PL205102B1

PL205102B1 - Sposób fermentacji tlenowej

Info

Publication number: PL205102B1
Application number: PL360821A
Authority: PL
Inventors: Van Den Pieter Marinus Broecke; Deodorus Jacobus Groen; Hendrik Jan Noorman
Original assignee: Dsm Nv
Priority date: 2000-10-19
Filing date: 2001-09-26
Publication date: 2010-03-31
Also published as: BR0114597B1; AU2002210518A1; CN1469922A; HUP0301440A2; EP1341898A1; DE60142521D1; EP1341898B1; HUP0301440A3; WO2002033048A1; CN1238489C; MXPA03003400A; PL360821A1; US7309599B2; US20040023359A1; HU230026B1; ES2350971T3; ATE473270T1; CA2424758C; CA2424758A1; PT1341898E

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób hodowli drobnoustroju w warunkach tlenowych w naczyniu do fermentacji.

Procesy fermentacji na skalę przemysłową prowadzi się w celu wytwarzania różnych produktów, takich jak biomasa (na przykład drożdże piekarskie), enzymy, aminokwasy i metabolity wtórne (na przykład antybiotyki). Większość z tych procesów fermentacji obejmuje hodowanie drobnoustrojów, w tym bakterii, drożdży i grzybów, i wymaga dostarczania tlenu do metabolizmu tlenowego tych drobnoustrojów. Tlen dostarcza się zwykle na drodze przepuszczania gazu zawierającego tlen, takiego jak powietrze, przez ciecz w naczyniu fermentacyjnym. Tlen ulega przeniesieniu z pęcherzyków gazu do fazy ciekłej, co umożliwia jego wychwycenie przez drobnoustrój. W procesach fermentacyjnych z dużą objętością naczyń i dużą gęstością biomasy przenoszenie tlenu z gazu do fazy ciekłej może stawać się czynnikiem ograniczającym wzrost. Zwiększenie przenoszenia tlenu jest zatem jednym z kierunków działania w celu uzyskania większego wzrostu, co zwiększa opłacalność tych procesów. Natomiast procesy fermentacyjne wymagające na przykład źródła węgla lub azotu jako czynnika ograniczającego w celu zwiększenia wytwarzania pewnego produktu wymagają takiej prędkości przepływu tlenu, która nie stanowiłaby czynnika ograniczającego wzrost. W tym celu opracowano procesy zwiększające prędkość przenoszenia tlenu. Znane ze stanu techniki sposoby zwiększania prędkości przenoszenia tlenu obejmują: nasilenie mieszania cieczy, zwiększanie przepływu gazu zawierającego tlen i/lub zwiększanie stężenia tlenu w gazie zawierającym tlen (na przykład powietrze wzbogacone tlenem). Opisano inne sposoby, skupiające się na podawaniu dwóch oddzielnych strumieni gazu zawierającego tlen.

W europejskim zgłoszeniu patentowym EP-A-0222529 ujawniono zasadę ulepszonego wzbogacania w tlen brzeczki fermentacyjnej przez zastosowanie drugiego strumienia gazu zawierającego tlen. Układ fermentacyjny składa się z naczynia wyposażonego w przewód wznośny i przewód opadowy; powietrze dostarcza się do pożywki bulionowej w przewodzie wznośnym, natomiast w przewodzie opadowym do pożywki bulionowej podaje się strumień drugiego gazu zawierającego tlen. W japońskim zgłoszeniu patentowym JP-63-283570 ujawniono ten i inne układy fermentacyjne, wyposażone w środki do pobudzania obiegu, takie jak przewód ssący i wirnik napędzany (lub zestaw wirników napędzanych), strumień powietrza w celu pobudzania obiegu i usuwania CO2 i aparat do dostarczania tlenu, dostarczający tlen w kierunku przeciwnym do strumienia płynu krążącego. Wadą tego układu jest to, że obieg cieczy wewnątrz naczynia musi być znany, dostatecznie stabilny i odpowiednio kontrolowany, aby ustawić aparat dostarczający tlen w taki sposób, aby otrzymać pożądany przepływ tlenu. W europejskim zgłoszeniu patentowym EP-A-0341878 ujawniono, że drugi strumień gazu zawierającego tlen można dostarczać do pożywki bulionowej w krążącej pętli poza urządzeniem do fermentacji.

W europejskim zgłoszeniu patentowym EP-A-0477818 ujawniono podobny sposób, obejmujący wtryskiwanie strumienia powietrza do naczynia do mieszania, wyposażonego w wirnik napędzany, posiadający oś pionową, i oddzielne wtryskiwanie dodatkowej ilości tlenu z dodatkowego punktu wtryskiwania tlenu. Ograniczeniem tej metody jest jednak to, że ten drugi punkt wtryskiwania tlenu musi znajdować się w znacznej odległości od punktu wtryskiwania powietrza w celu zmniejszenia do minimum możliwości mieszania się dodatkowego tlenu z pęcherzykami powietrza.

W europejskim zgł oszeniu patentowym EP-A-0829534 tę samą zasadę stosuje się do gazowego układu fermentacyjnego, to znaczy układu bez mechanicznych urządzeń mieszających. W układzie zachodzi wtryskiwanie pierwszego gazu zawierającego tlen, takiego jak powietrze, w postaci grupy pęcherzyków w górę przez naczynie w przepływie heterogennym, powodując przepływ w górę bulionu w naczyniu. Drugi gaz zawierają cy tlen, wtryskiwany w dolnej cz ęści naczynia, jest grupą pę cherzyków także poruszających się do góry przez to naczynie w przepływie homogennym. Autorzy wynalazku definiują przepływ homogenny jako przepływ o jednolitej dystrybucji pęcherzyków gazu i wąskiej dystrybucji wielkości pęcherzyków, w którym nie obserwuje się spływu gaz/ciecz. Homogenny charakter tego drugiego gazu jest cechą zasadniczą. Przeciwnie do ujawnienia w zgłoszeniu JP-62-119690, drugi gaz zawierający tlen nie jest dostarczany do pożywki bulionowej w obrębie naczynia fermentacyjnego w okolicy, w której pożywka bulionowa przepływa w dół, lecz raczej musi on być dostarczany w takiej okolicy, w której wę druje ona w górę .

W europejskim zgłoszeniu patentowym EP-A-0901812 sposób jeszcze bardziej ulepszono poprzez podawanie tlenu bezpośrednio do „stacjonarnego wiru - obracającego się płynu, wykonującego

PL 205 102 B1 tylko bardzo nieznaczne ruchy osiowe lub poprzeczne lub niewykonującego ruchów osiowych lub poprzecznych, prawdopodobnie powstałego wskutek działania układu pobudzenia mechanicznego. Jako zaletę metody opisano możliwość utrzymania pęcherzyków tlenu w obrębie wiru aż do rozpuszczenia pęcherzyków tlenu w mieszaninie reakcyjnej. Jednakże w przypadku naczyń przemysłowych bardzo trudne będzie ustalenie dokładnego położenia tych stacjonarnych okolic. Ponadto w wysoce turbulentnych mieszaninach gazowo-cieczowych, często stosowanych w tej branży, możliwe jest, że wiry wcale nie będą stacjonarne.

Fig. 1. Dystrybucja pęcherzyków o małych rozmiarach dla różnej odległości od urządzenia rozpryskującego

Fig. 2. Dystrybucja pęcherzyków o dużych rozmiarach dla różnej odległości od urządzenia rozpryskującego

Przepływ homogenny według niniejszego wynalazku definiuje się jako przepływ, w którym wszystkie pęcherzyki unoszą się z taką samą prędkością, a kierunek przepływu mieszaniny jest prosty, bez zwrotnego przepływu cieczy. Przepływ homogenny może zachodzić tylko wtedy, gdy otwory urządzenia rozpryskującego są jednolicie rozmieszczone na dnie naczynia, przy powierzchniowej prędkości gazu wynoszącej poniżej około 0,04 m/s.

Przepływ heterogenny według niniejszego wynalazku definiuje się jako przepływ, w którym dochodzi do miejscowych różnic w prędkości cieczy i do zwrotnego przepływu cieczy. Przepływ heterogenny może zachodzić wtedy, gdy otwory urządzenia rozpryskującego są niejednolicie rozmieszczone na dnie naczynia lub przy powierzchniowej prędkości gazu wynoszącej powyżej około 0,04 m/s i przy jednolitym rozmieszczeniu otworów urządzenia rozpryskującego na dnie naczynia.

Ruch chaotyczny pożywki bulionowej według niniejszego wynalazku definiuje się jako ruch cechujący się kierunkiem i prędkością, wykazującą zależność od jego historii i warunków w naczyniu i ograniczoną pewnymi granicami (na przykł ad prę dkość nie moż e nigdy przekroczyć pewnego maksimum). Różni się on od ruchu przypadkowego, który jest wartością statystyczną niezależną od historii i nie ograniczoną ż adnymi granicami (na przykł ad prę dkość moż e być bardzo duż a, choć prawdopodobieństwo tego jest bardzo małe).

Przepływ turbulentny według niniejszego wynalazku definiuje się jako ruch cieczy, w którym różnice pędu pojedynczych elementów cieczy nie mogą być tłumione przez lepkość cieczy. W wyniku tego powstaną krążące wiry, w których różnica lepkości cieczy stanie się bardziej zaznaczona, przy energicznym ruchu cieczy.

Jednolitą dystrybucję wielkości pęcherzyków gazu definiuje się według niniejszego wynalazku jako dystrybucję symetryczną o pojedynczym maksimum.

Niejednolitą dystrybucję wielkości pęcherzyków gazu definiuje się według niniejszego wynalazku jako dystrybucję niesymetryczną (na przykład z wydłużeniem w jedną stronę) lub dystrybucją o wię cej niż jednym maksimum.

Wąską dystrybucję wielkości pęcherzyków gazu definiuje się według niniejszego wynalazku jako taką dystrybucję, w której >95% pęcherzyków ma średnicę pozostającą w granicach od 0,2*0_b do 5*0_b, przy czym 0_b oznacza średnią średnicę pęcherzyka.

Szeroką dystrybucję wielkości pęcherzyków gazu definiuje się według niniejszego wynalazku jako taką dystrybucję, w której >95% pęcherzyków ma średnicę pozostającą w granicach od 0,01* 0_bdo 100* 0_b, przy czym 0_b oznacza średnią średnicę pęcherzyka.

Według niniejszego wynalazku zapewnia się sposób hodowli drobnoustroju w warunkach tlenowych w naczyniu fermentacyjnym, obejmujący wtryskiwanie pierwszego gazu zawierającego tlen do dolnej części naczynia w warunkach przepływu heterogennego, co powoduje ruch chaotyczny pożywki bulionowej, i wprowadzenie drugiego gazu zawierającego tlen do naczynia, przy czym ten drugi gaz zawierający tlen wprowadza się na drodze przepływu heterogennego pęcherzyków gazu w naczyniu we wszystkich możliwych kierunkach, niezależnie od kierunku przepływu pożywki bulionowej, co powoduje powstanie warunków przepływu turbulentnego w miejscu wtryskiwania, w postaci grupy pęcherzyków gazu o niejednolitej wielkości i szerokiej dystrybucji wielkości. Pierwszy gaz zawierający tlen może zawierać od 15 do 30% tlenu (obj./obj.), korzystnie, od 20 do 30% tlenu i najkorzystniej stanowi powietrze. Pierwszy gaz zawierający tlen wtryskuje się do dolnej części naczynia fermentacyjnego, korzystnie, w pobliżu jego dna. Drugi gaz zawierający tlen może zawierać od 30 do 100% tlenu, korzystnie, od 70 do 100% tlenu, najkorzystniej od 90 do 100% tlenu. Punkt wtryskiwania drugiego gazu zawierającego tlen nie jest ograniczony do pewnej okolicy naczynia fermentacyjnego i może znajdować się zarówno w pobliżu jak i w oddali od punktu wtryskiwania pierwszego gazu

PL 205 102 B1 zawierającego tlen, niezależnie od tego, czy naczynie fermentacyjne jest wyposażone w mechaniczne urządzenie mieszające, czy nie. Zaletą sposobu według niniejszego wynalazku jest to, że uzyskuje się ulepszony w porównaniu z metodami znanymi ze stanu techniki przepływ tlenu i unika się wszelkich ograniczeń umiejscowienia wlotu strumienia drugiego gazu zawierającego tlen, co pozwala na większą różnorodność w projektowaniu naczyń fermentacyjnych. Sposób według niniejszego wynalazku nadaje się do hodowli drożdży, grzybów i bakterii. Korzystnymi przykładami drożdży są drożdże z rodzajów Saccharomyces i Kluyveromyces, takie jak Saccharomyces cerevisiae i Kluyveromyces lactis. Korzystnymi przykładami grzybów są grzyby należące do rodzajów wytwarzających metabolity wtórne, takich jak Penicillium (na przykład Penicillium chrysogenum do wytwarzania penicyliny i innych antybiotyków) i Acremonium, i do rodzajów wytwarzających enzymy, takich jak Aspergillus i Trichoderma. Korzystnymi przykładami bakterii są bakterie należące do rodzajów Streptomyces, Escherichia, Pseudomonas i Bacillus.

W korzystnym wykonaniu zapewnia się sposób hodowli drobnoustroju w warunkach tlenowych w naczyniu fermentacyjnym, w którym pożywkę bulionową miesza się mechanicznie. Według innego korzystnego wykonania nie stosuje się mieszania mechanicznego, lecz mieszania pożywki bulionowej dokonuje się z użyciem strumienia pierwszego gazu zawierającego tlen, takiego jak powietrze, to znaczy stosuje się dzwonowy fermentator kolumnowy.

Drugi gaz zawierający tlen można wprowadzać do naczynia fermentacyjnego za pomocą zwykłych rurek lub rozpryskiwaczy gazu, otworów, dysz typu Venturiego, dysz gazowo-cieczowych lub supersonicznych dysz do wtryskiwania gazu. Korzystnie, drugi gaz zawierający tlen wprowadza się przez jedną lub więcej dysz, z których każda zawiera co najmniej jeden otwór. Korzystniej, drugi gaz zawierający tlen wstrzykuje się do naczynia fermentacyjnego w trzech wymiarach. Można to uzyskać poprzez zastosowanie kilku dysz, w których każda zawiera co najmniej jeden otwór, którego dysze są umieszczone w fermentatorze w odpowiedni sposób, aby uzyskać wtryskiwanie w trzech wymiarach. Zamiast tego można stosować jedną lub kilka dysz, zawierających po 3 otwory rozmieszczone tak, aby pozwolić na wtryskiwania w trzech wymiarach.

P r z y k ł a d 1

Powietrze rozpryskiwano przez dyszę umieszczoną w pobliżu dna naczynia szklanego o średnicy 0,6 m, napełnionego 300 litrami 4% roztworu Na2SO4 w wodzie. Roztwór Na2SO4 zastosowano w celu naśladowania koalescencji brzeczki fermentacyjnej i zapewnienia przejrzystości niezbędnej przy stosowanych technikach wykrywania. Dysza zawierała 7 otworów o średnicy 1 mm, z których 6 było równomiernie rozmieszczonych na okręgu o średnicy 32 mm, a jeden umieszczony w środku. Przepływ z dyszy skierowano ku górze. Zatrzymanie gazu i dystrybucję wielkości pęcherzyków mierzono w chmurze gazu w różnych ułożeniach pionowych powyżej rozpryskiwacza. Zatrzymanie gazu mierzono techniką transmisji radioaktywnej z zastosowaniem źródła promieniowania gamma Cs137 i detektora Nal. W tej technice mierzy się całkowitą gęstość mieszaniny gaz-ciecz w strefie detekcyjnej naczynia, co pozwala na obliczenie frakcji gazowej. Dystrybucję wielkości pęcherzyków, wyrażoną jako średnia Sautera d32 oznaczone poprzez analizę obrazu zarejestrowanych na wideo powiększeń optycznych wzorców pęcherzyków (T. Martin - praca doktorska: „Gas dispersion with radial and hydrofoil impellers in fluids with different coalescence characteristics, 1996. Herbert Utz Verlag, Monachium, Niemcy). W tabeli 1 i na fig. 1 i 2 przedstawiono wyniki pomiaru prędkości wylotu z dyszy - wynosiła ona 490 m/s. Obserwowano niejednolitą dystrybucję wielkości pęcherzyków z typowymi szczytami, w przypadku małych w zakresie wynoszącym od 0,2 do 0,3 mm (fig. 1) i w przypadku dużej średnicy w zakresie wynoszącym od 2 do 4 mm (fig. 2) z typowym 1,1% zatrzymaniem dla małych pęcherzyków i 1-3% - dla dużych pęcherzyków.

T a b e l a 1

Położenie pionowe (cm)	Zatrzymanie gazu	Sauter d32
Małe pęcherzyki (%)	Większe pęcherzyki (%)	Małe pęcherzyki (mm)	Większe pęcherzyki (mm)
5	1,1	0,1	0,267	2,273
14	1,1	1,3	0,216	2,630
41	1,1	2,2	0,287	3,587

PL 205 102 B1

P r z y k ł a d 2

Saccharomyces cerevisiae hodowano w fermentatorze kolumny pęcherzykowej, zaopatrzonym w rozpryskiwacz powietrza (tzn. pierwszego gazu zawierającego tlen) w pobliż u dna fermentatora i pę tlę recyrkulacyjną z zewnę trznym wymiennikiem ciepł a do chł odzenia. Prę dkość powierzchniowego przepływu powietrza wynosiła 0,20 m/s, a przepływ tlenu wynosił 0,4-0,6% na metr nienapowietrzonej wysokości pożywki bulionowej. Pożywkę bulionową poddano cyrkulacji przez wymiennik ciepła cztery razy na godzinę. Inne warunki fermentacji były takie, jak opisali Reed, G i Nagodawithana, TW w rozdziale 6 „Yeast technology (1991, Van Nostrand Reinhold, Nowy Jork). Drugi gaz zawierają cy tlen składał się z czystego tlenu i wtryskiwano go poniżej rozpryskiwacza powietrza, wykorzystując dysze działające pod ciśnieniem około 5 barów, o średnicy otworów rzędu 1 mm, w celu uzyskania naddźwiękowych prędkości wtryśnięć tlenu, czego skutkiem była niejednolita dystrybucja pęcherzyków tlenu. Położenie wlotu poniżej rozpryskiwacza tlenu dobraliśmy tak, aby umożliwić przedostawanie się w górę frakcji wię kszych pę cherzyków tlenu (50-70% obj.) i koalescencję z pę cherzykami powietrza oraz umożliwienie frakcji małych pęcherzyków wejścia do recyrkulacji. W ten sposób uzyskano optymalne warunki ciśnienia i czasu przebywania dla osiągnięcia niemal całkowitego wychwytu tlenu (skuteczność 100%), natomiast frakcja dużych pęcherzyków wykazała skuteczność przeniesienia przepływu powietrza. Stosunek przepływu obu gazów (powietrza do tlenu) wynosił 9:1. Produktywność drożdży wynosiła około 8-9 kg biomasy (sucha masa) na kg pożywki bulionowej na godzinę, co jest dwukrotnością produktywności uzyskiwanej bez wtryskiwania drugiego gazu zawierającego tlen. Poniższe wyniki przedstawiono w tabeli 2.

T a b e l a 2

Gaz zawierający O2	Skuteczność przenoszenia O2 (%)	Prędkość przenoszenia O2 (mmol O2 na kg pożywki bulionowej na godzinę)	Względna prędkość przenoszenia O2 (krotność)
1.	Powietrze	20	140	1
2.	Czysty O2 Duże pęcherzyki Małe pęcherzyki	20 100	60 70
Razem	270	1,9

P r z y k ł a d 3

Fermentację prowadzono podobnie do procesu opisanego w przykładzie 2, z tym wyjątkiem, że stosunek przepływu obu gazów (powietrza i tlenu) wynosił 6:1, a produktywność drożdży wynosiła w przybliżeniu 16 kg biomasy (sucha masa) na kilogram po żywki bulionowej na godzinę. Wyniki podano w tabeli 3.

T a b e l a 3

Gaz zawierający O2	Skuteczność przenoszenia O2 (%)	Prędkość przenoszenia O2 (mmol O2 na kg pożywki bulionowej na godzinę)	Względna prędkość przenoszenia O2 (krotność)
1.	Powietrze	15	140	1
2.	Czysty O2 Duże pęcherzyki Małe pęcherzyki	15 100	90 270
Razem	500	3,6

W porównaniu z przykładem 2 zaobserwowano dalsze zwię kszenie prędkości przenoszenia tlenu, co można wyjaśnić tym, że doszło do większego zużycia tlenu w wyniku zwiększenia produktywności drożdży.

P r z y k ł a d 3

Saccharomyces cerevisiae hodowano w fermentatorze zbiornikowym wyposażonym w rozpryskiwacz powietrza umiejscowiony poniżej wirnika napędzanego oraz drugi rozpryskiwacz umiejscowiony w poprzecznym strumieniu przepływu cieczy, generowanym przez dolny wirnik napędzany. Wirnik napędzany zaopatrzony był w tarczę wirnika turbiny. Drugi rozpryskiwacz wyposażony był

PL 205 102 B1 w dysze typu opisanego w przykł adzie 2, i przez ten rozpryskiwacz podawano drugi gaz zawierają cy tlen, złożony z czystego tlenu. Położenie drugiego rozpryskiwacza dobrano tak, aby znalazł się w najsilniej wstrząsanej części cieczy, aby dowieść, że pozytywny efekt tworzenia się pęcherzyków tlenu nie ogranicza się do tych sytuacji, w których znajduje się on w miejscu względnej stagnacji warunków przepływu.

Oprócz fermentacji porównawczej z użyciem samego powietrza przeprowadzono dwa doświadczenia z dodatkową ilością tlenu. W jednej fermentacji strumień powietrza wzbogacono poprzez zastąpienie około 6% powietrza czystym tlenem. W drugiej fermentacji dostarczono tę samą ilość powietrza poprzez bezpośrednie wtryskiwanie przez drugi rozpryskiwacz przy zmniejszeniu przepływu powietrza w pierwszym rozpryskiwaczu do 94%. Stężenie tlenu w fazie ciekłej było kontrolowane przy 20% nasyceniu powietrzem. Wyniki w zakresie prędkości przenoszenia tlenu na zakończenie fermentacji przedstawiono w tabeli 4.

T a b e l a 4

Doświadczenie	Prędkość przenoszenia O2 (mmol O2 na kg bulionu na h)
Porównanie	35
Wzbogacony strumień powietrza	44
Wtryskiwanie bezpośrednie	50

Poprawę prędkości przenoszenia tlenu na skutek użycia wzbogaconego strumienia powietrza można przypisać zwiększeniu siły napędowej z gazu do fazy ciekłej. Zmierzona wartość zwiększenia jest zgodna z oczekiwaniami.

Poprawę uzyskaną w doświadczeniu z bezpośrednim wtryskiwaniem można przypisać skumulowaniu się wpływu przenoszenia przez powietrze z rozpryskiwacza powietrza, frakcji dużych pęcherzyków tlenu z drugiego rozpryskiwacza i frakcji małych pęcherzyków tlenu również z drugiego rozpryskiwacza. Przyjmując, że stosunek dużych do małych pęcherzyków tlenu wynosi 5:1, to udział powietrza, dużych pęcherzyków tlenu i małych pęcherzyków tlenu w całkowitej prędkości przenoszenia tlenu wynosi, odpowiednio, 34, 10 i 6 mmol/kg pożywki bulionowej na godzinę.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób hodowli drobnoustroju w warunkach tlenowych w naczyniu fermentacyjnym, obejmujący wtryskiwanie pierwszego gazu zawierającego tlen do dolnej części naczynia w warunkach przepływu heterogennego, co powoduje ruch chaotyczny pożywki bulionowej, i wprowadzanie drugiego gazu zawierającego tlen do naczynia, znamienny tym, że ten drugi gaz zawierający tlen wprowadza się

- na drodze przepływu heterogennego pęcherzyków gazu w naczyniu we wszystkich możliwych kierunkach, niezależnie od kierunku przepływu pożywki bulionowej, co powoduje powstanie warunków przepływu turbulentnego w miejscu wtryskiwania,

- i w postaci grupy pęcherzyków gazu o niejednolitej wielkości i szerokiej dystrybucji wielkości.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako drobnoustrój stosuje się drożdże, grzyb lub bakterię.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się drożdże z rodzaju Saccharomyces lub Kluyveromyces.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako drożdże stosuje się Saccharomyces cerevisiae.
5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako drożdże stosuje się Kluyveromyces lactis.
6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się grzyb z rodzaju Penicillium, Acremonium, Aspergillus lub Trichoderma.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako grzyb stosuje się Penicillium chrysogenum.
8. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się bakterię z rodzaju Streptomyces, Escherichia, Pseudomonas lub Bacillus.
9. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 8, znamienny tym, że pożywkę bulionową miesza się mechanicznie.

PL 205 102 B1
10. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 9, znamienny tym, że drugi gaz zawierający tlen wprowadza się do naczynia fermentacyjnego przez jedną lub kilka dysz, z których każda zawiera co najmniej jeden otwór.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że dysze są rozmieszczone w naczyniu fermentacyjnym tak, aby uzyskać wtryskiwanie drugiego gazu zawierającego tlen w trzech kierunkach.
12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że otwory są rozmieszczone w dyszach tak, aby uzyskać wtryskiwanie drugiego gazu zawierającego tlen w trzech kierunkach.