ES2350971T3

ES2350971T3 - Procedimiento de fermentación aeróbico.

Info

Publication number: ES2350971T3
Application number: ES01978392T
Authority: ES
Inventors: Deodorus Jacobus Groen; Van Den Pieter Marinus Broecke; Hendrik Jan Noorman
Original assignee: Lesaffre et Cie SA
Current assignee: Lesaffre et Cie SA
Priority date: 2000-10-19
Filing date: 2001-09-26
Publication date: 2011-01-28
Anticipated expiration: 2021-09-26
Also published as: DK1341898T3; EP1341898A1; HUP0301440A2; CA2424758C; US7309599B2; HUP0301440A3; CN1238489C; MXPA03003400A; ATE473270T1; PL205102B1; PT1341898E; CN1469922A; AR035591A1; WO2002033048A1; PL360821A1; AU2002210518A1; HU230026B1; EP1341898B1; US20040023359A1; BR0114597B1

Abstract

Procedimiento de cultivo de un microorganismo en un recipiente de fermentación bajo condiciones aeróbicas que comprende la inyección de un primer gas que contiene oxígeno en la parte inferior del recipiente, con un flujo heterogéneo que provoca un movimiento caótico del caldo, y la introducción de un segundo gas que contiene oxígeno en el recipiente, caracterizado por la introducción del segundo gas que contiene oxígeno como - un flujo heterogéneo de burbujas de gas que se mueven en el recipiente en todas las direcciones posibles, independientemente de la dirección del flujo del caldo, que causa condiciones de flujo turbulento en el sitio de inyección, caracterizado por un movimiento del líquido en el que las diferencias de momento de los elementos líquidos individuales no pueden amortiguarse por la viscosidad del líquido; y como - un conjunto de burbujas de gas, de tamaño no uniforme, y una distribución de tamaño amplia; en el que el punto de inyección del segundo gas que contiene oxígeno no está limitado a una determinada área del recipiente de fermentación, y puede estar tanto en las proximidades como lejos del punto de inyección del primer gas que contiene oxígeno.

Description

Descripción [0001]La presente invención está relacionada con un procedimiento de cultivo de microorganismos, en condiciones aeróbicas, en un recipiente de fermentación. [0002]Se llevan a cabo procedimientos de fermentación a escala industrial para la producción de diversos productos, tales como biomasa (por ejemplo, levadura de panadería), enzimas, aminoácidos y metabolitos secundarios (por ejemplo, antibióticos). La mayor parte de estos procedimientos de fermentación implica el cultivo de microorganismos, incluyendo bacterias, levaduras y hongos, y requieren el suministro de oxígeno para el metabolismo aeróbico de estos microorganismos. Normalmente, el oxígeno se suministra haciendo pasar un gas que contiene oxígeno, tal como aire, a través del líquido en el recipiente de fermentación. El oxígeno se transfiere desde las burbujas de gas a la fase líquida, permitiendo así su captación por el microorganismo. En los procedimientos de fermentación, que implican recipientes de gran volumen y altas densidades de biomasa, la transferencia de oxígeno desde el gas a la fase líquida puede convertirse en el factor limitante del crecimiento. Por lo tanto, la obtención de una mayor transferencia de oxígeno es uno de los objetivos para obtener un mayor crecimiento, haciendo así a estos procedimientos más atractivos económicamente. Alternativamente, los procedimientos de fermentación que requieren, por ejemplo, la fuente de carbono o nitrógeno como el factor limitante para promover la producción de un cierto producto, requieren una velocidad de transferencia de oxígeno no limitante del crecimiento. Hasta ahora, se han desarrollado procedimientos que aumentan la velocidad de transferencia de oxígeno. Los procedimientos que se conocen en la técnica para aumentar la velocidad de transferencia de oxígeno comprenden: aumentar la mezcla (por ejemplo, por agitación) del líquido, aumentar el flujo de gas que contiene oxígeno y/o aumentar la concentración de oxígeno del gas que contiene oxígeno (por ejemplo, aire enriquecido con oxígeno). Se describen otros procedimientos que se centran en el suministro de dos corrientes de gas que contiene oxígeno diferentes. [0003]La Solicitud de Patente Europea EP-A-0.222.529 describe el principio de enriquecimiento de oxígeno mejorado de un caldo de fermentación, usando una segunda corriente de gas que contiene oxígeno. El sistema de fermentación consiste en un recipiente equipado con un tubo de subida y un tubo de bajada; el aire se suministra al caldo por el tubo de subida mientras que, por el tubo de bajada, se suministra un segundo gas que contiene oxígeno al caldo. En la Solicitud de Patente Japonesa JP-63-283570 se describen este y otros sistemas de fermentación, que están equipados con medios para hacer circular el flujo, tales como un tubo de aspiración o un (conjunto de) impulsores, una corriente de aire con el fin de promover la circulación y separación de CO2 y un dispositivo de suministro de oxígeno, que suministra oxígeno en la dirección opuesta a la de la corriente del fluido en circulación. La desventaja de dicho sistema es que el flujo del líquido dentro del recipiente debe ser conocido y suficientemente estable, y controlarse con precisión para colocar el dispositivo de suministro de oxígeno de manera que se obtenga la transferencia de oxígeno deseada. La Solicitud de Patente Europea EP-A-0.341.878 describe que el segundo gas que contiene oxígeno puede suministrarse al caldo en un circuito de circulación fuera del fermentador. [0004]La Solicitud de Patente Europea EP-A-0477818 describe un procedimiento similar que implica la inyección de una corriente de aire de suministro en un recipiente de mezcla provisto de medios impulsores que tienen un eje vertical e inyectar, por separado, oxígeno adicional desde un punto de inyección de oxígeno adicional. Sin embargo, este procedimiento está limitado por el hecho de que el último punto de inyección debe estar localizado lejos de las proximidades del punto de inyección de aire, para minimizar la mezcla del oxígeno adicional con las burbujas de aire. [0005]En la Solicitud de Patente Europea EP-A-0829534, se aplica el mismo principio a un sistema de fermentación accionado por gas, es decir, un sistema sin dispositivos de mezcla mecánicos. El sistema emplea la inyección de un primer gas que contiene oxígeno, tal como aire, en un conjunto de burbujas, hacia arriba, a través de un recipiente, con un flujo heterogéneo que provoca un flujo hacia arriba del caldo en el recipiente. El segundo gas que contiene oxígeno que se inyecta en la parte inferior del recipiente es un conjunto de burbujas, que se mueve también hacia arriba, a través de dicho recipiente, con un flujo homogéneo. El flujo homogéneo lo definen los inventores como aquel flujo que tiene una distribución de burbujas de gas uniforme y una distribución estrecha del tamaño de burbujas, en el que no hay un flujo hacia debajo de gas/líquido observable. Se indica que el carácter homogéneo de este segundo gas es una característica esencial. En contraste con la descripción del documento JP62-119690, el segundo gas que contiene oxígeno no se proporciona en el caldo dentro del recipiente fermentador en una región donde el caldo esté fluyendo hacia abajo sino que, en lugar de ello, debe proporcionarse donde el caldo esté subiendo. [0006]En la Solicitud de Patente Europea EP-A-0.901.812, el procedimiento se mejora adicionalmente proporcionando oxígeno directamente a un “vórtice estacionario”, un cuerpo rotatorio de líquido con poco o ningún movimiento axial o transversal, creado supuestamente por un sistema de agitación mecánica. Se dice que la ventaja es mantener las burbujas de oxígeno dentro del vórtice hasta que la burbuja de oxígeno se haya disuelto en la mezcla de reacción. Sin embargo, en recipientes industriales, será muy difícil localizar la posición precisa de estas regiones estacionarias. Además, en mezclas gas-líquido altamente turbulentas, como las aplicadas a menudo en la industria, es probable que los vórtices no sean estacionarios en absoluto. [0007]La Solicitud de Patente Europea EP-A-0.847.800 describe un procedimiento de inyección directa de oxígeno en un reactor de tipo columna de burbujas, que contiene principalmente un líquido orgánico oxidable. Se inyecta un primer gas que contiene oxígeno en la parte inferior del reactor, de manera que el líquido se dirige hacia arriba y se recircula hacia abajo. Se inyecta un segundo gas que contiene oxígeno en el área de flujo descendente, empobrecida en oxígeno.

Figura 1. Distribución de tamaño de partículas pequeñas para diferentes distancias desde el rociador. Figura 2. Distribución de tamaño de partículas grandes para diferentes distancias desde el rociador.

[0008]Un flujo homogéneo se define aquí como un flujo en el que todas las burbujas suben con la misma velocidad y la mezcla sigue líneas de corriente rectas, sin flujos de líquido de recirculación. El flujo homogéneo puede ocurrir únicamente cuando los orificios del rociador están distribuidos uniformemente en la parte inferior del recipiente y a velocidades superficiales del gas < aproximadamente 0,04 m/s. [0009]Un flujo heterogéneo se define aquí como un flujo en el que ocurrirán diferencias locales en la velocidad del líquido con la presencia de flujos de líquido de recirculación. El flujo heterogéneo ocurrirá cuando los orificios del rociador están distribuidos de forma no uniforme en la parte inferior del recipiente o, a velocidades superficiales del gas > aproximadamente 0,04 m/s, cuando los orificios del rociador están distribuidos uniformemente. [0010]El movimiento caótico del caldo se define aquí como un movimiento, caracterizado por una dirección y una velocidad, que tiene una dependencia de su historial y condiciones en el recipiente, y que está restringido por ciertos límites (por ejemplo, las velocidades nunca pueden superar un cierto máximo). Esto es diferente del movimiento aleatorio, que es una cantidad estadística que no tiene dependencia del historial, y que no está restringido por límites (por ejemplo, pueden darse velocidades extremadamente altas, aunque con una probabilidad extremadamente baja). [0011]El flujo turbulento se define aquí como un movimiento de líquido en el que las diferencias de momento de los elementos líquidos individuales no pueden amortiguarse por la viscosidad del líquido. Como resultado, se formarán corrientes parásitas en circulación, en las que las diferencias de velocidad del líquido serán más intensas, con el movimiento vigoroso del líquido. [0012]Una distribución de tamaño uniforme de las burbujas de gas se define aquí como una distribución simétrica con un solo máximo. [0013]Una distribución de tamaño no uniforme de las burbujas de gas se define aquí como una distribución no simétrica (por ejemplo, con una cola en un lado) o una distribución con más de un máximo. [0014]Una distribución de tamaño estrecha de las burbujas de gas se define aquí como una distribución en la que >95% de las burbujas tienen un diámetro que está dentro del intervalo entre 0,2*Ø y 5*Øb, donde Øb es el diámetro de burbuja medio. [0015]Una distribución de tamaño ancha de las burbujas de gas se define aquí como una distribución en la que >95% de las burbujas tienen un diámetro que está dentro del intervalo entre 0,01*Øb y 100*Øb, donde el Øb es el diámetro de burbuja medio. [0016]La presente invención proporciona un procedimiento, como se define en las reivindicaciones, de cultivo de un microorganismo en condiciones aeróbicas, en un recipiente de fermentación, que comprende la inyección de un primer gas que contiene oxígeno en la parte inferior del recipiente, con un flujo heterogéneo que provoca un movimiento caótico (como se ha definido anteriormente) del caldo y la introducción de un segundo gas que contiene oxígeno en el recipiente, caracterizado por que el segundo gas que contiene oxígeno se introduce como un flujo heterogéneo de burbujas de gas en el recipiente, en todas las direcciones posibles, e independiente de la dirección del flujo del caldo resultante, en condiciones de flujo turbulento (como se ha definido anteriormente) en el sitio de inyección, y como un conjunto de burbujas de gas de tamaño no uniforme y una distribución de tamaño ancha. El primer gas que contiene oxígeno puede contener un 1530% de oxígeno (v/v), preferiblemente un 20-30% de oxígeno y más preferiblemente es aire. El primer gas que contiene oxígeno se inyecta en la parte inferior del recipiente de fermentación, preferiblemente cerca del fondo. El segundo gas que contiene oxígeno puede contener un 30-100% de oxígeno, preferiblemente un 70-100% de oxígeno y más preferiblemente es del 90-100% de oxígeno. El punto de inyección del segundo gas que contiene oxígeno no está limitado a una cierta área del recipiente de fermentación y puede estar tanto en las proximidades como lejos del punto de inyección del primer gas que contiene oxígeno, independientemente de si el recipiente de fermentación está equipado o no con un dispositivo de agitación mecánico. La ventaja del procedimiento de la presente invención es que la transferencia de oxígeno obtenida por este procedimiento mejora respecto a los procedimientos existentes de la técnica anterior, y no pone ninguna limitación a la posición de entrada de la segunda corriente de gas que contiene oxígeno, permitiendo de esta manera una mayor flexibilidad en el diseño del recipiente de fermentación. El procedimiento de la presente invención es adecuado para cultivar levaduras, hongos y bacterias. Los ejemplos preferidos de levaduras son miembros de los géneros Saccharomyces o Kluyveromyces, tales como Saccharomyces cerevisiae y Kluyveromyces lactis. Los ejemplos preferidos de hongos son miembros de los géneros productores de metabolitos secundarios, tales como Penicillium (por ejemplo, Penicillium chrysogenum, para la producción de penicilina y otros antibióticos) y Acremonium y miembros de los géneros productores de enzimas, tales como Aspergillus y Trichoderma. Los ejemplos preferidos de bacterias son miembros de los géneros Streptomyces, Escherichia, Pseudomonas o Bacillus. [0017]Una realización preferida es un procedimiento para cultivar un microorganismo, en condiciones aeróbicas, en un recipiente de fermentación en el que el caldo se mezcla por agitación mecánica. En otra realización preferida, no se aplica agitación mecánica, sino que la mezcla del cultivo se obtiene mediante la primera corriente que contiene gas, tal como aire, es decir, el fermentador de columna con cono de cierre.

[0018]El segundo gas que contiene oxígeno puede introducirse en el recipiente de fermentación mediante simples tuberías o rociadores de gas, orificios, boquillas de tipo venturi, boquillas de gas-líquido o boquillas de inyección de gas supersónico. Preferiblemente, el segundo gas que contiene oxígeno se introduce mediante una o más boquillas, cada una de las cuales comprende, al menos, un orificio. Más preferiblemente, el segundo gas que contiene oxígeno se inyecta en el recipiente de fermentación en tres dimensiones. Esto puede obtenerse usando varias boquillas, cada una de las cuales comprende, al menos, un orificio, boquillas que están ubicadas en el fermentador en una disposición adecuada para proporcionar inyección en las tres dimensiones. Alternativamente, pueden usarse una o más boquillas, cada una de las cuales contiene, al menos, 3 orificios dispuestos de manera que proporcionan inyección en las tres dimensiones.

Ejemplo 1 [0019]El aire se roció a través de una boquilla instalada en las proximidades del fondo de un tanque de vidrio (0,6 m de diámetro) lleno con 300 litros de una solución de Na2SO4 al 4% en agua. La solución de Na2SO4 se usó para imitar las propiedades de coalescencia de un caldo de fermentación y proporcionar la transparencia necesaria para las técnicas de detección que se usaron. La boquilla contenía 7 orificios de 1 mm de diámetro, 6 de los cuales estaban espaciados equidistantes en un círculo de 32 mm de diámetro y uno situado en el centro. El flujo de la boquilla se dirigió hacia arriba. La retención de gas y la distribución del tamaño de burbuja se midieron en el penacho de gas, en diversas posiciones verticales por encima del rociador. La retención de gas se midió con una técnica de transmisión radiactiva usando una fuente de radiación gamma Cs137 y un detector de Nal. Esta técnica mide la densidad total de la mezcla gas-líquido en el recipiente de la zona de detección y, así, permite el cálculo de la fracción de gas. La distribución del tamaño de burbuja, expresada como media de Sauter d32, se determinó por análisis de imagen, de grabaciones de video, de ampliaciones ópticas de los patrones de burbuja (T. Martin- PhD thesis: Gas dispersión with radial and hydrofoil impellers in fluids with different coalescence characteristics. 1996. Herbert Utz Verlag, München (D)). La Tabla 1 y las Figuras 1 y 2 muestran los resultados para una velocidad de salida de la boquilla de 490 m/s. Se observó una distribución no uniforme del tamaño de burbuja, con picos típicos en el intervalo pequeño entre 0,2 y 0,3 mm (Figura 1) y en el intervalo de diámetro grande entre 2 y 4 mm (Figura 2), con una retención típica del 1,1% para las burbujas pequeñas y del 1-3% para las burbujas grandes.

Tabla 1.

Posición: Retención de gas Sauter d32

vertical (cm): Burbujas pequeñas (%) Burbujas grandes (%) Burbujas pequeñas (mm) Burbujas grandes (mm)

5: 1,1 0,1 0,267 2,273

14: 1,1 1,3 0,216 2,630

41: 1,1 2,2 0,287 3,587

Ejemplo 2 [0020]Se cultivó Saccharomyces cerevisiae en un fermentador de columna de burbujas, equipado con un rociador de aire (es decir, el primer gas que

10 contiene oxígeno) cerca del fondo del fermentador y un circuito de recirculación, con un intercambiador de calor externo, para enfriamiento. Los caudales superficiales de aire eran de aproximadamente 0,20 m/s y la transferencia de oxígeno era del 0,4-0,6% por metro de la altura del caldo no aireado. El caldo se hizo circular a través del cambiador de calor cuatro

15 veces por hora. Las otras condiciones de fermentación fueron como las descritas por Reed, G y Nagodawithana, T. W. en el capítulo 6 de YEAST TECHNOLOGY (1991, Van Nostrand Reinhold, Nueva York). El segundo gas que contiene oxígeno consistía en oxígeno puro y se inyectó por debajo del rociador de aire, empleando boquillas que funcionaban a una presión de

20 aproximadamente 5 bar, con diámetros de orifico del orden de 1 mm, para conseguir velocidades de inyección supersónicas del oxígeno, dando como resultado una distribución de burbujas de oxígeno no uniforme. Se seleccionó la posición de entrada por debajo del rociador de oxígeno para permitir que la fracción de burbujas de oxígeno más grandes (50-70% vol) se

25 moviera hacia arriba y coalesciera con las burbujas de aire, y para permitir que la fracción de burbujas pequeñas quedara atrapada en el flujo de recirculación. De esta manera, se crearon condiciones óptimas de presión y tiempo de residencia, para conseguir una captación de oxígeno casi total (100% de eficacia), mientras que la fracción de burbujas grandes mostró la

30 eficiencia de transferencia del flujo de aire. La proporción de los dos flujos de gas (aire/oxígeno) era de 9:1. La productividad de levadura era de aproximadamente 8-9 kg de biomasa (peso seco) por kg de caldo por hora, que es el doble de la productividad encontrada sin la inyección del segundo gas que contiene oxígeno. Los siguientes resultados se representan en la Tabla 2.

Tabla 2

Gas que contiene O2: Eficiencia de Transferencia de O2 (%) Velocidad de Transferencia de O2 (mmol O2 por kg de caldo por hora) Velocidad de Transferencia de O2 Relativa (-veces)

1º: Aire 20 140 1

2º: O2 puro burbujas grandes burbujas pequeñas 20 100 60 70

Total:: 270 1,9

5

Ejemplo 3 [0021]Se llevó a cabo una fermentación similar a la descrita en el Ejemplo 2, excepto que la proporción de los dos flujos de gas (aire/oxígeno) era 6:1, y la productividad de levadura era de aproximadamente 16 kg de biomasa (peso

10 seco) por kg de caldo por hora. La Tabla 3 da los resultados.

Tabla 3.

Gas que contiene O2: Eficiencia de Transferencia de O2 (%) Velocidad de Transferencia de O2 (mmol de O2 por kg de caldo por hora) Velocidad de Transferencia de O2 Relativa (veces)

1º: Aire 15 140 1

2º: O2 puro burbujas grandes burbujas pequeñas 15 10 90 270

Total:: 500 3,6

[0022]Comparado con el Ejemplo 2, se observó un aumento adicional en la

15 velocidad de transferencia de O2, que se explica por el hecho de que ocurrió un mayor consumo de O2, como resultado de un aumento de la productividad de la levadura.

Ejemplo 3

20 [0023]Se cultivó Saccharomyces cerevisiae en un fermentador de tanque agitado, equipado con un rociador de aire por debajo del impulsor inferior, y un segundo rociador, que se puso en la corriente de flujo de líquido radial, generada por el impulsor inferior. El impulsor era del tipo de disco de turbina. El segundo rociador estaba equipado con boquillas del tipo descrito en el Ejemplo 2 y, a través de este rociador, se suministró un segundo gas que

5 contiene oxígeno, que consistía en oxígeno puro. La posición del segundo rociador se eligió para que estuviera localizada en la parte agitada más vigorosamente del líquido, para demostrar que el efecto positivo de la generación de las burbujas de oxígeno no está limitado a las localizaciones donde las condiciones de flujo están relativamente estancadas.

10 [0024]Además de una fermentación de referencia sólo con aire, se han ejecutado dos experimentos con oxígeno extra. En una fermentación, la corriente de aire se enriqueció sustituyendo aproximadamente el 6% del aire por oxígeno puro. En la segunda fermentación, se suministró la misma cantidad de oxígeno por inyección directa a través de un segundo rociador,

15 mientras se reducía el flujo de aire en el primer rociador al 94%. La concentración de oxígeno en la fase líquida se controló al 20% de saturación del aire. En la Tabla 4 se muestran los resultados de la velocidad de transferencia de oxígeno al final de la fermentación.

20 Tabla 4.

Experimento: Velocidad de transferencia de O2 (mmol O2 por kg de caldo por hora)

Referencia: 35

Enriquecimiento: 44

Inyección directa: 50

[0025]La mejora de la velocidad de transferencia de oxígeno con el aire enriquecido puede atribuirse a una mayor fuerza impulsora del gas a la fase líquida. La magnitud medida está de acuerdo con las expectativas.

25 La mejora con el experimento de inyección directa puede atribuirse a una contribución acumulativa de la transferencia mediante el aire del rociador de aire, mediante una fracción de burbujas de oxígeno grandes desde el segundo rociador y una fracción de burbujas pequeñas, también desde el segundo rociador. Suponiendo que la proporción de burbujas de oxígeno

30 grandes a pequeñas es de 5:1, entonces las contribuciones del aire, burbujas de oxígeno grandes y burbujas de oxígeno pequeñas a la velocidad de transferencia de oxígeno total es de 34, 10 y 6 mmol por kg de caldo por hora, respectivamente.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

imagen1

Bibliografía no relativa a patentes citada en la descripción

imagen2

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de cultivo de un microorganismo en un recipiente de fermentación bajo condiciones aeróbicas que comprende la inyección de un primer gas que contiene oxígeno en la parte inferior del recipiente, con un flujo heterogéneo que provoca un movimiento caótico del caldo, y la introducción de un segundo gas que contiene oxígeno en el recipiente, caracterizado por la introducción del segundo gas que contiene oxígeno como

-

un flujo heterogéneo de burbujas de gas que se mueven en el recipiente en todas las direcciones posibles, independientemente de la dirección del flujo del caldo, que causa condiciones de flujo turbulento en el sitio de inyección, caracterizado por un movimiento del líquido en el que las diferencias de momento de los elementos líquidos individuales no pueden amortiguarse por la viscosidad del líquido; y como

-

un conjunto de burbujas de gas, de tamaño no uniforme, y una

distribución de tamaño amplia; en el que el punto de inyección del segundo gas que contiene oxígeno no está limitado a una determinada área del recipiente de fermentación, y puede estar tanto en las proximidades como lejos del punto de inyección del primer gas que contiene oxígeno.
2.

Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el microorganismo es una levadura, hongo o bacteria.
3.

Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la levadura pertenece al género Saccharomyces o Kluyveromyces.
4.

Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la levadura es Saccharomyces cerevisiae.
5.

Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la levadura es Kluyveromyces lactis.
6.

Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el hongo es un miembro de los géneros Penicillium, Acremonium, Aspergillus o
7.

Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el hongo es

Trichoderma.

Penicillium chrysogenum. 5
8. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la bacteria es un miembro de los géneros Streptomyces, Escherichia, Pseudomonas o Bacillus.

10 9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el caldo se mezcla por agitación mecánica.
10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el segundo gas que contiene oxígeno se introduce en el recipiente de

15 fermentación mediante una o más boquillas, cada una de las cuales comprende al menos un orifico.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que las boquillas

están situadas en el recipiente de fermentación para obtener la inyección del 20 segundo gas que contiene oxígeno en las tres dimensiones.
12. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que los orificios están situados en la boquilla para obtener la inyección del segundo gas que contiene oxígeno en las tres dimensiones.

25