PL206962B1 - Związek heterocykliczny o budowie skondensowanej - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest związek heterocykliczny o budowie skondensowanej. Nowe związki znajdują zastosowanie w leczeniu stanów związanych z receptorem jądrowym hormonalnym, takich jak rak.

Receptory jądrowe hormonalne (skrót ang. NHR) stanowią dużą nadrodzinę czynników transkrypcyjnych zależnych od ligandu i o specyficznej sekwencji. Członkowie tej rodziny oddziałują na transkrypcję albo bezpośrednio, poprzez specyficzne wiązanie do promotora genów docelowych (Evans, Science 240, strony 889-895 (1988)) albo pośrednio, poprzez wzajemne oddziaływanie białko-białko z innymi czynnikami transkrypcyjnymi (Jonat i inni. Cell, 62, strony 1189-1204 (1990), Schuele i inni. Cell, 62, strony 1217-1226 (1990) oraz Yang-Yen i inni. Cell, 62, strony 1205-1215 (1990)). Nadrodzina receptorów jądrowych hormonalnych (znana także jako „nadrodzina receptorów hormonów steroidowych/tarczycowych”), obejmuje receptory dla różnorodnych ligandów hydrofobowych, wliczając w to kortyzol, aldosteron, estrogen, progesteron, testosteron, witaminę D3, hormon tarczycy i kwas retynowy (Evans, 1988, powyżej). Ponadto, oprócz tych tradycyjnych receptorów jądrowych hormonalnych, nadrodzina obejmuje szereg białek które nie posiadają znanych ligandów, które określa się jako sieroce receptory jądrowe hormonalne (Mangelsdorf i inni. Cell, 83, strony 835-839 (1995), O'Malley i inni. Mol. Endocrinol., 10, strona 1293 (1996), Enmark i inni. Mol. Endocrinol., 10, strony 1293-1307 (1996) i Giguere, Endocrin. Rev., 20, strony 689-725 (1999)). Tradycyjne receptory jądrowe hormonalne są zwykle aktywatorami transkrypcji w obecności ligandu i mogą być albo aktywnymi represorami albo w przypadku braku ligandu obojętne w stosunku do transkrypcji. Niektóre spośród receptorów sierocych zachowują się tak, jakby w przypadku braku ligandu były obojętne w stosunku do transkrypcji. Jednakże inne receptory zachowują się albo jak aktywatory konstytutywne albo jak represory. Te sieroce receptory jądrowe hormonalne znajdują się albo pod kontrolą wszechobecnych ligandów, które nie zostały zidentyfikowane, albo nie wymagają, dla wywierania tych aktywności, związania się z ligandem.

Wspólnie z innymi czynnikami transkrypcyjnymi, receptory jądrowe hormonalne posiadają budowę modułową, składającą się z trzech oddzielnych domen: domeny N-końcowej o zmiennej wielkości zawierającej funkcję aktywacji transkrypcyjnej AF-1, bardzo konserwatywną domenę wiążącą DNA i średnio konserwatywną domenę wiążącą ligand. Domena wiążąca ligand jest nie tylko odpowiedzialna za wiązanie specyficznego ligandu lecz także zawiera funkcję transaktywującą nazywaną AF-2 i domenę dimeryzacji (Wurtz i inni. Nature Struc. Biol., 3, strony 87-94 (1996), Parker i inni. Nature Struc. Biol., 3, strony 113-115 (1996) i Kumar i inni, Steroids, 64, strony 310-319 (1999)). Chociaż całkowita sekwencja białka tych receptorów może się znacznie różnić, wszystkie posiadają przy domenie wiążącej ligand zarówno wspólną budowę, która wskazuje na rozbieżność w stosunku do archetypu dziedziczenia, jak i znaczną homologię (szczególnie identyczność sekwencji).

Receptory jądrowe hormonalne wiążące steroidy (skrót ang. SB-NHR) stanowią podrodzinę receptorów jądrowych hormonalnych. Receptory te są spokrewnione, ponieważ posiadają silniejszą wzajemną homologię sekwencji, szczególnie w domenie wiążącej ligand (skrót ang. LBD), niż inni członkowie nadrodziny NHR (Evans, 1988, powyżej) i wszystkie one wykorzystują ligandy na bazie steroidów. Do niektórych przykładów tej podrodziny receptorów jądrowych hormonalnych zalicza się receptor androgenu (AR), receptor estrogenu (ER), receptor progesteronu (PR), receptor glikokortykosteroidów (GR), receptor mineralokortykosteroidów (MR), receptor aldosteronu (ALDR) oraz receptor steroidowy i ksenobiotyczny (SXR) (Evans i inni, międzynarodowa publikacja patentowa numer WO 99/35246). W oparciu o silną homologię sekwencji w domenie LBD, szereg receptorów sierocych może także być członkami podrodziny SB-NHR.

Zgodnie z wysoką homologią sekwencji stwierdzoną w domenie LBD każdego członka rodziny SB-NHR, naturalne ligandy dla każdego z nich wywodzą się ze wspólnego rdzenia steroidowego. Do przykładów niektórych ligandów na bazie steroidów, wykorzystywanych przez członków podrodziny SB-NHR, zalicza się kortyzol, aldosteron, estrogen, progesteron, testosteron i dihydrotestosteron. Specyficzność określonego ligandu na bazie steroidu, w stosunku do jednego członka rodziny SB-NHR względem innego, uzyskuje się przez różnicowanie podstawienia wokół rdzenia steroidowego. Wysokie powinowactwo wiązania do określonego członka rodziny SB-NHR, połączone z wysokim poziomem specyficzności tego określonego członka rodziny SB-NHR, można osiągnąć przy tylko niewielkich

PL 206 962 B1 zmianach strukturalnych wokół rdzenia steroidowego (na przykład Waller i inni, Toxicol. Appl. Pharmacol., 137, strony 219-227 (1996) i Mekenyan i inni, Environ. Sci. Technol., 31, strony 3702-3711 (1997), powinowactwo wiązania progesteronu do receptora androgenu w porównaniu z testosteronem).

Opisano szereg otrzymanych syntetycznie antagonistów i agonistów, steroidowych i niesteroidowych, dla członków rodziny SB-NHR. Wiele spośród tych ligandów agonistycznych i antagonistycznych stosuje się klinicznie u ludzi, do leczenia różnych stanów medycznych. Preparat RU486 jest przykładem syntetycznego agonisty receptora PR, który stosuje się jako środek do regulacji urodzeń (Vegeto i inni. Cell, 69, strony 703-713 (1992)) oraz flutamid jest przykładem antagonisty receptora AR, który stosuje się do leczenia raka prostaty (Neri i inni, Endo., 91, strony 427-437 (1972)). Tamoksyfen jest przykładem specyficznego, tkankowego modulatora działania receptora ER, który stosuje się w leczeniu raka sutka (Smigel, J. Nail. Cancer Inst., 90, strony 647-648 (1998)). Tamoksyfen może działać jako antagonista receptora ER w tkance piersiowej, działając równocześnie jako agonista receptora ER w tkance kostnej (Grese i inni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, strony 14105-14110 (1997)). Z powodu selektywnych efektów tkankowych widocznych w przypadku tamoksyfenu, środek ten oraz środki jemu podobne są określane jako „agonista częściowy” lub „antagonista częściowy”. Oprócz ligandów nieendogennych pochodzenia syntetycznego, ligandy nieendogenne dla receptorów NHR można otrzymać ze źródeł żywnościowych (Regal i inni. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 223, strony 372-378 (2000) i Hempstock i inni, J. Med. Food, 2, strony 267-269 (1999)). Fitoestrogeny flawonoidowe są przykładem ligandu nienaturalnego dla rodziny receptorów SB-NHR, które można łatwo otrzymać ze źródła żywnościowego, takiego jak soja (Quella i inni, J. Clin. Oncol., 18, strony 1068 -1074 (2000) i Banz i inni, J. Med. Food, 2, strony 271-273 (1999)). Zdolność modulowania aktywności transkrypcyjnej indywidualnego receptora NHR przez dodanie małocząsteczkowego ligandu, czyni z tych receptorów idealne obiekty docelowe dla rozwoju środków farmaceutycznych przeznaczonych dla różnych stanów chorobowych.

Jak wspomniano powyżej, ligandy nie pochodzące ze źródeł naturalnych można modyfikować syntetycznie w ten sposób aby służyły jako modulatory działania receptorów NHR. W przypadku receptorów SB-NHR, inżynieria ligandu nie pochodzącego ze źródeł naturalnych może obejmować identyfikację struktury rdzenia, która naśladuje naturalny układ rdzenia steroidowego. Można to osiągnąć na drodze skriningu losowego w stosunku do szeregu receptorów SB-NHR albo przez badania bezpośrednie z użyciem dostępnych struktur krystalicznych różnych domen receptora NHR wiążących ligand (Bourguet i inni. Nature, 375, strony 377-382 (1995), Brzozowski, i inni, Nature, 389, strona 753 -758 (1997), Shiau i inni. Cell, 95, strony 927-937 (1998) i Tanenbaum i inni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, strony 5998-6003 (1998)). Zróżnicowane podstawienie wokół takiego naśladowczego rdzenia steroidowego może dostarczyć środki charakteryzujące się selektywnością w stosunku do jednego receptora względem innego. Ponadto, tego typu modyfikacje można wykorzystać do otrzymywania środków charakteryzujących się aktywnością agonistyczną lub antagonistyczną dla określonych receptorów SB-NHR. Zróżnicowane podstawienie wokół naśladowczego rdzenia steroidowego może dać w wyniku utworzenie serii agonistów i antagonistów o wysokim powinowactwie, charakteryzujących się specyficznością dla, na przykład, receptora ER względem receptora PR względem receptora AR względem receptora GR względem receptora MR. Tego typu bezpośrednie badanie podstawienia zróżnicowanego na przykład dla modulatorów steroidowych receptorów NHR na bazie chinoliny, zostało przedstawione w J. Med. Chem., 41, strona 623 (1999), w międzynarodowej publikacji patentowej numer WO 9749709, w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5,696,133, 5,696,130, 5,696,127, 5,693,647, 5,693,646, 5,688,810, oraz numer 5,688,808 i w międzynarodowej publikacji patentowej numer WO 9619458, przy czym wszystkie te materiały źródłowe zamieszcza się w niniejszym jako referencje.

Związki według obecnego wynalazku zawierają rdzeń który służy jako naśladowca steroidowy i są użyteczne jako modulatory działania receptorów jądrowych hormonalnych wiążących steroidy, jak również innych receptorów NHR, jak to opisano poniżej.

Przedmiotem wynalazku są związki o budowie cyklicznej skondensowanej o poniższym wzorze I oraz ich sole, które to związki są szczególnie użyteczne jako modulatory działania receptora jądrowego hormonalnego:

PL 206 962 B1

G

I w którym to wzorze symbole mają następujące znaczenia i są, w przypadku występowania każdego z nich, wybrane niezależnie

G oznacza aryl wybrany spoś ród grupy fenylowej lub naftalenylowej lub grupę heterocykliczną , którą jest pierścień chinolinylowy, przy czym wspomniana grupa arylowa lub heterocykliczna jest ewentualnie podstawiona na jednej lub wielu pozycjach przez atom wodoru, C1-6alkil lub podstawiony C1-6alkil, atom fluorowca, -CN, R¹OC=O, R¹HNC=O, grupę nitrową, R¹OCH2-, R¹O-, -NH2, -NR⁴R⁵, -SR¹ lub grupę okso;

Z oznacza O;

E oznacza grupę o wzorze S(O)_n, N-R⁷, C=CR¹⁰R^10' lub CR⁷R^7';

M oznacza grupę o wzorze C-Q 2 lub N;

A1 oznacza CR⁷;

A2 oznacza CR⁷;

Y oznacza CR⁷R^7';

W oznacza CR⁷R^7' -CR⁷R^7' lub CR⁸=CR^8';

Q1 oznacza atom wodoru, C1-6alkil lub podstawiony C1-6alkil, atom fluorowca, -R¹O, -NH2 lub -NR⁴R⁵;

Q2 oznacza atom wodoru, C1-6alkil lub podstawiony C1-6alkil, atom fluorowca, -R¹O, -NH2 lub - NR⁴R⁵;

L oznacza wią zanie;

R¹ oznacza atom wodoru, C1-6alkil lub podstawiony C1-6alkil;

R⁴ oznacza atom wodoru, C1-6alkil lub podstawiony C1-6alkil;

R⁵ oznacza atom wodoru, C1-6alkil lub podstawiony C1-6alkil;

każdy z podstawników R⁷ and R^7' niezależnie od siebie oznacza atom wodoru, C1-6alkil lub podstawiony C1-6alkil;

każdy z podstawników R⁸ and R^8' niezależnie od siebie oznacza atom wodoru, C1-6alkil lub podstawiony C1-6alkil;

10' 1 1 każdy z podstawników R¹⁰ i R^10' niezależnie od siebie oznacza atom wodoru, R¹, COOR¹,

CONR¹R², Cl, F, Br, I, CN, OR¹, R¹C=O, SO2OR¹ lub SO2NR¹R^1'; przy czym wspomniany podstawiony C1-6alkil jest podstawiony przez jeden lub wiele podstawników wybranych z grupy obejmującej atom fluorowca, C1-6alkoksyl, grupę C1-6alkilotio, hydroksyl, -COOH i - NH2;

z tym zastrzeżeniem, że gdy m oznacza grupę o wzorze C-Q2, to E oznacza grupę o wzorze N-R⁷, w którym R⁷ ma wyżej podane znaczenie; lub grupę o wzorze S(O)n, w którym n oznacza 1 lub 2; i gdy m oznacza N, to E oznacza grupę o wzorze C=CR¹⁰R^10', w którym R¹⁰ i R^10' mają wyżej podane znaczenie; lub oznacza grupę o wzorze CR⁷R^7', przy czym w przypadku tego związku każdy podstawnik R⁷ i R^7' ma wyżej podane znaczenie oraz dodatkowo oznacza C3alkenyl, CN lub grupę o wzorze OR¹, w którym R¹ ma wyż ej podane znaczenie.

Korzystny jest związek według wynalazku o wzorze (la)

G' (O)S

A.

‘2 (la)

PL 206 962 B1 w którym G, Z, n, A1, A2, Y, W, Q1, Q2, L, mają wyżej okreś lone znaczenie.

Szczególnie korzystnym związkiem według wynalazku jest związek o wzorze (la) wybrany z grupy obejmują cej:

1, 1 -d itlenek (3aa,4a,7a,7aa)-2-(3-chloro-4-fluorofenylo)-3a,4,7,7a-tetrahydro-4,7-metano-1,2-benzoizotiazol-3(2H)-onu (1B);

ester etylowy kwasu (3aa,4a,7a,7aa)-4-(2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-1,1-dioksydo-3-okso-4,7-metano-1,2-benzoizotiazol-2-ilo)benzoesowego;

1, 1-ditlenek (3aa,4a,7a,7aa)-2-(3-chloro-2-fluorofenylo)-3a,4,7,7a-tetrahydro-4,7-metano-1,2-benzoizotiazol-3(2H)-onu; oraz

1,1-ditlenek (3aa,4a,7a,7aa)-3a,4,7,7a-tetrahydro-2-(2,3,4-trifluorofenylo)-4,7-metano-1,2-benzoizotiazol-3(2H)-onu.

Inną korzystną podgrupą związków według wynalazku o wzorze I jest związek o wzorze (Ib)

w którym G, Z, A1, A2, Y, W, Q1, Q2, L, mają wyżej określone znaczenie.

Szczególnie korzystnym związkiem według wynalazku o wzorze (Ib) jest związek wybrany z grupy obejmującej:

(3aa,4a,7a,7aa)-oktahydro-3a-hydroksy-2-[4-nitro-3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-etano-3B-indazol-3-on (11G);

oraz (3aa,4a,7a,7aa)-oktahydro-3a-hydroksy-2-[3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-etano-3B-indazol-3-on. Inną korzystną podgrupą związków według wynalazku o wzorze I jest związek o wzorze (Ic)

w którym G, Z, A1, A2, Y, W, Q1, Q2, L, mają wyżej określone znaczenie, a E oznacza grupę o wzorze C=CR¹⁰R^10', w którym R¹⁰ i R^10' mają wyżej określone znaczenie.

Dalszą korzystną podgrupą związków według wynalazku o wzorze I jest związek o wzorze (Id)

w którym G, Z, A1, A2, Y, W, Q1, Q2, L, mają wyżej określone znaczenie, a E oznacza grupę o wzorze CR⁷R^7', w którym R⁷ i R^7' mają wyżej określone znaczenie.

PL 206 962 B1

Szczególnie korzystny związek o wzorze (Id) jest wybrany z grupy obejmującej:

(3aa,4a,7a,7aa)-oktahydro-3-hydroksy-2-[4-nitro-3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-metano-1H-izoindol-1-on (2);

(3aa,4a,7a,7aa)-oktahydro-2-[4-nitro-3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-metano-1H-izoindol-1-on (3);

(3aa,4a,7a,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-neksahydro-3-hydroksy-2-[4-nitro-3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-metano-1 H-izoindol-1-on (4);

(3aa,4a,7a,7aa)2-[4-bromo-3-(trifluorometylo)fenylo]-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-3-metoksy-4,7-metano-1 H-izoindol-1-on (5);

(3aa,4a,7a,7aa)-oktahydro-2-[4-nitro-3-(trifluorometylo)fenylo]-3-(2-propenylo)-4,7-metano-1H-izoindol-1-on (6);

(3aa,4e,7e,7aa)-oktahydro-3-hydroksy-2-(4-nitro-1-naftalenylo)-4,7-epoksy-1H-izoindol-1-on (7);

(3aa,4e,7e,7aa)-oktahydro-2-(4-nitro-1-naftalenylo)-4,7-epoksy-1H-izoindol-1-on (8);

(3aa,4a,7a,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-3-hydroksy-2-[3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-etano-1H-izoindol-1-on (9);

(3aa,4a,7a,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-2-[3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-etano-1H-izoindol-1-on (10);

(1a,3aa,4a,7a,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-2-(4-nitro-1-naftalenylo)-3-okso-4,7-metano-1H-izoindolo-1-karbonitryl (12B);

(3aa,4e,7e,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-3-hydroksy-4,7-dimetylo-2-[3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-epoksy-1 H-izoindol-1-on (13B);

(3aa,4e,7e,7aa)-oktahydro-3-hydroksy-4,7-dimetylo-2-[3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-epoksy-1H-izoindol-1-on (14);

(3aa,4a,7a,7aa)-2-(1,2-dihydro-4-metylo-2-okso-7-chinolinylo)-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-3-metoksy-4,7-metano-1H-izoindol-1-on;

(3aa,4a,7a,7aa)-oktahydro-3-metoksy-2-(1-naftalenylo)-4,7-metano-1H-izoindol-1-on;

(3aa,4a,7a,7aa)-2-[4-bromo-3-(trifluorometylo)fenylo]-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-4,7-metano-1H-izoindol-1-on;

(3aa,4a,7a,7aa)-oktahydro-2-(1-naftalenylo)-4,7-metano-1H-izoindol-1-on;

(3aa,4a,7a,7aa)-2-(1,2-dihydro-4-metylo-2-okso-7-chinolinylo)-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-4,7-metano-1H-izoindol-1-on;

(3aa,4a,7a,7aa)-2-(3,5-dichlorofenylo)-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-4,7-metano-1H-izoindol-1-on;

(3aa,4a,7a,7aa)2-(4-bromo-1-naftalenylo)-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-4,7-metano-1H-izoindol-1-on;

(3aa,4a,7a,7aa)-2-[4-bromo-3-(trifluorometylo)fenylo]-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-3-hydroksy-4,7-metano-1 H-izoindol-1-on;

(3aa,4a,7a,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-2-[4-nitro-3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-metano-1H-izoindol-1-on;

(3aa,4a,7a,7aa)-2-[4-bromo-3-(trifluorometylo)fenylo]-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-3-hydroksy-5-metylo-4,7-metano-1H-izoindol-1-on;

(1a,3aa,4a,7a,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-2-[4-nitro-3-(trifluorometylo)fenylo]-3-okso-4,7-metano-1H-izoindolo-1-karbonitryl; oraz (3aa,4a,7a,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-2-(4-nitro-1-naftalenylo)-4,7-metano-1H-izoindol-1-on.

Poniżej zamieszczone są definicje określeń użytych w niniejszym opisie. Jeżeli nie wskazano inaczej, początkową definicję ustaloną w niniejszym opisie dla grupy lub określenia, stosuje się w całym niniejszym opisie indywidualnie do tej grupy lub określenia albo do części innej grupy.

Określenia „alkil” i ”alk” odnoszą się do grupy powstałej z alkanu (węglowodoru) o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, zawierającego od 1 do 6 atomów węgla. Do przykładów takich grup zalicza się metyl, etyl, propyl, izopropyl, n-butyl, t-butyl, izobutyl, pentyl, heksyl, izoheksyl, i tym podobne.

Określenia „halogen” lub „fluorowiec” odnoszą się do chloru, bromu, fluoru lub jodu.

Gdy grupa funkcyjna jest określona jako „zabezpieczona”, oznacza to, że grupa jest w postaci zmodyfikowanej, w celu jej osłabienia, szczególnie w celu uniemożliwienia zachodzenia niepożądanych reakcji ubocznych w miejscu zabezpieczonym. Do odpowiednich grup zabezpieczających dla sposobów i związków opisanych w niniejszym zalicza się, bez ograniczeń, takie grupy które opisano w powszechnie dostępnych podręcznikach, takich jak Greene, T. W. i inni, „Protective Groups in Organic Synthesis”, Wiley, N.Y. (1991).

Związki o wzorze I tworzą sole, które także mieszczą się w zakresie wynalazku. Jeżeli nie wskazano inaczej, to odniesienie w niniejszym opisie do związku o wzorze I jest równoznaczne

PL 206 962 B1 z odniesieniem się do jego soli. Stosowane w niniejszym okreś lenie „sól(sole) oznacza sole kwasowe i/lub zasadowe utworzone z nieorganicznymi i/lub organicznymi kwasami i zasadami. Oprócz tego, gdy związek o wzorze I zawiera zarówno fragment zasadowy, taki jak pirydyna lub imidazol, lecz nie ograniczając się do nich, jak też fragment kwasowy taki jak kwas karboksylowy, lecz nie ograniczając się do nich, to mogą być utworzone jony amfoteryczne („sole wewnętrzne”), które mieszczą się w użytym w niniejszym określeniu „sól(sole)”. Korzystne są sole dopuszczone do stosowania w farmacji (to jest sole nietoksyczne, dopuszczone ze względów fizjologicznych), chociaż użyteczne są również inne sole, na przykład w operacjach wydzielania lub oczyszczania, które można stosować podczas otrzymywania związków. Sole związków o wzorze I można utworzyć na przykład w reakcji związku o wzorze I z ilością kwasu lub zasady odpowiadającej ilości równoważnej, w reakcji prowadzonej środowisku w którym następuje wytrącenie się soli albo w reakcji w środowisku wodnym, po której następuje liofilizacja.

Związki o wzorze I które zawierają fragment zasadowy, taki jak amina albo pierścień pirydynowy lub imidazolowy, lecz nie ograniczając się do nich, mogą tworzyć sole z różnymi kwasami organicznymi i nieorganicznymi. Do przykładów soli addycyjnych z kwasem zalicza się octany (takie jak te utworzone z kwasem octowym lub kwasem trifluorowcooctowym, na przykład z kwasem trifluorooctowym), adypiniany, alginiany, askorbiniany, asparaginiany, benzoesany, benzenosulfoniany, wodorosiarczany, borany, maślany, cytryniany, sole z kamforą, kamforosulfoniany, cyklopentanopropioniany, diglukoniany, dodecylosiarczany, etanosulfoniany, fumarany, glukoheptaniany, glicerofosforany, hemisiarczany, heptaniany, heksaniany, chlorowodorki, bromowodorki, jodowodorki, hydroksyetanosulfoniany (na przykład 2-hydroksyetanosulfoniany), mleczany, maleiniany, metanosulfoniany, naftalenosulfoniany (na przykład 2-naftalenosulfoniany), nikotyniany, azotany, szczawiany, pektyniany, peroksodisiarczany(VI), fenylopropioniany (na przykład 3-fenylopropioniany), fosforany, pikryniany, piwalany, propioniany, salicylany, bursztyniany, siarczany (takie które są utworzone z kwasem siarkowym), sulfoniany (takie które wymieniono powyżej w niniejszym opisie), winiany, tiocyjaniany, toluenosulfoniany takie jak tolueno-4-sulfoniany, undekaniany i tym podobne.

Związki o wzorze I które zawierają fragment kwasowy, takiego kwasu jak kwas karboksylowy, lecz nie ograniczając się do niego, mogą tworzyć sole z różnymi zasadami organicznymi i nieorganicznymi. Do przykładów soli zasadowych zalicza się sole amonowe, sole metali alkalicznych, takie jak sole sodowe, litowe i potasowe, sole metali ziem alkalicznych, takie jak sole wapniowe i magnezowe, sole z zasadami organicznymi (na przykład z aminami organicznymi), takimi jak benzatyny, dicykloheksyloaminy, hydrabaminy (utworzone z N,N-bis(dehydroabietylo)etylenodiaminą), N-metylo-D-glukaminy, N-metylo-D-glikamidy, t-butyloaminy oraz sole z aminokwasami, takimi jak arginina, lizyna i tym podobne. Grupy zasadowe zawierają ce atom azotu moż na poddać czwartorzę dowaniu z takimi środkami jak niższe halogenki alkilowe (takie jak chlorki, bromki i jodki metylu, etylu, propylu i butylu), siarczany dialkilowe (na przykład siarczany dimetylu, dietylu, dibutylu i diamylu), halogenki alkilów o dł ugim ł a ń cuchu (na przyk ł ad chlorki, bromki i jodki decylu, laurylu, mirystylu i stearylu), halogenki aryloalkilu (na przykład bromki benzylu i fenetylu) i inne.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem przewiduje się także solwaty związków według wynalazku. Do solwatów związków o wzorze I zalicza się na przykład hydraty.

Związki o wzorze I oraz ich sole mogą istnieć w ich postaciach tautomerycznych (na przykład jako amid lub iminoeter). Wszystkie tego typu postacie tautomeryczne traktuje się w niniejszym jako część obecnego wynalazku.

Przyjmuje się, że wszystkie stereoizomery związków według obecnego wynalazku (na przykład te które mogą istnieć z powodu asymetrycznych atomów węgla na różnych podstawnikach), wliczając w to postacie enancjomeryczne i postacie diastereoizomeryczne, mieszczą się w zakresie tego wynalazku. Na przykład, poszczególne stereoizomery związków według wynalazku mogą być w zasadzie wolne od innych izomerów (na przykład jako czyste lub w znacznym stopniu czyste izomery optyczne, posiadające określoną aktywność) lub mogą być zmieszane na przykład jako racematy albo ze wszystkimi innymi stereoizomerani lub z innymi wybranymi stereoizomerami. Centra chiralne związków według obecnego wynalazku mogą posiadać konfiguracje S lub R, jak to zdefiniowano w Zaleceniach lUPAC, 1974. Postacie racemiczne można rozdzielać metodami fizycznymi, takimi jak na przykład krystalizacja frakcjonowana, rozdzielanie lub krystalizacja pochodnych diastereoizomerycznych lub rozdzielanie metodą chromatografii kolumnowej. Indywidualne izomery optyczne można otrzymać z ich racematów stosując dowolną, odpowiednią metodę, wliczając w to, lecz nie ograniczając się do

PL 206 962 B1 nich, takie metody tradycyjne jak na przykład tworzenie soli z kwasem optycznie czynnym i następnie krystalizację.

Wynalazek obejmuje wszystkie izomery konfiguracyjne związków według obecnego wynalazku, albo w mieszaninie albo w postaci czystej lub w znacznym stopniu czystej. Definicja związków według obecnego wynalazku obejmuje zarówno izomery alkenów cis- (Z) jak i trans- (E), jak również izomery cis- i trans- węglowodorów cyklicznych lub pierścieni heterocyklicznych. W pewnych przypadkach, na przykład dla skondensowanego układu pierścieniowego przyłączonego do fragmentu G-L we wzorze I, może być korzystna konformacja egzo lub endo. Na przykład, w przypadku antagonistów receptora androgenu (albo selektywnych modulatorów receptora androgenu), w których grupa Y oznacza O lub NR⁷, korzystna może być konfiguracja egzo, podczas gdy w większości innych definicji grupy Y korzystna może być konfiguracja endo. Można ocenić, że korzystna konfiguracja może być funkcją określonego związku oraz jego korzystnej aktywności. Rozdział izomerów konfiguracyjnych można wykonać z zastosowaniem dowolnej, odpowiedniej metody, takiej jak chromatografia kolumnowa.

W całym opisie, grupy oraz ich podstawniki mogą być tak dobrane aby uzyskać stabilne fragmenty cząsteczek i stabilne związki.

Odmiany wskazane w niniejszym opisie są odmianami przykładowymi lub korzystnymi. Są one podane dla zilustrowania wynalazku.

Związki według obecnego wynalazku można otrzymywać z wykorzystaniem takich metod które zostały zilustrowane w poniższych schematach I-XXII. Specjalista w tej dziedzinie może łatwo dobrać rozpuszczalniki, temperatury, ciśnienia oraz inne warunki reakcji. Substraty są dostępne w handlu albo specjalista w tej dziedzinie może je łatwo wytworzyć. Przy wytwarzaniu związków można wykorzystywać techniki kombinatoryczne, na przykład w takich przypadkach, w których stosowane produkty pośrednie posiadają grupy nadające się do realizacji tych technik. Patrz poniżej odnośnie alternatywnych metod, które można stosować przy otrzymywaniu związków według obecnego wynalazku: Li, i inni, Eur. J. Org. Chem. 9, strony 1841-1850 (1998); Li, Y-Q, Synlett. 5, strony 461-464 (1996); Thiemann, i inni, Bull. Chem. Soc. Jpn. 67, strony 1886-1893 (1994); Tsuge i inni, Heterocycles 14, strony 423-428 (1980); Ward i i nni, Can. J. Chem. 75, strony 681-693 (1997); Ward i i nni, Can. J. Chem. 69, strony 1487-1497 (1991); Ward i inni, Tetrahedron Lett. 31, strony 845-848 (1990); Fleming i inni, J. Org. Chem. 44, strony 2280-2282 (1979); Jankowski i inni, J. Organomet. Chem. 595, strony 109-113 (2000); Keglevich i inni, J. Organomet. Chem. 579, strony 182-189 (1999); Keglevich i inni, J. Organomet. Chem. 570, strony 49-539 (1998); Jankowski i inni, Hetroat. Chem. 7, strony 369 -374 (1996); Jankowski i inni, J. Am. Chem. Soc. 113, strony 7011-7017 (1991); Quin i inni, Tetrahedron Lett. 31, strony 6473-6476 (1990); Quin inni, J. Org. Chem. 59, strony 120-129 (1994); Quin strony, J. Org. Chem. 58, strony 6212-6216 (1993); Quin i inni, Phosphorous, Sulfur Silicon Relat. Elem. 63, strony 349-362 1991); Quin i inni, Hetroat. Chem. 2, strony 359-367 (1991); Hussong i inni, Phosphorus Sulfur. 25, strony 201-212 (1985); Quin i inni, J. Org. Chem. 51, strony 3341-3347 (1986); Myers inni, J. Am. Chem. Soc. 114, strony 5684-5692 (1992); Myers inni, J. Am. Chem. Soc. 113, strony 6682-6683 (1991); Shen inni, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5,817,679; Cordone i inni, J. Am. Chem. Soc. 111, strony 5969-5970 (1989); Jung i inni, J. Chem. Soc. Commun., strony 630-632 (1984); Lay i inni, J. Am. Chem. Soc. 104, strony 7658-7659 (1982); Gonzalez i inni, J. Am. Chem. Soc. 117, strony 3405-3421 (1995); Kreher i inni, Chem. Ber. 125, strony 183-189 (1992); Simig i inni, Synlett. 7, strony 425-426 (1990); Sha i inni, J. Org. Chem. 55, strony 2446-2450 (1990); Drew i inni, J. Chem. Soc, Perkin Trans. 1 7, strony 1277-1284 (1985); Kreher i inni, Anorg. Chem., Org Chem. 31B, strony 599-604 (1976); Avalos i inni, Tetrahedron Lett. 39, strony 9301-9304 (1998); Gousse i inni, Macromolecules 31, strony 314-321 (1998); Mikhailyuchenko i inni, Khim. Geterotsikl Soedin. 6, strony 751-758 (1993); Lubowitz i inni, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4,476,184; Padwa inni, J. Org. Chem. 61, strony 3706-3714 (1996); Schlessinger i inni, J. Org. Chem. 59, strony 3246-3247 (1994); Buchmeiser i inni, międzynarodowa publikacja patentowa numer WO 9827423; Tanabe i inni, opis patentowy Japonii numer np JP 07144477; Mochizucki i inni, opis patentowy Japonii numer JP 63170383; Hosoda i inni, opis patentowy Japonii numer JP 62053963; Onaka i inni, opis patentowy Japonii numer JP 62053964; Kato i inni, opis patentowy Japonii numer JP 53086035; Kato i inni, opis patentowy Japonii numer JP 51088631; Tottori i inni, opis patentowy Japonii numer JP 49124225; Augustin i inni, opis patentowy Niemiec numer DD 101271; Title i inni, opis patentowy Francji numer ER 2031538; Gousse i inni, Polym. Int. 48, strony 723-731 (1999); Padwa i inni, J. Org. Chem. 62, strony 4088-4096 (1997); Theurillat-Moritz i i nni, Tetrahedron: Asymmetry 7, strony 3163-3168 (1996); Mathews i i nni, J. Carbohydr.

PL 206 962 B1

Chem. 14, strony 287-297 (1995); Srivastava i inni, Natl. Acad. Sci. Lett. (India) 15, strony 41-44 (1992); Mayorga i inni, Rev. Cubana Quim. 4, 1-6 (1988); Kondoli. inni, J. Chem. Res., Synop. 3, strona 76 (1987); Primelles i inni. Cent. Azucar strony 7-14 (1985); Solov'eva i inni, Khim. Geterotsikl. Soedin. 5, strony 613-15 (1984); Liu i inni, Yaoxue Xuebao 18, strony 752-759 (1983); Joshi i inni, Indian J. Chem, Sect. B. 22B, strony 131-135 (1983); Amos i inni, międzynarodowa publikacja patentowa numer WO 9829495; Odagiri i inni, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4,670,536; Gallucci i inni. Europejski opis patentowy numer EP 355435; Redmore D., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 3,821,232; Nakano i inni, Heterocycles 35, strony 37-40 (1993); Tomisawa i inni, Chem. Pharm. Bull 36, strony 1692-1697 (1988); Krow i inni, J. Heterocycl. Chem. 22, strony 131-135 (1985); Krow i inni, J. Org. Chem. 47, strony 1989-1993 (1982); Liu i inni, Yaoxue Xuebao 18, strony 752-759 (1983); Nishikawa et al, Yaoxue Xuebao JP 01061457; i/lub Rice i inni, J. Med. Chem. 11, strony 183-185 (1968).

Wszystkie dokumenty cytowane w obecnym opisie patentowym, takie jakie przytoczono w rozdziale pod tytułem „Sposoby otrzymywania” oraz w innych częściach niniejszego opisu, zamieszcza się w niniejszym w całości jako referencje, wliczając w to zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer seryjny 09/885,798, zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer seryjny 09/885,381 i zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer seryjny 60/271,672. Odniesienie do któregokolwiek z dokumentów zamieszczonych w niniejszym opisie nie może być interpretowane jako uznanie tego dokumentu za stan techniki.

Imidazolinony o wzorach IV i V, które są związkami o wzorze I, wytwarza się w sposób zilustrowany na schemacie I. Produkty pośrednie o wzorze II (które można zsyntetyzować w sposób opisany w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer seryjny 09/885,798), poddaje się reakcji z ditioacetalami ketonu o wzorze III w celu wytworzenia imidazolinonów o wzorze IV. Reakcja zachodzi na przykład w obecności trietyloaminy lub metoksylanu/etoksylanu sodu w etanolu lub metanolu, w stanie wrzenia pod chłodnicą zwrotną, zgodnie z procedurą opracowaną przez Huang i innych, Synth. Commun. 21, strony 1177-1187 (1991). Ditioacetale ketenu o wzorze III są dostępne w handlu lub może je wytworzyć specjalista.

Grupę estrową w związkach o wzorze IV można hydrolizować, na przykład z zastosowaniem wodorotlenku sodu, w takim rozpuszczalniku jak metanol lub etanol i w temperaturze od koło 0°C do około 50°C, otrzymując odpowiedni kwas karboksylowy. Kwas można przekształcić w odpowiedni

10' 1 2 ester = COOR¹) lub amid (R^10' = CONR¹R²) o wzorze V, poddając reakcji z chlorkiem tionylu lub chlorkiem oksalilu w celu wytworzenia chlorku kwasowego i następnie poddając reakcji odpowiednio z właściwym alkoholem R¹OH lub aminą H-NR¹R².

W wyniku reakcji chlorku kwasowego z amoniakiem powstaje niepodstawiony amid, R¹⁰ = CONH2,

10' który można odwodniać tradycyjnymi sposobami w celu wytworzenia nitrylu, R^10' = CN.

PL 206 962 B1

Jak to przedstawiono na schemacie II, dien o wzorze VI można poddać reakcji z dienofilem o wzorze VII (najkorzystniej gdy E oznacza S(O)n), w warunkach które specjalista w tej dziedzinie może łatwo dobrać (takich jak na przykład doprowadzenie ciepła („Δ”)), w celu wytworzenia związku o wzorze VIII, który jest związkiem o wzorze I. Będący produktem pośrednim dien o wzorze VI jest dostępny w handlu lub bez trudu może go wytworzyć specjalista, na przykład zgodnie z następującymi danymi literaturowymi i zawartymi w nich odsyłaczami: Hofman i inni, J. Agric. Food Chem. 45, strony 898-906 (1997); Baciocchi i inni, 8 J. Chem. Soc, Perkin Trans. 2, 8, strony 821-824 (1975); Wu i inni, J. Heterocycles, 38, strony 1507-1518 (1994); Yin i i nni, Tetrahedron Lett, 38, strony 5953-5954 (1997); Mic'ovic' i inni, Tetrahedron, 20, strony 2279-2287 (1964); Gorbunova i inni, J. Org. Chem., 35, strony 1557-1566 (1999); Rassu i inni, Chem. Soc. Rev., 29, strony 109-118 (2000); Kaberdin i inni, Russ. Chem. Rev., 68, strony 765-779 (1999); Barluenga i inni, Aldrichimica Acta, 32, strony 4-15 (1999); Bogdanowicz-Szwed etal., Pol. Wiad. Chem., 52, strony 821-842 (1998); Casiraghi i inni, Adv. Asymmetric Synth., 3, strony 113-189 (1998); i/lub Baeckvall i inni, Chem. Rev., 98, strony 2291-2312 (1998). Dienofil o wzorze VII, który jest produktem pośrednim, jest dostępny w handlu lub bez trudu może go wytworzyć specjalista, na przykład zgodnie z następującymi danymi literaturowymi i zawartymi w nich odsyłaczami: Kato i inni, międzynarodowa publikacja patentowa numer WO 99/08679; Seijas i inni, Europejski opis patentowy numer EP-648757; Beeley i inni, J. Chem. Soc, Perkin Trans. 1, 16, strony 2245-2251 (1994); Walder i inni, Helv. Chem. Acta., 72, strony 1435-1443 (1989); opisy patentowe Japonii numer 56118073 oraz numer 56081573; Lewis i inni, J. Heterocycl. Chem., 8, strony 571-580 (1971).

Schemat III

IX X XI

Jak to zilustrowano na schemacie III, związek o wzorze IX, można przekształcić w związki o wzorze X i XI, które są związkami o wzorze I. W wyniku reakcji związku o wzorze IX z takim środkiem redukującym jak NaBH4, w takim układzie rozpuszczalnikowym jak CH3OH i THF, otrzymuje się alkohol o wzorze X. W wyniku reakcji związku o wzorze X z takim środkiem redukującym jak (C2H5)3SiH, co powoduje usunięcie grupy hydroksy, otrzymuje się związek o wzorze XI. Metody otrzymywania produktów pośrednich o wzorze IX są opisane w zgłoszeniach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki numer seryjny 09/885,381 i 60/271,672 oraz w dokumentach zacytowanych w innych zgłoszeniach i które są zamieszczone w niniejszym opisie.

PL 206 962 B1

Jak to przedstawiono na schemacie IV, związek o wzorze IX można przekształcić w związek o wzorze XII, który jest związkiem o wzorze I. Związek o wzorze IX można poddać reakcji z takim środkiem redukującym jak NaBH4, w takim rozpuszczalniku jak THF razem z alkoholem o wzorze R¹-OH. Po zakończeniu redukcji amidu do alkoholu stanowiącego produkt pośredni (wzór X), mieszaninę można poddać reakcji z takim kwasem jak HCl, otrzymując eter o wzorze XII,

Jak to pokazano na schemacie V, związek o wzorze X można przekształcić w związek o wzorze XIII, który jest związkiem o wzorze I. Związek o wzorze X można poddać reakcji ze środkiem acylującym o wzorze Z'COCl lub z będącym produktem pośrednim bezwodnikiem o wzorze (Z'COCl)2O, w obecności takiej zasady jak (C2H5)3N, z zastosowaniem ogrzewania lub bez ogrzewania, otrzymując związek o wzorze XIII. W przypadku związków o wzorze XIII, Z' oznacza R¹, OR¹ lub NHR¹. Półprodukty o wzorze Z'COCl lub (Z'COO)2O są dostępne w handlu lub bez trudu może je wytworzyć specjalista.

Jak to przedstawiono na schemacie VI, związek o wzorze X można przekształcić w związek o wzorze XIV, który jest związkiem o wzorze I. Związek o wzorze X można poddać reakcji z takim kwasem Lewisa jak BF₃/C₂H₅)₂O i z reagentem o wzorze (R¹)3SiR²⁰, takim jak (CH3)₃SiR²⁰, w niskiej temperaturze wynoszącej 0°C, otrzymując związek o wzorze XIV. W przypadku związków o wzorze XIV, R²⁰ oznacza allil (R^7a jest wybrany niezależnie spośród grup wymienionych w definicji R⁷), grupę nitrylową lub grupę azydową. Półprodukty o wzorze (CH3)3SiR²⁰ są dostępne w handlu lub bez trudu może je wytworzyć specjalista.

PL 206 962 B1

Jak to przedstawiono na schemacie VII, związek o wzorze XIV można przekształcić w związki o wzorach XV, XVI i XVII, które są związkami o wzorze I. Związek o wzorze XIV można poddać reakcji z wodnym roztworem zasady, takiej jak NaOH, w sposób znany specjaliście w tej dziedzinie, w celu wytworzenia pochodnej kwasu karboksylowego o wzorze XV. Związek o zorze XV można poddać reakcji z produktami pośrednimi o wzorze R¹-OH lub R¹-NH2, razem z dowolnym układem różnych peptydowych środków sprzęgających, dobrze znanych specjaliście w tej dziedzinie, w celu wytworzenia związku o wzorze XVI. Postępując odmiennie, związek o wzorze XV można poddać reakcji ze związkiem chlorującym, takim jak SOCI2 lub ClCOCOCl, w sposób dobrze znany specjaliście, w celu wytworzenia chlorku kwasowego o wzorze XVII. Związek o wzorze XVII można poddać reakcji z produktami pośrednimi o wzorze R¹-OH lub R¹-NH2, razem z taką zasadą jak (C2H5)3N, w obecności zasady lub bez niej i stosując ogrzewanie lub bez ogrzewania, w celu wytworzenia związku o wzorze XVI. Produkty pośrednie o wzorze R¹-OH lub R¹-NH2 są dostępne w handlu lub bez trudu może je wytworzyć specjalista.

Jak to przedstawiono na schemacie VIII, związek o wzorze XV można przekształcić w związek o wzorze XVIII, który jest związkiem o wzorze I. Związek o wzorze XV można poddać reakcji z takim reagentem jak (C6H5)2PON3 i z takim alkoholem jak aIkohol t-butylowy, w celu wytworzenia stanowiącego produkt pośredni karbaminianu t-butylu, który z kolei można odbezpieczyć w reakcji z takim kwasem jak TFA lub z etanolowym roztworem HCl, otrzymując w wyniku wolną aminę o wzorze XVIII.

PL 206 962 B1

Schemat IX

Z = wiązanie, O lub NH.

Jak to zilustrowano na schemacie IX, związek o wzorze XVIII można przekształcić w związki o wzorach XIX i XX, które są związkami o wzorze I. Związek o wzorze XVIII można poddać reakcji z takim środkiem acylującym jak R¹Z''COCl lub (R¹Z''CO)2O, z taką zasadą jak (C2H5)3N, stosując ogrzewanie lub bez ogrzewania, w sposób znany specjaliście w tej dziedzinie, w celu wytworzenia związku o wzorze XIX. Odmiennie, związek o wzorze XVIII można poddać reakcji z kwasem o wzorze R¹Z''COOH razem z dowolnym układem różnych peptydowych środków sprzęgających, dobrze znanych specjaliście w tej dziedzinie, w celu wytworzenia związku o wzorze XIX. Związek o wzorze XVIII można także poddać reakcji z halogenkiem alkilu o wzorze R⁴-X' (X' oznacza atom fluorowca; R⁴ nie oznacza podstawionego (niepodstawionego) arylu lub heteroarylu), w obecności takiej zasady jak K2CO3 lub NaH, w celu wytworzenia pochodnej alkiloaminowej związku o wzorze XX. Produkty pośrednie o wzorze R⁴-X' są dostępne w handlu lub bez trudu może je wytworzyć specjalista.

Schemat X

xvm xxi

Jak to pokazano na schemacie X, związek o wzorze XVIII można przekształcić w związek o wzorze XXI, który jest związkiem o wzorze I. Związek o wzorze XVIII można poddać reakcji ze stanowiącym produkt pośredni aldehydem o wzorze R^7aCHO i następnie ze środkiem redukującym, takim jak NaB(O2CCH3)3H, w sposób znany specjaliście w tej dziedzinie, w celu wytworzenia związku o wzorze XXI. Produkty pośrednie o wzorze R^7aCHO są dostępne w handlu lub bez trudu może je wytworzyć specjalista.

Schemat XI

XXII XVIII

PL 206 962 B1

Jak to przedstawiono na schemacie XI, związek o wzorze XVIII można wytworzyć w sposób odmienny, z zastosowaniem pochodnej azydowej o wzorze XXII. Związek o wzorze XXII można wytworzyć w sposób przedstawiony na schemacie VI. W wyniku reakcji związku o wzorze XXII z takim środkiem redukującym jak trifenylofosfina, w THF i wodzie albo w reakcji z wodorem w obecności katalizatora Pd/C w metanolu, otrzymuje się związek o wzorze XVIII, który jest związkiem o wzorze I.

o wzorze XXIII, w sposób opisany w następujących pozycjach literaturowych i w zawartych w nich odsyłaczach: Pitha J. i inni, J. Med. Chem., 32, strony 96-100 (1989); Falck J. R, i inni, J. Chem. Soc, Perkin Trans. 1, 2, strony 413-414 (1990); Baxter E. W. i inni, J. Org. Chem., 54, strony 2893-2904 (1989); Ried W. i inni, Chem. Ber., 120, strony 657-658 (1987); Kunng F.-A. i inni, J. Org. Chem., 48, strony 4262-4266 (1988); Niwayama S. i inni, Tetrahedron Lett, 33, strony 883-886 (1992); Afarinkia K. i nni, Tetrahedron, 55, strony 3129-3140 (1999); Bates R. W. i nni, Aust. J. Chem., 51, strony 383-387 (1998); Marko I. E. i inni, Tetrahedron Lett., 34, strony 7309-7312 (1993); Simo T. i inni, J. Heterocycl. Chem., 29, strony 811-813 (1992); Matsui T. i inni, Heterocycles, 34, strony 723-728 (1992); Matsui T. i inni, Bull Chem. Soc. Jpn., 61, strony 316-318 (1988); Kvita V. i inni, Helv. Chim. Acta., 68, strony 1569-1576 (1985); Shiu L. H. i inni, Organometallics, 17, strony 4206-4212 (1998); Ager D. J. i inni, Heterocycles, 37, strony 1789-1805 (1994); Ager D. J. i inni, J. Chem. Res., Synop. 12, strony 462-463 (1986); Bock M., G. i inni, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5,686,454; Merges R. i inni, Chem. Ber., 127, strony 1143-1145 (1994); Bock M. G. i inni. Europejski opis patentowy numer EP 532097; Horton D. i inni, Carbohydr. Res., 216, strony 33-49 (1991); Chenier P. J. i inni, Synth. Commun., 18, strony 1947-1959 (1988), Verkruijsse H. D. i inni, Reel Trav. Chim. Pays-Bas, 105, strony 66-68 (1986); Gupta, I. i inni, J. Chem. Soc, Chem. Commun., 21, strony 1227-1228 (1982); Wilt J. W. i inni, J. Org. Chem., 47, strony 3721-3730 (1982); Klemarczyk P. T. i inni, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4,312,888; Yates P. i inni, J. Chem. Soc, Chem. Commun., 10, strony 449-451 (1981); Figeys H. P. i inni, Tetrahedron Lett., 21, strony 2369 -2372 (1980); Nallet J. P. i inni, Tetrahedron Lett., 20, strony 2583-2584 (1979); Rousseau G. i Lnni, Synthesis, strony 67-70 (1978); Just G. i inni, Can. J. Chem., 54, strony 2925-2934 (1976); Just G. i inni, Can. J. Chem., 54, strony 849-950 (1976); Werstiuk N. H. i inni, Can. J. Chem., 53, strony 26-40 (1975); Mamer O. A. i inni, Can. J. Chem., 52, strony 1983-1987 (1974); McCoy L. L. i inni, J. Am. Chem. Soc, 95, strony 7407-7412 (1973); Gassman P. G. i inni, J. Am. Chem. Soc, 90, strony 1517 -1524 (1968); Wilt J. W. i inni, J. Org. Chem., 33, strony 694-708 (1968). W wyniku reakcji związku o wzorze XXIII z takim środkiem chlorującym jak chlorek oksalilu, z zastosowaniem metod dobrze

PL 206 962 B1 znanych specjaliście w tej dziedzinie, otrzymuje się chlorek kwasowy o wzorze XXIV, który jest produktem pośrednim. W wyniku reakcji związku o wzorze XXIV z zasadą, taką jak NaH, i z produktem pośrednim w postaci aminy o wzorze G-L-NH2, przeprowadzonej w sposób dobrze znany specjaliście, wytwarza się amid o wzorze XXV, który stanowi produkt pośredni. Epoksydowy produkt pośredni o wzorze XXVI wytwarza się w reakcji zwią zku o wzorze XXV z takim utleniaczem jak mCPBA. W wyniku reakcji produktu pośredniego o wzorze XXVI z takim środkiem aminującym jak difenylofosfinylohydroksyloamina, otrzymuje się produkt pośredni w postaci pochodnej hydrazyny o wzorze XXVII. Zwykłe ogrzewanie produktu pośredniego o wzorze XXVII powoduje cyklizację poprzez otwarcie epoksydu, dając w wyniku związek o wzorze XXVIII. Produkty pośrednie o wzorze G-L-NH2 są dostępne w handlu lub bez trudu może je wytworzyć specjalista.

Jak to przedstawiono na schemacie XIII, w wyniku reakcji aIkoholu o wzorze X z aminą o wzorze R⁴-NH2, w trakcie ogrzewania, z zastosowaniem, metody opisanej przez Valtersa R. i innych, Latv. PSR Zinat. Akad. Vestis, Kim. Ser., strony 234-237, (1983), wytworzono aminę o wzorze XXIX, która jest związkiem o wzorze I.

Jak to pokazano na schemacie XIV, alkohol o wzorze X można przekształcić w siarczek arylowy o wzorze XXX (Ar oznacza aryl lub aryl podstawiony), który jest związkiem o wzorze I, przy czym reakcję prowadzi się z wykorzystaniem metod opisanych przez Huang P. Q. i innych, w Tetrahedron

Asymm., 10, strony 3309-3317, (1999) i Wee A. G. H. i innych, w J. Org. Chem., 63, strony 4218-4227 (1998). Postępując odmiennie, selenek fenylu o wzorze XXX można na przykład wytworzyć z alkoholu o wzorze X, w sposób opisany przez Kametani T. i innych, w J. Chem. Soc, Perkin Trans. L, strony

PL 206 962 B1

833-837, (1988). Selenek fenylu o wzorze XXX można napromieniać w obecności akceptora rodnikowego o wzorze J*, w celu trzymania związku o wzorze XXXI, który jest związkiem o wzorze I. Siarczek lub selenek o wzorze XXX można także poddać reakcji z wodorkiem tributylocyny, w obecności AIBN 2,2-azobisizobutyronitryl) i akceptora rodnikowego, otrzymując związek o wzorze XXXI. Pełniejszy opis akceptorów rodnikowych o wzorze J*, można znaleźć w artykułach Giese B. w Ang. Chem., Int.

Ed. Engl., 22, strona 753, (1983) i Currana D. P. w Synthesis, strona 417, (1988), które zamieszcza się w niniejszym jako referencje i które są znane specjaliście w tej dziedzinie.

Jak to przedstawiono na schemacie XV, w wyniku reakcji aIkoholu o wzorze X z acetonitrylem w kwasie siarkowym, w sposób opisany przez Nikintina K. V. i i nnych, w Mendeleev Commun., 1, strony 31-32, (2000), otrzymuje się związek o wzorze XXXII, który jest związkiem o wzorze I.

Jak to zilustrowano na schemacie XVI, związek o wzorze XXXIII, który jest związkiem o wzorze I, można łatwo wytworzyć wykorzystując metody opisane przez Ishihara Y. i inni, Chem. Phartn. Bull., 38, strony 3024-3030, (1990) oraz Mali. R.S, i inni, Synthesis, strony 755-757, (1986), Alkohol o wzorze X można poddać reakcji z reagentem Wittiga, po której następuje zamknięcie pierścienia w pozycji 1,4- wytworzonego oleinowego produktu pośredniego i w wyniku otrzymuje się związek o wzorze XXXIII. Reagenty typu Wittiga są dostępne w handlu lub może je zsyntetyzować specjalista w tej dziedzinie.

PL 206 962 B1

Jak to przedstawiono na schemacie XVII, alkohol o wzorze X można poddać reakcji z kwasem arylosulfonowym, w obecności chlorku wapnia i z zastosowaniem ogrzewania, z wykorzystaniem metod opisanych przez Huanga P. Q. i innych, Synth. Commun., 30, strony 2259-2268, (2000), otrzymując związek o wzorze XXXIV, który jest związkiem o wzorze I. Stanowiące produkty pośrednie, opisane pochodne kwasu arylosulfonowego są dostępne w handlu lub bez trudu może je wytworzyć specjalista, wiązek o wzorze XXXIV można poddać reakcji z odczynnikiem Grignarda, z zastosowaniem metod opisanych przez Arai Y. i innych, Chem. Pharm. Bull., 40, strony 1670-1672, (1992), trzymując związek o wzorze XXXV, który jest związkiem o wzorze I. Różne odczynniki Grignarda są dostępne w handlu lub z łatwością może je zsyntetyzować specjalista w tej dziedzinie.

Jak to pokazano na schemacie XVIII, produkt pośredni o wzorze XXXVI, który można wytworzyć w sposób przedstawiony w zgłoszeniach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki numer seryjny 09/885,381 oraz 60/271,672, można poddać reakcji z reagentami alkilolitowymi lub arylolitowymi albo z alkilowymi lub arylowymi odczynnikami Grignarda jak to opisali Cornelius L. A. i inni, w J. Org. Chem., 58, strony 3188-3190, (1993) oraz Canonne P. i inni, w Tetrahedron Lett., 27, strony

PL 206 962 B1

1001-2004, (1986), otrzymując produkt pośredni o wzorze XXXVII. Będący produktem pośrednim keton o wzorze XXXVII, można następnie kondensować z aminą o wzorze G-L-NH2, otrzymując iminowy produkt pośredni o wzorze XXXVIII. Iminowy produkt pośredni o wzorze XXXVIII, który nie trzeba wydzielać, można redukować z zastosowaniem metod znanych specjaliście albo ogrzewać lub kontaktować z peptydowym środkiem sprzęgającym) i następnie cyklizować, w celu wytworzenia związku o wzorze XIL, który jest związkiem o wzorze I.

Jak to przedstawiono na schemacie XIX, iminowy produkt pośredni o wzorze XXXVIII można poddać reakcji z odczynnikiem stanowiącym źródło anionu cyjankowego, takim jak TMSCN, w obecności takiego kwasu Lewisa jak kompleks eterowy trifluorku boru, z zastosowaniem metod opisanych przez Kuehlinga i innych, w Chem. Ber., 23, strona 709, (1890) oraz Kuehlinga i innych, w Chem. Ber., 38, strona 1222, (1905), otrzymując związek o wzorze XL, który jest związkiem o wzorze I.

Jak to zilustrowano na schemacie XX, iminowy produkt pośredni o wzorze XXXVII można poddać reakcji z aminą pierwszorzędową o wzorze R⁴-NH2, z zastosowaniem metod opisanych przez Stajera G. i innych, w Heterocycles, 37, strony 883-890, (1994) oraz Sohara P. i innych, w Magn. Reson. Chem., 32, strony 705-710, (1994), otrzymując związek o wzorze XLI, który jest związkiem o wzorze I. Tworzenie się produktu następuje po początkowym dodaniu aminy pierwszorzędowej do iminy, po którym następuje cyklizacja do żądanego związku wzorze XLI.

Jak to zilustrowano na schemacie XXI, związek o wzorze XXVIII można łatwo odtlenić działając najpierw disiarczkiem węgla i jodkiem metylu, w celu wytworzenia ksantynianu będącego produktem pośrednim. Następnie, w reakcji z wodorkiem ributylocyny i AIBN, opisanej przez Palomo C. i innych, w Tetrahedron Lett., 33, strona 4827-4830, (1992), otrzymuje się związek o wzorze XLII, który jest związkiem o wzorze I.

PL 206 962 B1

Jak to zilustrowano na schemacie XXII, związek o wzorze XXVIII można przekształcić w związki o wzorze XLIII i XLIV, które są związkami o wzorze I. Związek o wzorze XXVIII można poddać reakcji ze środkiem acylującym, takim jak R¹COCl lub (R¹CO)2O, z taką zasadą jak (C2H5)3N, stosując ogrzewanie lub bez ogrzewania, w sposób znany specjaliście w tej dziedzinie, w celu wytworzenia związku o wzorze XLIII. Odmiennie, związek o wzorze XVIII można poddać reakcji z kwasem o wzorze R¹COOH, razem z dowolnym układem peptydowych reagentów sprzęgających dobrze znanych specjaliście w tej dziedzinie, w celu wytworzenia związku o wzorze XLIII. Związek o wzorze XVIII można także poddać reakcji z halogenkiem (na przykład z halogenkiem alkilu) o wzorze R⁷-X' (w przypadku tego schematu R⁷ obejmuje grupy zdefiniowane dla R⁴, za wyjątkiem podstawionego (niepodstawionego) arylu lub heteroarylu, w obecności takiej zasady jak K2CO3 lub NaH, w celu wytworzenia pochodnej aminy (na przykład alkiloaaminy) o wzorze XLIV. Produkty pośrednie o wzorach R¹COCl, (R¹CO)2O i R⁷-X' są dostępne w handlu lub może je zsyntetyzować specjalista.

Inne związki według wynalazku można wytworzyć z zastosowaniem procedur analogicznych do opisanych powyżej. Na przykład, powyższe procedury które zademonstrowano dla przypadku gdy Z oznacza atom tlenu, można stosować wtedy gdy Z oznacza S, NH lub NR. W każdym przypadku gdy jest to odpowiednie, związki o wzorze I można także wytwarzać z zastosowaniem metod opisanych w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer seryjny 10/025,116, złożonym równocześnie z tym zgłoszeniem przez Mark Salvati i innych, zatytułowanym „Fused Heterocyclic Succinimide Compounds and Analogs Thereof, Modulators of Nuclear Hormone Receptor Function”, zamieszczonym w niniejszym w całości jako odnośnik, takich metod jak przedstawione tam przekształcenia mikrobiologiczne/enzymatyczne i/lub metody rozdzielania.

Zastosowanie i przydatność

Związki według obecnego wynalazku modulują funkcję receptorów jądrowych hormonalnych (NHR) i obejmują związki, które są na przykład agonistami, częściowymi agonistami, antagonistami lub częściowymi antagonistami receptora androgenowego (AR), receptora estrogenowego (ER), receptora progesteronowego (PR), receptora glukokortykoidowego (GR), receptora mineralokortykoidowego (MR), receptora steroidowego i ksenobiotycznego (SXR), innych wiążących steroidy receptorów NHR, receptorów sierocych lub innych receptorów NHR. Korzystna jest selektywna modulacja jednego z takich receptorów NHR względem innych receptorów, w obrębie rodziny NHR. Określenie „modulacja” obejmuje na przykład aktywację (na przykład aktywności agonistycznej, takiej jak selektywna aktywność agonistyczna względem receptora androgenowego) lub hamowanie (na przykład aktywności antagonistycznej).

Tak więc, związki według obecnego wynalazku są użyteczne w leczeniu stanów związanych z NHR. Stosowane w niniejszym kreślenie „stan związany z NHR”, oznacza stan lub zaburzenie, które może być leczone poprzez modulację funkcji NHR u osobnika, które to postępowanie lecznicze obejmuje zapobieganie (na przykład leczenie profilaktyczne), częściowe złagodzenie lub wyleczenie stanu

PL 206 962 B1 albo zaburzenia. Modulacja może występować miejscowo na przykład w obrębie określonych tkanek osobnika lub bardziej szeroko u całego osobnika leczonego na takie zaburzenie stanu.

Związki według wynalazku są użyteczne w leczeniu różnych stanów i zaburzeń, wliczając w to opisane poniżej, lecz nie ograniczając się do nich.

Związki o wzorze I mogą być stosowane jako agoniści, agoniści częściowi, antagoniści lub antagoniści częściowi receptora estrogenowego, korzystnie selektywnie w stosunku do tego receptora, w układzie stanów medycznych, w których zaangażowana jest modulacja ścieżki receptora estrogenowego. Zastosowania tych związków obejmują: osteoporozę, uderzenia gorąca, suchości pochwy, raka prostaty, raka sutka, raka śluzówki macicy, rodzaje raka w którym zachodzi ekspresja receptora estrogenowego, takie jak wyżej wymienione rodzaje raka i inne, antykoncepcję, przerywanie ciąży, menopauzę, brak miesiączki i bolesne miesiączkowania lecz nie ograniczając się do tego.

Związki o wzorze I mogą być stosowane jako agoniści, częściowi agoniści, antagoniści lub częściowi antagoniści receptora progesteronowego, korzystnie selektywnie w stosunku do tego receptora, w układzie stanów medycznych, w których zaangażowana jest modulacja ścieżki receptora progesteronowego. Zastosowania tych związków obejmują: raka sutka, inne rodzaje raka zawierającego receptor progesteronu, endometriozę, kacheksję, antykoncepcję, menopauzę, synchronię cyklu, oponiaka, bolesne miesiączkowanie, włókniakomięśniaka gładkiego, przerywanie ciąży, wywołanie porodu i osteoporozę.

Związki o wzorze I mogą być stosowane jako agoniści, częściowi agoniści, antagoniści lub częściowi antagoniści receptora glukokortykoidowego, korzystnie selektywnie w stosunku do tego receptora, w układzie stanów medycznych, w których zaangażowana jest modulacja ścieżki receptora glukokortykoidowego. Zastosowania tych związków obejmują: choroby o charakterze zapalnym, choroby autoimmunologiczne, raka prostaty, jaka sutka, chorobę Alzheimera, choroby psychotyczne, uzależnienia od leków, cukrzycę niezależną od insuliny, lecz nie ograniczając się do nich i mogą być stosowane jako środki blokujące receptor dopaminowy, lub inaczej, jako środki do leczenia zaburzeń, w których mediatorem jest receptor dopaminowy.

Związki o wzorze I mogą być stosowane jako agoniści, częściowi agoniści, antagoniści lub częściowi antagoniści receptora mineralokortykoidowego, korzystnie selektywnie w stosunku do tego receptora, w układzie stanów medycznych w których zaangażowana jest modulacja ścieżki receptora mineralokortykoidowego. Zastosowania tych związków obejmują: zespół odstawienia leku i choroby o charakterze zapalnym lecz nie ograniczając się do nich.

Związki o wzorze I mogą być stosowane jako agoniści, częściowi agoniści, antagoniści lub częściowi antagoniści receptora aldosteronu, korzystnie selektywnie w stosunku do tego receptora, w układzie stanów medycznych w których zaangażowana jest modulacja ścieżki receptora aldosteronu. Jednym z zastosowań tych związków jest zastoinowa niewydolność serca, lecz nie ograniczając się do tego.

Związki o wzorze I mogą być stosowane jako agoniści, częściowi agoniści, antagoniści lub częściowi antagoniści receptora androgenowego, korzystnie selektywnie w stosunku do jego receptora, w układzie stanów medycznych w których zaangażowana jest modulacja ścieżki receptora androgenowego. Zastosowania tych związków obejmują: hirsutyzm, trądzik, łojotok, chorobę Alzheimera, łysienie typu męskiego, niedorozwój gonad, nadmierne owłosienie, łagodny przerost prostaty, gruczolaki i nowotwory prostaty (takie jak zaawansowany rak prostaty z przerzutami), leczenie łagodnych lub złośliwych komórek guza zawierających receptor androgenowy, takich jak w przypadku raków sutka, mózgu, skóry, jajnika, pęcherza, układu limfatycznego, wątroby i nerek, raków trzustki, modulację ekspresji VCAM i jej zastosowanie do leczenia chorób serca, zapalenie i modulację immunologiczną, modulację ekspresji VEGF i jej zastosowanie jako środka przeciwko angiogenezie, osteoporozę, hamowanie spermatogenezy, libido, kacheksję, endometriozę zespół torbielowatości jajnika, anoreksję, uzupełnienie androgenów w związanym z wiekiem spadkiem poziomu testosteronu u mężczyzn, męską menopauzę, hormonalną terapię zastępczą u mężczyzn, zaburzenia seksualne u mężczyzn i kobiet i hamowanie atrofii mięśni u pacjentów ambulatoryjnych, lecz nie ograniczając się do nich. Na przykład brana jest pod uwagę modulacja pan AR, ze szczególnie korzystną selektywną dla prostaty modulacją AR („SARM”), jak w przypadku wczesnego stadium raków prostaty.

Związki o wzorze I mogą być stosowane jako (korzystnie selektywnie) antagoniści zmutowanego receptora androgenowego występującego w wielu liniach komórek nowotworowych. Przykładami takich mutantów są mutanty występujące w reprezentatywnych liniach komórkowych nowotworu prostaty, takich jak LN-Cap, (mutacja T877A, Biophys. Acta, 187, strona 1052 (1990)), PCa2b, (mutacje

PL 206 962 B1

L701H i T877A, J. Urol., 162, strona 2192 (1999) i CWR22, (mutacja H874Y, Mol. Endo., 11, strona

450 (1997)). Zastosowania związków według wynalazku obejmują: gruczolaki i nowotwory prostaty, rak sutka i rak śluzówki macicy lecz nie ograniczając się do nich.

Związki o wzorze I mogą być zastosowane jako agoniści, częściowi agoniści, antagoniści lub częściowi antagoniści receptora steroidowego i ksenobiotycznego, korzystnie selektywnie w stosunku do tego receptora, w układzie stanów medycznych, w których zaangażowana jest modulacja ścieżki receptora steroidowego i ksenobiotycznego. Zastosowania związków według wynalazku obejmują: leczenie zaburzeń regulacji homeostazy cholesterolu, osłabianie metabolizmu środków farmaceutycznych poprzez jednoczesne podawanie środka (związku według wynalazku), który moduluje działanie SXR regulujące P450 lecz nie ograniczając się do nich.

Oprócz wyżej wymienionych NHR, istnieje wiele NHR, dla których nie można scharakteryzować aktywujących lub dezaktywujących ligandów. Te białka są sklasyfikowane jako inne NHR, z powodu znacznej homologii sekwencji i są znane jako receptory sieroce. Ponieważ receptory sieroce wykazują znaczną holologię sekwencji w stosunku do innych NHR, związki o wzorze I obejmują te, które służą jako modulatory funkcji sierocych NHR. Receptory sieroce, które są modulowane przez takie modulatory NHR jak związki objęte wzorem I są przedstawione w tabeli 1, lecz nie ograniczając się do nich. Przykładowe zastosowania terapeutyczne wymienionych modulatorów receptorów sierocych są również przedstawione w tabeli 1, lecz nie ograniczają się tylko do tych przykładów.

T a b e l a 1

Przykładowe sieroce jądrowe receptory hormonalne, postać M = monomeryczna, D = heterodimeryczna,

H = homodimeryczna), ekspresja tkankowa i docelowe zastosowanie lecznicze (CNS = ośrodkowy układ nerwowy)

Receptor	Postać	Ekspresja tkankowa	Docelowe zastosowanie lecznicze
NURR1	M/D	neurony dopaminergiczne	choroba Parkinsona
RZRe	M	mózg (przysadka), mięśnie	zaburzenia snu
RORa	M	móżdżek, konórki Purkinjego	zapalenie stawów, ataksja móżdżkowa
NOR-1	M	mózg, mięśnie, serce, nadnercze, grasica	zaburzenia ośrodkowego układu nerwowego, rak
NGFI-Be	M/D	mózg	zaburzenia ośrodkowego układu nerwowego
COUP-Tfa	H	mózg	zaburzenia ośrodkowego układu nerwowego
COUP-TFe	H	mózg	zaburzenia ośrodkowego układu nerwowego
COUP-TEyX	H	mózg	zaburzenia ośrodkowego układu nerwowego
Nur 77	H	mózg, grasica, nadnercza	zaburzenia ośrodkowego układu nerwowego
Rev-ErbAa	H	mięśnie, mózg (wszechobecna)	otyłość
HNF4a	H	wątroba, nerki, jelita	cukrzyca
SF-1	M	gonady, przysadka	zaburzenia metaboliczne
LXRa,e	D	nerki (wszechobecna)	zaburzenia metaboliczne
GCNF	M/H	jądra, jajniki	niepłodność
ERRa,e	M	łożysko, kości	niepłodność, osteoporoza
FXR	D	wątroba, nerki	zaburzenia metaboliczne
CARa	H	wątroba, nerki	zaburzenia metaboliczne
PXR	H	wątroba, jelita	zaburzenia metaboliczne
COUP-TF2 (ARPI)	D	jądro	onkologia/rozwój naczyń
RORe	M	CNS, siatkówka, szyszynka	zaburzenia metaboliczne

Tak więc, związki według wynalazku znajdują zastosowanie do leczenia stanów związanych z receptorami NHR, obejmujące etap podawania osobnikowi potrzebującemu takiego leczenia co najmniej

PL 206 962 B1 jednego związku o wzorze I w ilości skutecznej do tego celu. Inne środki terapeutyczne, takie jak te które opisano poniżej, mogą być zastosowane razem ze związkami według wynalazku (na przykład oddzielnie lub razem jako ustalona dawka). Leczenie obejmuje podawanie innego środka (środków) terapeutycznego przed, jednocześnie lub po podaniu związku (związków) według obecnego wynalazku.

Związki według wynalazku znajdują zastosowanie do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierającej co najmniej jeden ze związków o wzorze I, który jest zdolny do leczenia stanu związanego z receptorami NHR, w ilości skutecznej do tego celu oraz nośnik dopuszczony do stosowania w farmacji (podłoże lub rozcieńczalnik). Kompozycje te mogą zawierać inne środki lecznicze, jak to opisano poniżej i mogą być tworzone, na przykład, poprzez zastosowanie tradycyjnych stałych lub płynnych podłoży albo rozcieńczalników, jak również dodatków farmaceutycznych odpowiednich do pożądanego sposobu podawania (na przykład, zaróbek, środków wiążących, środków konserwujących, stabilizatorów, środków smakowych i tym podobnych) zgodnie z technikami dobrze znanymi specjalistom w dziedzinie farmacji stosowanej.

Należy pokreślić, że związki według obecnego wynalazku są, bez ograniczeń odnoszących się do mechanizmu ich działania, użyteczne w leczeniu dowolnych stanów lub zaburzeń wymienionych lub opisanych w niniejszym, takich jak choroby zapalne lub nowotwory albo inne choroby proliferacyjne i w kompozycjach do leczenia takich stanów lub zaburzeń. Do takich stanów i zaburzeń należą, bez ograniczeń, jakiekolwiek spośród wcześniej opisanych jak również opisane dalej, takie jak: zachowanie siły i funkcji mięśni (na przykład u osób w podeszłym wieku), odwrócenie lub zapobieganie wątłości lub związanej z wiekiem inwolucji funkcjonalnej („ARFD”) u osób w podeszłym wieku (na przykład zmniejszenie masy mięśni); leczenie katabolicznych działań ubocznych glukokortykosteroidów; zapobieganie i/lub leczenie zmniejszonej masy, gęstości lub wzrostu kości (na przykład w osteoporozie lub osteopenii); leczenie zespołu przewlekłego zmęczenia (CFS); przewlekła malaria; leczenie zespołu ostrego zmęczenia i zmniejszenia masy mięśni po zabiegu operacyjnym (na przykład rehabilitacja pooperacyjna); przyspieszenie gojenia ran; przyspieszenie gojenia złamania kości (na przykład przyspieszenie powrotu do zdrowia pacjentów po złamaniu biodra); przyspieszenie gojenia skomplikowanych złamań (na przykład rozproszona osteogeneza); wymiana stawu; zapobieganie pooperacyjnemu formowaniu adhezji; przyspieszenie naprawy lub wzrostu zęba; zachowanie funkcji narządów zmysłów (na przykład słuchu, wzroku, węchu i smaku); leczenie choroby okołozębowej; leczenie wyniszczenia wtórnego do złamań i wyniszczenia związanego z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc (COPD), przewlekła choroba wątroby, AIDS, niedowaga, wyniszczenie nowotworowe, proces zdrowienia po oparzeniu lub urazie, przewlekły stan kataboliczny (na przykład śpiączka), zaburzenia odżywiania (np. anoreksja) i chemioterapia; leczenie kardiomiopatii; leczenie trombocytopenii; leczenie opóźnienia wzrostu związanego z chorobą Crohna; leczenie zespołu krótkiego jelita; leczenie zespołu nadwrażliwości jelita grubego; leczenie zapalenia jelita; leczenie choroby Crohna i wrzodziejącego zapalenia okrężnicy; leczenie komplikacji związanych z transplantacją; leczenie fizjologicznego niskiego wzrostu, włącznie z dziećmi z niedoborem hormonu wzrostu i niskiego wzrostu związanego z przewlekłą chorobą; leczenie otyłości i zahamowania wzrostu związanego z otyłością; leczenie anoreksji (na przykład związanej z kacheksją lub starzeniem); leczenie nadmiernego wydzielania kortyzolu i zespołu Cushing'a, choroba Paget'a, leczenie zapalenia kości i stawów; spowodowanie pulsacyjnego uwalniania hormonu wzrostu; leczenie osteochondrodyplazji; leczenie depresji, nerwowości, drażliwości i stresu; leczenie zmniejszonego napędu psychicznego i niskiej samooceny (na przykład motywacji/asertywności); poprawa funkcji poznawczych (na przykład w leczeniu demencji, włącznie z chorobą AIzheimera i krótkotrwałą utratą pamięci); leczenie katabolizmu związanego z dysfunkcją płuc i zależnością od wentylatora; leczenie dysfunkcji serca (na przykład związanej z chorobą zastawki, zawałem, przerostem serca lub zastoinowa niewydolnością serca); obniżanie ciśnienia krwi; ochrona przed dysfunkcją komór lub zapobieganie incydentom reperfuzji; leczenie dorosłych poddawanych przewlekłej dializie; odwracanie lub spowalnianie stanu katabolicznego związanego ze starzeniem; osłabianie lub odwracanie katabolicznych reakcji białkowych po urazie (na przykład odwracanie stanu katabolicznego wiązanego z operacją chirurgiczną, zastoinową niewydolnością serca, miopatią serca, oparzeniami, rakiem, COPD i tym podobnych); zmniejszanie kacheksji i utraty białka związanej z przewlekłą chorobą, taką jak rak lub AIDS; leczenie hiperinsulinemii włącznie z przerostem wysp trzustki; leczenie pacjentów ze zmniejszoną odpornością; leczenie wyniszczenia wiązanego ze stwardnieniem rozsianym lub innymi chorobami neurodegeneracyjnymi; wzmaganie naprawy mieliny; utrzymywanie określonej grubości skóry; podtrzymywanie homeostazy metabolicznej i homeostazy nerkowej (na przykład u osłabionych osób w podeszłym wieku); stymulacja osteoblastów, przebudowy

PL 206 962 B1 ości i wzrostu chrząstki; regulacja pobierania pokarmu; leczenie oporności na insulinę włącznie z NIDDM u ssaków (na przykład u ludzi); leczenie oporności na insulinę w sercu; poprawa jakości snu i korekta relatywnego niedoboru somatotropiny wieku starczego wywołanego wydłużeniem fazy REM snu i spadkiem utajenia fazy REM; leczenie hipotermii; leczenie zatorowej niewydolności serca; leczenie lipodystrofii (na przykład u pacjentów leczonych na HIV lub AIDS, na przykład inhibitorami proteazy); leczenie atrofii mięśniowej (na przykład w stanach braku aktywności fizycznej, unieruchomienia w łóżku lub z powodu zmniejszonego obciążenia); leczenie osłabienia układu mięśniowo-szkieletowego (na przykład u osób w podeszłym wieku); poprawa ogólnej funkcji płuc; leczenie zaburzeń snu i leczenie stanu katabolicznego w stanie krytycznym spowodowanym przewlekłą chorobą; leczenie hirsutyzmu, trądziku, łojotoku, łysienia typu męskiego, anemii, nadmiernego owłosienia, łagodnego przerostu prostaty, gruczolaków i nowotworów prostaty (na przykład zaawansowanego raka prostaty: z przerzutami) i złośliwych komórek nowotworowych zawierających receptor androgenowy, takich jak w przypadku raków sutka, mózgu, skóry, jajnika, pęcherza, układu chłonnego, wątroby i nerki; raków skóry, trzustki, śluzówki macicy, płuc i okrężnicy; kostniakomięsaka, hiperkalcemii w przebiegu choroby nowotworowej, raka kości z przerzutami, leczenie spermatogenezy, endometriozy i torbielowatości jajnika; stan przedrzucawkowy, rzucawka połogowa i przedwczesny poród; leczenie zespołu napięcia przedmiesiączkowego; leczenie suchości pochwy; związany z wiekiem spadek poziomu testosteronu u mężczyzn, męska menopauza, niedorozwój gonad, hormonalna terapia zastępcza u mężczyzn, dysfunkcje seksualne u mężczyzn i kobiet (na przykład zaburzenia erekcji, obniżenie potrzeb seksualnych, spadek satysfakcji seksualnej, obniżenie libido), antykoncepcja u mężczyzn i kobiet, utrata włosów, zespół Reaven'a i zwiększenie sprawności/siły kości i mięśni oraz zaburzenia, choroby i stany określane wspólnie jako „zespół X„ lub zespół metaboliczny, jak to szczegółowo zostało opisane przez Johannssona w J. Clin. Endocrinol. Metab., 82, strony 727-734 (1997).

Związki według obecnego wynalazku mają terapeutyczne zastosowanie w modulacji aktywacji/proliferacji komórek immunologicznych, na przykład jako kompetycyjne inhibitory wewnątrzkomórkowych reakcji wiązania ligand/receptor z zaangażowaniem cząsteczek CAM (Cellular Adhesion Molecules) i leukointegryn. Na przykład, związki według obecnego wynalazku modulują LFA-ICAM 1 i są szczególnie użyteczne jako antagoniści LFA-ICAM 1 i w leczeniu wszystkich stanów związanych z LFA-ICAM 1, takich jak zaburzenia immunologiczne. Do korzystnych zastosowań związków według obecnego wynalazku zalicza się: stany zapalne, takie jak te które wynikają z odpowiedzi niespecyficznego układu immunologicznego u ssaka (na przykład zespół ostrego wyczerpania oddechowego dorosłych, wstrząs, toksyczne działanie tlenu, zespół uszkodzenia wielu narządów związany z posocznicą, zespół uszkodzenia wielu narządów związany z urazem, uszkodzenie reperfuzji tkanek związany z bypassem sercowo-płucnym, zawał serca lub zastosowanie środków trombolitycznych, ostre zapalenie kłębuszkowe nerek, zapalenie naczyń, reaktywne zapalenie stawów, dermatoza z ostrymi komponentami zapalnymi, udar, uszkodzenie termiczne, hemodializa, leukafereza, wrzodziejące zapalenie okrężnicy, martwicowe zapalenie jelita cienkiego i okrężnicy oraz zespół wiązany z transfuzją granulocytów) i stany wynikające z reakcji specyficznego układu immunologicznego u ssaka (takie jak na przykład łuszczyca, odrzucenie przeszczepu narządu/tkanki, reakcja przeszczepu przeciwko gospodarzowi i choroby autoimmunologiczne włącznie z zespołem Raynaud'a, autommunologiczne zapalenie tarczycy, zapalenie skóry, stwardnienie rozsiane, reumatoidalne zapalenie stawów, cukrzyca zależna od insuliny, zapalenie błony naczyniowej oka, zapalenie jelita włącznie z chorobą Crohna i wrzodziejącym zapaleniem okrężnicy oraz układowy toczeń rumieniowaty), lecz nie ograniczając się do nich. Związki według obecnego wynalazku mogą być stosowane w leczeniu astmy lub jako dodatek minimalizujący toksyczność terapii cytokinami w leczeniu raka. Związki według obecnego wynalazku mogą być zastosowane w leczeniu wszystkich chorób, które mogą być obecnie leczone steroidami. Związki według obecnego wynalazku mogą być zastosowane w leczeniu tych i innych zaburzeń w monoterapii lub razem z innymi środkami immunosupresyjnymi lub przeciwzapalnymi. Zgodnie z wynalazkiem, związek o wzorze I może być podawany przed wystąpieniem zapalenia (w celu zahamowania przewidywanego zapalenia) lub po wystąpieniu zapalenia. Gdy jest podawany profilaktycznie, związek (związki) immunosupresyjny jest korzystnie podawany (są korzystnie podawane) przed wystąpieniem jakiejkolwiek reakcji zapalnej lub objawu zapalnego (na przykład przed, lub wkrótce po, przeszczepieniu narządu lub tkanki lecz przed wystąpieniem jakichkolwiek objawów lub przed odrzuceniem narządu). Profilaktyczne podanie związku o wzorze I zapobiega lub łagodzi jakąkolwiek następczą reakcję zapalną jak na przykład odrzucenie przeszczepionego narządu lub tkanki i tym podobne). Podanie

PL 206 962 B1 związku o wzorze I łagodzi jakiekolwiek istniejące zapalenie (jak na przykład odrzucenie przeszczepionego narządu lub tkanki).

Związki o wzorze I mogą być podawane w jakimkolwiek zastosowaniu spośród opisanych tutaj, jakąkolwiek odpowiednią drogą, na przykład doustnie, w postaci tabletek, kapsułek, granulek lub proszków; podjęzykowo, dopoliczkowo, pozajelitowo, to jest w postaci iniekcji podskórnej, dożylnej, domięśniowej lub injekcji domostkowej lub metodą infuzji (na przykład jako sterylne roztwory lub zawiesiny wodne albo niewodne do iniekcji); donosowo włącznie z podawaniem na błony śluzowe nosa, poprzez rozpylacz do inhalacji; miejscowo, w postaci kremu lub maści; doodbytniczo, w postaci czopków; w jednostkowych postaciach dawkowania zawierających nietoksyczne, dopuszczone do stosowania w farmacji podłoża lub rozcieńczalniki. Związki według obecnego wynalazku można na przykład dodawać w postaci odpowiedniej do natychmiastowego lub przedłużonego uwalniania. Natychmiastowe uwalnianie lub przedłużone uwalnianie może być osiągnięte przez zastosowanie odpowiednich kompozycji farmaceutycznych zawierających związki według wynalazku lub, szczególnie w przypadku przedłużonego uwalniania, przez użycie takich urządzeń jak implanty podskórne lub pompy osmotyczne. Związki według wynalazku mogą także być podawane w postaci preparatów liposomowych.

Przykładowe kompozycje do podawania doustnego obejmują zawiesiny, które mogą zawierać, na przykład, celulozę mikrokrystaliczną jako środek objętościowy, kwas alginowy lub alginian sodu jako środek tworzący zawiesinę, metylocelulozę jako środek zwiększający lepkość oraz znane w tej dziedzinie środki słodzące lub smakowe oraz tabletki do natychmiastowego uwalniania które mogą na przykład zawierać celulozę mikrokrystaliczną, fosforan dwuwapniowy, skrobię, stearynian magnezu i/lub laktozę i/lub inne substancje pomocnicze, środki wiążące, środki powiększające objętość, środki rozsadzające, rozcieńczalniki i substancje poślizgowe, takie jak te które są znane w tej dziedzinie. Związki o wzorze I mogą także być dostarczane przez jamę ustną, w wyniku podania podjęzykowego i/lub dopoliczkowego. Tabletki wytłaczane, tabletki prasowane lub liofilizowane są przykładowymi postaciami które można stosować. Do przykładowych kompozycji zalicza się postacie użytkowe zawierające związek (związki) według obecnego wynalazku i szybko rozpuszczające się rozcieńczalniki, takie jak mannitol, laktoza, sacharoza i/lub cyklodekstryny. Tego typu preparaty użytkowe mogą również zawierać składniki o dużej masie cząsteczkowej, takie jak celulozy (avicel) lub glikole polietylenowe (PEG). Takie preparaty mogą zawierać składnik ułatwiający adhezję do śluzówki, taki jak hydroksypropyloceluloza (HPC), hydroksypropylometyloceluloza (HPMC), karboksymetyloceluloza sodu (SCMC), kopolimer bezwodnika maleinowego (na przykład Gantrez) i środki do kontroli uwalniania, takie jak kopolimer poliakrylowy (na przykład Carbopol 934). Dla ułatwienia wytwarzania i stosowania można także dodać środki nawilżające, poślizgowe, smakowe, barwiące oraz stabilizatory.

Przykładowe kompozycje do stosowania w postaci aerozolu do nosa lub inhalacji obejmują roztwory w solance, które na przykład mogą zawierać alkohol benzylowy lub inne odpowiednie konserwanty, promotory absorpcji w celu zwiększenia biodostępności i/lub inne środki rozpuszczające lub dyspergujące, takie jak środki znane w tej dziedzinie.

Do przykładowych kompozycji do podawania pozajelitowego zalicza się roztwory lub zawiesiny do wstrzyknięcia, które na przykład mogą zawierać odpowiednie nietoksyczne, zaakceptowane do stosowania pozajelitowego rozcieńczalniki lub rozpuszczalniki takie, jak mannitol, 1,3-butanodiol, wodę, roztwór Ringera, izotoniczny roztwór chlorku sodu lub inne odpowiednie środki dyspergujące lub zwilżające oraz ułatwiające tworzenie zawiesiny, włącznie z syntetycznymi mono- i diglicerydami oraz kwasami tłuszczowymi, w tym z kwasem oleinowym lub preparatem Cremaphor.

Przykładowe kompozycje do stosowania doodbytniczego obejmują czopki, które mogą zawierać, na przykład, odpowiedni niedrażniący składnik, taki jak masło kakaowe, syntetyczne estry glicerydowe lub glikole polietylenowe, które w zwykłej temperaturze są w stanie stałym, lecz przechodzą w stan ciekły i/lub rozpuszczają się w odbytnicy uwalniając lek.

Przykładowe kompozycje do stosowania miejscowego obejmują nośnik do stosowania miejscowego, taki jak Plastibase (olej mineralny zżelowany z polietylenem).

Skuteczna ilość związku według wynalazku może być określona przez specjalistę i obejmuje przykładowe dawki dla dorosłego człowieka od około 1 mg/kg do 100 mg/kg (na przykład 15 mg/kg) masy ciała substancji czynnej dziennie, które mogą być podane w dawce pojedynczej lub w postaci indywidualnych dawek podzielonych, podawanych na przykład od 1 do 4 razy dziennie. Jest oczywiste, że określony poziom dawek i częstotliwość podawania określonemu osobnikowi, może być zróżnicowana zależnie od wielu czynników włącznie z aktywnością specyficznego zastosowanego związku, stabilności metabolicznej i długości działania związku, gatunku, wieku, masy ciała, ogólnego stanu

PL 206 962 B1 zdrowia, płci i diety osobnika, sposobu i czasu podawania leku, szybkości wydalania, kombinacji leków i ostrości określonego stanu. Do korzystnych osobników których można leczyć zalicza się zwierzęta, najkorzystniej takie gatunki ssaków jak ludzie i zwierzęta domowe, psy, koty i tym podobne, cierpiących z powodu stanów związanych z NHR.

Jak wspomniano powyżej, związki według wynalazku mogą być zastosowane same albo w połączeniu ze sobą i/lub z innymi odpowiednimi ś rodkami leczniczymi uż ytecznymi w leczeniu chorób związanych z NHR, na przykład z antybiotykiem lub innym środkiem farmaceutycznie aktywnym.

Związki według wynalazku mogą na przykład być łączone ze środkami przyspieszającymi wzrost, takimi jak TRH, dietylstilbestrol, teofilina, enkefaliny, prostaglandyny E, związki ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 3,239,345, na przykł ad zeranol oraz związki ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4,036,979, na przykład sulbenox albo peptydy ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4,411,890.

Związki według wynalazku można także stosować w połączeniu ze środkami pobudzającymi wydzielanie hormonu wzrostu, jakimi jak GHRP-6, GHRP-1 (jakie ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4,411,890 i w publikacjach międzynarodowych numer WO 89/07110 oraz numer WO 89/07111), GHRP-2 (jaki opisano w publikacji międzynarodowej numer WO 93/04081), NN703 (Novo Nordisk), LY444711 (Lilly), MK-677 (Merck), CP424391 (Pfizer) i B-HT920 lub z czynnikiem uwalniają cym hormon wzrostu i z jego analogami albo z hormonem wzrostu i jego analogami lub z somatomedynami, łącznie z IGF-1 oraz IGF-2 lub z agonistami alfaadrenergicznymi, takimi jak klonidyna lub z agonistami receptora serotoniny 5-HTD, takimi jak sumatryptan lub środkami, które hamują somatostatynę lub jej uwalnianie, takimi jak fizostygmina i pirydostygmina. Dalszym zastosowaniem ujawnionych związków według wynalazku jest ich połączenie z hormonem przytarczyc, PTH (1-34) lub z bifosfonianami, takimi jak MK-217 (alendronian).

Dodatkowym zastosowaniem związków według wynalazku jest ich połączenie z estrogenem, testosteronem, selektywnym modulatorem receptora estrogenu, takim jak tamoksyfen lub raloksyfen lub z innymi modulatorami receptora androgenu, takimi jak modulatory ujawnione przez J.P. Edwardsa i innych w Bio. Med. Chem. Lett., 9, strony 1003-1008 (1999) oraz L.G. Hamanna i innych, w J. Med. .Chem., 42, strony 210-212 (1999).

Dalszym zastosowaniem związków według tego wynalazku jest ich połączenie z agonistami receptora progesteronu („PRA”), takimi jak lewonorgestrel i octan medroksyprogesteronu (MPA).

Związki według wynalazku mogą być stosowane w monoterapii lub w połączeniu ze sobą i/lub z innymi modulatorami receptorów jądrowych hormonalnych albo z innymi odpowiednimi środkami leczniczymi użytecznymi w leczeniu wyżej wymienionych chorób włącznie z: środkami przeciwcukrzycowymi; środkami przeciwko osteoporozie; środkami przeciwko otyłości; środami przeciwzapalnymi; środkami przeciwlękowymi; środkami przeciwdepresyjnymi; środkami przeciwko nadciśnieniu; środkani przeciwpłytkowymi; środkami przeciwzakrzepowymi i trombolitycznymi; glikozydami nasercowymi; środkami obniżającymi poziom cholesterolu/lipidów; antagonistami receptorów mineralokortykoidów; inhibitorami fosfodiesterazy; inhibitorami białkowej kinazy tyrozynowej; mimetykami tarczycowymi (włącznie z agonistami receptora tarczycy); środkami anabolicznymi; lekami przeciwko HIV lub AIDS; lekami stosowanymi w terapii choroby Alzheimera i innych zaburzeń poznawczych; lekami stosowanymi w leczeniu zaburzeń snu; środkami przeciwrozrostowymi i środkami przeciwnowotworowymi.

Do przykładów odpowiednich leków przeciwcukrzycowych do stosowania w połączeniu ze związkami według wynalazku zalicza się biguanidyny (na przykład metforminę), inhibitory glukozydazy (na przykład akarbozę), insuliny (włącznie z lekami pobudzającymi wydzielanie insuliny lub lekami uwrażliwiającymi na insulinę), meglitynidy (na przykład repaglinid), sulfonylomoczniki (na przykład glimepiryd, gliburyd i glipizyd), połączenia biguanid/gliburyd (na przykład Glucovance®), tiazolidynodiony (na przykład troglitazon, rozyglitazon i pioglitazon), agonistów PPAR-alfa, agonistów PPAR-gamma, agonistów dualnych PPAR alfa/gamma, inhibitory SGLT2, inhibitory fosforylazy glikogenu, inhibitory białka wiążącego kwasy tłuszczowe (aP2) takie, jak inhibitory ujawnione w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer seryjny 09/519,079, złożonym dnia 6 marca 2000 roku, podobny do glukagonu peptyd-1 (GLP-1) oraz inhibitory peptydazy dipeptydylowej IV (DP4).

Do przykładów odpowiednich środków stosowanych przeciw osteoporozie w połączeniu ze związkami według wynalazku zalicza się alendronian, risedronian, PTH, fragment PTH, raloksyfen, kalcytoninę, steroidowych i niesteroidowych agonistów receptora progesteronu, antagonistów receptora RANK,

PL 206 962 B1 antagonistów receptora wykrywającego wapń, inhibitory TRAP, selekywne modulatory receptora estrogenu (SERM), inhibitory estrogenu i AP-1.

Do przykładów odpowiednich leków stosowanych w leczeniu otyłości, do stosowania w połączeniu ze związkami według wynalazku, zalicza się inhibitory aP2, takie jakie ujawniono w ogłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer seryjny 09/519,079, złożonym dnia 6 marca 2000 roku, antagonistów PPAR gamma, agonistów PPAR delta, agonistów beta 3 adrenergicznych, takich jak AJ9677 (Takeda/Dainippon), L750355 (Merck) lub CP331648 (Pfizer) lub innych znanych agonistów beta 3 ujawnionych w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5,541,204, 5,770,615, 5,491,134, 5,776,983 oraz numer 5,488,064, taki inhibitor lipazy jak orlistat lub ATL-962 (Alizyme), inhibitor wychwytu zwrotnego serotoniny (i dopaminy) taki jak sybutramina, topiramat (Johnson & Johnson) lub axokine (Regenron), lek receptora beta tarczycy taki jak ligand receptora tarczycy, jak to ujawniono w publikacjach międzynarodowych numer WO 97/21993 (U. Cal. SF) oraz numer WO 99/00353 (KaroBio) i w opisie patentowym Wielkiej Brytanii numer 98/284425 (KaroBio) i/lub lek przeciwko anoreksji, taki jak deksamfetamina, fentermina, fenylopropanoloamina lub mazyndol.

Do przykładów odpowiednich leków przeciwzapalnych, do stosowania w połączeniu ze związkami według wynalazku, zalicza się prednizon, deksametazon, Enbrel®, inhibitory cykloksygenazy (na przykład inhibitory COX-1 i/lub COX-2 takie, jak NSAID-y, aspiryna, indometacyna, ibuprofen, piroksykam, Naproxen®, Celebrex®, Vioxx®), agonistów/antagonistów CTLA4-Ig, antagonistów ligandu CD40, inhibitory IMPDH takie jak antagoliści integryny mykofenolanu (CellCept®) i antagoniści integryny alfa-4 beta-7, inhibitory adhezji komórkowej, antagonistów interferonu gamma, ICAM-1, antagonistów czynnika martwicy nowotworów (TNF) (na przykład infliksymab, OR1384), inhibitory syntezy prostaglandyn, budezonid, klofazymina, CNI-1493, antagonistów CD4 (na przykład pryliksymab), inhibitory kinazy białkowej aktywowanej mitogenem p38, inhibitory białkowej kinazy tyrozynowej (PTK), inhibitory IKK i leki do leczenia zespołu drażliwego jelita (na przykład leki rozluźniające Zelmac® i Maxi-K® jakie ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 6,184,231 B1).

Przykłady odpowiednich leków przeciwlękowych do stosowała w połączeniu ze związkami według wynalazku obejmują diazepam, lorazepam, buspiron, oksazepam i embonian hydroksyzyny.

Do przykładów odpowiednich leków przeciwdepresyjnych do stosowania w połączeniu ze związkami według wynalazku zalicza się cytalopram, fluoksetynę, nefazodon, sertralinę i paroksetynę.

Do przykładów leków przeciw nadciśnieniu odpowiednich do stosowania ze związkami według wynalazku zalicza się blokery beta adrenergiczne, blokery kanału wapniowego (typu L i typu T, takie jak na przykład diltiazem, werapamil, nifedypina, amlodypina i mibefradil), diuretyki (na przykład chlorotiazyd, hydrochlorotiazyd, flumetiazyd, hydroflumetiazyd, bendroflumetiazyd, metylochlorotiazyd, trichlorometiazyd, politiazyd, benzotiazyd, trikrynafen kwasu etakrynowego, chlortalidon, furosemid, musoliminę, bumetanid, triamteren, amiloryd, spironolakton), inhibitory reniny, inhibitory ACE (na przykład kaptopril, zofenopril, fozinopril, enalapril, ceranopril, cilazopril, delapril, pentopril, quinapril, ramipril, lisynopril), antagonistów receptora AT-1 (na przykład losartan, irbesartan, walsartan), antagonistów receptora ET (na przykład sitaksentan, atrsentan i związki ujawnione w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5,612,359 raz numer 6,043,265), dualnych antagonistów ET/ATII (na przykład związki ujawnione w publikacji międzynarodowej numer WO 00/01389), obojętne inhibitory endopeptydazy (NEP), inhibitory wazopeptydazy (dualne inhibitory NEP-ACE) (na przykład omapatrilat i gemopatrilat) oraz nitraty.

Do przykładów odpowiednich leków przeciwpłytkowych do stosowania w połączeniu ze związkami według wynalazku zalicza się blokery GPIIb/IIIa (na przykład abcyksymab, eptyfibatyd, tyrofiban), antagonistów P2Y12 (na przykład klopidogrel, tyklopidyna, CS-747), antagonistów receptora tromboksanu (na przykład ifetroban), aspirynę oraz inhibitory PDE-III (na przykład dipirydamol) z aspiryną lub bez niej.

Przykłady odpowiednich glikozydów nasercowych do stosowania w połączeniu ze związkami według wynalazku obejmują naparstnicę i uabaina.

Przykłady odpowiednich leków obniżających poziom cholesterolu/lipidów do stosowania w kombinacji ze związkami według wynalazku obejmują inhibitory reduktazy HMG-CoA (np. prawastatynę, lowastatynę, atorwastatynę, symwastatynę, NK-104 (a.k.a. itawastatyna lub niswastatyna lub nisbastatyna) i ZD-4522 (rosuwastatyna lub atawastatyna lub wisastatyna), inhibitory MTP, inhibitory lipooksygenazy, inhibitory absorpcji cholesterolu i białkowe inhibitory transferu estru cholesterolu (na przykład CP-529414).

PL 206 962 B1

Do przykładów odpowiednich antagonistów receptora mineralokortykoidów do stosowania w połączeniu ze związkami według wynalazku zalicza się spironolakton i eplerinon.

Do przykładów odpowiednich inhibitorów fosfodiesterazy do stosowania w połączeniu ze związkami według wynalazku zalicza się inhibitory PDEIII, takie jak cilostazol oraz inhibitory PDE V takie, jak sildenafil.

Do przykładów odpowiednich mimetyków tarczycowych do stosowania w połączeniu ze związkami według wynalazku zalicza się tyreotropinę, polityroid, KB-130015 i dronedaron.

Do przykładów odpowiednich środków anabolicznych do stosowania w połączeniu ze związkami według wynalazku zalicza się testosteron, dietylostilbestrol TRH, estrogeny, β-agonistów, teofilinę, steroidy anaboliczne, dehydroepiandrosteron, enkefaliny, prostaglandyny E, kwas retinowy i związki jakie ujawniono w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 3,239,345, na przykład Zeranol® oraz numer 4,036,979, na przykład Sulbenox® albo peptydy jakie ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4,411,890.

Do przykładów odpowiednich środków terapeutycznych stosowanych w leczeniu HIV lub AIDS do stosowania w połączeniu ze związkami według wynalazku zalicza się siarczan indinawiru, sakwinawir, metanosulfonian sakwinawiru, ritonawir, lamiwudynę, zydowudynę, kombinacje lamiwudyna/zydowudyna, zalcytabinę, dydanozynę, stawudynę i octan megestrolu.

Do przykładów odpowiednich leków do leczenia choroby Alzheimera i zaburzeń poznawczych do stosowania w połączeniu ze związkami według wynalazku zalicza się donepezyl, takrynę, rewastygminę, 5HT6, inhibitory gamma sekretazy, inhibitory beta sekretazy, blokery kanału SK, blokery Maxi-K i blokery KCNQ.

Do przykładów odpowiednich leków do leczenia zaburzeń snu do stosowania w połączeniu ze związkami według wynalazku zalicza się analogi melatoniny, antagonistów receptora melatoniny, agonistów ML1B i antagonistów receptora GABA/NMDA.

Do przykładów odpowiednich leków przeciwrozrostowych do stosowania w połączeniu ze związkami według wynalazku zalicza się cyklosporynę A, paklitaksel, FK 506 i adriamycynę.

Do przykładów odpowiednich leków przeciwnowotworowych do stosowania w połączeniu ze związkami według wynalazku zalicza się paklitaksel, adriamycynę, epotilony, cisplatynę i karboplatynę.

Związki według wynalazku mogą być ponadto stosowane w połączeniu z dodatkami żywieniowymi, takimi jak dodatki przedstawione w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5,179,080, szczególnie w połączeniu z białkiem serwatki lub kazeiną, aminokwasami (takimi, jak leucyna, rozgałęzione aminokwasy i hydroksymetylomaślan), triglicerydami, witaminami (na przykład A, B6, B12, kwas foliowy, C, D i E), minerałami (na przykład selenem, magnezem, cynkiem, wapniem i potasem), karnityną, kwasem liponowym, kreatyną i koenzymem Q-10.

Ponadto, związki według wynalazku mogą być stosowane w połączeniu z lekami używanymi w leczeniu dysfunkcji seksualnej, włącznie z inhibitorami PDE5, takimi jak sildenafil lub IC-351, ze środkiem antyresorpcyjnym, hormonalnymi terapiami zastępczymi, analogami witaminy D, kalcytoninami, wapniem pierwiastkowym lub dodatkami wapniowymi, inhibitorami katepsyny K, inibitorami MMP, antagonistami receptora witronektyny, antagonistami Src SH2, inhibitorami wakularnego H+-ATP-azy, agonistami receptora progesteronu, ipriflawonem, fluorkiem, antagonistami RANK, PTH i jego analogami i fragmentami, Tibolonem, inhibitorami reduktazy HMG-CoA, SERMs, inhibitorami p38, prostanoidami, inhibitorami dehydrogenazy 17-beta hydroksysteroidu oraz inhibitorami Src kinazy lecz nie ograniczając się do nich.

Związki według wynalazku mogą być stosowane w połączeniu ze środkami antykoncepcyjnymi dla mężczyzn, takimi jak nonoksynol 9 lub lekami do leczenia łysienia, jak minoksydyl i finasteryd lub chemioterapeutykami, takimi jak agoniści LHRH.

W korzystnym zastosowaniu przeciwnowotworowym lub antyangiogennym, związki według wynalazku mogą być podawane w monoterapii lub w połączeniu z innymi lekami przeciwrakowymi i cytotoksycznymi i stosowane w terapii raka i w innych chorobach proliferacyjnych, na przykład, gdy drugi lek ma taki sam lub inny mechanizm działania niż związki o wzorze I według obecnego wynalazku. Do przykładowych klas leków przeciwrakowych i cytotoksycznych użytecznych do stosowania w połączeniu ze związkami według wynalazku zalicza się: leki alkilujące, takie jak analogi iperytu azotowego, alkilosulfoniany, nitrozomoczniki, etylenoiminy i triazeny; inhibitory EGFR, takie jak małocząsteczkowe inhibitory EGFR, przeciwciała EGFR takie jak C225 (Erbitux); takie antymetabolity jak antagoniści folanu, analogi puryny i analogi pirymidyny; takie antybiotyki jak antracykliny, bleomycyny, mitomycyna, daktynomycyna i plikamycyna; takie enzymy jak L-asparaginaza; inhibitory transferazy

PL 206 962 B1 farnezylo-białkowej; inhibitory 5a-reduktazy, inhibitory dehydrogenazy 17e-hydroksysteroidowej typu 3; takie leki hormonalne jak glukokortykoidy, estrogeny/antyestrogeny, androgeny/antyandrogeny, progestyny i antagoniści hormonu uwalniającego hormon luteinizujący, octan oktreotydu; takie środki rozrywające mikrotubule jak ekteinascydyny lub ich anałogi i pochodne; środkami stabilizującymi mikrotubule takimi, jak taksany, na przykład, paklitaksel (Taxol®), docetaksel (Taksotere®) i jego analogi i epotilony takie, jak epotilony A-F oraz ich analogi; produkty otrzymywane z roślin, takie jak alkaloidy vinca, epipodofilotoksyny, taksany i inhibitory topoizomerazy; inhibitory transferazy prenylobiałkowej i różne leki, takie jak hydroksymocznik, prokarbazyna, mitotan, heksametylomelamina, kompleksy koordynujące platynę takie, jak cisplatyna i karboplatyna oraz inne leki stosowane jako środki przeciwrakowe i cytotoksyczne, jak środki modyfikujące reakcję biologiczną i czynniki wzrostu; modulatory immunologiczne i przeciwciała monoklonalne, lecz nie ograniczając się do nich. Związki według wynalazku mogą także być stosowane w połączeniu z radioterapią.

Reprezentatywne przykłady klas leków przeciwrakowych i cytotoksycznych obejmują chlorowodorek mechloretaminy, cyklofosfamid, chlorambucil, melfalan, ifosfamid, busulfan, karmustynę, lomustynę, semustynę, streptozocyna, tiotepa, dakarbazynę, metotreksat, tioguaninę, merkaptopurynę, fludarabinę, pentastatynę, kladrybinę, cytarabinę, fluorouracyl, chlorowodorek doksorubicyny, daunorubicynę, idarubicynę, siarczan bleomycyny, mitomycynę C, aktynomycynę D, safracyny, saframycyny, chinokarcyny, diskodermolidy, winkrystynę, winblastynę, winian winorelbiny, etopozyd, fosforan etopozydu, tenipozyd, paklitaksel, tamoksyfen, estramustynę, fosforan sodowy estramustyny, flutamid, buserelinę, leuprolid, pterydyny, diinezy, lewamizol, aflakon, interferon, interleukiny, aldesleukiny, filgrastim, sargramostim, rituksimab, BCG, tretinoin, chlorowodorek irinotekanu, betametozon, chlorowodorek gemcytabiny, altretaminę i topotekan oraz jakiekolwiek ich analogi lub pochodne lecz nie ograniczając się do nich.

Korzystnymi przedstawicielami tych klas są: paklitaksel, cisplatyna, karboplatyna, doksorubicyna, karminomycyna, daunorubicyna, aminopteryna, metotreksat, metopteryna, mitomycyna C, ekteinascydyna 743 lub porfiromycyna, 5-fluorouracyl, 6-merkaptopuryna, gemcytabina, arabinozyd cytozyny, podofilotoksyna lub pochodne podofilotoksyny takie, jak etopozyd, fosforan etopozydu lub tenipozyd, melfalan, winblastyna, leurozydyna, windezyna i leurozyna lecz nie ograniczając się do ich.

Do przykładów leków przeciwrakowych i cytotoksycznych zalicza się: pochodne epotilonu, jakie opisano w niemieckim opisie patentowym numer 4138042.8 oraz w publikacjach międzynarodowych numer WO 97/19086, WO 98/22461, WO 98/25929, WO 98/38192, WO 99/01124, WO 99/02224, WO 99/02514, WO 99/03848, WO 99/07692, WO 99/27890, WO 99/28324, WO 99/43653, WO 99/54330, WO 99/54318, WO 99/54319, WO 99/65913, WO 99/67252, WO 99/67253 i numer WO 00/00485; inhibitory kinazy zależne od cykliny, jakie opisano w publikacji międzynarodowej numer WO 99/24416 (patrz także opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 6,040,321) i inhibitory transferazy prenylobiałkowej, jakie opisano w publikacji międzynarodowej numer WO 97/30992 oraz numer WO 98/54966 i środki opisane ogólnie i szczegółowo w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 6,011,029 (związki z patentu Stanów Zjednoczonych które mogą być zastosowane razem z jakimikolwiek modulatorami NHR (razem z przedstawionym w niniejszym wynalazku, lecz nie ograniczając się do nich), takie jak modulatory AR, modulatory ER, z modulatorami LHRH lub z kastracją chirurgiczną, szczególnie w leczeniu raka).

Połączenia według obecnego wynalazku mogą także być tworzone lub podawane łącznie z innymi środkami terapeutycznymi, które są wybierane w związku z ich szczególną użytecznością w terapiach stosowanych w wyżej wymienionych schorzeniach. Na przykład związki według wynalazku mogą być łączone ze środkami zapobiegającymi mdłościom, nadwrażliwości i podrażnieniu żołądka, takimi jak leki przeciwwymiotne i leki przeciwhistaminowe H1 i H2.

W odniesieniu do leczenia raka, związki według tego wynalazku są najkorzystniej stosowane w monoterapii lub w połączeniu z terapiami przeciwrakowymi, takimi jak naświetlania /lub terapiami obejmującymi leki cytostatyczne i/lub cytotoksyczne, takie jak leki wchodzące w interakcje z DNA jak cisplatyna lub doksorubicyna; inhibitory transferazy białkowej farnezylu, takie jakie opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 6,011,029; inhibitory topoizomerazy II takie, jak etopozyd; inhibitory topoizomerazy I, takie jak CPT-11 lub topotekan; leki stabilizujące tubulinę, takie jak paklitaksel, docetaksel, inne taksany lub epotilony; z lekami hormonalnymi, takimi jak tamoksyfen; z inhibitorami syntazy tymidylanowej, takimi jak 5-fluorouracyl; antymetabolity takie, jak metotreksat; leki antyangiogenne, takie jak angiostatyna, ZD6474, ZD6126 i komberstatyna A2; inhibitory kinazy, takie jak przeciwciała specyficzne dla her2, Iressa i inhibitory CDK; inhibitory deacetylazy histonu,

PL 206 962 B1 takie jak CI-994 i MS-27-275 lecz nie ograniczając się do nich. Takie związki mogą także być stosowane w połączeniu ze środkami które hamują wytwarzanie krążącego testosteronu, takimi jak agoniści lub antagoniści LHRH lub z kastracją chirurgiczną. Do przykładów terapii łączonych (na przykład do leczenia raka prostaty), przeznaczonych do użycia ze związkiem według obecnego wynalazku, zalicza się modulator LHRH lub prednizon.

Zgodnie z obecnym wynalazkiem, przewiduje się także zestaw, na przykład do leczenia raka prostaty, składający się z pierwszego pojemnika (takiego jak ampułka), który zawiera kompozycję farmaceutyczną zawierającą związek według obecnego wynalazku, ewentualnie w nośniku dopuszczonym do stosowania w farmacji i z drugiego pojemnika (takiego jak ampułka), który zawiera kompozycję farmaceutyczną zawierającą jeden środek lub ich większą ilość (taki jak modulator LHRH), do stosowała w połączeniu z tym związkiem według obecnego wynalazku, przy czym ten środek (środki), ewentualnie w nośniku dopuszczonym do stosowania w farmacji.

Znane terapie zaawansowanego raka prostaty z przerzutami obejmują na przykład „całkowite wyeliminowanie androgenu”, w którym wzrost guza jest hamowany przez kontrolowanie dostarczania androgenu do tkanek prostaty poprzez kastrację chemiczną (kastracja służy do zahamowania wytwarzania krążącego estosteronu (T) i dihydrotestosteronu (DHT) i następnie podawanie antagonistów receptora androgenu (AR) (antagoniści AR hamują funkcję T/DHT wynikającą z konwersji krążących prekursorów androgenu do T/DHT w tkance prostaty). Związki według wynalazku mogą być zastosowane jako antagoniści AR w terapii całkowicie eliminującej, w monoterapii lub w kombinacji z innymi antagonistami AR, takimi jak flutamid, Casodex, nilutamid lub octan cyproteronu.

Zgodnie z obecnym wynalazkiem, przewiduje się związki, które można zastosować do leczenia pacjentów cierpiących z powodu raka prostaty opornego na antagonistów receptora androgenu, które nie są objęte wzorem I według wynalazku (lub ich sole), takie jak bikalutimid. Tak więc, przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób leczenia raka prostaty opornego na antagonistę receptora androgenu, innego niż te opisane wzorem lub ich sole, obejmujący etap podawania pacjentowi, potrzebującemu takiego leczenia, związku zdolnego do zmniejszenia szybkości wzrostu masy guza tego raka, w ilości skutecznej do powodowania tego zmniejszenia masy guza. Określenie „zmniejszenie szybkości wzrostu masy guza” odnosi się do zmniejszenia szybkości wzrostu (wliczając oczywiście stabilizacje lub zmniejszenie wymiaru) masy tego guza po leczeniu, względem szybkości wzrostu po leczeniu przy użyciu innego antagonisty receptora androgenu niż antagonista o wzorze I lub jego sole. Związki o wzorze I oraz ich sole dopuszczone do stosowania w farmacji według obecnego wynalazku, są korzystnie takimi związkami.

Przedmiotem obecnego wynalazku jest także zastosowanie antyestrogenu i/lub inhibitora aromatazy, w połączeniu ze związkiem według obecnego wynalazku, na przykład w celu wspierania osłabienia skutków ubocznych związanych z leczeniem antyandrogenem, takich jak ginekomastia. Do przykładów antyestrogenu i/lub inhibitorów aromatazy, zalicza się anastrazol (Arimidex), cytrynian tamoksyfenu (Nolvadex), eksemastan (Aromasin), cytrynian toremifenu (Fareston), letrozol (Femara), chlorowodorek raloksyfenu (Evista), Faslodex, lub 923 (Wyeth Ayerst).

Związki według wynalazku można stosować jako środki wspomagające przy zabiegach chirurgicznych.

Innym zastosowaniem związków według wynalazku jest ich połączenie z terapią przeciwciałami, taką jak terapia przeciwciałami przeciwko PSCA. Dodatkowym zastosowaniem jest ich łączne podawanie ze szczepionką/czynnikiem immunomodulującym w leczeniu raka, lecz nie ograniczając się do tego.

Związki według obecnego wynalazku mogą być stosowane zgodnie ze sposobami opisanymi w tymczasowym zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer seryjny 60/284,438, zatytułowanym „Selective Androgen Receptor Modulators and Methods for Their Identification, Design and Use”, głoszonym dnia 18 kwietnia 2001 roku przez Marka E. Salvati i współpracowników które to tymczasowe zgłoszenie patentowe jest załączone tu w całości jako odnośnik (włącznie z odnośnikami do wszystkich specyficznych związków w zakresie wzoru według wynalazku, lecz nie ograniczając się do nich) i w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer seryjny 09/885,827, zatytułowanym „Selective Androgen Receptor Modulators and Methods for their Identification, Design and Use” zgłoszonym dnia 20 czerwca 2001 roku przez Marka E. Salvati i współpracowników, które to zgłoszenie patentowe jest w niniejszym załączone w całości jako odnośnik (włącznie z odnośnikami do wszystkich specyficznych związków w zakresie wzoru I według wynalazku lecz nie ograniczając się do nich).

PL 206 962 B1

W przypadku racematów związków według obecnego wynalazku, jeden enancjomer może na przykład być pełnym antagonistą AR, podczas gdy inny enancjomer może być antagonistą AR w tkance guza, podczas gdy nie wykazuje aktywności lub wykazuje aktywność agonistyczną w tkance nienowotworowej zawierającej receptor androgenu.

Powyższe oraz inne środki lecznicze, gdy są stosowane w połączeniu ze związkami według wynalazku mogą być na przykład stosowane w ilościach zalecanych w Physician's Desk Reference (PDR) lub w innym przypadku można je stosować zgodnie z zaleceniem specjalisty z tej dziedziny.

Następujące testy mogą być zastosowane do określenia aktywności związku jako modulatora NHR. Korzystne są te związki, których aktywność jest większa od 20 μm, w przypadku wiązania lub transaktywacji w którymkolwiek z tych testów. W pisanych poniżej testach transaktywacji i w standardowych testach wiązania AR wykazano, że różne związki według obecnego wynalazku posiadają aktywność modulatora AR.

Testy transaktywacji

Test specyficzny dla AR

Związki według wynalazku były badane w testach transaktywacji transfekowanego konstruktu reportera i przy użyciu endogennego receptora androgenu komórek gospodarza. Test transaktywacji jest sposobem identyfikacji funkcjonalnych agonistów i częściowych agonistów które dają podobny efekt lub antagonistów hamujących działanie naturalnych hormonów, w tym przypadku dihydrotestosteronu (DHT). Ten test może być stosowany w celu przewidywania działania in vivo, gdyż istnieje dobra korelacja obu rodzajów danych. Patrz na przykład T. Berger i współpracownicy, J. Steroid. Biochem. Molec. Biol., 773, (1992), które to ujawnienie jest załączone w niniejszym jako referencja.

W teście transaktywacji plazmid reporterowy jest wprowadzany przez transfekcję (procedura indukowania komórek do pobierania przez nieobcych genów) do odpowiednich komórek. Ten plazmid reporterowy, zawierający cDNA dla białka reporterowego, takie jak wydzielana fosfataza zasadowa (SEAP), jest kontrolowany przez rosnące sekwencje antygenu specyficznego dla prostaty (PSA) zawierające elementy odpowiedzi androgenu (AREs). Ten plazmid reporterowy działa jako reporter dla modulującej transkrypcję aktywności AR. Tak więc reporter działa jako surogat w stosunku do produktów (mRNA, następnie białko) normalnie podlegających ekspresji przez gen pod kontrolą AR i jego naturalnego hormonu. W celu wykrycia antagonistów, test transaktywacji jest przeprowadzany w obecności stałego stężenia naturalnego hormonu AR (DHT), znanego z indukowania zdefiniowanego sygnału reportera. Zwiększające się stężenia przypuszczalnych antagonistów będą zmniejszały sygnał reportera (np. wytwarzanie SEAP). Z drugiej strony, ekspozycja transfekowanych komórek na działanie wzrastających stężeń przypuszczalnych agonistów, będzie zwiększała wytwarzanie sygnału reportera.

W tym teście komórki LNCaP i MDA zostały uzyskane z American Type Culture Collection (Rockville, MD) i były utrzymywane w pożywce RPMI 1640 lub DMEM, uzupełnionej 10% surowicą płodu bydlęcego, odpowiednio (FBS; Gibco). Odpowiednie komórki były przejściowo transfekowane przez elektroporację, godnie ze zoptymalizowaną procedurą opisaną przez Heisera, 130 Methods Mol. Biol., 117 (2000) z plazmidem reporterowym pSEAP2/PSA540/Enhancer. Plazmid reporterowy został skonstruowany w następujący sposób: dostępne na rynku ludzkie łożyskowe genomowe DNA było użyte do generacji reakcji cyklu polimerazy (PCR), fragmentu zawierającego miejsce Bglll (pozycja 5284) i miejsce HindIII w pozycji 5831 ludzkiego promotora antygenu specyficznego dla prostaty (Accession # U37672), Schuur i współpracownicy, J. Biol. Chem., 271 (12), strony 7043-51 (1996). Ten fragment został subklonowany do pSEAP2/basic (Clontech) uprzednio wytrawionego za pomocą Bglll i Hindlll, w celu wygenerowania konstruktu pSEAP2/PSA540. Następnie fragment obarczony fragmentem ludzkiej rosnącej sekwencji PSA pomiędzy pozycjami -5322 i -3873 został amplifikowany przez PCR z ludzkiego łożyskowego genomowego DNA. Miejsca XhoI i Bglll wprowadzono do primerów. Powstały fragment był sub-klonowany do pSEAP2/PSA540 wytrawionym za pomocą odpowiednio Hhol i Bglll, w celu wytworzenia konstruktu pSEAP2/PSA540/Enhancer. Komórki LNCap i MDA 453 zostały zebrane w pożywkach zawierających oczyszczony węglem drzewnym 10% FBS. Każda zawiesina komórek została przeniesiona do dwóch kuwet Gene Pulser (Bio-Rad), do których dodano następnie 8 μg kontruktu reporterowego i została poddana elekroporacji przy użyciu urządzenia Gene Pulser firmy Bio-Rad przy 210 woltach i 960 mikrofaradach. Po transfekcji komórki były przemywane i inkubowane w pożywkach zawierających oczyszczoną węglem drzewnym surowicę płodu bydlęcego przy braku (próbą ślepa) i w obecności (próba kontrolna) 1 nM dihydrotestosteronu (DHT, Sigma Chemical) i w obecności lub przy braku standardowego anty-androgenu bikalutamid lub związków

PL 206 962 B1 według wynalazku w stężeniach od 10^-10 M do 10^-5 M (próbka). Każda próbka była wykonana w dwóch egzemplarzach. Rozcieńczenia związku były wykonywane na laboratoryjnym stanowisku roboczym Biomek 2000. Po 48 godzinach frakcja nadsączu była badana na aktywność SEAP z zastosowaniem Phospha-Light Chemiluminescent Reporter Gene Assay System (Tropix, Inc). Zdolność do życia pozostałych komórek była badana przy użyciu CellTiter 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS Assay, Promega), Mówiąc krótko, do komórek dodaje się mieszaninę związku tetrazoliowego (sól wewnętrzna 3-4,5-dimetylotiazolo-2-ylo)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-(4-sulfofenylo)-2H-tetrazoliowa; MTS) i odczynnika sprzęgającego elektrony (metylosiarczan 5-metylofenazyny; PMS). MTS (odczynnik Owena) jest redukowany biologicznie przez komórki do formazanu, który jest rozpuszczalny w pożywce hodowli komórkowej i dzięki temu jego absorbancja przy 490 nm może być mierzona bezpośrednio z płytek testowych o 96 zagłębieniach, bez dodatkowego przetwarzania. Ilość formazanu mierzona przez wielkość absorbancji przy 490 nm jest bezpośrednio proporcjonalna do liczby żywych komórek w hodowli. Dla każdej próbki odczyt SEAP był normalizowany przez wartość Abs490 otrzymaną w teście MTS. Dla działania antagonistycznego % zahamowania był obliczony jako:

% hamowania = 100 x (1 - [średnia próba kontrolna - średnia próba ślepa/próbka średnia - średnia próba ślepa])

Dane zostały przedstawione na wykresie i obliczone zostało stężenie związku, które hamowało 50% znormalizowanego SEAP (IC50).

Dla działania agonistycznego % próby kontrolnej został przedstawiony jako skutek działania badanego związku w porównaniu z maksymalnym efektem działania obserwowanym w przypadku naturalnego hormonu, w tym przypadku DHT i został obliczony jako:

% próby kontrolnej = 100 x próbka średnia - średnia próba ślepa/średnia próba kontrolna - średnia próba ślepa

Dane zostały przedstawione na wykresie i obliczono stężenie związku, który aktywuje do poziomu 50% znormalizowanego SEAP dla próby kontrolnej (EC50).

Test specyficzności GR

Zastosowany plazmid reporterowy tworzył cDNA dla białka eporterowego SEAP; jak to opisano dla testu specyficznej transaktywacji AR. Ekspresja białka reporterowego SEAP była regulowana przez długie powtarzalne sekwencje terminalne wirusa guza sutka myszy (MMTV LTR), które zawierają trzy elementy odpowiedzi hormonalnej (HREs) i które mogą być regulowane zarówno przez GR, jak i PR patrz na przykład G. Chalepakis i współpracownicy Cell, 53 (3), strona 371 (1988). Ten plazmid został poddany transfekcji do komórek A549 i w wyniku ekspresji powstał endogenny GR, do przeprowadzenia specyficznego dla GR testu transaktywacji. Komórki A549 otrzymano od American Type Culture Collection (Rockville, MD), utrzymywane w RPMI 1640 uzupełnionym 10% surowicą płodu bydlęcego (FBS; Gibco). Sposób określenia specyficznej aktywności agonistycznej GR związków według obecnego wynalazku był identyczny do opisanego dla testu specyficznej transaktywacji AR za wyjątkiem tego, że DHT zostało zastąpione przez 5 nM deksametazon (Sigma Chemicals), specyficznego agonistę fla GR. Określenie specyficznej dla GR aktywności agonistycznej związków według wynalazku było przeprowadzone, jak to opisano dla testu transaktywacji AR, w którym mierzy się aktywację specyficznego układu reporterowego GR, przez dodanie badanego związku przy braku specyficznego dla GR ligandu agonistycznego.

Test specyficzny dla PR

Zastosowany plazmid reporterowy tworzył cDNA dla białka reporterowego SEAP, jak to opisano dla testu transaktywacji specyficznej dla AR. Ekspresja białka reporterowego SEAP była regulowana przez długie powtarzalne sekwencje terminalne wirusa guza sutka myszy (MMTV LTR), które zawierają trzy elementy odpowiedzi hormonalnej (HREs) i które mogą być regulowane zarówno przez GR, jak PR. Ten plazmid został poddany transfekcji do T47D i w wyniku ekspresji powstał endogenny PR, dla przeprowadzenia testu transaktywacji specyficznej dla PR. Komórki T47D uzyskano od American Type Culture Collection (Rockville, MD) i utrzymywano w pożywce DMEM uzupełnionej 10% surowicą płodu bydlęcego (FBS, Gibco). Określenie specyficznej aktywności agonistycznej związków według wynalazku było identyczne jak to opisano dla testu specyficznej dla AR transaktywacji z tym wyjątkiem, że DHT zostało zastąpione przez 1 nM promegaston (NEN), specyficznego agonistę PR. Określenie specyficznej dla PR aktywności agonistycznej związków według wynalazku przeprowadzono

PL 206 962 B1 w sposób opisany dla testu transaktywacji AR, w którym mierzy się aktywację układu reporterowego specyficznego dla PR przez dodanie badanego związku, przy braku znanego specyficznego dla AR ligandu agonistycznego.

Test wiązania AR

Dla przeprowadzenia testu wiązania całych komórek, ludzkie komórki LNCaP (T877A mutant AR) lub MDA 453 (typ dziki AR) umieszczone na płytkach o 96 zagłębieniach do mikromiareczkowania zawierających RPMI 1640 lub DMEM, uzupełnione oczyszczonych węglem drzewnym 10% CA-FBS (Cocaleco Biologicals), inkubowano w temperaturze 37°C w celu usunięcia jakiegokolwiek endogennego ligandu, który mógł w komórkach tworzyć kompleks z receptorem. Po 48 godzinach, przeprowadzono aIbo analizę saturacji w celu określenia Kd dla miareczkowanego dihydrotestosteronu, [³H]-DHT, albo kompetycyjny test wiązania w celu oceny zdolności badanych związków do konkurorania z [³H]-DHT. Dla analizy nasycenia, do komórek zostały dodane pożywki (RPMI lub DMEM - 0,2% CA-FBS) zawierające [³H]-DHT (w stężeniach od 0,1 nM do 16 nM) bez obecności (wiązanie całkowite) lub w obecności (wiązanie niespecyficzne) 500-krotnego nadmiaru molowego nieznakowanego DHT. Po 4 godzinach w 37°C, próbka całkowitych pożywek wiążących w każdym stężeniu [³H]-DHT została pobrana w celu oceny ilości wolnego [³H]-DHT. Pozostałe pożywki zostały usunięte, komórki były przemywane trzy razy przy użyciu PBS i zebrane na płytach UniFilter GF/B (Packard), po czym dodano Microscint (Packard) i w celu oceny ilości związanego [³H]-DHT płytki były zliczane za pomocą licznika Top-Counter (Packard).

Dla oceny nasycenia, różnica pomiędzy wiązaniem całkowitym i wiązaniem niespecyficznym została zdefiniowana jako wiązanie specyficzne. Wiązanie specyficzne zostało ocenione metodą analizy Scatchard, w celu wyznaczenia Kd dla [³H]-DHT. Patrz na przykład D.Rodbard, „Mathematics and statistics of ligand assays”, An illustrated guide, w Ligand Assay pod redakcją J. Langona i J.J. Clappa, Masson Publishing U.S.A., Inc. New York, strony 45-99, (1981), co załącza się w niniejszym jako referencję.

W celu przeprowadzenia badań kompetycyjności, do komórek dodano pożywki zawierające 1 nM [³H]-DHT i związki według wynalazku („związki badane”) w stężeniach od 10-10 do 10-5. Wykonano dwie repliki każdej próbki. Po 4 godzinach utrzymywania w temperaturze 37°C, komórki zostały przemyte, zebrane i policzone, jak to opisano powyżej. Dane przedstawiono na wykresie jako ilość [³H]-DHT (% próbki kontrolnej przy braku związku badanego) pozostającą powyżej zakresu krzywej odpowiedzi dawki dla danego związku. Stężenie badanego związku, które hamowało 50% ilości związanego [³H]-DHT, przy braku kompetycyjnego ligandu, zostało wyznaczone ilościowo (IC50) po transformacji „log-logit”. Wartości KI zostały wyznaczone przy zastosowaniu równania Cheng-Prosoffa do wartości IC50, gdzie:

KI = _^IC50_ (1+(³H-DHT)/K_d dla ³H-DHT)

Po skorygowaniu niespecyficznego wiązania, obliczono wartości IC50. IC50 jest zdefiniowane jako stężenie kompetycyjnego ligandu, które obniża specyficzne wiązanie o 50%. KdS dla [³H]-DHT dla MDA 453 i LNCaP wynosiło odpowiednio 0,7 nM i 0,2 nM.

Test proliferacji ludzkich komórek prostaty

Związki według obecnego wynalazku („związki badane”), testowano pod względem wpływu na proliferację ludzkich komórek raka prostaty. W tym celu komórki PCa2b - linię komórkową uzyskaną z przerzutu u pacjenta u którego nie wykonano kastracji, Navone i współpracownicy, Clin. Cancer Res., 3, strony 2493-2500 (1997) - inkubowano przez 72 godziny razem z zadanymi związkami lub bez nich, po czym obliczano ilość [³H]-tymidyny włączonej do DNA w celu oceny liczby komórek i tym samym proliferacji. Linia komórkowa MDA Pca2b była utrzymywana w pożywkach BRFF-HPC1 (Biological Research Faculty & Facility Inc., MD), uzupełnionych 10% FBS. Do przeprowadzenia badań, komórki umieszczono na mikropłytkach zawierających 96 zagłębień oraz inkubowano w temperaturze 37°C w 10% FBS (oczyszczonym węglem drzewnym)/BRFF-BMZERO (bez androgenów). Po 24 godzinach na komórki działano, przy braku (próba ślepa) lub w obecności 1 nM DHT (próba kontrolna), związkami według obecnego wynalazku (próbka) w stężeniach od 10^-10 M do 10^-15 M. Wykonano dwie repliki każdej próbki. Rozcieńczenia związku były wykonywane na laboratoryjnym stanowisku roboczym Biomek 2000. Po 72 godzinach do każdego zagłębienia dodano 0,44 uCi. [³H]-tymidyny (Amersham) i inkubowano przez kolejne 24 godziny, po czym dokonywano trypsynizacji zbierając

PL 206 962 B1 komórki na filtry GF/B. Do filtrów dodawano Microscint PS, przed zliczeniem ich przy użyciu licznika Beckman TopCount.

Procent hamowania obliczono jako:

% hamowania = 100 x (1 - [średniapróba kontrolna - średniapróba ślepa/średniapróbka - średniapróbka ślepa])

Dane przedstawiono na wykresie i obliczono (IC50), to jest tężenie związku które hamowało 50% inkorporowania [³H]-tymidyny.

Test transaktywacji mioblastów myszy C2C12

Dwa funkcjonalne testy transaktywacji zostały opracowane celu zbadania skuteczności agonistów androgenu w komórce mięśniowej przy użyciu reportera lucyferazy. Pierwszy test (ARTA Stable 1) wykorzystuje linię komórek, Stable 1 (klon # 72), które stabilnie powodują ekspresję receptora androgenu szczura pełnej długości, lecz wymagają przejściowej transfekcji wzmacniacza/reportera. Linia komórkowa została otrzymana z komórek mioblastów myszy CH2C12. Drugi test (ARTA Stable 2) wykorzystuje linię komórkową Stable 2 (klon # 133) otrzymaną ze Stable 1, która stabilnie powoduje ekspresję zarówno rAR, jak i reportera wzmacniacz/reporter lucyferazy.

Konstrukt wzmacniacz/reporter używany w tym układzie jest pGL3/2XDR 1/lucyferazą. Opublikowano informację, że 2XDR-1 jest specyficznym dla AR elementem odpowiedzi w komórkach CV-1, Brown i współpracownicy, The Journal of Biological Chemistry, 272, strony 8227-8235, (1997). Został on opracowany przez losową mutagenezę sekwencji wzmacniacza konsensusu AR/GR.

Test ARTA Stable 1

1. Komórki Stable 1 umieszczono na płytkach zawierających 96 zagłębień, w ilości 6000 komórek na zagłębienie, w DMEM ze stężoną glukozą, bez czerwieni fenolowej (Gibco BRL, numer katalogowy 21063-029) zawierającym 10% FBS, na który działano węglem drzewnym i dekstranem (HyClone, numer katalogowy SH30068.02), 50 mM buforu HEPES (Gibco BRL, numer katalogowy 15630 -080), 1X MEM pirogronian sodu (Gibco BRL, numer katalogowy 11360-070), 0,5X antybiotyk-środek przeciwgrzybiczy i 800 μg/ml genetycyny (Gibco BRL, numer katalogowy 10131-035).

2. Po 48 godzinach komórki poddano transfekcji przy pomocy pGL3/2XDR/lucyferaza, stosując odczynnik LipofectAMINE Plus™ (Gibco BRL, Cat. No.: 10964-013). Dokładnie 5 ng/zagłębienie DNA pGL3/2XDR-1/lucyferazy i 50 ng/zagłębienie DNA spermy łososia (jako podłoże) rozcieńczono przy użyciu 5 ul pożywki Opti-MEMem (Gibco BRL, numer katalogowy 31985-070)/zagłębienie. Do tego dodano 0,5 μl/zagłębienie odczynnika Plus. Mieszaninę tę inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej. W oddzielnym naczyniu rozcieńczono 0,385 μl odczynnika LipofectAMINE/zagłębienie za pomocą 5 μl/zagłębienie Opti-MEM. Mieszaninę DNA połączono następnie z mieszaniną LipofectAMINE i inkubowano przez dodatkowe 15 minut w temperaturze pokojowej. W tym czasie, usunięto pożywki z komórek i zastąpiono je 60 μl Opti-MEM/zagłębienie. Do tego dodano 10 μl mieszaniny transfekcyjnej DNA/LipofectAMINE/zagłębienie. Komórki inkubowano przez 4 godziny.

3. Mieszaninę transfekcyjną usunięto z komórek i zastąpiono 90 μl pożywek jak w powyższym punkcie 1.

4. W każdym zagłębieniu umieszczono 10 μl leku o odpowiednim rozcieńczeniu.

5. Po 24 godzinach, do wykrywania aktywności zastosowano system testowy Steady-GloTM Luciferase, postępując zgodnie z instrukcją producenta (Promesa, numer katalogowy E2520).

Test ARTA stable 2

1. Komórki Stable 2 umieszczono na płytkach zawierających 96 zagłębień, w ilości 6000 komórek/zagłębienie, w DMEM ze stężoną glukozą bez czerwieni fenolowej (Gibco BRL, numer katalogowy 21063-029) zawierającym 10% FBS, na który działano węglem drzewnym i dekstranem (HyCLone numer katalogowy SH30068.02), 50 mM buforu HEPES (Gibco BRL, numer katalogowy 15630-080), 1X MEM Na pirogronian (Gibco BRL, numer katalogowy 11360-070), 0,5X antybiotyk-środek przeciwgrzybiczy, 800 μg/ml genetyczny (Gibco BRL, numer katalogowy 1011-035) i 800 μg/ml higromycyny β (Gibco BRL, numer katalogowy 10687-010).

2. Po 48 godzinach pożywki usunięto z komórek i zastąpiono świeżymi pożywkami w ilości 90 ąl. W każdym zagłębieniu umieszczono 10 μl leku o odpowiednim rozcieńczeniu.

3. Po 24 godzinach, do wykrywania aktywności zastosowano system testowy Steady-GloTM Luciferase, postępując zgodnie z instrukcją producenta (Promega, numer katalogowy E2520).

Patrz zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer seryjny 09/885,831, zatytułowane „Cell Lines and Cell-Based Assays for Identification of Androgen Receptor Modulators”

PL 206 962 B1 zgłoszone dnia 20 czerwca 2001 przez Jacka Ostrowskiego i współpracowników, które to zgłoszenie patentowe załączono w niniejszym w całości jako referencję.

Testy proliferacji

Test proliferacji komórek sutka myszy

Zdolność związków według obecnego wynalazku („związki badane”) do modulowania funkcji AR określano poprzez badanie tych związków w teście proliferacji przy użyciu linii komorowej reagującej na androgen z komórek sutka myszy otrzymanych z guza Shionogi, Hiraoka i współpracownicy, Cancer Res., 47, strony 6560-6564 (1987). Klony zależne od Stable AR macierzystych linii Shionogi uzyskiwano przez pasaż fragmentów guza według ogólnej procedury opisanej przez Tetuo i współpracowników, Cancer Research, 25, strony 1168-1175 (1965). Po przeprowadzeniu powyższej procedury wyizolowano, scharakteryzowano i wykorzystano jedną stabilną linię, SC114. Komórki SC114 inkubowano przez 72 godziny, ze związkami badanymi lub bez nich, po czym obliczono ilość [³H]-tymidyny inkorporowanej do DNA jako zastępczy punkt końcowy, dla oceny liczby komórek i dzięki temu tempa proliferacji, jak opisał to Suzuki i współpracownicy w J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 37, strony 559-567 (1990). Linia komórkowa SC114 była utrzymywana w MEM zawierającym 10^-8 testosteronu i 2% FCS, na który działano DCC. W celu przeprowadzenia testu, komórki umieszczono w mikropłytkach zawierających 96 zagłębień, w pożywce zachowawczej, po czym inkubowano w temperaturze 37°C. Następnego dnia pożywkę zmieniono na pożywkę wolną od surowicy [pożywka Hama F-12:MEM (1:1, w stosunku objętościowym) zawierająca 0,1% BSA] z (badanie działania antagonistycznego) lub bez (badanie działania agonistycznego) 10^-8 M testosteronu i z badanymi związkami według wynalazku o stężeniach od 10^-10 do 10^-5. Sporządzono dwie replikacje każdej próbki. Rozcieńczenia związku były wykonywane na laboratoryjnym stanowisku roboczym Biomek 2000. Po 72 godzinach, do każdego zagłębienia dodano 0,44 uCI [³H]-tymidyny (Amersham), po czym inkubowano przez kolejne 2 godziny i następnie wykonywano trypsynizację i zbieranie komórek na filtry GF/B. Przed liczeniem na liczniku Beckman TopCount, do filtrów dodawano Micro-scint PS.

Dla działania antagonistycznego, % hamowania obliczano jako:

% hamowania = 100 x (1 - [średniapróbka - średniapróba ślepa/ ^/średniapróba kontrolna ^- średniapróba ślepa])

Dane przedstawiono na wykresie i obliczono stężenie związku, które hamowało 50% inkorporacji [³H]-tymidyny (IC50).

Dla działania agonistycznego % próbki kontrolnej określono jako efekt działania badanego związku w porównaniu do maksymalnego efektu działania obserwowanego w przypadku naturalnego hormonu, w tym przypadku DHT i obliczano jako:

% próbki kontrolnej = 100 x (średniapróbka - średniapróba ślepa)/ ^/(średniapróba kontrolna ^- średniapróba ślepa)

Dane przedstawiono na wykresie i obliczano stężenie związku, które hamowało 50% inkorporacji [³H]-tymidyny (EC50).

Test in vitro do badania indukowanej transrepresji GR

Test AP-1 jest testem reportera lucyferazy przeprowadzonym na komórkach. Komórki A549, które zawierają endogenny receptor glukokortykoidowy, były stabilnie transfekowane miejscem wiążącym Ap-1 DNA dołączonym do genu lucyferazy. Następie, komórki hodowano w RPMI + 10% surowicy płodu bydlęcego (oczyszczonej węglem drzewnym) + penicylina/streptomycyna z 0,5 mg/ml genetycyny. Komórki umieszczono na płytkach dzień przed eksperymentem w ilości około 40000 komórek na zagłębienie. W dniu testu pożywki usunięto przez zasysanie i do każdego zagłębienia dodano 20 μl buforu testowego (RPMI bez czerwieni fenolowej + 10% FCS (na który działano węglem drzewnym) + penicylina/streptomycyna). W tym momencie, do każdego zagłębienia dodawano 20 μl buforu testowego (doświadczenia kontrolne), związki według wynalazku („związki badane”) (rozpuszczone w DMSO i dodawane w różnych stężeniach) lub deksametazon (100 nM w DMSO, pozytywna próba kontrolna). Następnie płytki inkubowano wstępnie przez 15 minut w temperaturze 37°C, a następnie stymulowano przy pomocy 10 ng/ml PMA. Następnie płytki inkubowano przez 7 godzin w temperaturze 37°C, po czym do każdego zagłębienia dodano 40 μl odczynnika substratu lucyferazy. Aktywność mierzono przez analizę w urządzeniu do badania luminescencji, w porównaniu z próbami kontrolnymi z użyciem bufora lub deksametazonu. Aktywność była oznaczana jako % hamowania układu reportera w porównaniu do próby kontrolnej z użyciem bufora z samym 10 ng/ml PMA. Próba kontrolna

PL 206 962 B1 z użyciem deksametazonu o stężeniu; < 10 μM, zwykle hamuje aktywność o 65%. Badane związki, które wykazują hamowanie indukcji PMA o 50% lub więcej, przy stężeniu badanego związku < 10 μM, uważane są za aktywne.

Test masy wilgotnej prostaty, test antagonisty AR

Aktywność związków według wynalazku jako antagonistów AR była badana na modelu niedojrzałych samców szczura, w standardowym, uznanym teście aktywności antyandrogenu, jak to pisali: L.G. Hershberger i współpracownicy w Proc. Soc. Expt. Biol. Med., 83, strona 175 (1953); P.C. Walsh i R.F. Gittes, w ”Inhibition of extratesticular stimuli to prostate growth in the castrated rat by antiandrogens”, Endocrinology, 86, strona 624 (1970); oraz B.J. Furr i współpracownicy w “ICI 176,334: A novel non-steroid, peripherally selective antiandrogen”, J. Endocrionol., 113, R7-9 (1987), które to oniesienia załącza się w niniejszym jako referencje.

Podstawą tego testu jest fakt, że męskie dodatkowe narządy płciowe takie, jak prostata i pęcherzyki nasienne, odgrywają ważną rolę w funkcji reprodukcyjnej. Te gruczoły są stymulowane do wzrostu i utrzymywane we właściwej wielkości i funkcji wydzielniczej przez stałą obecność testosteronu (T) w osoczu, który jest głównym androgenem osocza (> 95%) wytwarzanym przez komórki Leydiga w jądrach, pod kontrolą hormonu luteinizującego przysadki (LH) i hormonu stymulującego pęcherzyki (FSH). Testosteron jest przekształcany w prostacie do bardziej aktywnej postaci, dihydrotestosteronu (DHT), przez 5a-reduktazę. Androgeny nadnerczy również stanowią około 20% całkowitego DHT w prostacie szczura, w porównaniu z 40% u mężczyzny 65-letniego. F. Labrie i inni w Clin. Invest. Med., 16, strony 475-492 (1993). Jednakże nie jest to główna ścieżka, ponieważ zarówno u zwierząt, jak i u ludzi kastracja prowadzi do prawie całkowitej inwolucji prostaty i pęcherzyków nasiennych bez jednoczesnej adrenalektomii. Dlatego w normalnych warunkach nadnercza nie wspomagają znacząco wzrostu tkanek prostaty. M.C. Luke i D.S. Coffey, „The Physiology of Reporduction”, edytorzy - E. Knobil i J.D. Neill, 1, strony. 1435-1487 (1994). Ponieważ męskie narządy płciowe są tkankami najbardziej reaktywnymi na modulację aktywności androgenów, ten model jest stosowany do określenia zależnego od androgenów wzrostu dodatkowych narządów płciowych u niedojrzałych, kastrowanych szczurów.

Niedojrzałe samce szczura, (wiek 19-20 dni, Sprague-Dawley, Harlan Sprague-Dawely), zostały poddane kastracji w znieczuleniu metofanem. Pięć dni po operacji tym kastrowanym szczurom (60-70 g, wiek 23-25 dni) podawano leki przez 3 dni. Zwierzętom podawano podskórnie (s.c.) 1 mg/kg propionianu testosteronu (TP) w oleju arachidowym jako podłożu, po czym badane związki antyandrogenne (związki według wynalazku) podawano doustnie przez sondę (p.o.) w rozpuszczonej zawiesinie 80% PEG 400 i 20% Tween 80 (PEGTW). Zwierzętom podawano leki (v/w) w 0,5 ml podłoża na 100 g masy ciała. Zwierzęta podzielono na następujące grupy eksperymentalne:

1. Podłoże kontrolne.

2. Propionian testosteronu (TP) (3 mg/szczura/dzień, podskórnie).

3. TP plus Casodex (podawany p.o. w PEGTW, QD), znany antyandrogen jako związek referencyjny.

4. W celu wykazania aktywności antagonistycznej, związek według wynalazku („związek badany”) podano (p.o. w PEGTW, QD) z TP (s.c. jak to podawano w grupie 2) w zakresie dawek.

5. W celu wykazania aktywności agonistycznej, związek według wynalazku („związek badany”) podawano samodzielnie (p.o. w PEGTW, QD) w zakresie dawek.

Po zakończeniu 3-dniowego podawania związków zwierzęta uśmiercano i ważono prostatę brzuszną. W celu porównania danych z różnych doświadczeń, masy narządów płciowych standaryzowano w mg na 100 g masy ciała, przy czym wzrost masy narządu indukowany przez TP uznawany był za wzrost maksymalny 100%). Do analizy statystycznej stosowano test ANOVA, a następnie jednostronny test Studenta lub dokładny test Fishera.

Zwiększenie lub zmniejszenie masy narządu płciowego odzwierciedla zmiany w liczbie komórek (zawartość DNA) i w masie komórek (zawartość białka), w zależności od stężenia androgenu w osoczu. Patrz Y. Okuda i współpracownicy, J. Urol., 145, 188-191 (1991), który jest załączony tu jako referencja, dlatego mierzenie masy powiększonego narządu jest wystarczające do wykazania bioaktywności androgenów i antagonistów androgenów. U niedojrzałych kastrowanych szczurów zastąpienie egzogennych androgenów zwiększa pęcherzyki nasienne (SV) i prostatę brzuszną (VP) w sposób zależny od dawki.

Maksymalny wzrost masy narządu był od cztero- do pięciokrotny, gdy podawano 3 mg testosteronu (T)/na szczura/na dzień lub 1 mg propionianu testosteronu (TP)/na szczura/na 3 dni. EC50 dla T

PL 206 962 B1 i TP wynosił odpowiednio około 1 mg i 0,03 mg. Wzrost masy VP i SV również korelował ze wzrostem stężenia T i DHT w osoczu. Pomimo, że podanie T powodowało 5 razy większe stężenie T i DHT w osoczu po 2 godzinach od iniekcji podskórnej niż podanie TP, te wysokie poziomy obniżały się bardzo szybko. W przeciwieństwie do tego, stężenia T i DHT w osoczu zwierząt, którym podano TP, były dość stałe przez 24 godziny i dlatego TP wykazywał około 10-30-krotnie większą siłę działania niż wolny T.

W tym modelu z zastosowaniem niedojrzałych, kastrowanych szczurów, znany antagonista AR (Casodex) był również podawany razem z 0,1 mg TP (ED80) hamując indukowany testosteronem wzrost masy VP i SV w sposób zależny od dawki. Antagonistyczne efekty działania były podobne, gdy leki podawano doustnie lub podskórnie. Związki według wynalazku wykazywały także działanie antagonistyczne w stosunku do AR hamując indukowany testosteronem wzrost masy VP i SV.

Test dźwigacza odbytu i test masy powiększonej prostaty, test agonisty AR

Aktywność związków według wynalazku jako agonistów AR była badana na modelu niedojrzałych samców szczura, w teście przeznaczonym do badania działania anabolicznego na mięśnie i działania podtrzymującego na narządy płciowe, dla danego związku, jak to opisali: L.G. Hershberger i współpracownicy w Proc. Soc. Expt. Biol. Med., 83, strona 175 (1953); B.L. Beyler i współpracownicy, „Methods for evaluating anabolic and catabolic agents in laboratory animals”, J. Amer. Med. Women's Ass., 23, strona 708 (1968); H. Fakuda i współpracownicy, „Investigations of the levator and muscle as an anabolic steroid assay”. Nago Dai. Yak. Ken. Nem., 14, strona 84 1966), które to doniesienia są załączone w niniejszym jako referencje.

Podstawą tego testu jest dobrze znany fakt działania androgenów na stan i wzrost tkanki mięśniowej i dodatkowych narządów płciowych u zwierząt i człowieka. Steroidy androgenne takie, jak testosteron (T) zostały dobrze scharakteryzowane pod względem zdolności do zachowywania masy mięśniowej. Leczenie zwierząt lub ludzi po kastracji egzogennym T powoduje odwrócenie atrofii mięśni. Wpływ T na atrofię mięśni w mięśniu dźwigacza odbytu u szczura zostało dobrze scharakteryzowane w następujących doniesieniach: M. Masouka i współpracownicy, „Constant cell population in normal, testosterone deprived and testosterone simulated levator ani muscles” Am. J. Anat., 119, strona 263 (1966); Z. Gori i współpracownicy, „Testosterone hypertrophy of levator ani muscle of castrated rats. I. Quantitative data”. Boll. - Soc. Ital. Biol. Sper., 42, strona 1596 (1966); Z. Gori i współpracownicy., Testosterone hypertrophy of levator ani muscle of castrated rats. II. Electron-microscopic observations”, Boll. - Soc. Ital. Biol. Sper., 42, strona 1600 (1966); A. Boris i współpracownicy, Steroids, 15, strona 61 (1970). Jak to przedstawiono powyżej, wpływ androgenów na stan męskich dodatkowych narządów płciowych, jak prostata i pęcherzyki nasienne, został dobrze opisany. Kastracja powoduje gwałtowną inwolucję prostaty i pęcherzyków nasiennych. Ten efekt może być odwrócony przez dodanie androgenów. Ponieważ zarówno mięsień dźwigacza odbytu, jak i męskie narządy płciowe są tkankami najbardziej reaktywnymi na działanie androgenów, ten model jest stosowany w celu określenia zależnego od androgenów odwracania atrofii mięśnia dźwigacza odbytu i dodatkowych narządów płciowych u niedojrzałych, kastrowanych szczurów. Dojrzałe płciowo szczury (200-250 g, wiek 6-8 tygodni, Sprague-Dawley, Harlan) otrzymano od dostawcy (Taconic) po kastracji. Szczury zostały podzielone na grupy i przez 7-14 dni podawano im codziennie jeden z następujących preparatów:

1. Podłoże kontrolne

2. Propionian testosteronu (TP) (3 mg/szczura/dzień, podane podskórnie)

3. TP plus Casodex (podawany p.o. w PEGTW, QD), znany antyandrogen, zastosowany jako związek referencyjny.

4. W celu wykazania aktywności antagonistycznej, związek według wynalazku („związek badany”) podawano (p.o. w PEGTW, QD) z TP (s.c, tak jak podawano w grupie 2), w zakresie dawek.

5. W celu wykazania aktywności agonistycznej, związek według wynalazku („związek badany”) podawano samodzielnie (p.o. w PEGTW, QD), w zakresie dawek.

Po zakończeniu 7-14-dniowego okresu podawania preparatów zwierzęta uśmiercano dwutlenkiem węgla i ważono dźwigacz odbytu, pęcherzyk nasienny i prostatę brzuszną. W celu porównania danych z różnych eksperymentów, masy mięśnia dźwigacza odbytu i narządów płciowych najpierw standaryzowano jako masę mg na 100 g masy ciała, przy czym wzrost masy narządu indukowany przez TP uznano za wzrost maksymalny (100%). Do analizy statystycznej użyto testu Super-anova (jeden czynnik).

Wzrost i zmniejszenie się masy narządu płciowego odzwierciedla zmiany w liczbie komórek (zawartość DNA) i masie komórek (zawartość białka), w zależności od stężenia androgenu w osoczu.

PL 206 962 B1

Patrz Y. Okuda i współpracownicy, J. Urol., 145, strony 188-191 (1991), które to doniesienie załącza się w niniejszym jako referencję. Dlatego mierzenie masy powiększonego narządu jest wystarczające do wykazania bioaktywności androgenów i antagonistów androgenów. U niedojrzałych kastrowanych szczurów, podanie egzogennych androgenów zwiększa dźwigacz odbytu, pęcherzyki nasienne (SV) i prostatę w sposób zależny od dawki.

Maksymalne zwiększenie masy narządu było od cztero- do pięciokrotne, gdy podawano 3 mg testosteronu (T) dziennie/szczura lub 1 mg propionianu testosteronu (TP) dziennie/szczura przez 3 dni. EC50 dla T i TP wynosiło odpowiednio około 1 mg i 0,03 mg. Zwiększenie masy VP i SV również korelowało ze wzrostem stężenia T i DHT w osoczu. Pomimo, że podanie T powodowało 5 razy większe stężenie T i DHT w osoczu po 2 godzinach od iniekcji podskórnej niż podanie TP, te wysokie poziomy obniżały się bardzo szybko. W przeciwieństwie do tego, stężenia T i DHT w osoczu zwierząt którym podano TP, były dość stałe przez 24 godziny i dlatego TP wykazywał około 10-30-krotnie większą siłę działania niż wolny T.

Test zenoprzeszczepu ludzkiej prostaty MDA-Pca-2b

Badanie przeciwnowotworowe in vivo: ludzkie guzy prostaty MDA-PCA-2b hodowano w myszach nagich Balb/c nu/nu. Guzy były przeszczepiane samcom myszy nagich (wiek 4-6 tygodni) w postaci podskórnych transplantów przy użyciu fragmentów guza pobranych od myszy dawcy. Pasażowania guzów dokonywano co 5-6 tygodni.

Do testu skuteczności działania przeciwnowotworowego, na początku eksperymentu zebrano ilość zwierząt wymaganą do wykrycia znaczącej reakcji i każdemu ze zwierząt wszczepiono podskórnie fragment guza (~ 50 mg) za pomocą trokara kaliber 13. Dopuszczono do wzrostu guzów do około 100-200 mg (guzy które nie mieściły się w tym zakresie były wyłączane z badania) i zwierzęta zostały równo podzielone na różne grupy: badane i kontrolne. Leczenie każdego zwierzęcia było uzależnione od jego masy ciała. Leczone zwierzęta badano codziennie sprawdzając zależność toksyczność/umieralność. Każda grupa zwierząt była ważona przed rozpoczęciem leczenia (Wt1) i po podaniu ostatniej dawki (Wt2). Różnica w masie ciała (WT2 -Wt1) była miarą toksyczności zależnej od leczenia.

Odpowiedź guza była badana przez mierzenie guzów za pomocą sprawdzianu szczękowego, dwa razy w tygodniu do momentu gdy guzy osiągnęły wcześniej ustaloną „docelową” wielkość 0,5 g. Masy guzów (mg) były obliczane ze wzoru:

masa guza = (długość x szerokość2) τ 2.

Punkt końcowy odpowiedzi guza został wyrażony jako zahamowanie wzrostu guza (%T/C) i zdefiniowany jako stosunek średniej masy guza u leczonych zwierząt (T) do średniej masy guza w grupie kontrolnej (C).

W celu określenia śmiertelności komórek guza, czas podwojenia objętości guza (skrót ang. TVDT) został obliczony z wzoru:

TVDT = średni czas (dni), w jakim guzy kontrolne osiągały docelową wielkość - średni czas (dni), w jakim guzy kontrolne osiągały połowę docelowej wielkości; oraz log śmierci komórki = (T - C) τ (3,32 x TVDT)

Obliczenia statystyczne wykonano przy użyciu uogólnionego przez Gehana testu Wilcoxona.

Guz prostaty Dunninga

Guz prostaty Dunninga R3327H jest spontanicznie występującym, dobrze zróżnicowanym reagującym na androgeny gruczolakorakiem prostaty (Smolev JK, Heston WD, Scott WW i Coffey DS., Cancer Treat Rep., 61, strony 273-287 (1977). Wyselekcjonowano wzrost podlinii R3327H z uwagi na wysoce zależny od androgenów i odtwarzalny wzrost u nieuszkodzonych samców szczurów. Dlatego ten model i inne podlinie tego guza są szeroko używane do oceny aktywności przecinowotworowej In vivo takich antyandrogenów jak flutamid i bikalutamid/Casodex (A. Maucher i von Angerer, J. Cance Res. Clin. Oncol., 119, strony 669-674 (1993), Furr B.J.A., Euro. URL., 18 (supl. 3), strony 2-9 (1990), Shain S.A.i RI. Huot, J. SteroidBiochem., 31, strony 711-718 (1988) ).

Na początku badania, elementy guza Dunninga (około 4 x 4 m) przeszczepiano podskórnie do boku dojrzałych samców szczurów Copenhagen (wiek 6-7 tygodni, Harlan-Sprague Dawley, Indianapolis, MD). Po 6 tygodniach od implantacji, zwierzęta z guzami, które można było zmierzyć (około 80 -120 mm²) zostały podzielone losowo na grupy badane (8-10 szczurów w grupie) rozpoczęto leczenie. Jedna grupa szczurów została poddana kastracji, aby służyła jako negatywna grupa kontrolna wzrostu guzów. Zwierzętom podawano codziennie związki według wynalazku, standardowe antyandrogeny

PL 206 962 B1 takie, bikalutamid lub podłoże (grupa kontrolna) przez średnio 10 do 14 tygodni. Związki badane rozpuszczono w podłożu (2,5 ml/kg masy ciała), to jest w 10% roztworze glikolu polietylenowego i 0,05% Tween-80 w 1% karboksymetylocelulozie, PEG/CMC, (Sigma, St. Luis, MO). Typowe eksperymenty terapeutyczne obejmują trzy grupy trzech wzrastających dawek dla każdego związku standardowego lub badanego (w zakresie 300-3 mg/kg).

Guzy w grupie podłoża (grupa kontrolna) osiągnęły wielość 1500 do 2500 mm³, podczas gdy grupa zwierząt kastrowanych typowo wykazywała zastój podczas 14 tygodni obserwacji, można oczekiwać, że zwierzęta, którym podano doustnie 20 mg/kg bikalutamidu lub flutamidu będą wykazywały 40% zmniejszenie objętości guzów w porównaniu z grupą kontrolną po 14 tygodniach leczenia. Wielkość guzów była co tydzień mierzona sprawdzianem szczękowym z noniuszem (Froboz, Szwajcaria), ₃ wykonując prostopadłe pomiary długości i szerokości. Objętości guzów mierzono w mm³ przy użyciu wzorów:

długość x szerokość x wysokość = objętość.

Różnice statystyczne pomiędzy grupami badanymi i kontrolnymi oceniano z zastosowaniem wielokrotnej analizy ANOVA, a następnie z użyciem jednostronnego nieparametrycznego testu t Studenta.

Test masy prostaty dojrzałych szczurów

Aktywność związków według wynalazku była badana na modelu dojrzałych samców szczura, który jest odmianą testu dźwigacza odbytu i masy powiększonej prostaty opisanego powyżej. Powyższe testy in vivo są uznanymi testami określania działania anabolicznego danego związku na mięśnie i podtrzymującego działania na narządy płciowe, jak to opisali: L.G. Hershberger i inni, 83 Proc. Soc. Expt. Biol. Med., 175 (1953); B.L. Beyler i współpracownicy, „Methods for evaluating anabolic and catabolic agents in laboratory animals”, 23 J. Amer. Mesd. Women's Ass., 708 (1968); oraz H. Fukuda i współpracownicy, „Investigations of the levator ani muscle as an anabolic steroid assay”, 14 Nago Dai. Yak. Ken. Nem., 84 (1966), które to doniesienia są załączone w niniejszym jako odnośniki. Podstawa tego testu jest dobrze zdefiniowany wpływ androgenów na stan i wzrost tkanek mięśniowych i dodatkowych narządów płciowych u zwierząt i u człowieka.

Dodatkowe męskie narządy płciowe takie, jak prostata i pęcherzyki nasienne odgrywają ważną rolę w funkcji reprodukcyjnej. Te gruczoły są pobudzane do wzrostu, a ich wielkość i funkcja wydzielnicza jest utrzymywana przez stałą obecność testosteronu (T) w osoczu, który jest głównym androgenem osocza (> 95%), wytwarzanym przez komórki Leydiga w jądrach pod kontrolą hormonu luteinizującego (LH) przysadki i hormonu stymulującego pęcherzyki (FSH). Testosteron jest przekształcany w prostacie przez 5a-reduktazę do bardziej aktywnej formy, dihydrotestosteronu, (DHT). Androgeny nadnerczy również stanowią do około 20% całkowitego DHT w prostacie szczura, w porównaniu z 40% u 65-letniego mężczyzny. F. Labrie i współpracownicy, 16 Clin. Invest. Med., strony 475-492 (1993). Jednakże nie jest to główna ścieżka, ponieważ zarówno u zwierząt, jak i u człowieka kastracja prowadzi do prawie całkowitej inwolucji prostaty i pęcherzyków nasiennych bez jednoczesnej adrenalektomii. Dlatego, w normalnych warunkach, nadnercza nie wspomagają w istotny sposób wzrostu tkanek prostaty, M.C. Luke i D.S. Coffey, „The Physiology of Reproduction”, Edytorzy E. Knobil i J.D. Neill, 1, strony 1435-1487 (1994). Ponieważ męskie narządy płciowe i dźwigacz odbytu są tkankami najbardziej reagującymi na modulację aktywności androgenów, ten model jest stosowany do określania aktywności związków, które modulują ścieżkę receptora androgenów u dojrzałych szczurów.

Wraz z jego mitogennym działaniem na takie tkanki, jak prostata, pęcherzyki nasienne i mięśnie, testosteron także służy jako negatywny regulator dla swojej własnej biosyntezy. Wytwarzanie testosteronu przez komórki Leydiga w jądrach jest kontrolowane przez poziom krążącego LH uwalnianego z przysadki. Poziomy LH są kontrolowane przez poziom LHRH wytwarzanego w rejonie podwzgórza. Testosteron we krwi hamuje sekrecję LHRH i następnie obniża poziom LH i ostatecznie poziom krążącego testosteronu. Przez badanie poziomu LH we krwi, na który wpływają związki według wynalazku („związki badane”), możliwe jest określenie poziomu aktywności agonistycznej lub antagonistycznej tych związków w osi podwzgórzowej tego cyklu wewnątrzwydzielniczego.

Porównywalnym grupom szczurów Harlan Sprague-Dawely wiek 40-42 dni, waga 180-220 g) podawano przez 14 dni doustnie przez sondę (p.o.) testowane związki, rozpuszczone w zawiesinie 80% PEG 400 i 20% Tween 20 (PEGTW). Dwie grupy kontrolne, jedna nietknięta i jedna po kastracji, otrzymywały doustnie tylko podłoże PEGTW. Zwierzęta otrzymywały 0,5 ml podłoża na 100 g masy ciała (objętość na masę). Zwierzęta podzielono na następujące grupy doświadczalne:

1. podłoże nienaruszone (p.o., PEGTW, QD)

PL 206 962 B1

2. podłoże kontrolne (p.o., PEGTW, QD)

3. bikalutamid (Casodex, uznany antyandrogen jako związek referencyjny) lub związek według wynalazku, p.o. w PEGTW QD. (w zakresie dawek).

Na końcu 14-dniowego leczenia zwierzęta uśmiercano i suwano chirurgicznie prostatę brzuszną, pęcherzyki nasienne i dźwigacz odbytu i następnie ważono. W celu porównania danych z różnych doświadczeń, masa narządów była standaryzowana jako mg ma kg masy ciała i wyrażona jako procent wartości odpowiedniego narządu w grupie nienaruszonej.

Hormon luteinizujący szczurów (rLH) był ilościowo określany za pomocą zestawu Biotrak [¹²⁵I] (Amersham Pharmacia Biotel) zgodnie z zaleceniami producenta. Test jest oparty na konkurencji LH obecnego w osoczu z wiązaniem [¹²⁵I] rLH do zawiesiny Amerlex-M kropla/przeciwciało. Pozostała po inkubacji z osoczem i przemywaniu radioaktywność jest ekstrapolowana na krzywą standardową w celu uzyskania odczytu w ng/ml.

Wzrost i zmniejszenie masy narządu płciowego i dźwigacza odbytu odzwierciedla zmiany w liczbie komórek (zawartość DNA) i masie komórek (zawartość białka) zależnie od stężenia androgenu w osoczu, patrz Y. Okuda i współpracownicy, J. Urol., 45, strony 188-191 (1991), które to doniesienie załącza się w niniejszym jako odnośnik. Dlatego mierzenie masy powiększonego narządu jest wystarczające do określenia bioaktywności androgenów i antagonistów androgenów. W teście na dojrzałych szczurach, aktywni agoniści nie będą oddziaływać lub będą zwiększać masę jednego lub więcej narządów reagujących na androgeny (dźwigacz odbytu, prostata, pęcherzyk nasienny) i nie będą oddziaływać lub będą hamować wydzielanie LH. Związki o aktywności antagonistycznej będą zmniejszały masę jednego z narządów reagujących na androgeny (dźwigacz odbytu, prostata, pęcherzyk nasienny) lub ich większa ilość i nie będą miały pływu lub będą miały ograniczony wpływ hamujący na wydzielanie LH.

Test ludzkiego zenoprzeszczepu prostaty CWR22

Badanie działania przeciwnowotworowego in vivo: ludzkie guzy prostaty CWR22 były hodowane u myszy nagich Balb/c nu/nu. Guzy były przeszczepiane jako podskórne transplanty do dorosłych samców myszy nagich (wiek 4-6 tygodni) przy użyciu fragmentów guza uzyskanych od myszy dawców. Pasażowanie guzów było dokonywane co 5-6 tygodni.

W celu przeprowadzenia badania skuteczności przeciwnowotworowej, wymagana liczba zwierząt konieczna do wykrycia znaczącej reakcji została zebrana na początku eksperymentu i każdemu ze zwierząt wszczepiono podskórny implant fragmentu guza (~ 50 mg) za pomocą trokara kaliber 13. Dopuszczono do wzrostu guzów do wielkości około 100-200 mg (guzy nie mieszczące się w tym zakresie wyłączono z badania) i zwierzęta podzielono równo na różne grupy badane i kontrolne. Leczenie każdego zwierzęcia było oparte na indywidualnej masie ciała. Leczone zwierzęta kontrolowano codziennie sprawdzając zależność toksyczność/umieralność. Każda grupa zwierząt była ważona przed rozpoczęciem leczenia (Wt1) i po podaniu ostatniej dawki (Wt2). Różnica w masie ciała (WT2 - Wt1) była miarą toksyczności zależnej od leczenia.

Odpowiedź guza była badana przez mierzenie guzów za pomocą sprawdzianu szczękowego, dwa razy w tygodniu do momentu gdy guzy osiągnęły wcześniej ustaloną „docelową” wielkość 0,5 mg. Masy guzów (mg) były obliczane z wzoru:

masa guza = (długość x szerokość2) * 2.

Punkt końcowy odpowiedzi guza został wyrażony jako zahamowanie wzrostu guza (%T/C) i zdefiniowany jako stosunek średniej masy guza u leczonych zwierząt (T) do średniej masy guza w grupie kontrolnej (C).

W celu określenia śmiertelności komórek guza, czas podwojenia objętości guza (skrót ang. TVDT) został obliczony z wzoru:

TVDT = średni czas (dni), w jakim guzy kontrolne osiągały docelową wielkość - średni czas (dni), w jakim guzy kontrolne osiągały połowę docelowej wielkości; oraz log śmierci komórki = (T - C) * (3,32 x TVDT)

Obliczenia statystyczne wykonano przy użyciu uogólnionego przez Gehana testu Wilcoxona.

Następujące przykłady ilustrują zastosowania obecnego wynalazku, nie ograniczając zakresu zastrzeżeń patentowych.

PL 206 962 B1

Skróty

DBU = 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en 4-DMAP = 4-dimetyloaminopirydyna ee = nadmiar enancjomeryczny DMF = dimetyloformamid EtOAc = octan etylu

LDA diizopropyloamidek litu

Zasada Hiiniga = W,W-diizopropyloetyloamina

Me = metyl

RT = czas retencji

TFA = kwas trifluorooctowy

THF = tetrahydrofuran

TLC = chromatografia cienkowarstwowa

TMS = trimetylosilil p-TSA = kwas p-toluenosulfonowy

Δ = ogrzewanie t-Bu = tert-butyl

PhCH3 = toluen

Pd/C = pallad na węglu aktywnym

TsCl = chlorek tosylu (chlorek p-toluenosulfonylu)

TBSOTf = trifluorometanosulfonian tert-butylodimetylosililu TBS = tert-butylodimetylosilan

Mel = jodek metylu (BOC)2O = diwęglan di-tert-butylu

TEA = trietyloamina n-BuLi = n-butylolit rt = temperatura pokojowa

LC = chromatografia cieczowa

Ts = tosyl

Ph = fenyl EtOH = etanol DCE = dichloroetan DMSO = dimetylosulfotlenek Ra-Ni = nikiel Raney'a MS = sita molekularne

MS (ES) = spektromeria mas z interfejsem elektrosprejowym mCPBA = kwas m-chloronadbenzoesowy sat = nasycony

AcOH = kwas octowy MeOH = metanol Et2O = eter dietylowy Ac = acetyl

DEAD = azodikarboksylan dietylu h = godziny Et = etyl

WSDCC = rozpuszczalny w wodzie dikarbonylodiimid, chlorowodorek 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu

TBAF = fluorek tetrabutyloamoniowy DBAD = azodikarboksylan di-tert-butylu DCC = dicykloheksylokarbodiimid katalizator Wilkinsona = RhCl(PPh3)3 ADDP = 1,1-[azodikarbonylo]dipiperydyna DMA = dimetyloacetamid DME = 1,2-dimetoksyetan

BOP = heksafluorofosforan benzotriazol-1-iloksytris(dimetyloamino)fosfonowy

PL 206 962 B1

P r z y k ł a d 1

1,1 -Ditlenek (3aa,4a,7a,7aa)-2-(3-chloro-4-fluorofenylo)-3a,4,7,7a-tetrahydro-4,7-metano-

A. 2-(3-Chloro-4-fluorofenylo)-1,1-diokso-1,2-dihydro-1λ⁶-izotiazol-3-on (1A)

Do roztworu 2-(3-chloro-4-fluorofenylo)izotiazol-3-onu (0, 399 g, 1,74 mmola, product dostępny w handlu) w chlorku metylenu (30 ml), utrzymywanego w temperaturze 0°C, dodano mCPBA (mieszanina 60%, 1,50 g, 5,21 mmoli). Mieszaninę reakcyjną ogrzano następnie do temperatury 25°C. Po 2 godzinach dodano w trakcie energicznego mieszania nasycony roztwór NaHCO3 (25 ml). Po 30 minutach, mieszaninę reakcyjną ekstrahowano chlorkiem metylenu (3 x 30 ml), po czym połączone warstwy organiczne osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i zatężono pod próżnią. Surową substancję oczyszczono metodą chromatografii szybkosprawnej na żelu krzemionkowym, stosując elucję chlorkiem metylenu. Otrzymano 0,296 g związku 1A w postaci sproszkowanej substancji stałej koloru białego.

HPLC: 97% przy 3,217 min (czas retencji) (kolumna YMC S5 ODS 4,6 x 50 mm, elucja przez 4 minuty 10%-90% wodnym roztworem metanolu zawierającym 0,2% kwasu fosforowego, objętościowe natężenie przepływu - 4 ml/min, monitoring przy 220 nm).

B. 1,1-Ditlenek (3aa,4a,7a,7aa)-2-(3-chloro-4-fluorofenylo)-3a,4,7,7a-tetrahydro-4,7-metano-1,2-benzoizotiazol-3(2H)-onu (1B)

Do roztworu związku 1A (0,050 g, 0,192 mmola) w chlorku metylenu (3,0 ml), utrzymywanego w temperaturze 0°C, dodano świeżo krakowany cyklopentadien (0,025 g, 0,383 mmola). Mieszaninę reakcyjną ogrzano następnie do temperatury 25°C. Po 20 minutach, mieszaninę reakcyjną zatężono pod próżnią i następnie oczyszczono metodą preparatywnej TLC na żelu krzemionkowym, stosując elucję 3% roztworem octanu etylu w chlorku metylenu. Otrzymano 0,056 g związku 1B, w postaci substancji stałej koloru żółtego.

HPLC: 100% przy 3,497 min (czas retencji) (kolumna YMC S5 ODS 4,6 x 50 mm, elucja przez 4 minuty 90% wodnym roztworem metanolu zawierającym 0,2% kwasu fosforowego, objętościowe natężenie przepływu - 4 ml/min, monitoring przy 220 nm).

MS (ES): m/z 360, 66 [M+Na]⁺.

P r z y k ł a d 2 (3aa,4a,7a,7aa)-Oktahydro-3-hydroksy-2-[4-nitro-3-(trifluorometylo)fenylo-4,7-metano-1 H-izoindol-1-on (2)

Do roztworu (3aa,4a,7a,7aa)-heksahydro-2-[4-nitro-3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-metano-1 H-izoindolo-1,3(2H)-dionu (0,100 g, 0,282 mmola, wytworzonego w sposób opisany w głoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer seryjny 60/271,672) w mieszaninie THF/metanol

PL 206 962 B1 (2,0 ml/1,0 ml), utrzymywanego w temperaturze 0°C, dodano NaBH4 (0,011 g, 282 mmola), po czym mieszaninę reakcyjną ogrzano powoli do temperatury 25°C. Po 1 godzinie, mieszaninę reakcyjną zgaszono wodą i ekstrahowano chlorkiem metylenu (3 x 30 ml). Położone warstwy organiczne osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i następnie zatężono pod próżnią, otrzymując 0,096 g związku 2 w postaci substancji stałej koloru białego. Surowa substancja wymagała dodatkowego oczyszczenia.

HPLC: 96% przy 3,847 min (czas retencji) (kolumna YMC S5 ODS 4,6 X 50 mm, elucja przez 4 minuty 10%-90% wodnym roztworem metanolu zawierającym 0,2% kwasu fosforowego, objętociowe natężenie przepływu - 4 ml/min, monitoring przy 220 nm).

MS (ES): m/z 357,06 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 3 (3aa,4a,7a,7aa)-Oktahydro-2-[4-nitro-3-(trifluorometylo)fenylo-4,7-metano-1H-izoindol-1-on (3)

Do roztworu związku 2 (0,050 g, 0,14 mmola) w chlorku metylenu (3,0 ml), utrzymywanego w temperaturze 0°C, dodano TFA (0,150 ml) i trietylosilan (0,150 ml), po czym mieszaninę reakcyjną ogrzano powoli do temperatury 25°C. Po 1 godzinie mieszaninę reakcyjną zatężono pod próżnią i oczyszczono metodą preparatywnej TLC na żelu krzemionkowym, stosując elucję chlorkiem metylenu. Otrzymano 0,040 g związku 3 w postaci substancji stałej koloru białego.

HPLC: 95% przy 4,060 min (czas retencji) (kolumna YMC S5 ODS 4,6 x 50 mm, elucja przez 4 minuty 10%-90% wodnym roztworem metanolu zawierającym 0,2% kwasu fosforowego, objętościowe natężenie przepływu - 4 ml/min, monitoring przy 220 nm).

MS (ES): m/z 341,15 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 4 (3aa,4a,7a,7aa)2,3,3a,4,7,7a-Heksahydro-3-hydroksy-2-[4-nitro-3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-metano-1H-izoindol-1-on (4)

Do roztworu NaBH4 (54 mg, 1,42 mmola, 1 równoważnik) w THF (8 ml) i metanolu (4 ml), utrzymywanego w temperaturze 0°C, dodano roztwór (3aa,4a,7a,7aa)-3a,4,7,7a-tetrahydro-2-[4-nitro-3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-metano-1H-izoindolo-1,3(2H)-dionu (500 mg, 1,42 mmola, 1 równoważnik, wytworzonego w sposób opisany w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer seryjny 60/271,672) w THF (2 ml). Po 10 minutach mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury pokojowej i następnie mieszano przez 2 godziny. Mieszaninę reakcyjną zgaszono przez ostrożne dodanie wody (4 ml) i ekstrahowano przy użyciu CH2CI2 (3 x 10 ml). Połączone warstwy organiczne przemyto solanką (1 x 25 ml) i osuszono nad Na2SO4, otrzymując związek 4 (480 mg, 1,36 mmola, 95,5%) w postaci substancji stałej koloru żółtego.

HPLC, warunki: 90% przy 3,61 min (kolumna YMC 5u Ballistic C18 4,6 x 50 mm, elucja gradientowa przez 4 minuty 10%-90% wodnym roztworem metanolu zawierającym 0,1% TFA, detekcja przy 220 nm).

MS (ES): m/z 528,41 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 5 (3aa,4a,7a,7aa)-2-[4-Bromo-3-(trifluorometylo)fenylo]-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-3-metoksy-4,7-metano-1H-izoindol-1-on (5)

PL 206 962 B1

Br (3aa,4a,7a,7aa)-2-[4-Bromo-3-(trifluorometylo)fenylo]-3a,4,7,7a-tetrahydro-4,7-metano-1H-izoindolo-1,3(2H)-dion (0,200 g, 0,52 mmola, wytworzony w sposób opisany w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer seryjny 60/271,672) rozpuszczono w mieszaninie metanol/THF (2 ml/4 ml) i schłodzono do temperatury 0°C. Następnie dodano w jednej porcji NaBH4 i po 10 minutach mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury 25°C, po czym mieszano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i z kolei dodano 12 N roztwór HCl (0,050 ml). Po 1 godzinie, mieszaninę reakcyjną zgaszono nasyconym, wodnym roztworem NaHCO3 (20 ml) i następnie ekstrahowano chlorkiem metylenu (2 x 50 ml). Warstwy organiczne osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i następnie zatężono pod próżnią, otrzymując 0,202 g związku 5, w postaci substancji stałej koloru białego.

HPLC: 91,5% przy 4,140 min (czas retencji) (kolumna YMC S5 ODS 4,6 x 50 mm, elucja przez 4 minuty 10%-90% wodnym roztworem metanolu zawierającym 0,2% kwasu fosforowego, objęrościowe natężenie przepływu - 4 ml/min, monitoring przy 220 nm).

MS (ES): m/z 403,07 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 6 (3aa,4a,7a,7aa)-Oktahydro-2-[4-nitro-3-(trifluorometylo)-fenylo]-3-(2-propenylo)-4,7-metano-1H-izoindol-1-on (6)

•CF.

Sporządzono zawiesinę związku 2 (0,100 g, 0,28 mmola) w chlorku metylenu (3,0 ml), po czym schłodzono do temperatury 0°C. Następnie dodano BF₃Ht₂O (0,103 ml, 0,843 mmola) i po 10 minutach mieszania dodano allilotrimetylosilan (0,053 ml, 0,336 mmola). Po 1 godzinie mieszaninę reakcyjną zgaszono nasyconym, wodnym roztworem NaHCO3 (20 ml) i następnie ekstrahowano chlorkiem metylenu (3 x 30 ml). Warstwy organiczne suszono nad bezwodnym siarczanem sodu i następnie zatężono pod próżnią. Surową substancję oczyszczono metodą preparatywnej TLC na żelu krzemionkowym, stosując elucję chlorkiem metylenu, otrzymując 0,029 g związku 6, w postaci oleju koloru żółtego.

HPLC: 95% przy 4,230 min (czas retencji) (kolumna YMC S5 ODS 4,6 x 50 mm, elucja przez 4 minuty 10%-90% wodnym roztworem metanolu zawierającym 0,2% kwasu fosforowego, objętościowe natężenie przepływu - 4 ml/min, monitoring przy 220 m).

MS (ES): m/z 381,16 [M+H] ⁺.

P r z y k ł a d 7 (3aa,4p,7p,7aa)-Oktahydro-3-hydroksy-2-(4-nitro-1 -naftalenylo)-4,7-epoksy-1 H-izoindol1-on (7)

HO

PL 206 962 B1

Do roztworu NaBH4 (56 mg, 1,48 mmola, 1 równoważnik), w mieszaninie THF/metanol użytej w stosunku 2:1 (15 ml), utrzymywanej w temperaturze 0°C, dodano roztwór (3aa,4e,7e,7aa)-heksahydro-2-(4-nitro-1-naftalenylo)-4,7-epoksy-1H-izoindolo-1,3(2H)-dionu (500 mg, 1,48 mmola, wytworzony w sposób opisany w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer seryjny 09/885,381) w THF (4,0 ml). Mieszanie kontynuowano w temperaturze 0°C przez 10 minut, po czym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną wlano do wody (20 ml) i ekstrahowano przy użyciu CH2CI2 (2 x 15 ml). Połączone warstwy organiczne przemyto solanką (1 x 30 ml), osuszono nad MgSO4 i zatężono pod obniżonym ciśnieniem, po oczyszczeniu metodą chromatografii szybkosprawnej na żelu krzemionkowym, z zastosowaniem elucji mieszaniną 20% acetonu w CH2CI2, otrzymano 192,4 mg związku 7 w postaci substancji stałej koloru żółtego.

HPLC, warunki: 96% przy 1,29 min (kolumna YMC S5 TurboPack Pro 4,6 x 33 mm, elucja gradientowa przez 2 minuty 10%-90% wodnym roztworem metanolu zawierającym 0,1% TFA, objętościowe natężenie przepływu - 4 ml/min, monitoring przy 220 nm).

MS (ES): m/z 341,0 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 8 (3aa,4p,7p,7aa)-Oktahydro-2-(4-nitro-1 -naftalenylo)-4,7-epoksy-1 H-izoindol-1-on (8)

Do roztworu związku 7 (162 mg, 0,48 mmola,1 równoważnik) w CH2CI2 (5 ml), utrzymywanego w temperaturze 0°C, dodano trietylosilan (1,25 ml) i następnie dodano TFA (1,25 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny i następnie wprowadzono do nasyconego roztworu NaHCO3, po czym ekstrahowano przy użyciu CH2CI2 (2 x 10 ml). Połączone warstwy organiczne osuszono nad Na2SO4 i zatężono pod obniżonym ciśnieniem, otrzymując 152 mg (99%) związku 8, w postaci substancji stałej koloru pomarańczowego.

HPLC: 99% przy 3,28 min (kolumna YMC 5u Ballistic C18 4,6 x 50 mm, elucja przez 4 minuty 10%-90% wodnym roztworem metanolu zawierającym 0,1% TFA, objętościowe natężenie przepływu - 4 ml/min, monitoring przy 220 nm).

MS (ES): m/z 325,14 [M+H] ⁺.

P r z y k ł a d 9 (3aa,4a,7a,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-Heksahydro-3-hydroksy-2-[3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-etano-1H-izoindol-1-on (9)

(3aa,4a,7a,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-Tetrahydro-2-[3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-etano-1H-izoindol-1,3(2H)-dion (0,30 g, 0,93 mmola, wytworzony w sposób opisany w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer seryjny 60/271,672, które to zgłoszenie zamieszcza się w niniejszym opisie jako referencję) rozpuszczono w THF (5 ml) i metanolu (2,5 ml), po czym schłodzono do temperatury 0°C. Dodano NaBH4 (0,035 g, 0,93 mmola) i następnie mieszaninę reakcyjną mieszano przez 10 minut w temperaturze 0°C, po czym ogrzano do temperatury 22°C i utrzymywano w tej temperaturze przez 2 godziny. Dodano wodę i następnie warstwę wodną ekstrahowano przy użyciu CH2CI2 (3 x 30 ml). Warstwy organiczne przemyto solanką i osuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po zatężeniu otrzymano 255 mg wymienionego w tytule związku 9 w postaci substancji stałej koloru białego.

PL 206 962 B1

HPLC, warunki: 98% przy 3,20 min (kolumna YMC S5 ODS 4,6 x 50 mm, elucja przez 4 minuty 10%-90% wodnym roztworem etanolu zawierającym 0,2% H3PO4, monitoring przy 220 nm).

MS (ES): m/z 324,19 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 10 (3aa,4a,7a,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-Heksahydro-2-[3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-etano-1H-izoindol-1-on (10)

(3aa,4a,7a,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-Heksahydro-3-hydroksy-2-[3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-etano-1H-izoindol-1-on (0,025 mg, 0,70 mmola, wytworzony w sposób opisany w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer seryjny 60/271,672, które to zgłoszenie zamieszcza się w niniejszym opisie jako referencję) rozpuszczono w CH2CI2 (30 ml), po czym dodano TFA (0,20 ml, 2,80 mmola) i (C2H5)3SiH (0,45 ml, 2,8 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 5 godzin w temperaturze pokojowej, utrzymując w atmosferze azotu. Dodano nasycony roztwór NaHCO3 (30 ml), po czym mieszaninę reakcyjną ekstrahowano przy użyciu CH2CI2. Warstwę organiczną oddzielono i następnie połączone warstwy organiczne przemyto solanką osuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Rozpuszczalnik odparowano i otrzymany olej oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, stosując elucję mieszaniną zawierającą 1% metanolu w CH2CI2. Otrzymano 197 mg wymienionego w tytule związku 10, w postaci substancji stałej koloru stałego.

HPLC, warunki: 98% przy 3,62 min (czas retencji) (kolumna YMC S5 ODS 4,6 x 50 mm, elucja gradientowa przez 4 minuty 10%-90% wodnym roztworem metanolu zawierającym 0,2% kwasu fosforowego, objętościowe natężenie przepływu - 4 ml/min, monitoring przy 220 nm).

MS (ES): m/z 308,21 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 11 (3aa,4a,7a,7aa)-Oktahydro-3a-hydroksy-2-[4-nitro-3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-etano-3H-indazol-3-on (11G)

A. Kwas bicyklo[2.2.2]okta-2,5-dieno-2-karboksylowy (11A)

Związek 11A wytworzono stosując procedurę Pitha J. i innych, opisaną w J. Med. Chem., 32, strony 96-100 (1989). mieszaninę cykloheksadienu (3,90 g, 48,6 mmola) i kwasu propiolowego (2,35 g, 33,5 mmola, 1 równoważnik) mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 tydzień. Po oczyszczeniu metodą chromatografii szybkosprawnej na żelu krzemionkowym, z zastosowaniem elucji mieszaniną 2% metanolu w CH2CI2, otrzymano 2,07 g (41%) związku 11A w postaci substancji stałej koloru żółtego.

B. Kwas bicyklo[2.2.2]okt-2-eno-2-karboksylowy (11B)

PL 206 962 B1

Związek 11A (600 mg, 3,99 mmoła) rozpuszczono w octanie etyłu (5 ml), następnie dodano 5% Pd/C (12 mg), po czym mieszaninę mieszano przez 5 godzin w atmosferze wodoru z balonu. Mieszaninę reakcyjną przefiltrowano przez warstwę jelitu i natężono pod obniżonym ciśnieniem, otrzymując 600 mg związku 11B w postaci oleju koloru żółtego. Nie było potrzeby dodatkowego oczyszczania.

HPLC, warunki: 95% przy 2,65 min (kolumna YMC S5 ODS 4,6 x 50 mm, elucja gradientowa przez 4 minuty 10%-90% wodnym roztworem metanolu zawierającym 0,2% kwasu fosforowego, detekcja przy 220 nm).

C. Chlorek bicyklo[2.2.2]okt-2-eno-2-karbonylu (11C)

Do roztworu związku 11B (600 mg, 3,95 mmola, 1 równoważnik) w CH2CI2 (8 ml), zawierającego jedną kroplę DMF, dodano chlorek oksalilu (2,0 M w CH2CI2, 2,4 ml, 4,8 mmola, 1,2 równoważnika). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 3 godziny w temperaturze pokojowej i następnie zatężono pod obniżonym ciśnieniem, otrzymując 680 mg związku 11C, który użyto w następnym etapie bez dodatkowego oczyszczania.

D. (4-Nitro-3-trifluorometylofenylo)amid kwasu bicyklo[2.2.2]okt-2-eno-2-karboksylowego (11D)

Do mieszaniny NaH (60% w oleju mineralnym, 105 mg, 2,63 mmola, 1 równoważnik) w THF (2 ml) dodano 4-nitro-3-trifluoroanilinę (542 mg, 2,63 mmola, 1 równoważnik). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i następnie dodano roztwór związku 11C (447 mg, 2,63 mmola, 1 równoważnik) w THF (4 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez okres nocy w temperaturze pokojowej, po czym ostrożnie dodano wodę (5 ml) i ekstrahowano przy użyciu CH2CI2 (2 x 20 ml). Połączone warstwy organiczne przemyto solanką (1 x 25 ml), osuszono nad Na2SO4 i zatężono pod obniżonym ciśnieniem. Po oczyszczeniu metodą chromatografii szybkosprawnej na żelu krzemionkowym, z zastosowaniem elucji mieszaniną zawierającą 30% octanu etylu w heksanie, otrzymano 360 mg (1,06 mmola, 40,3%) związku 11D.

E. (4-Nitro-3-trifluorometylofenylo)amid kwasu 3-oksatricyklo[3.2.2.0^2,4]nonano-2-karboksylowego (11E)

Do roztworu związku 11D (340 mg, 1,0 mmola, 1,0 równoważnik) w CH2CI2 (20 ml) dodano mCPBA (60% mieszanina, 518 ng, 3,00 mmola, 3 równoważniki). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez okres nocy i następnie rozcieńczono chlorkiem metylenu (40 ml). Roztwór organiczny przemyto nasyconym roztworem NaHCO3 (1 x 50 ml), następnie solanką (1 x 50 ml), osuszono nad Na2SO4 i zatężono pod obniżonym ciśnieniem. Po oczyszczeniu metodą chromatografii szybkosprawnej na żelu krzemionkowym, z zastosowaniem elucji przy użyciu mieszaniny zawierającej 80% CH2CI2 w heksanie, otrzymano 205 mg (0,58 mmola, 57,6%) związku 11E.

HPLC, warunki: 95% przy 3,70 min (kolumna YMC S5 ODS 4,6 x 50 mm, elucja gradientowa przez 4 minuty 10%-90% wodnym roztworem metanolu zawierającym 0,2% kwasu fosforowego, detekcja przy 220 nm).

F. N-(4-Nitro-3-trifluorometylofenylo)hydrazyd kwasu 3-oksatricyklo[3.2.2.0^2,4]nonano-2-karboksylowego (11F)

PL 206 962 B1

Do roztworu związku 11E (50 mg, 0,14 mmola, 1 równoważnik) w DMF (3 ml) dodano NaH (60% w oleju mineralnym, 7,9 mg, 0,20 mmola, 1,4 równoważnika). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 godziny w temperaturze 70°C. Mieszaninę reakcyjną schłodzono do temperatury pokojowej i dodano difenylofosfinylohydroksyloaminę (52 mg, 0,22 mmola, 1,6 równoważnika, wytworzonego zgodnie z procedurą Colvina E.W. i innych, opisaną w Tetrahedron Lett., 23, strony 3835-6 1982)). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez okres nocy w temperaturze pokojowej i następnie reakcję zgaszono przez dodanie wody (3 ml), po czym ekstrahowano octanem etylu (2 x 20 ml). Połączone fazy organiczne przemyto wodą (25 ml), osuszono nad Na2SO4 i zatężono pod obniżonym ciśnieniem. Po oczyszczeniu metodą chromatografii szybkosprawnej na żelu krzemionkowym, z zastosowaniem elucji przy użyciu mieszaniny zawierającej 10% octanu etylu w CH2CI2, otrzymano 8,0 mg (0,022 mola, 15,4%) związku 11F, w postaci substancji stałej koloru żółtego.

HPLC, warunki: 93% przy 3,54 min (kolumna YMC S5 ODS 4,6 x 50 mm, elucja gradientowa przez 4 minuty 10%-90% wodnym roztworem metanolu zawierającym 0,2% kwasu fosforowego, detekcja przy 220 nm).

G. (3aa,4a,7a,7aa)-Oktahydro-3a-hydroksy-2-[4-nitro-3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-etano-3H-indazol-3-on (11G)

Roztwór związku 11F (8,0 mg, 0,022 mmola) w etanolu (1 ml) ogrzewano przez okres nocy w temperaturze 65°C. Rozpuszczalnik usunięto pod obniżonym ciśnieniem, otrzymując związek 11G (7,2 mg, 0,019 mmola, 90%).

HPLC, warunki: 97% przy 3,54 min (kolumna YMC S5 ODS 4,6 x 50 mm, elucja gradientowa przez 4 minuty 10%-90% wodnym roztworem metanolu zawierającym 0,2% kwasu fosforowego, detekcja przy 220 nm).

MS (ES): m/z 369,9 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 12 (1a3aa,4a,7a,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-Heksahydro-2-(4-nitro-1 -naftalenylo)-3-okso-4,7-metano-1H-izoindolo-1-karbonitryl (12B) to.

A. (1a3aa,4a,7a,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-Heksahydro-3-hydroksy-2-(4-nitro-1-naftalenylo)-4,7-metano-1H-izoindol-1-on (12A) (3aa,4a,7a,7aa)-3a,4,7,7a-Tetrahydro-2-(4-nitro-1-naftalenylo)-4,7-metano-1H-izoindolo-1,3(2H)-dion (1,00 g, 2,99 mmola, wytworzony w sposób opisany w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer seryjny 60/271,672) rozpuszczono w mieszaninie THF/metanol (15 ml/15 ml), po czym roztwór schłodzono do temperatury 0°C. Następnie dodano borowodorek sodu (0,113 g, 2,99 mmola), po czym mieszaninę reakcyjną ogrzano powoli do temperatury 25°C. Po 4 godzinach, reakcję zgaszono wodą (20 ml) i ekstrahowano chlorkiem etylenu (3 x 50 ml). Połączone fazy orga48

PL 206 962 B1 niczne osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i zatężono pod próżnią, otrzymując 0,895 g związku 12A, w postaci substancji stałej koloru pomarańczowego. Ten związek wzięto do dalszych prac bez oczyszczania.

B. (3aa,4a,7a,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-Heksahydro-2-(4-nitro-1-naftalenylo)-3-okso-4,7-metano-1H-izoindolo-1-karbonitryl (12B)

Związek 12A (0,140 g, 0,417 mmola) rozpuszczono w chlorku metylenu (4,0 ml) i schłodzono do temperatury -78°C. Następnie dodano BF₃^Et₂O (0,153 ml, 1,25 mmola), po czym dodano cyjanotrimetylosilan (0,167 ml, 1,25 mmola). Mieszaninę reakcyjną ogrzano powoli do temperatury 25°C. Po 2 godzinach, reakcję zgaszono nasyconym, wodnym roztworem NaHCO3 (30 ml) i następnie ekstrahowano chlorkiem metylenu (3 x 30 ml). Połączone fazy organiczne osuszono nad siarczanem sodu i następnie zatężono pod próżnią. Surowy produkt oczyszczono metodą preparatywnej TLC na żelu krzemionkowym, stosując elucję mieszaniną zawierającą 10% acetonu w chloroformie, otrzymano 0,093 g związku 12B, w postaci substancji stałej koloru białego.

HPLC: 98% przy 2,747 min (czas retencji) (kolumna YMC S5 ODS 4,6 x 50 mm, elucja gradientowa przez 4 minuty 10%-90% wodnym roztworem metanolu zawierającym 0,2% kwasu fosforowego, objętościowe natężenie przepływu - 4 ml/min, monitoring przy 220 nm).

MS (ES): m/z 346,17 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 13 (3aa,4p,7p,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-Heksahydro-3-hydroksy-4,7-diinetylo-2-[3-(trifluorometylo)fenylo-4,7-epoksy-1H-izoindol-1-on (13B)

A. (3aa,4p,7p,7aa)-3a,4,7,7a-Tetrahydro-4,7-dimetylo-2-[3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-epoksy-1H-izoindolo-1,3 (2H)-dion; oraz (3aa,4a,7a,7aa)-3a,4,7,7a-Tetrahydro-4,7-dimetylo-2-[3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-epoksy-1H-izoindolo-1,3(2H)-dion (13Ai oraz 13Aii)

2,5-Dimetylofuran (0,32 ml, 2,6 mmola) i 1-[3-(trifluorometylo)fenylo] 1H-pirolo-2,5-dion (0,50 g,

2,5 mola) rozpuszczono w dichlorometanie (2,0 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 16 godzin w temperaturze 22°C i następnie usunięto rozpuszczalnik pod próżnią. Surową substancję oczyszczono metodą chromatografii szybkosprawnej na żelu krzemionkowym, stosując elucję mieszaniną zawierającą 0,5% metanolu w CH2CI2. Otrzymano 50 mg związku 13Aii w postaci substancji stałej koloru białego i 250 mg związku 13Ai w postaci substancji stałej koloru białego.

HPLC: 95% przy 3,05 min (kolumna YMC S5 ODS 4,6 x 50 mm, elucja gradientowa przez 4 minuty 10%-90% wodnym roztworem metanolu zawierającym 0,2% kwasu fosforowego, detekcja przy 20 nm).

MS (ES): m/z 340,19 [M+H]⁺.

B. (3aa,4p,7p,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-Heksahydro-3-hydroksy-4,7-dimetylo-2-[3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-epoksy-1H-izoindol-1-on (13B)

Związek 13Ai (150 mg, 0, 442 mmola) rozpuszczono w THF (2 ml) i metanolu (1 ml), po czym schłodzono do temperatury 0°C. Dodano NaBH4 (18,5 mg, 0,487 mmola), po czym mieszaninę reakPL 206 962 B1 cyjną mieszano przez 10 minut w temperaturze 0°C i następnie ogrzano do temperatury 22°C i utrzymywano w tej temperaturze przez 2 godziny. Następnie dodano wodę, po czym warstwę wodną ekstrahowano dichlorometanem (3 x 10 ml). Warstwy organiczne przemyto solanką i osuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po zatężeniu otrzymano 145 mg związku 13B, w postaci substancji stałej koloru białego.

HPLC, warunki: 97% przy 2,78 min (kolumna YMC S5 ODS 4,6 x 50 mm, elucja gradientowa przez 4 minuty 10%-90% wodnym roztworem metanolu zawierającym 0,2% kwasu fosforowego, detekcja przy 220 nm).

MS (ES) m/z 342,19 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 14 (3aa,4e,7p,7aa)-Oktahydro-3-hydroksy-4,7-dimetylo-2-[3-(tnfluorometylo)fenylo]-4,7-epoksy-1H-izoindol-1-on (14)

Związek 13B (100 mg, 0,293 mmola) rozpuszczono w mieszaninie etanol/octan etylu (2 ml/2 ml) i dodano 10% Pd/C (70 g). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 16 godzin w temperaturze pokojowej, utrzymując w atmosferze wodoru z balonu i następnie przefiltrowano przez celit. Po zatężeniu otrzymano 97 mg związku 14, w postaci substancji stałej koloru białego.

HPLC, warunki: 97% przy 2,78 min (kolumna YMC S5 ODS 4,6 x 50 mm, elucja gradientowa przez 4 minuty 10%-90% wodnym roztworem metanolu zawierającym 0,2% kwasu fosforowego, detekcja przy 220 nm).

MS (ES): m/z 344,21 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d y od 15 do 30

Stosując procedury analogiczne do tych które opisano powyżej, wytworzono dodatkowe związki według obecnego wynalazku. W tabeli 1 zamieszczono wykaz związków z przykładów od 15 do 30, podając budowę związków, ich nazwę, czas retencji, masę cząsteczkową i stosowaną procedurę. Nie wyznaczano absolutnej konfiguracji dla poszczególnych związków i wszystkie związki chiralne wytworzono w postaci racematów.

Zastosowano następujące metody chromatograficzne do oznaczania czasów retencji związków z tabeli 1:

LCMS: kolumna YMC S5 ODS 4,6 x 50 mm, elucja przez 4 minuty 10%-90% wodnym roztworem metanolu zawierającym 0,1% TFA, objętościowe natężenie przepływu 4 ml/min, monitoring przy 220 nm;

LCMS*: kolumna YMC S5 ODS 4,6 x 50 mm, elucja przez 2 minuty 10%-90% wodnym roztworem metanolu zawierającym 0,1% TFA, objętościowe natężenie przepływu 4 ml/min, monitoring przy 220 nm;

LC: kolumna YMC S5 ODS 4,6 x 50 mm, elucja przez 4 minuty 10%-90% wodnym roztworem metanolu zawierającym 0,2% kwasu fosforowego, objętościowe natężenie przepływu 4 ml/min, monitoring przy 220 nm;

Masę cząsteczkową związków zamieszczonych w tabeli 1 oznaczono metodą Ms(ES) i podano jako m/z.

PL 206 962 B1

Numer przy- kładu	Wzór strukturalny	Nazwa związku	Czas Retencji [min]	Procedura według przykładu
15	H	o	Ester etylowy kwasu (3aa,4α,7a, 7aa)-4- (2,3,3a,4,7,7a- -Heksahydro-1,1- -dioksydo-3-okso-4,7-methano-l,2- benzoi zotiazol-2- -ilo)benzoesowego	3,427 LC	1
16	Z		1,1-Ditlenek (3aa, 4a, 7a, 7aor) -2- -(3-chloro-2- -fluorofenylo)- -3a,4,7,7a- tetrahydro-4,7- -metano-1,2- benzoi zotia zol- -3(2Ή)-onu	3,37 LC	1
17	l		1,1-Ditlenek (3aa,4α,7a,7aa)- -3a,4,7,7a- -tetrahydro-2- -(2,3,4-trifluoro- fenylo)-4,7- -metano-1,2- benzoizotiazol- -3 (277) -onu	3,41 LC	1
18	i	% uy	(3aa,4α,7a,7aa)-2- -(1,2-Dihydro-4-metylo-2-okso-7-chinolinylo)- -2,3,3a,4,7,7a- -hexahydro-3- -metoksy-4,7- -metano-lH- -izoindol-l-on	2,95 i 3,20 atropo- izomery LC (M+H)+ 337,33	5

PL 206 962 B1 ciąg dalszy Tabeli 1

19	£		(3aa, 4α, 7a, 7aa) - Oktahydro-3- -metoksy-2-(1- -naftalenylo)-4,7- -metano-lH- -i zoindol-l-on	4,19 LC (M+H)+ 307,99	5
20	£-	yr XX.	(3aa,4a,7a, 7aa)-2-[4-Brcmo-3-(trifluorometylo)fenylo]-2 f 3 , 3a f 4 ,Ί ,7 a -heksahydro-4,7- -metano-lH- -izoindol-l-on	3,75 LC (M+H)+ 372,25	3
21			(3aoe, 4α, 7a, 7 aot) - -Oktahydro-2-(1- -naftalenylo)-4,7- -metano-lH- -izoindol-l-on	3,87 LC (M+H)+ 278,25	3
22			(3aa, 4οί, 7a, 7aa) -2- -(1,2-Dihydro-4- -metylo-2-okso-7- -chinolinylo)- -2,3,3a,4,7,7a- -heksahydro-4,7- -inetano-lif— izoindol-l-on	3,41 LC [M+H] + 307,25	3
23	Z	V Cl	(3aa,4α,7a,7aa)-2- -(3,5-Dichloro- fenylo)- -2,3,3a,4,7,7a- -heksahydro-4,7- -metano-lfl- -izoindol-l-on	4,30 LC	3

PL 206 962 B1 ciąg dalszy Tabeli 1

24	3	33	(3aa,4ot,7a,7aa)-2- -(4-Bramo-1- -naftalenylo)- -2,3,3a,4,7,7a- -heksahydro-4,7- -metano-l#- -izoindol-l-on	4,14 LC	3
u	Br
25						(3aa,4α,la,7aa)-2-	3,82	2
						-[4-Bromo-3-	LC
			7Ύ			-(trifluoro-
				xCF3	metylo)fenylo]-
			/ I	3	Br	-2,3,3a,4,7,7a- -heksahydro-3- -hydroksy-4,1- -metano-lif- -izoindol-l-on
26						(3ac<, 4α,7α, 7aa)-	3,86	3
						-2,3,3a,4,7,7a-	LC
	/L	-X.	?T			-Heksahydro-2-
	H*	Ά	33	^cf3	-[4-nitro-3-
				T		-(trifluoro-
				\3-	^°2	metylo)fenylo]- -4,7-metano-lJf- -izoindol-l-on
27						(3aa,4a,la,7aa)-2-	3,67	2
			\ f .			[4-Bremo-3-	LC
		£				-(trifluoro-
				33	/Ci,3	metylo)fenylo]-
			HO		Dr	-2,3,3a,4,7,7a-
						-heksahydro-3- -hydroksy-5metylo-4,7-metano- -lff-izoindol-1-on
28						(3aa,4a,la, 7aa)-	3,43	11
		k	--./HzP			-Oktahydro-3a-	LC
	£		7ύ			-hydroksy-2-[3-
		H*		r33	xcf3	-(trifluoro-
			H	O		metylo)fenylo]- -4,7-etano-3H- -indazol-3-on

PL 206 962 B1 ciąg dalszy Tabeli 1

29		α	^cf3 >ΙΟ2	(Ια, 3aa, 4α, 7α, 7aa) - -2,3,3a,4,7,7a- -Heksahydro-2- -[4-nitro-3- -(trifluorametylo)fenylo]-3-okso-4,7- -methano-l/f- -izoindolo-1- -karbonitryl	3,17 LC	12
30					(3aa,4α,7a,7aa)-	3,16	3
		\ /			-2,3,3a,4,7,7a-	LC
		V/		ll	-Heksahydro-2-
			ά	Η ^νο2	-(4-nitro-l- -naftalenylo)-4,7- -methano-lif- -izoindol-l-on

Zastrzeżenia patentowe

Claims (7)

Zastrzeżenia patentowe

1,1-ditlenek (3aa,4a,7a,7aa)-3a,4,7,7a-tetrahydro-2-(2,3,4-trifluorofenylo)-4,7-metano-1,2-benzoizotiazol-3 (2H)-onu.

1,1-ditlenek (3aa,4a,7a,7aa)-2-(3-chloro-2-fluorofenylo)-3a,4,7,7a-tetrahydro-4,7-metano-1,2-benzoizotiazol-3(2H)-onu; oraz

1, 1 -ditlenek (3aa,4a,7a,7aa)-2-(3-chloro-4-fluorofenylo)-3a,4,7,7a-tetrahydro-4,7-metano-1,2-benzoizotiazol-3(2H)-onu (1B);

ester etylowy kwasu (3aa,4a,7a,7aa)-4-(2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-1,1-dioksydo-3-okso-4,7-metano-1,2-benzoizotiazol-2-ilo)benzoesowego;

1. Związek heterocykliczny o budowie skondensowanej o wzorze (I) albo jego sól w którym symbole mają następujące znaczenia i są, w przypadku występowania każdego z nich, wybrane niezależnie

G oznacza aryl wybrany spośród grupy fenylowej lub naftalenylowej lub grupę heterocykliczną, którą jest pierścień chinolinylowy, przy czym wspomniana grupa arylowa lub heterocykliczna jest ewentualnie podstawiona na jednej lub wielu pozycjach przez atom wodoru, C1-6alkil lub podstawiony C1-6alkil, atom fluorowca, -CN, R¹OC=O, R¹HNC=O, grupę nitrową, R¹OCH2-, R¹O-, -NH2, -NR⁴R⁵, -SR¹ lub grupę okso;

Z oznacza O;

E oznacza grupę o wzorze S(O)_n, N-R⁷, C=CR¹⁰R^10' lub CR⁷R^7';

M oznacza grupę o wzorze C-Q 2 lub N;

A1 oznacza Cr⁷;

A2 oznacza Cr⁷;

Y oznacza CR⁷R^7';

W oznacza CR⁷R^7'- CR⁷R^7' lub CR⁸=CR⁸';

₁

Q1 oznacza atom wodoru, C1-6alkil lub podstawiony C1-6alkil, atom fluorowca, -R¹O, -NH2 lub -NR⁴R⁵;

₁

Q2 oznacza atom wodoru, C1-6alkil lub podstawiony C1-6alkil, atom fluorowca, -R¹O, - NH2 lub - NR⁴R⁵;

L oznacza wią zanie;

R¹ oznacza atom wodoru, C1-6alkil lub podstawiony C1-6alkil;

PL 206 962 B1

R⁴ oznacza atom wodoru, C1-6alkil lub podstawiony C1-6alkil;

R⁵ oznacza atom wodoru, C1-6alkil lub podstawiony C1-6alkil;

każdy z podstawników R⁷ and R^7' niezależnie od siebie oznacza atom wodoru, C1-6alkil lub podstawiony C1-6alkil;

każdy z podstawników R⁸ and R^8' niezależnie od siebie oznacza atom wodoru, C1-6alkil lub podstawiony C1-6alkil;

10 10' 1 1 każdy z podstawników R¹⁰ and R^10' niezależnie od siebie oznacza atom wodoru, R¹, COOR¹,

CONR¹R², Cl, F, Br, I, CN, OR¹, R¹C=O, SO2OR¹ lub SO2NR¹R^1';

przy czym wspomniany podstawiony C1-6alkil jest podstawiony przez jeden lub wiele podstawników wybranych z grupy obejmującej atom fluorowca, C1-6alkoksyl, grupę C1-6-alkilotio, hydroksyl, -COOH i - NH2;

z tym zastrzeżeniem, ż e gdy M oznacza grupę o wzorze C-Q2, to E oznacza grupę o wzorze N-R⁷, w którym R⁷ ma wyżej podane znaczenie; lub grupę o wzorze S(O)n, w którym n oznacza 1 lub 2; i gdy M oznacza N, to E oznacza grupę o wzorze C=CR¹⁰R^10', w którym R¹⁰ i R¹⁰' mają wyżej podane znaczenie; lub oznacza grupę o wzorze CR⁷R^7', przy czym w przypadku tego związku każdy podstawnik R⁷ i R^7' ma wyżej podane znaczenie oraz dodatkowo oznacza C3alkenyl, CN lub grupę o wzorze OR¹, w którym R¹ ma wy ż ej podane znaczenie.

2. Związek według zastrz. 1, o wzorze (la) w którym G, Z, n, A1, A2, Y, W, Q 1, Q 2, L, mają znaczenie okreś lone w zastrz. 1.

3. Związek według zastrz. 1, o wzorze (Ib) w którym G, Z, A1, A2, Y, W, Q1, Q2, L, mają znaczenie określone w zastrz. 1.

PL 206 962 B1

3. Związek według zastrz. 2, o wzorze (la) wybrany z grupy obejmującej:

4. Związek według zastrz. 3, o wzorze (Ib) wybrany grupy obejmującej:

(3aa,4a,7a,7aa)-oktahydro-3a-hydroksy-2-[4-nitro-3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-etano-3H-indazol-3-on (11G) oraz (3aa,4a,7a,7aa)-oktahydro-3a-hydroksy-2-[3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-etano-3H-indazol-3-on.

5. Związek według zastrz. 1, o wzorze (Ic) w którym G, Z, A1, A2, Y, W, Q1, Q2, L, mają znaczenie określone w zastrz. 1, a E oznacza grupę o wzorze C=CR¹⁰R^10', wktórym R¹⁰ i R^10' mają znaczenie określone w zastrz. 1.

6. Związek według zastrz. 1, o wzorze (Id) w którym G, Z, A1, A2, Y, W, Q1, Q2, L, mają znaczenie określone w zastrz. 1, a E oznacza grupę o wzorze CR⁷R^7', w którym R⁷ i R^7' mają znaczenie okreśłone w zastrz. 1.

7. Związek według zastrz. 6, o wzorze (Id) wybranyz grupy obejmującej: (3aa,4a,7a,7aa)-oktahydro-3-hydroksy-2-[4-nitro-3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-metano-1H-izoindol-1-on (2);

(3aa,4a,7a,7aa)-oktahydro-2-[4-nitro-3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-metano-1H-izoindol-1-on (3); (3aa,4a,7a,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-3-hydroksy-2-[4-nitro-3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-metano-1H-izoindol-1-on (4);

(3aa,4a,7a,7aa)-2-[4-bromo-3-(trifluorometylo)fenylo]-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-3-metoksy-4,7-metano-1H-izoindol-1-on (5);

(3aa,4a,7a,7aa)-oktahydro-2-[4-nitro-3-(trifluorometylo)fenylo]-3-(2-propenylo)-4,7-metano-1H-izoindol-1-on (6);

(3aa,4e,7e,7aa)-oktahydro-3-hydroksy-2-(4-nitro-1-naftalenylo)-4,7-epoksy-1H-izoindol-1-on (7); (3aa,4e,7e,7aa)-oktahydro-2-(4-nitro-1-naftalenylo)-4,7-epoksy-1H-izoindol-1-on (8); (3aa,4a,7a,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-3-hydroksy-2-[3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-etano-1H-izoindol-1-on (9);

(3aa,4a,7a,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-2-[3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-etano-1H-izoindol-1-on (10);

(1a,3aa,4a,7a,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-2-(4-nitro-1-naftalenylo)-3-okso-4,7-metano-1H-izoindolo-1-karbonitryl (12B);

(3aa,4e,7e,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-3-hydroksy-4,7-dimetylo-2-[3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-epoksy-1H-izoindol-1-on (13B);

(3aa,4e,7e,7aa)-oktahydro-3-hydroksy-4,7-dimetylo-2-[3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-epoksy-1H-izoindol-1-on (14);

(3aa,4a,7a,7aa)-2-(1,2-dihydro-4-metylo-2-okso-7-chinolinylo)-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-3-metoksy-4,7-metano-1H-izoindol-1-on;

(3aa,4a,7a,7aa)-oktahydro-3-metoksy-2-(1-naftalenylo)-4,7-metano-1H-izoindol-1-on;

PL 206 962 B1 (3aa,4a,7a,7aa)-2-[4-bromo-3-(trifluorometylo)fenylo]-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-4,7-metano-1H-izoindol-1-on;

(3aa,4a,7a,7aa)-oktahydro-2-(1-naftalenylo)-4,7-metano-1H-izoindol-1-on;

(3aa,4a,7a,7aa)-2-(1,2-dihydro-4-metylo-2-okso-7-chinolinylo)-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-4,7-metano-1H-izoindol-1-on;

(3aa,4a,7a,7aa)-2-(3,5-dichlorofenylo)-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-4,7-metano-1H-izoindol-1-on;

(3aa,4a,7a,7aa)-2-(4-bromo-1-naftalenylo)-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-4,7-metano-1H-izoindol-1-on;

(3aa,4a,7a,7aa)-2-[4-bromo-3-(trifluorometylo)fenylo]-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-3-hydroksy-4,7-metano-1H-izoindol-1-on;

(3aa,4a,7a,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-2-[4-nitro-3-(trifluorometylo)fenylo]-4,7-metano-1H-izoindol-1-on;

(3aa,4a,7a,7aa)-2-[4-bromo-3-(trifluorometylo)fenylo]-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-3-hydroksy-5-metylo-4,7-metano-1H-izoindol-1-on;

(1a,3aa,4a,7a,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-2-[4-nitro-3-(trifluorometylo)fenylo]-3-okso-4,7-metano-1H-izoindolo-1-karbonitryl; oraz (3aa,4a,7a,7aa)-2,3,3a,4,7,7a-heksahydro-2-(4-nitro-1-naftalenylo)-4,7-metano-1H-izoindol-1-on.