PL212620B1 - Membrana poliolefinowa do izolacji mikroorganizmów Gram (+) i sposób jej wytwarzania - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest membrana poliolefinowa i sposób jej przygotowania przez modyfikację mikroporowatych membran poliolefinowych, do immunoizolacji bakterii Gram dodatnich.

Mikroporowate membrany poliolefinowe są znane od lat i wykonywane różnymi metodami. Według opisu zgłoszeniowego niemieckiego nr DE3026718 A1, opisującego produkcję kapilar polipropylenowych, gorący roztwór polimeru wytłacza się przez odpowiednio ukształtowaną dyszę do fajki przędzalniczej, zawierającej ciecz chłodzącą, a następnie z otrzymanych kapilar ekstrahuje się rozpuszczalnik. W patencie europejskim nr EPO I 0860 1 A2 oraz w opisie patentowym USA nr 3 801 404, opisano sposób otrzymywania płaskich membran polipropylenowych, polegający na wytwarzaniu mikroporowatych filmów przez rozciąganie na zimno lub na gorąco folii polipropylenowej. Opis patentowy niemiecki nr DE 3205289 C2 ujawnia składy mieszanin rozpuszczalników polimeru. Generalnie, standardowa membrana polipropylenowa jest przygotowana przez podgrzanie około 30% wagowych polipropylenu i 70% wagowych oleju lub innej cieczy o wysokiej temperaturze wrzenia w odpowiednim czasie i temperaturze do uformowania jednorodnego roztworu, przez wytłaczanie lub wylewanie roztworu na schłodzoną powierzchnię.

Inne dane na temat poliolefinowych włókien do plazmaforezy są trudno dostępne.

Enkapsulacja materiału biologicznego w membranie półprzepuszczalnej, pozwalająca na odseparowanie tego materiału od wytwarzanych przezeń produktów może znaleźć bezpośrednie zastosowanie biotechnologiczne, bądź umożliwić immunoizolację, która jest ważnym czynnikiem w oddzieleniu żywego przeszczepu od układu immunologicznego organizmu bez potrzeby stosowania immunosupresji. Układ materiału biologicznego, produkującego substancje biologicznie czynne, enkapsulowanego w membranie i wszczepionego biorcy, może spełniać rolę terapeutyczną.

Przykładowo, układ enkapsulowanych mikroorganizmów transfekowanych ludzkimi genami, jako źródło czynników regulacyjnych jak również przeciwnowotworowych może regulować lub modyfikować procesy biologiczne w organizmach eukariotycznych.

Skonstruowano membranę kapilarną do enkapsulacji mikroorganizmów Gram (+).

Aby ocenić przydatność membrany do enkapsulacji mikroorganizmów Gram (+), poddawano ją badaniu in vitro, sprawdzając stabilność membrany przy użyciu spektroskopii FTIR (Fourier Transformation Infrared), jakość enkapsulacji oraz funkcjonowanie enkapsulowanych w membranie mikroorganizmów.

W celu zbadania funkcjonowania enkapsulowanych w opracowanej membranie mikroorganizmów Gramm (+), enkapsulowano bakterie Bacillus subtilis transfekowane genem białka produkującego listeriolizynę, która wykazuje aktywność hemolityczną i cytolityczną, mogąc działać na błonę komórkową komórek eukariotycznych i indukować w komórkach apoptozę oraz nekrozę, co może znaleźć potencjalne zastosowanie w terapii przeciwnowotworowej.

Badano czynność enkapsulowanych w membranie bakterii Bacillus subtilis poprzez określenie ich wpływu na ludzkie limfocyty T linii komórkowej Jurkat, hodowane w ich obecności. Żywotność komórek Jurkat badano w cytometrze przepływowym. Stwierdzono spadek żywotności komórek Jurkat hodowanych w obecności opłaszczonych bakterii o 80% w porównaniu z kontrolą ujemną, którą stanowiła hodowla Jurkat w obecności pustych kapilar. Badając stabilność opracowanej membrany, wykorzystując widmo promieniowania podczerwonego (FTIR), nie stwierdzono zmian w składzie cząsteczkowym membran inkubowanych przez 1 miesiąc w środowisku symulującym fizjologiczne. Badano przepuszczalność membran wytworzonych sposobem według wynalazku i stwierdzono, że pozwalają one na transport wszelkich substancji odżywczych, niezbędnych do życia opłaszczonemu materiałowi biologicznemu, jednocześnie nie pozwalając na wydostawanie się na zewnątrz mikroorganizmów.

Podczas badań nad przydatnością różnego rodzaju membran do izolacji mikroorganizmów, stwierdzono, że stwarzają one kłopoty z zamykaniem, są zbyt kruche lub nie zapewniają dostępu substancji odżywczych do materiału biologicznego lub nie zapewniają izolacji bakterii Gram (+) od środowiska zewnętrznego, pomimo odpowiedniego punktu odcięcia gwarantującego izolację i funkcjonowanie bakterii Gram (-).

Badano między innymi membrany z polipropylenu nie modyfikowanego, polietylenu, mieszanin polietylen-polipropylen. Okazało się, że nadają się one do plazmaforezy, ale nie do izolacji mikroorganizmów Gram (+).

PL 212 620 B1

Znane membrany według patentów PL175147, oraz patentu PL189940, gwarantują immunoizolację komórek i zapobiegają obrastaniu tkanką łączną we wszczepie, jednak nie znajdują zastosowania w immunoizolacji mikroorganizmów.

W związku z potrzebą immunoizolacji mikroorganizmów Escherichia coli, do badań biomedycznych, powstał problem związany z faktem, iż membrana o punkcie odcięcia teoretycznie gwarantującym nieprzechodzenie bakterii na zewnątrz, nie spełnia swojej roli. Opracowano membranę zapewniającą ich immunoizolację i udowodniono jej skuteczność in vivo we wszczepie u gryzoni (zgłoszenie P-380587, 07.09.2006).

Ostatnio, zaistniała potrzeba izolacji, dla celów biotechnologicznych, bakterii Bacillus subtilis, które są bakteriami Gram (+), posiadającymi wielowarstwową ścianę komórkową (wszystkich warstw jest zwykle ok. 40 i są one ze sobą połączone poprzecznymi wiązaniami), pozwalającą im zmieniać charakter z hydrofilowego na hydrofobowy i odwrotnie, co czyni dobór membrany do izolacji bardzo trudnym.

Zupełnie nieoczekiwanie, okazało się, iż membrana modyfikowana zaadsorbowanymi polielektrolitami, opisana w niniejszym zgłoszeniu, pozwala zapobiec wydostawaniu się bakterii Gram (+) na zewnątrz membrany, co ma zastosowanie biotechnologiczne.

Nieoczekiwanie, sposobem według wynalazku można otrzymać membrany modyfikowane, pozwalające na izolację nie tylko komórek Eukariota i mikroorganizmów Gram (-), ale również mikroorganizmów Gram (+), nie ograniczające jednocześnie transportu substancji odżywczych przez membranę i pozwalające na ich normalne funkcjonowanie, zapobiegające wydostawaniu się mikroorganizmów Gram dodatnich na zewnątrz.

Membrana poliolefinowa, do izolacji mikroorganizmów, według wynalazku charakteryzuje się tym, że na podłożu z materiału poliolefinowego ma naniesioną co najmniej jedną biwarstwę, utworzoną kolejno z warstwy polikationu, wybranego z grupy obejmującej aminokwasy alifatyczne, zwłaszcza białkowe, a następnie warstwy z polianionu, wybranego z grupy obejmującej aminy II lub III rzędowe, korzystnie zawierającego grupy etylowe lub metylowe.

Membrana poliolefinowa, do izolacji mikroorganizmów, według wynalazku korzystnie, zawiera biwarstwę w której warstwa polikationu, zwłaszcza alifatycznego aminokwasu białkowego, najkorzystniej polarnego, ma grubość od 4 ąm do 20 ąm, a warstwa polianionu zwłaszcza polimeru aminy alifatycznej II lub III rzędu, korzystnie zawierającego grupy etylowe lub metylowe, ma grubość od 4 ąm do 20 ąm.

Sposób wytwarzania mikroporowatych membran poliolefinowych do izolacji mikroorganizmów Gram (+), według wynalazku polega na tym, że w strukturę membrany poliolefinowej o wysokiej porowatości wprowadza się w znany sposób, korzystnie przez moczenie, roztwór polimeru białkowego aminokwasu, wybranego z grupy obejmującej aminokwasy alifatyczne, korzystnie polarne, korzystnie rozpuszczony w roztworze NaCI, a następnie w strukturę membrany wprowadza się w znany sposób, korzystnie przez moczenie, roztwór polimeru aminy II lub III rzędowej, wybranej z grupy obejmującej aminy alifatyczne, zwłaszcza metyloaminy i/lub etyloaminy, korzystnie zawierające 100% grup metylowych lub etylowych, rozpuszczony w roztworze NaCI.

W sposobie według wynalazku, korzystnie wprowadza się roztwór polimeru białkowego aminokwasu w roztworze NaCI, o stężeniu o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych, korzystnie przy pH 7,0-7,6.

W sposobie według wynalazku, korzystnie wprowadza się roztwór polimeru białkowego aminokwasu w roztworze NaCI 0,05-0,5 M, o stężeniu 0,05-0,2% objętościowych.

W sposobie według wynalazku korzystnie poddaje się membranę kąpieli w roztworze polimeru aminokwasu alifatycznego pod ciśnieniem 0,05-0,10 MPa w temperaturze 12-40°C, w czasie 10 minut, a przygotowane w ten sposób kapilary, ewentualnie, moczy się w soli fizjologicznej.

W sposobie według wynalazku korzystnie poddaje się membranę kąpieli w roztworze polimeru aminy II lub III rzędowej zawierającego grupy etylowe pod ciśnieniem 0,04-0,09 MPa w temperaturze 12-45°C, w czasie 10 minut, a przygotowane w ten sposób kapilary ewentualnie moczy się w soli fizjologicznej.

W sposobie według wynalazku, korzystnie wprowadza się roztwór polimeru aminy II lub III rzędowej w roztworze NaCI, o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych, przy pH 7,0-7,6.

W sposobie według wynalazku, korzystnie wprowadza się roztwór polimeru aminy II lub III rzędowej w roztworze NaCI 0,05-0,5 M, korzystnie o stężeniu 0,05-0,2% objętościowych.

Sposób według wynalazku polega na utworzeniu, co najmniej jednej biwarstwy polielektrolitów na membranie poliolefinowej stanowiącej podłoże. Polielektrolity przygotowuje się przez rozpuszczenie

PL 212 620 B1 polimerów w roztworze NaCI o odpowiednim pH. Membranę poliolefinową poddaje się kąpieli w roztworze kolejno polikationu, a następnie polianionu w odpowiednio dobranych warunkach ciśnieniowych, w odpowiedniej temperaturze i czasie tak, aby biwarstwa polielektrolitów została zaadsorbowana przez podłoże. Procedurę można powtórzyć kilkakrotnie. Tak przygotowane kapilary moczy się jeszcze ewentualnie w soli fizjologicznej.

Najkorzystniejsza wersja sposobu polega na tym, że kapilary starannie umyte i wysuszone zanurza się w pojemniku z roztworem polikationu będącego polimerem białkowego aminokwasu polarnego w roztworze NaCI na okres 5-15 minut w komorze ciśnieniowej przy odpowiednim ciśnieniu i w temperaturze od 5-40°C. Roztwór polielektrolitów może wypełniać całkowicie pory membrany lub pokrywać tylko elementy struktury membrany, pozostawiając pory otwarte. Po wyjęciu kapilary poddaje się ją moczeniu w soli fizjologicznej. Następnie, kapilary zanurza się w pojemniku z roztworem polianionu, będącego polimerem aminy II lub III rzędowej w roztworze NaCI, zawierającego grupy etylowe na okres 5-15 minut w komorze ciśnieniowej przy odpowiednim ciśnieniu i w temperaturze od 5-45°C. Polielektrolit może wypełniać całkowicie pory membrany lub pokrywa elementy struktury membrany. Po wyjęciu kapilary poddaje się ją moczeniu w soli fizjologicznej. Procedurę korzystnie jest powtórzyć.

Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku, nie ograniczające jego zakresu.

P r z y k ł a d I.

Kapilary polipropylenowe, umyte i wysuszone, moczy się przez 15 minut w roztworze poli-L-lizyny w roztworze NaCI 0,5 M, o stężeniu 0,3% obj., po czym wymoczone kapilary umieszcza się w kąpieli z soli fizjologicznej w 20°C na 10 minut. Następnie, kapilary poddaje się moczeniu w roztworze polietylenoiminy (100% grup etylowych) w roztworze NaCI 0,5 M, o stężeniu 0,3% obj., po czym wymoczone kapilary umieszcza się w kąpieli z soli fizjologicznej w 20°C na 10 minut, a następnie powtarza się procedurę.

P r z y k ł a d II.

Kapilary polipropylenowe, umyte i wysuszone, moczy się przez 10 minut w roztworze poli-L-argininy w roztworze NaCI 0,1M o stężeniu 0,05% obj., po czym kapilary suszy się w temperaturze pokojowej w nawiewie powietrza. Następnie, kapilary poddaje się moczeniu w roztworze polietylenoiminy (100% grup etylowych) w roztworze NaCI 0,1M o stężeniu 0,05% obj., po czym wymoczone kapilary umieszcza się w nagrzewnicy termostatowej w 4°C na 15 minut.

P r z y k ł a d III.

Kapilary polipropylenowe, umyte, poddaje się kąpieli w roztworze poli-L-Iizyny w roztworze NaCI 0,3 M, o stężeniu 0,5% objętościowych, po czym wymoczone kapilary umieszcza się w nagrzewnicy termostatowej w temperaturze pokojowej na 10 minut. Następnie, kapilary poddaje się moczeniu w roztworze polimetyloiminy (100% grup metylowych) w roztworze NaCI 0,3 M, o stężeniu 0,4% obj., po czym wymoczone kapilary umieszcza się w nagrzewnicy termostatowej w temperaturze pokojowej na 30 minut. Następnie, kapilary poddaje się kąpieli w roztworze poli-L-lizyny w roztworze NaCI 0,3 M, o stężeniu 0,5% objętościowych, po czym wymoczone kapilary umieszcza się w nagrzewnicy termostatowej w temperaturze pokojowej na 10 minut. Następnie, kapilary poddaje się moczeniu w roztworze polimetyloiminy (100% grup metylowych) w roztworze NaCI 0,3 M, o stężeniu 0,4% obj., po czym wymoczone kapilary suszy się w temperaturze pokojowej w nawiewie powietrza.

Claims (7)

1. Membrana poliolefinowa, do izolacji mikroorganizmów Gram (+), znamienna tym, że na podłożu z materiału poliolefinowego ma naniesioną co najmniej jedną biwarstwę, utworzoną kolejno z warstwy polikationu - aminokwasu alifatycznego, zwłaszcza białkowego, a następnie warstwy z polianionu, stanowiącego aminy II lub III rzędowe, korzystnie zawierające grupy etylowe lub metylowe.

2. Membrana według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera co najmniej jedną biwarstwę, w której warstwa polikationu, zwłaszcza alifatycznego aminokwasu białkowego, zwłaszcza polarnego, ma grubość od 4 pm do 20 pm, a warstwa polianionu zwłaszcza polimeru aminy alifatycznej II lub III rzędu, zawierającej grupy etylowe lub metylowe, ma grubość od 4 pm do 20 pm.

3. Sposób wytwarzania membran poliolefinowych do izolacji mikroorganizmów Gram (+), przez modyfikację membrany poliolefinowej, znamienny tym, że w strukturę membrany poliolefinowej o wysokiej porowatości wprowadza się w znany sposób, korzystnie przez moczenie, roztwór polimeru

PL 212 620 B1 białkowego aminokwasu, wybranego z grupy obejmującej aminokwasy alifatyczne, korzystnie polarne, korzystnie rozpuszczony w roztworze NaCI, a następnie w strukturę membrany wprowadza się w znany sposób, korzystnie przez moczenie, roztwór polimeru aminy II lub III rzędowej, wybranej z grupy obejmującej aminy alifatyczne, zwłaszcza metyloaminy i/lub etyloaminy, korzystnie zawierające 100% grup metylowych lub etylowych, rozpuszczony w roztworze NaCI, przy czym do wprowadzania stosuje się roztwór polimeru białkowego aminokwasu, w roztworze NaCI 0,05-0,5 M, korzystnie o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych, a roztwór polimeru aminy II lub III rzędowej w roztworze o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych, korzystnie przy pH 7,0-7,6

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że do wprowadzania stosuje się roztwór polimeru białkowego aminokwasu, w roztworze NaCI 0,05-0,5 M, o stężeniu 0,05-0,2% objętościowych.

5. Sposób według zastrz. 3 albo 4, znamienny tym, że membranę poddaje się kąpieli w roztworze polimeru aminokwasu alifatycznego pod ciśnieniem 0,05-0,10 MPa w temperaturze 12-40°C, w czasie 10 minut, a przygotowane w ten sposób kapilary, ewentualnie, moczy się w soli fizjologicznej.

6. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że poddaje się membranę kąpieli w roztworze polimeru aminy II lub III rzędowej zawierającego grupy metylowe lub etylowe pod ciśnieniem 0,04-0,09 MPa w temperaturze 12-45°C, w czasie 10 minut, a przygotowane w ten sposób kapilary, ewentualnie, moczy się w soli fizjologicznej.

7. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wprowadza się roztwór polimeru aminy II lub III rzędowej w roztworze NaCI, o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych, przy pH 7,0-7,6.

7. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wprowadza się roztwór polimeru aminy II lub III rzędowej w roztworze NaCI 0,05-0,5 M, o stężeniu 0,05-0,2% objętościowych.