w stosunku wykrywanych (Tabela 1).

- czułość wykrywania osiągnięta przy pomocy tak wytworzonego podłoża metodą przyżyciową jest równa czułości metod molekularnych, ponieważ pozwala na wykrywanie ok. 50 jtk/ml bez zbędnego sprzętu i czasu w przypadku metod molekularnych.

T a b e l a 1. Detekcja bakterii Cms testem przyżyciowym z wykorzystaniem mikrosfer szklanych i Sephadex. Wynik po 10 dniach inkubacji mikrosfer na pożywce.

Bakterie	Mikrosfery szklane ze złotem koloidalnym	Sephadex ze złotem koloidalnym
1	2	3
[CFU/ml]	Suma kolonii/liczbę powtórzeń	Suma kolonii/liczbę powtórzeń
0	0 (2 obce kolonie)/2	0/2
5*10¹	4/3	7/3

PL 213 855 B1 cd. tabeli 1

1	2	3
10²	10/3	18 (4 obce kolonie)/3
5*10²	39 (3 obce kolonie)/3	48 (2 obce kolonie)/3
10³	87/3	165/3

- czułość wykrywania osiągnięta przy pomocy tak wytworzonego podłoża metodą immunoenzymatyczną pozwala na wykrywanie ok. 500 jtk/ml bez zbędnego sprzętu i czasu w przypadku metod molekularnych. Poniżej podano porównanie przed i po modyfikacji ziaren Sephadex mikrosfer szklanych.

T a b e l a 2. Detekcja bakterii Cms testem ELISA z wykorzystaniem mikrosfer szklanych i Sephadex. Wynik po 1 godz. inkubacji z substratem dla AP - pNPP. Wartości istotnie różniące się od tła zaznaczono pogrubioną czcionką.

Bakterie	Mikrosfery szklane modyfikowane standartowo	Sephadex modyfikowany standartowo	Mikrosfery szklane ze złotem koloidalnym	Sephadex ze złotem koloidalnym
[CF U/ml]	E 405	SD	E 405	SD	E 405	SD	E 405	SD
0	0,043	0,004	0,123	0,015	0,044	0,004	0,156	0,019
10²	0,028	0,003	0,012	0,001	0,024	0,002	0,102	0,012
5*10²	0,042	0,004	0,123	0,015	0,218	0,022	0,458	0,055
10³	0,111	0,011	0,225	0,027	0,604	0,060	0,658	0,079
10⁴	0,166	0,017	0,492	0,059	0,835	0,083	0,973	0,117
10⁵	0,215	0,021	0,702	0,084	0,865	0,086	1,302	0,156

Inne realizacje testu przewidują jego zastosowanie w stosunku do innych bakterii.

P r z y k ł a d 3

Mikrosfery Sephadex ze złotem koloidalnym pokrywano przeciwciałami IgG anty-Cms 0,05 mg/ml w 0,01 buforze boranowym pH 9,2 i inkubowano 30 minut w temperaturze w zakresie 37°C. Po usunięciu nadmiaru niezwiązanych przeciwciał, w celu zablokowania pozostałej powierzchni mikrosfer dodano dwie objętości 10% roztworu albuminy wołowej, przepłukano trzykrotnie 10-cioma objętościami roztworu TBS-BSA pH 8,2 i umieszczono w temperaturze 4°C.

Sporządzano ekstrakt z tkanki bulw ziemniaka podejrzanych o infekcję bakteriami Cms i dodano bufor 1xPBS pH 7,4 w stosunku 1:1. Do oddzielnych probówek Eppendorf wpipetowano po 2 ml roztworu i dodano po 30 μΐ ziaren immunosorbenta Sephadex ze złotem koloidalnym pokrytych przeciwciałami anty-Cms. Całość inkubowano 30 minut w temperaturze pokojowej łagodnie kołysząc, aby utrzymać mikrosfery w roztworze. Po zatrzymaniu mieszania i samoistnej sedymentacji, usunięto roztwór znad ziaren Sephadex i płukano przy pomocy buforu 1xPBS pH 7,4 z 0,05% Tween 20 usuwając w ten sposób nadmiar niezwiązanych bakterii. Czynność powtarzano ponownie dwukrotnie, a następnie bakterie pułapkowane na ww. immunosorbentach oceniano immunoenzymatycznie stosując jako znacznik koniugat IgG anty-Cms z enzymem alkaliczną fosfatazą i inkubując z roztworem substratowym z substratem dla AP - pNPP dokonując pomiarów absorbancji przy λ = 405 nm po 1, 2 i 4 godzinach inkubacji.

P r z y k ł a d 4

Mikrosfery Sephadex ze złotem koloidalnym pokrywano przeciwciałami skierowanymi na bakterie Erwinia carotovora subsp. carotovora 0,05 mg/ml w 0,01 buforze boranowym pH 9,2 i inkubowano 30 minut w temperaturze w zakresie 37°C. Po usunięciu nadmiaru niezwiązanych przeciwciał, w celu zablokowania pozostałej powierzchni mikrosfer dodano dwie objętości 10% roztworu albumin wołowej, przepłukano trzykrotnie 10-cioma objętościami roztworu TBS-BSA pH 8,2 i umieszczono w temperaturze 4°C.

PL 213 855 B1

Sporządzano ekstrakt z tkanki bulw ziemniaka podejrzanych o infekcję bakteriami Ecc i dodano bufor 1xPBS pH 7,4 w stosunku 1:1. Do oddzielnych probówek Eppendorf wpipetowano po 2 ml roztworu i dodano po 30 μΐ ziaren immunosorbenta Sephadex ze złotem koloidalnym pokrytych przeciwciałami anty-Cms. Całość inkubowano 30 minut w temperaturze pokojowej łagodnie kołysząc, aby utrzymać mikrosfery w roztworze. Po zatrzymaniu mieszania i samoistnej sedymentacji, usunięto roztwór znad ziaren Sephadex i płukano przy pomocy buforu 1xPBS pH 7,4 z 0,05% Tween 20 usuwając w ten sposób nadmiar niezwiązanych bakterii. Czynność powtarzano ponownie dwukrotnie, a następnie bakterie pułapkowane na ww. immunosorbentach oceniano immunoenzymatycznie stosując jako znacznik koniugat IgG anty-Cms z enzymem alkaliczną fosfatazą i inkubując z roztworem substratowym z substratem dla AP - pNPP dokonując pomiarów absorbancji przy λ = 405 nm po 1, 2 i 4 godzinach inkubacji.

Claims

1. Zestaw do przyżyciowego wykrywania bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus obecności w analizowanej próbce, znamienny tym, że zawiera ziarnisty immunosorbent poliwęglowodanowy lub mineralny mający postać szklanych mikrokulek o wielkości od 10 do 40 μm posiadający powierzchnie aktywowaną chemicznie z osadzanym kowalencyjnie złotem koloidalnym i immobilizowanymi przeciwciałami specyficznymi wobec wybranego antygenu bakteryjnego wobec Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, przy czym przeciwciała specyficzne wobec bakterii uzyskuje się poprzez prowadzenie immunizacji z wykorzystaniem antygenu bakteryjnego otrzymanego z komórek bakterii poprzez przemywanie bakterii roztworem buforowym wybranym spośród roztworu buforowego glicyna - HCl lub roztworu buforowego glicyna - NaOH.

2. Zestaw według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciała są dodatkowo wyznakowane znacznikiem.

3. Zestaw według zastrz. 2, znamienny tym, że znacznik jest wybranym spośród: złota koloidalnego, enzymu, barwnika fluorescencyjnego lub fluorochromu.

4. Zestaw według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera dodatkowo składniki pokarmowe dla immobilizowanych komórek bakteryjnych.

5. Zestaw według zastrz. 4, znamienny tym, że składniki pokarmowe wybiera się spośród: pożywek selektywnych, półselektywnych lub mineralnych.

6. Zastosowanie zestawu jak określono w jakimkolwiek zastrz. od 1 do 5 do wykrywania albo przeżyciowego izolowania wybranych bakterii.