PL226841B1 - Membrana polielektrolitowa do izolacji mikroorganizmów, Gram (-) iGram (+) oraz sposób jejwytwarzania - Google Patents

Membrana polielektrolitowa do izolacji mikroorganizmów, Gram (-) iGram (+) oraz sposób jejwytwarzania

Info

Publication number
PL226841B1
PL226841B1 PL402667A PL40266713A PL226841B1 PL 226841 B1 PL226841 B1 PL 226841B1 PL 402667 A PL402667 A PL 402667A PL 40266713 A PL40266713 A PL 40266713A PL 226841 B1 PL226841 B1 PL 226841B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
concentration
volume
solution
gram
fulerenol
Prior art date
Application number
PL402667A
Other languages
English (en)
Other versions
PL402667A1 (pl
Inventor
Ludomira Granicka
Magdalena Borkowska
Anna Grzeczkowicz
Radosław Stachowiak
Jacek Bielecki
Original Assignee
Inst Biocybernetyki I Inżynierii Biomedycznej Im Macieja Nałęcza Polskiej Akademii
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inst Biocybernetyki I Inżynierii Biomedycznej Im Macieja Nałęcza Polskiej Akademii filed Critical Inst Biocybernetyki I Inżynierii Biomedycznej Im Macieja Nałęcza Polskiej Akademii
Priority to PL402667A priority Critical patent/PL226841B1/pl
Publication of PL402667A1 publication Critical patent/PL402667A1/pl
Publication of PL226841B1 publication Critical patent/PL226841B1/pl

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest membrana polielektrolitowa, zwłaszcza nałożona bezpośrednio na grupę izolowanych komórek, do izolacji mikroorganizmów zarówno Gram (-), jak i Gram (+) oraz sposób jej przygotowania.
Membrany polielektrolitowe są przedmiotem zainteresowania od lat 90-tych, przy czym dla zwiększenia użyteczności membran dla celów biotechnologicznych stosuje się membrany funkcjonalne, zawierające grupy zmieniające/modyfikujące ich właściwości w kierunku przewidywanych zastosowań.
Enkapsulacja materiału biologicznego w membranie półprzepuszczalnej, pozwalająca na odseparowanie tego materiału od wytwarzanych przezeń produktów może znaleźć bezpośrednie zastosowanie biotechnologiczne, bądź umożliwić immunoizolację, która jest ważnym czynnikiem w oddzieleniu materiału biologicznie aktywnego od układu immunologicznego organizmu bez potrzeby stosowania immunosupresji. Układ materiału biologicznego, produkującego substancje biologicznie czynne, enkapsulowanego w membranie i wszczepionego biorcy, może spełniać rolę terapeutyczną.
Przykładowo, układ enkapsulowanych mikroorganizmów zmodyfikowanych genetycznie, jako źródło czynników przeciwnowotworowych może modyfikować procesy biologiczne w organizmach eukariotycznych.
Skonstruowano membranę do enkapsulacji mikroorganizmów Gram (+).
Aby ocenić przydatność membrany do enkapsulacji mikroorganizmów Gram (+), poddawano ją badaniu in vitro, sprawdzając stabilność membrany przy użyciu spektroskopii FTIR (Fourier Transformation Infrared), jakość enkapsulacji oraz funkcjonowanie enkapsulowanych w membranie mikroorganizmów.
W celu zbadania funkcjonowania enkapsulowanych w opracowanej membranie mikroorganizmów Gramm (+), enkapsulowano bakterie Bacillus subtilis transfekowane genem białka produkującego listeriolizynę, która wykazuje aktywność hemolityczną i cytolityczną, mogąc działać na błonę komórkową komórek eukariotycznych i indukować w komórkach apoptozę oraz nekrozę, co może znaleźć potencjalne zastosowanie w terapii przeciwnowotworowej.
Badano czynność enkapsulowanych w membranie bakterii Bacillus subtilis poprzez określenie ich wpływu na ludzkie limfocyty T linii komórkowej Jurkat, hodowane w ich obecności. Żywotność komórek Jurkat badano w cytometrze przepływowym. Stwierdzono spadek żywotności komórek Jurkat hodowanych w obecności opłaszczonych bakterii o średnio 75% w porównaniu z kontrolą ujemną, którą stanowiła hodowla Jurkat bez obecności opłaszczonych bakterii. Badając stabilność opracowanej membrany, wykorzystując widmo promieniowania podczerwonego (FTIR), nie stwierdzono zmian w składzie cząsteczkowym membran inkubowanych przez 1 miesiąc w środowisku symulującym fizjologiczne. Badano przepuszczalność membran wytworzonych sposobem według wynalazku i stwierdzono, że pozwalają one na transport wszelkich substancji odżywczych, niezbędnych do życia opłaszczonemu materiałowi biologicznemu, jednocześnie nie pozwalając na wydostawanie się na zewnątrz mikroorganizmów.
Podczas badań nad przydatnością różnego rodzaju membran do izolacji mikroorganizmów, stwierdzono, że nie zapewniają dostępu substancji odżywczych do materiału biologicznego lub stwarzają one kłopoty z izolacją bakterii Gram (+) od środowiska zewnętrznego, pomimo odpowiedniego punktu odcięcia gwarantującego izolację i funkcjonowanie bakterii Gram (-) nie gwarantując nie wydostawania się bakterii na zewnątrz.
Badano między innymi membrany z polilizyny (PLL) i sulfonianu polistyrenu (PSS) oraz z poliaminy i sulfonianu polistyrenu. Okazało się, że nadają się one do enkapsulacji komórek eukariotycznych, ale nie zapewniają spełnienia wyżej wymienionych warunków jeśli chodzi o izolację mikroorganizmów Gram (+).
Z opisu patentowego PL 212 620 znana jest także membrana poliolefinowa, do izolacji mikroorganizmów, charakteryzująca się tym, że na podłożu z materiału poliolefinowego ma naniesioną, co najmniej jedną biwarstwę, utworzoną kolejno z warstwy polikationu, obejmującego aminokwasy alifatyczne, zwłaszcza białkowe, a następnie warstwy z polianionu, wybranego z grupy obejmującej aminy II lub III rzędowe, jakkolwiek zapewniająca izolację mikroorganizmów Gram (+), to zważywszy na jej formę - makrokapsuły, zwiększająca objętość ewentualnego wszczepu. W związku z przewid ywanym działaniem układu dla celów lokalnego dostarczania produkowanego czynnika, korzystna byłaby minimalizacja objętości wszczepu bez pogorszenia jakości izolacji materiału biologicznego.
PL 226 841 B1
Można to uzyskać stosując metodę dopasowanego opłaszczania, nakładając opracowaną membranę warstwa po warstwie.
Nieoczekiwanie okazało się, że sposobem według wynalazku można otrzymać membrany modyfikowane, zwłaszcza nałożone bezpośrednio na grupę izolowanych komórek, pozwalające na izolację nie tylko komórek Eukariota i mikroorganizmów Gram (-), ale również mikroorganizmów Gram (+), nie ograniczające transportu substancji odżywczych przez membranę, pozwalające na ich normalne funkcjonowanie, zapobiegające wydostawaniu się mikroorganizmów Gram dodatnich na zewnątrz.
Membrana polielektrolitowa, do izolacji mikroorganizmów, według wynalazku charakteryzuje się tym, że bezpośrednio na materiał biologiczny, na grupę izolowanych komórek bakteryjnych Gram (+) lub Gram (-), ma naniesioną co najmniej jedną biwarstwę, obejmującą aminokwasy alifatyczne, poli-L-argininę i/lub poli-L-lizynę, o grubości od 4 nm do 2 pm oraz powłokę z polietylenoiminy lub polimetylenoiminy, z inkorporowanym fulerenolem o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych oraz biotynę o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych o grubości od 2 pm, na której umieszczone jest medium hodowlane, RPMI-1640 oraz na nim, ewentualnie, ponownie warstwę z aminokwasów alifatycznych, poli-L-argininy lub poli-L-lizyny, a następnie warstwę polimerową z amin II lub III rzędowych, polietylenoiminy lub polimetylenoiminy, zawierających w swej strukturze inkorporowany fulerenol o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych oraz biotynę o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych.
Sposób wytwarzania półprzepuszczalnych powłok, zwłaszcza bezpośrednio na materiale biologicznym do izolacji mikroorganizmów Gram (+) lub Gram (-), według wynalazku polega na tym, że na materiał biologiczny wprowadza się przez moczenie lub kąpiel, roztwór polimeru białkowego aminokwasu, wybranego z grupy obejmującej aminokwasy alifatyczne, polarne, rozpuszczone w roztworze NaCl - 0,05-0,5 M, o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych, a następnie w strukturę membrany wprowadza się przez moczenie, roztwór polimeru aminy II lub III rzędowej, wybranej z grupy obejmującej aminy alifatyczne, metyloaminy i/lub etyloaminy, zawierające 100% grup metylowych lub etylowych, w roztworze o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych, zawierającym fulerenol o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych oraz biotynę o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych, przy pH 7,0-7,6 zawierających w swej strukturze fulerenol w stężeniu 0,03-0,5% objętościowych oraz biotynę w stężeniu 0,03-0,5% objętościowych, rozpuszczone w roztworze NaCI, przy czym, materiał biologiczny poddaje się kąpieli w roztworze polimeru aminokwasu alifatycznego pod ciśnieniem 0,09-0,1 MPa - atmosferycznym, w temperaturze 15-37°C, w czasie do 10 minut, a przygotowany w ten sposób układ, ewentualnie, moczy się w soli fizjologicznej.
W sposobie według wynalazku korzystnie poddaje się układ kąpieli w roztworze polimeru aminy II lub III rzędowej zawierającego grupy etylowe pod ciśnieniem 0,9-1 MPa w temperaturze 15-37°C, w czasie do 10 minut, a przygotowany układ płucze się w soli fizjologicznej.
Sposób według wynalazku polega na utworzeniu, co najmniej jednej biwarstwy polielektrolitów na powierzchni materiału biologicznego - komórki bakteryjnej Gram (+) lub Gram (-). Polielektrolity przygotowuje się przez rozpuszczenie polimerów w roztworze NaCl o odpowiednim pH. Procedurę tworzenia biwarstwy można powtórzyć kilkakrotnie. Tak przygotowany układ płucze się jeszcze ewentualnie w soli fizjologicznej.
Najkorzystniejsza wersja sposobu polega na tym, że peletę komórek bakteryjnych Gram (+) lub Gram (-) w probówce zalewa się roztworem polimeru białkowego aminokwasu polarnego w roztworze NaCI na okres 5-6 minut w komorze ciśnieniowej przy odpowiednim ciśnieniu i w temperaturze od 20-37°C. Następnie, układ zanurza się w pojemniku z roztworem polimeru aminy II lub III rzędowej w roztworze NaCl, zawierającego grupy etylowe, fulerenol o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych oraz biotynę o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych, korzystnie przy pH 7,0-7,6, na okres 5-10 minut, w komorze ciśnieniowej przy atmosferycznym ciśnieniu i w temperaturze od 15-37°C. Następnie układ poddaje się płukaniu w soli fizjologicznej. Procedurę korzystnie jest powtórzyć.
Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku, nie ograniczające jego zakresu.
P r z y k ł a d 1
W celu przygotowania masy komórek bakteryjnych zalewa się je roztworem poli-L-lizyny w NaCI 0,5 M w roztworze NaCI 0,5 M, o stężeniu 0,3% obj., po czym układ umieszcza się w kąpieli z soli fizjologicznej w 20°C na 5 minut, a następnie powtarza się procedurę.
P r z y k ł a d 2
Masę komórek bakteryjnych zalaną roztworem poli-L-argininy w roztworze NaCl 0,1M o stężeniu 0,05% obj., na 5 min., płukano w soli fizjologicznej w 20°C przez 3 minuty. Następnie, układ komórek z nałożoną powłoką poddaje się moczeniu w roztworze polietylenoiminy (100% grup etylowych)
PL 226 841 B1 z inkorporowanym fulerenolem i biotyną o stężeniu odpowiednio 0,200 mg/ml oraz 0,1 mg/ml w roztworze NaCl 0,1 M o stężeniu 0,05% obj., po czym układ umieszcza się w kąpieli z medium hodowlanego RPMI-1640 w 25°C na 4 minuty.
P r z y k ł a d 3
Masę komórek bakteryjnych zalewa się roztworem poli-L-lizyny w roztworze NaCl 0,3 M, o stężeniu 0,5% objętościowych, po czym wymoczone komórki umieszcza się w kąpieli z medium hodowlanego RPMI-1640 w 25°C na 4 minuty.
Następnie, komórki poddaje się moczeniu w roztworze polimetyloiminy (100% grup metylowych) w roztworze NaCl 0,01 M, o stężeniu 0,4% obj., Następnie, układ poddaje się kąpieli w roztworze poli-L-lizyny w roztworze NaCI 0,1 M, o stężeniu 0,5% objętościowych, po czym płucze się w soli filologicznej przez 3 minuty. Następnie, układ poddaje się moczeniu w roztworze polimetyloiminy (100% grup metylowych) z inkorporowanym fulerenolem oraz biotyną w roztworze NaCI 0,3 M, o stężeniu 0,4% obj., po czym układ umieszcza się w kąpieli z medium hodowlanego RPMI-1640 w 25°C na 4 minuty.

Claims (5)

1. Membrana polielektrolitowa, do izolacji mikroorganizmów Gram (-) oraz Gram (+), posiadająca co najmniej jedną biwarstwę, utworzoną kolejno z warstwy polielektrolitowej, obejmującej aminokwasy alifatyczne, oraz warstwy amin II lub III rzędowych, znamienna tym, że bezpośrednio na materiale biologicznym, na grupie izolowanych komórek bakteryjnych Gram (+) lub Gram (-), ma naniesioną co najmniej jedną biwarstwę, obejmującą aminokwasy alifatyczne, poli-L-argininę i/lub poli-L-lizynę, o grubości od 4 nm do 2 μm oraz powłokę z polietylenoiminy lub polimetylenoiminy, z inkorporowanym fulerenolem o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych oraz biotynę o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych o grubości od 2 μm, na której umieszczone jest medium hodowlane, RPMI-1640 oraz na nim, ewentualnie, ponownie warstwę z aminokwasów alifatycznych, poli-L-argininy lub poli-L-lizyny, a następnie warstwę polimerową z amin II lub III rzędowych, polietylenoiminy lub polimetylenoiminy, zawierających w swej strukturze inkorporowany fulerenol o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych oraz biotynę o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych.
2. Sposób wytwarzania mikroporowatych membran polielektroiitowych do izolacji mikroorganizmów Gram (-) oraz (+), znamienny tym, że na materiał biologiczny wprowadza się przez moczenie lub kąpiel, roztwór polimeru białkowego aminokwasu, wybranego z grupy obejmującej aminokwasy alifatyczne, polarne, rozpuszczone w roztworze NaCI - 0,05-0,5 M, o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych, a następnie w strukturę membrany wprowadza się przez moczenie, roztwór polimeru aminy II lub III rzędowej, wybranej z grupy obejmującej aminy alifatyczne, metyloaminy i/lub etyloaminy, zawierające 100% grup metylowych lub etylowych, w roztworze o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych, zawierającym fulerenol o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych oraz biotynę o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych, przy pH 7,0-7,6 zawierających w swej strukturze fulerenol w stężeniu 0,03-0,5% objętościowych oraz biotynę w stężeniu 0,03-0,5% objętościowych, rozpuszczone w roztworze NaCI, przy czym, materiał biologiczny poddaje się kąpieli w roztworze polimeru aminokwasu alifatycznego pod ciśnieniem 0,09-0,1 MPa - atmosferycznym, w temperaturze 15-37°C, w czasie do 10 minut, a przygotowany w ten sposób układ, ewentualnie, moczy się w soli fizjologicznej.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że poddaje się układ kąpieli w roztworze polimeru aminy II lub III rzędowej zawierającego grupy metylowe lub etylowe oraz fulerenol o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych oraz biotynę o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych, pod ciśnieniem 0,09-0,1 MPa w temperaturze 20-37°C, w czasie 2 minut, a przygotowany w ten sposób układ, ewentualnie, moczy się w medium hodowlanym, RPMI-1640.
4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że wprowadza się roztwór polimeru aminy II lub III rzędowej zawierający fulerenol oraz biotynę w roztworze NaCl, o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych, przy pH 7,0-7,6.
5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że wprowadza się roztwór polimeru aminy II lub III rzędowej zawierający fulerenol oraz biotynę w roztworze NaCI 0,05-0,5 M, o stężeniu 0,01-0,2% objętościowych.
PL402667A 2013-02-04 2013-02-04 Membrana polielektrolitowa do izolacji mikroorganizmów, Gram (-) iGram (+) oraz sposób jejwytwarzania PL226841B1 (pl)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL402667A PL226841B1 (pl) 2013-02-04 2013-02-04 Membrana polielektrolitowa do izolacji mikroorganizmów, Gram (-) iGram (+) oraz sposób jejwytwarzania

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL402667A PL226841B1 (pl) 2013-02-04 2013-02-04 Membrana polielektrolitowa do izolacji mikroorganizmów, Gram (-) iGram (+) oraz sposób jejwytwarzania

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL402667A1 PL402667A1 (pl) 2014-08-18
PL226841B1 true PL226841B1 (pl) 2017-09-29

Family

ID=51302417

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL402667A PL226841B1 (pl) 2013-02-04 2013-02-04 Membrana polielektrolitowa do izolacji mikroorganizmów, Gram (-) iGram (+) oraz sposób jejwytwarzania

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL226841B1 (pl)

Also Published As

Publication number Publication date
PL402667A1 (pl) 2014-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rodrigo-Navarro et al. Engineered living biomaterials
Drachuk et al. Biomimetic coatings to control cellular function through cell surface engineering
Lee et al. Hydrogel‐based three‐dimensional cell culture for organ‐on‐a‐chip applications
Monge et al. Spatio‐temporal control of LbL films for biomedical applications: from 2D to 3D
Blanco et al. The development of a three-dimensional scaffold for ex vivo biomimicry of human acute myeloid leukaemia
Zhou et al. Functional electrospun fibrous scaffolds with dextran-g-poly (l-lysine)-VAPG/microRNA-145 to specially modulate vascular SMCs
Jonas et al. Controlling the growth of Staphylococcus epidermidis by layer-by-layer encapsulation
Lima et al. Microbubbles as biocompatible porogens for hydrogel scaffolds
CN108473632B (zh) 聚合组合物
Khoshnood et al. The potential impact of polyethylenimine on biological behavior of 3D-printed alginate scaffolds
Srivastava et al. Enhanced encapsulation efficiency and controlled release of co-encapsulated Bacillus coagulans spores and vitamin B9 in gellan/κ-carrageenan/chitosan tri-composite hydrogel
CN107142228A (zh) 一种大肠杆菌外膜囊泡的制备、载药方法与其在抗肿瘤中的应用
WO2014171842A1 (en) Biocompatible encapsulation system
WO2016184872A1 (en) Functionalized membranes for bioartificial organs
WO2013006683A2 (en) Bio-mimetic ultrathin hydrogel coatings for pancreatic islet transplantation
Yu et al. Dual-peptide-modified alginate hydrogels for the promotion of angiogenesis
Vargas-Alfredo et al. Fabrication of biocompatible and efficient antimicrobial porous polymer surfaces by the Breath Figures approach
Park et al. Cell-adhesive double network self-healing hydrogel capable of cell and drug encapsulation: New platform to construct biomimetic environment with bottom-up approach
US11421106B2 (en) Vesicle incorporating transmembrane protein
Sun et al. Polyurethane scaffold-based 3D lung cancer model recapitulates in vivo tumor biological behavior for nanoparticulate drug screening
EP3315601A1 (en) Method for culturing animal cell composition, method for producing animal cell composition using same, and animal cell composition
PL226841B1 (pl) Membrana polielektrolitowa do izolacji mikroorganizmów, Gram (-) iGram (+) oraz sposób jejwytwarzania
US12291701B2 (en) Cell culture container having minute volume
Hastings et al. Crosslinked hydrogel capsules for cell encapsulation formed using amino/betaine dual-functional semibatch copolymers
Aleixandre et al. Engineered living biomaterials