PL206319B1 - Szczep Pseudomonas, sposób wytwarzania roztworu do obróbki roślin i/lub materiału siewnego, roztwór zawierający szczep Pseudomonas, proszek zawierający szczep Pseudomonas i zastosowanie szczepu Pseudomonas - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest szczep Pseudomonas, sposób wytwarzania roztworu do obróbki roślin i/lub materiału siewnego, roztwór zawierający szczep Pseudomonas, proszek zawierający szczep Pseudomonas i zastosowanie szczepu Pseudomonas.

Z niemieckiego opisu patentowego nr DE 197 39 364 A2 jest już znany sposób wzmacniania i ochrony roś lin, w którym stosuje się drobnoustroje z rodzaju Pseudomonas.

W znanym sposobie co najmniej jeden induktor odpornoś ci razem z uż ytecznym drobnoustrojem wprowadza się do pożywki dla roślin albo do nasion roślinnych, przy czym induktor odporności i drobnoustrój mają uzupełniający się wpływ na roślinę.

Jako przykład użytecznego drobnoustroju wymienia się szczep Pseudomonae sp. Ps1 w rodzaju Pseudomonas fluorescens, który jest złożony w DSMZ.

W tym dokumencie opisuje się dalej sposób, w jaki tego rodzaju uż yteczny drobnoustrój moż na wydzielić z gleby i korzeni. W tym sposobie szereg rozcieńczonych roztworów z gleby i korzeni rozkłada się na płytkach, poddaje inkubacji i bada na fluoryzujące kolonie, z którymi następnie prowadzi się odsiewanie względem szkodliwych grzybów. Znaleziony znanym sposobem szczep bada się następnie, jak dalece można go łączyć z induktorami odporności. W ten sposób znaleziono szczep Pseudomonae sp. PS1.

Próby zgłaszającego niniejszy wynalazek wykazały jednak, że obróbka opisana w wymienionym na wstępie dokumencie nie jest jeszcze zadowalająca, co między innymi sprowadza się do tego, że razem z opisanym drobnoustrojem muszą być stosowane kosztowne induktory odporności, przy czym okazało się ponadto, że działanie ochronne często nie jest zadowalające.

Z amerykańskiego opisu patentowego nr US 2932128 jest znany sposób obróbki materiału siewnego, w którym materiał siewny zwilża się roztworem zawierającym bakterie, a następnie poddaje działaniu zmniejszonego ciśnienia w celu nasycenia materiału siewnego.

Na tym tle u podstaw niniejszego wynalazku leży zadanie opracowania nowych roztworów i sposobu oraz nowego drobnoustroju do obróbki materiału siewnego i ewentualnie roślin.

Zgodnie z wynalazkiem to zadanie rozwiązano z jednej strony w zasadzie za pomocą szczepu Pseudomonas z oznaczeniem Proradix, który zgodnie z umową budapeszteńską został złożony w dniu 03.11.1999 roku pod numerem akcesyjnym Pseudomonas sp. PRORADIX - DSM 13134 w DSMZ, 38124 Braunschweig.

Przedmiotem wynalazku jest szczep Pseudomonas z oznaczeniem Proradix, który zgodnie z umową budapeszteń ską został zł o ż ony w dniu 03.11.1999 pod numerem akcesyjnym PRORADIX DSM 13134 w DSMZ, 38124 Braunschweig.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania roztworu do obróbki roślin i/lub materiału siewnego, obejmujący etapy:

a) dostarczenia szczepu Pseudomonas według zastrz. 1,

b) dostarczenia medium odżywczego, które zawiera związki fosforu i azotu oraz kwas bursztynowy,

c) zaszczepiania medium odżywczego tym szczepem Pseudomonas i

d) inkubacji medium odżywczego w temperaturze 26-32°C z wytrząsaniem w ciągu co najmniej 50 godzin.

Korzystnie medium odżywcze zawiera K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, MgSO4 i kwas bursztynowy.

Korzystnie medium odżywcze zawiera glukozę.

Korzystnie medium odżywcze zawiera 6,0 g K2HPO4, 3,0 g KH2PO4, 1,0 g (NH4)2SO4, 0,2 g MgSO4 i 4,0 g kwasu bursztynowego w 1000 ml odmineralizowanej wody.

Korzystnie medium odżywcze zawiera 6,0 g K2HPO4, 3,0 g KH2PO4, 1,5 g (NH4)2SO4, 0,2 g MgSO4, 2,0 g glukozy i 4,0 g kwasu bursztynowego w 1000 ml odmineralizowanej wody.

Korzystnie roztwór po inkubacji suszy się pod zmniejszonym ciśnieniem dla wytworzenia proszku zawierającego szczep Psueudomonas określony powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest roztwór zawierający szczep Psueudomonas określony powyżej i medium odżywcze, w którym zawarte są związki fosforowe i azotowe.

Przedmiotem wynalazku jest proszek zawierający szczep Psueudomonas określony powyżej wytworzony sposobem opisanym powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie szczepu Pseudomonas Proradix określonego powyżej do zwilżania roślin i/lub materiału siewnego roztworem zawierającym ten szczep.

Korzystnie a) zwilża się materiał siewny/rośliny roztworem opisanym powyżej,

PL 206 319 B1

b) przykłada się zmniejszone ciśnienie do tak zwilżonego materiału siewnego/tak zwilżonych roślin i

c) znosi się zmniejszone ciśnienie.

Korzystnie

a) rozpuszcza się opisany powyżej proszek w wodzie i

b) spryskuje się względnie zwilża się przez zanurzenie materiału siewnego/rośliny ziemniaka albo polewa się młode rośliny roztworem z etapu a).

Wynalazca wynalazku według niniejszego zgłoszenia wydzielił szczep Pseudomonas Proradix, który po zbadaniu w DSMZ stanowi prawdopodobnie nowy gatunek wewnątrz grupy RNA I Pseudomonadaceae. Ostateczne zaszeregowanie Proradix nie mogło jednak nastąpić, ponieważ istnieje stosunkowo nieznaczne podobieństwo sekwencji do prawomocnie opisanych odmian z rodzaju Pseudomonas.

Próby polowe z gatunkiem Proradix wykazały, że chodzi przy tym o użyteczną bakterię, która zasiedla korzenie roślin użytkowych i stąd kieruje swoje działanie na roślinę. Przy tym okazało się, że jedno zastosowanie wystarcza na okresy wegetacji oraz że można zrezygnować z dodatkowych induktorów odporności.

Proradix można stosować w kompozycji jako ciekłą zaprawę albo jako proszek i nadaje się on do obróbki nasion jarzyn, a zwłaszcza sałaty polowej i marchwi, nasion roślin trawnikowych i nasion drzew. Dalej stosować go można przy nasionach roślin do zielonego nawożenia w celu biologicznego polepszenia gleby i odkażenia oraz do zaprawiania i do obróbki zanurzeniowej ziemniaków. Przy wszystkich tych zastosowaniach Proradix zapewnia lepszą jakość w porównaniu z nie poddanym obróbce grupom kontrolnym oraz częściowo także w porównaniu z fungicydami chemicznymi.

Zadanie postawione przed wynalazkiem rozwiązano ponadto drogą opracowania sposobu wytwarzania roztworu do obróbki roślin i/lub materiału siewnego, który obejmuje etapy:

a) dostarczenia wydzielonych użytecznych bakterii, zwłaszcza z rodzaju Pseudomonas,

b) dostarczenia medium odżywczego, w którym są zawarte związki fosforowe i azotowe oraz kwas bursztynowy,

c) zaszczepiania medium odżywczego wydzielonymi bakteriami oraz

d) inkubacji medium odżywczego w temperaturze około 26-32°C z lekkim wytrząsaniem w ciągu co najmniej 50 godzin.

Wynalazca rozpoznał, że w ten sposób wytworzony roztwór prowadzi do kondycjonowania użytecznych bakterii, które przyczynia się do lepszego działania ochronnego w przypadku potraktowanych nim roślin/potraktowanego nim materiału siewnego. To kondycjonowanie polega według tymczasowej oceny wynalazcy na indukowaniu tworzenia się egzopolisacharydów przez produkty rozkładu kwasu bursztynowego. Egzopolisacharydy są substancją ochronną, która tworzy śluz, dzięki któremu bakterie mogą szczególnie dobrze gromadzić się na materiale siewnym/roślinach.

Szczególnie korzystne jest przy tym, gdy medium do hodowli bakterii zawiera K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, MgSO4 i kwas bursztynowy, przy czym szczególnie korzystnie zawiera ono około 6,0 g K2HPO4, około 3,0 g KH2PO4, około 1,0 g (NH4)2SO4, około 0,2 g MgSO4 i około 4,0 g kwasu bursztynowego w około 1000 ml dejonizowanej H2O.

Wynalazca rozpoznał, że w tym medium tworzą się szczególnie szybko egzopolisacharydy, przy czym gęstość komórek do obróbki materiału siewnego w przypadku roztworu wytworzonego tym sposobem nie jest w takim stopniu decydująca jak już wspomniane kondycjonowanie.

Z drugiej strony jest korzystne, gdy medium odżywcze zawiera glukozę, przy czym zawiera ono korzystnie około 6,0 g K2HPO4, około 3,0 g KH2PO4, około 1,5 g (NH4)2SO4, około 0,2 g MgSO4, około 2,0 g glukozy i około 4 g kwasu bursztynowego w około 1000 ml dejonizowanej wody.

Przy takim składzie medium odżywczego można uzyskać większą gęstość komórek, ponieważ źródło węgla występuje w większym stężeniu. Wynalazca rozpoznał jednak, że tylko na skutek glukozy w medium odżywczym szybko pojawiałaby się kwaśna wartość pH, która nie pozwala na dalszą hodowlę. Dlatego jako źródło węgla wybiera się mieszaninę glukozy i kwasu bursztynowego, w związku z czym przemianie podlega najpierw glukoza, przez co tworzy się wysoka gęstość komórek ale niższa wartość pH. Po zużyciu glukozy przemianie ulega kwas bursztynowy, przez co wzrasta wartość pH, tak że ma miejsce przeżywanie bakterii, ale ich wolniejszy wzrost. Prowadzi to do już wspomnianego tworzenia się egzopolisacharydów z towarzyszącym lepszym działaniem drobnoustrojów znajdujących się w tego rodzaju roztworze.

Szczególnie korzystne jest przy tym oczywiście, gdy stosuje się wydzielone bakterie gatunku Proradix.

PL 206 319 B1

Przedmiotem wynalazku jest ponadto roztwór wytworzony już opisanym sposobem.

Z drugiej strony jest takż e mo ż liwe suszenie roztworu pod zmniejszonym ciś nieniem, co jest korzystne zwłaszcza wtedy, gdy medium odżywcze zawiera glukozę, w związku z czym otrzymany proszek ma wysoką gęstość bakterii. Taki proszek daje się następnie przy stosowaniu polowym rozpuszczać w wodzie, przy czym tak potraktowaną wodę można wtedy stosować do opylania materiału siewnego, ziemniaków, itp.

W związku z tym przedmiotem niniejszego wynalazku jest także w ten sposób wytworzony proszek.

Zgłaszający niniejszy wynalazek rozpoznał mianowicie, że bakterie z gatunku Proradix kondycjonowane w roztworze nadają się do próżniowej obróbki materiału siewnego i prowadzą do doskonałych wyników ochronnych.

Przedmiotem wynalazku jest zatem zastosowanie szczepu Pseudomonas Proradix do zwilżania roślin i/lub materiału siewnego roztworem zawierającym ten szczep.

W szczególności materiał siewny rośliny zwilżony takim roztworem poddaje się czasowo działaniu zmniejszonego ciśnienia.

Korzystne zastosowanie szczepu Pseudomonas Proradix jest takie, że materiał siewny/rośliny opyla się czyli spryskuje się roztworem proszku zawierającego ten szczep w wodzie. Także i to zastosowanie, prowadzi do skutecznej ochrony potraktowanych roślin.

Dalsze zalety wynalazku wynikają z następującego opisu przykładów hodowli i zastosowania nowego sposobu oraz gatunku Proradix.

Rozumie się, że wymienione wyżej i wyjaśniane dalej cechy można wykorzystać nie tylko w podanych kombinacjach, lecz takż e i w innych kombinacjach albo samodzielnie, bez wychodzenia poza ramy niniejszego wynalazku.

P r z y k ł a d 1: Wydzielanie gatunku Proradix

Próbki gleby i korzeni poddano namywaniu i w szeregu rozcieńczeń rozłożono na selektywnym medium, tak że otrzymywano pojedyncze kolonie. Kolonie fluoryzujące wykorzystywano do przesiewania in vitro, w którym więcej niż 500 wydzielonych produktów bakteryjnych testowano pod względem hamowania wzrostu grzybów chorobotwórczych, a zwłaszcza grzyba glebowego Rhizoctonia. Interesujących przedstawicieli wybierano i badano na roślinach, a na koniec w próbie polowej.

W tych próbach zgłaszający niniejszy wynalazek wydzielił gatunek Proradix (DSM 13134) z rodzaju Pseudomonas, który zgodnie z identyfikacją DSMZ jest nowym gatunkiem w ramach grupy RNA I Pseudomonadaceae. Ostateczne zaklasyfikowanie nie mogło jednak nastąpić, ponieważ istnieje tylko stosunkowo nieznaczne podobieństwo sekwencji do prawomocnie opisanych odmian, przy czym chodzi jednak bez wątpienia o fluoryzującego przedstawiciela grupy RNA I Pseudomonad.

P r z y k ł a d 2: Hodowla wydzielonych bakterii

a) W celu obróbki materiału siewnego wydzielone pseudomonady, korzystnie z gatunku Proradix, wszczepiono do następującego medium odżywczego:

K2HPO4 6,0 g

KH2PO4 3,0 g (NH4)2SO4 1,0 g

MgSO4 0,2 g kwas bursztynowy 4,0 g i dopeł niono do 1000 ml dejonizowaną wodą .

Zaszczepione medium odżywcze poddaje się inkubacji w temperaturze 28°C i przy 100 obrotach na minutę w ciągu 72 godzin, przy czym tworzy się wtedy ciekła zaprawa,

b) W celu wytworzenia kompozycji proszkowej produkt wydzielenia Pseudomonad, korzystnie z gatunku Proradix, hoduje się w następującym medium odż ywczym:

K2HPO4 6,0 g

KH2PO4 3,0 g (NH4)2SO4 1,5 g

MgSO4 0,2 g glukoza 2,0 g kwas bursztynowy 4,0 g dopełnionym do 1000 ml dejonizowaną wodą.

Tak zaszczepione medium odżywcze poddaje się inkubacji w temperaturze 28-30°C przy 100 obrotach na minutę w zależności od siły materiału inokulacyjnego w ciągu 65-70 godzin.

PL 206 319 B1

Na koniec roztwór przeprowadza się w proszek w suszarce próżniowej. Substancje pomocnicze kompozycji: chude mleko w proszku i guma arabska.

c) Dzięki obydwóm mediom odżywczym indukuje się tworzenie egzopolisacharydów, przy czym w medium odż ywczym opisanym w punkcie a) to tworzenie odbywa się bardzo szybko, a gę stość komórek nie jest tu decydująca, ponieważ w przypadku obróbki materiału siewnego nie wymaga się wielkich ilości bakterii.

W przypadku medium opisanego w punkcie b) konieczna jest jednak wysoka gę stość komórek, przy czym pomimo tego powinno stosować się tworzenie egzopolisacharydów. Osiąga się to za pomocą mieszaniny glukozy i kwasu bursztynowego. Najpierw przemianie ulega glukoza, co prowadzi do obniżenia wartości pH i jednak do wysokiej gęstości komórek. Po zużyciu glukozy zużywa się kwas bursztynowy jako źródło węgla, przy czym jego produkty rozkładu prowadzą do wzrostu wartości pH i do tworzenia się egzopolisacharydów.

P r z y k ł a d 3: Obróbka materiału siewnego za pomocą Proradix

Możliwość obróbki polega na rozpuszczaniu w wodzie proszku wytworzonego zgodnie z przykładem 2b) i spryskiwaniu uzyskanym roztworem materiału siewnego względnie młodych roślin przed wysadzeniem.

Dalej możliwe jest także rozpylanie roztworu wytworzonego z medium odżywczym opisanym w przykładzie 2a) bezpośrednio na materiał siewny/rośliny przed ich wysadzeniem. Gdy poddany obróbce materiał siewny ma być jeszcze w międzyczasie magazynowany, to zwilża się go początkowo roztworem opisanym w przykładzie 2a), a następnie wprowadza do zamykanej komory, w której wytwarza się następnie przejściowo zmniejszone ciśnienie.

W ten sposób bakterie wnikają do materiału siewnego i mogą rozwijać swoje działanie ochronne także po dłuższym przechowywaniu.

P r z y k ł a d 4: Obróbka młodych roślin sałaty odmiany Garunda

Przed wysadzeniem młodych roślin odmiany Garunda na pole, które mają być wysadzone na 1 hektarze gruntu uprawnego, wylewa się 50 ml Proradix (10⁷ cfu/ml) na roślinę (zgodnie z przykładem 2b).

Po zebraniu tylko 50% roślin nie nadawało się do handlu, podczas gdy w przypadku próby kontrolnej nie poddanej obróbce 70% zebranych roślin nie miało wartości handlowej.

W przypadku przeprowadzonej dla porównania obróbki za pomocą chemicznych fungicydów Switsch (NOVARTIS) (0,8 kg/ha) i Risolex (Spiess Urania) (3 l/ha) 58% względnie 48% roślin nie miało wartości handlowej.

Ten wynik wskazuje, że sałata dzięki obróbce za pomocą Proradix staje się wyraźnie mniej podatna na porażenie czarną zgnilizną, przy czym wyniki są przynajmniej tak samo dobre, jak przy obróbce fungicydami chemicznymi.

P r z y k ł a d 5: Obróbka ziemniaków

Proradix przygotowuje się w preparacie w postaci proszku, jak opisano w przykładzie 2b), a proszek rozpuszcza się w wodzie w sposób następujący:

g proszku w 80 l wody na jeden ha roślin ziemniaka g proszku = 4 x 10¹² cfu

Za pomocą tego roztworu bulwy ziemniaków spryskuje się maszynowo, a bezpośrednio po tym układa. Alternatywnie bulwy ziemniaków opyla się bezpośrednio proszkiem.

Próby porównawcze pomiędzy ziemniakami nie poddanymi obróbce (próba kontrolna), poddanymi obróbce za pomocą Proradix i poddanymi obróbce za pomocą FZB24 (Bayer Leverkusen, podstawa: Bacillus subtilis) dały w przybliżeniu takie same zbiory towaru rynkowego z hektara. Ocena jakości wykazała jednak przy obróbce za pomocą Proradix niezawodną ochronę przed plamistością brunatną (porażenie przez Rhizoctonia), około 45% zebranych ziemniaków nie było porażone, a dalsze 45% było lekko porażone. W grupie kontrolnej odpowiednie liczby wynosiły 10% i 50%, a przy FZB24 - 25% i 50%.

Także i tu widoczna jest wyższość Proradix w porównaniu z konwencjonalnymi środkami do ochrony roślin.

P r z y k ł a d 6: Obróbka marchwi

Materiał siewny marchwi zwilżano, jak opisano w przykładzie 3, zaprawą Proradix, według przykładu 2a, poddawano obróbce pod zmniejszonym ciśnieniem (infiltracja w materiał siewny), tymczasowo przechowywano i wysiewano.

PL 206 319 B1

Zebraną marchew przechowywano w ciągu 4 miesięcy w temperaturze 4°C, a następnie, jak to zwykle bywa przy sprzedaży, przechowywano w ciągu dwóch tygodni w temperaturze pokojowej, a na koniec poddawano ocenie jakości.

Ocena jakości wykazała w przypadku odmiany Nerac 50% marchwi bez braków (nie poddana obróbce próba kontrolna: 18%) i 27% nieużytecznej marchwi (próba kontrolna: 58%). W przypadku odmiany Mocum liczby wynosiły 36% (próba kontrolna: 14%) względnie 46% (próba kontrolna: 54%).

Obróbka marchwi za pomocą Proradix prowadzi zatem do wyraźnego zwiększenia jakości zbiorów.

Podsumowując można więc stwierdzić, że do obróbki roślin i/lub materiału siewnego przygotowuje się wydzielone użyteczne bakterie, z rodzaju Pseudomonas, gatunku Proradix, i poddaje inkubacji w medium odżywczym, które zawiera związki fosforu i azotu oraz kwas bursztynowy. Roztwór można stosować bezpośrednio do zwilżania roślin i/lub materiału siewnego, przy czym można dołączyć jeszcze ewentualnie obróbkę pod zmniejszonym ciśnieniem. Roztwór można ponadto suszyć pod zmniejszonym ciśnieniem, przy czym proszek przed użyciem rozpuszcza się w wodzie.

Claims (12)

1. Szczep Pseudomonas z oznaczeniem Proradix, który zgodnie z umową budapeszteńską został złożony w dniu 03.11.1999 pod numerem akcesyjnym PRORADIX - DSM 13134 w DSMZ, 38124 Braunschweig.

2. Sposób wytwarzania roztworu do obróbki roś lin i/lub materiału siewnego, obejmują cy etapy:

a) dostarczenia szczepu Pseudomonas według zastrz. 1,

b) dostarczenia medium odżywczego, które zawiera związki fosforu i azotu oraz kwas bursztynowy,

c) zaszczepiania medium odżywczego tym szczepem Pseudomonas i

d) inkubacji medium odżywczego w temperaturze 26-32°C z wytrząsaniem w ciągu co najmniej

50 godzin.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że medium odżywcze zawiera K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, MgSO4 i kwas bursztynowy.

4. Sposób według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że medium odżywcze zawiera glukozę.

5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że medium odżywcze zawiera 6,0 g K2HPO4, 3,0 g

KH2PO4, 1,0 g (NH4)2SO4, 0,2 g MgSO4 i 4,0 g kwasu bursztynowego w 1000 ml odmineralizowanej wody.

6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że medium odżywcze zawiera 6,0 g K2HPO4, 3,0 g

KH2PO4, 1,5 g (NH4)2SO4, 0,2 g MgSO4, 2,0 g glukozy i 4,0 g kwasu bursztynowego w 1000 ml odmineralizowanej wody.

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że roztwór po inkubacji suszy się pod zmniejszonym ciśnieniem dla wytworzenia proszku zawierającego szczep Psueudomonas określony w zastrz. 1.

8. Roztwór zawierający szczep Psueudomonas określony w zastrz. 1 i medium odż ywcze, w którym zawarte są związki fosforowe i azotowe.

9. Proszek zawierający szczep Psueudomonas okreś lony w zastrz. 1 wytworzony sposobem według zastrz. 7.

10. Zastosowanie szczepu Pseudomonas Proradix określonego w zastrz. 1 do zwilżania roślin i/lub materiału siewnego roztworem zawierającym ten szczep.

11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że

a) zwilża się materiał siewny/rośliny roztworem według zastrz. 8,

b) przykłada się zmniejszone ciśnienie do tak zwilżonego materiału siewnego/tak zwilżonych roślin i

c) znosi się zmniejszone ciśnienie.

12. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że

a) rozpuszcza się proszek według zastrz. 9 w wodzie i

b) spryskuje się względnie zwilża się przez zanurzenie materiał siewny/rośliny ziemniaka albo polewa się młode rośliny roztworem z etapu a).