PL204477B1 - Kompleks, kompozycja farmaceutyczna, szczepionka i jej zastosowanie - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są nowy kompleks, nowa kompozycja farmaceutyczna o właściwościach adiuwantowych oraz ich zastosowanie do wytwarzania szczepionek.

Tworzenie wysoce oczyszczonych szczepionek, zawierających rekombinowane lub izolowane z drobnoustrojów antygeny, pociąga za sobą zmniejszenie ich immunogenności. Można temu przeciwdziałać poprzez zastosowanie adiuwantów - substancji zwiększających odpowiedź immunologiczną na podany antygen. Idealny adiuwant powinien być nietoksyczny, biodegradowalny i możliwy do użycia u dzieci, u osób w podeszłym wieku i z zaburzoną odpornością (1). Powinien on ponadto indukować już po jednorazowym podaniu (najlepiej doustnym lub donosowym) antygenowoswoiste reakcje, zarówno o typie komórkowym, jak i humoralnym, obejmujące cały ustrój, łącznie z błonami śluzowymi. Adiuwant powinien być stabilny, łatwo mieszać się z antygenem oraz nadawać się do produkcji na większą skalę. Jak dotąd dopuszczono do stosowania u ludzi zaledwie kilka adiuwantów: związki glinu (wodorotlenek i fosforan), MF59 - emulsja oparta na skwalenie, oraz liposomopodobny preparat IRIV - immunostymulujące, rekonstytuowane wirosomy grypy (2, 3). Eksperymentalnie wykorzystuje się niepełny adiuwant Freunda (iFa), będący emulsją złożoną z oleju mineralnego i detergentu oraz pełny adiuwant Freunda (cFa), wzbogacony dodatkowo zabitymi prątkami gruźlicy (4).

Wiele związków znajduje się wciąż w fazie badań klinicznych, m.in. monofosforylowany lipid A (MPL), pochodna lipopolisacharydu (LPS) izolowanego z Salmonella minnesota R595 (5). Substancja ta zachowuje wiele właściwości wyjściowej cząsteczki, ale cechuje się obniżoną toksycznością. MPL działa gorączkotwórczo w stopniu o wiele mniejszym niż LPS. Jego aktywność adiuwantowa wynika ze zdolności do pobudzania komórek prezentujących antygen, u których dochodzi do wzrostu ekspresji cząsteczek kostymulujących. Dzięki temu antygen jest lepiej i szybciej rozpoznawany przez komórki efektorowe układu immunologicznego (6). MPL uruchamia swoiste mechanizmy cytotoksyczne oraz pobudza syntezę interferonu gamma (7). Związek ten podany donosowo indukuje syntezę przeciwciał typu Ig A w obrębie błon śluzowych; w surowicy natomiast obserwuje się podwyższony poziom IgG2a (8).

W badaniach immunotropowych w ł a ś ciwoś ci laktoferyny wykazano jej adiuwantowe dział anie w teście nadwrażliwości typu opóźnionego (DTH) przy zastosowaniu owalbuminy, krwinek barana i BCG jako antygenów (9). Laktoferyna (LF) jest białkiem związanym z metabolizmem żelaza i stanowi istotny składnik wrodzonej odpowiedzi immunologicznej (10). Wykazuje właściwości przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe, przeciwgrzybicze, przeciwnowotworowe; promuje także dojrzewanie limfocytów B i T (11-16). LF ma zdolność wiązania związków ujemnie naładowanych, np. LPS, heparyny, DNA, dzięki zagęszczeniu kilku reszt zasadowych aminokwasów w jej N-końcowym fragmencie (17). Udowodniono, że wiązanie LPS przez laktoferynę odbywa się poprzez lipid A (18, 19). Jak dotąd nie ma doniesień na temat powstawania kompleksu LF-MPL.

Celem wynalazku jest zaproponowanie nowego adiuwanta, który mógłby być stosowany do wytwarzania szczepionek. Pożądane jest aby otrzymany adiuwant posiadał wysoką efektywność i niską pirogenność.

Nieoczekiwanie okazało się, że kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawierająca LF i MPL posiada właściwości adiuwantowe. Ponadto, nieoczekiwanie stwierdzono tworzenie się w takiej mieszaninie kompleksu LF-MPL.

Przedmiotem wynalazku jest kompleks składając się z laktoferyny (LF) i monofosforylowanego lipidu A (MPL) o wzorze:

OH

HO

przy czym korzystnie stosunek wagowy LF do MPL wynosi około 0,43.

PL 204 477 B1

W korzystnej realizacji laktoferyna został a wybrana z grupy skł adają cej się z laktoferyny ludzkiej, bydlęcej, mysiej, koziej, wieprzowej, końskiej i bawolej, albo ich znanych pochodnych, natomiast MPL jest monofosforanem lipidu A pochodzącego z jednej z następujących bakterii: Hafnia alvei, zwłaszcza Hafnia alvei PCM 1200, Escherichia coli, Salmonella enteritica sv. Typhimurium albo Yersinia enterocolitica. Korzystnie, LF posiada jedną z sekwencji aminokwasowych przedstawionych na SEQ ID No. 1 do 7.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera laktoferynę (LF) oraz monofosforylowany lipid A (MPL) otrzymany z bakteryjnego lipopolisacharydu, przy czym korzystnie laktoferyna została wybrana z grupy składającej się z laktoferyny ludzkiej, bydlęcej, mysiej, koziej, wieprzowej, końskiej i bawolej, albo ich znanych pochodnych, natomiast MLP jest monofosforanem lipidu A pochodzącego z jednej z następujących bakterii: Hafnia alvei, zwłaszcza Hafnia alvei PCM 1200, Escherichia coli, Salmonella enteritica sv. Typhimurium albo Yersinia enterocolitica.

Korzystnie, LF posiada jedną z sekwencji aminokwasowych przedstawionych na SEQ ID No. 1 do 7. Równie korzystnie MPL jest związkiem według wzoru przedstawionego powyżej. W korzystnej realizacji kompozycja farmaceutyczna według wynalazku ma postać roztworu. Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może zawierać kompleks LF z MPL według wynalazku. Możliwe są różne stosunki ilościowe LF do MPL, korzystnie stosunek wagowy LF do MPL wynosi od 0,3 do 30:1, szczególnie korzystnie około 20:1. W preferowanej realizacji wynalazku kompozycja farmaceutyczna według wynalazku jest kompozycją adiuwantową.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczepionka zawierająca antygen i adiuwant oraz ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik charakteryzująca się tym, że jako adiuwant zawiera kompozycję według wynalazku zdefiniowaną powyżej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompozycji farmaceutycznej według wynalazku jako adiuwanta do wytwarzania szczepionek. Korzystnie, wytwarzana szczepionka jest przeznaczona co najmniej jedną drogą wybraną spośród: podawania przez iniekcję, podawania przezśluzówkowego, doustnie, dootrzewnowo, dożołądkowo, podskórnie,

Korzystnie, wytwarzana szczepionka jest przeznaczona do podawania wraz z osobną dawką zawierającą przynajmniej jeden ze składników kompozycji według wynalazku, która to dawka poprzedza, towarzyszy lub następuje po podaniu szczepionki.

Stosując tego rodzaju podejście można uzyskać lepszy efekt terapeutyczny, wykorzystujący działanie immunostymulacyjne i/lub immunomodulacyjne składników kompozycji.

Ujawniono nowy typ dwuskładnikowego adiuwantu będącego mieszaniną zawierająca kompleks laktoferyny i monofosforylowanego lipidu A. Adiuwant ten stosowano osobno w przypadku podania doustnego lub w emulsji z niepełnym adiuwantem Freunda, przy immunizacji śródskórnej. Nowy adiuwant wykazywał silnie zmniejszoną zdolność do indukcji TNF alpha w hodowli linii komórkowej P388D1 oraz niższą reakcję zapalną w teście skórnym u myszy niż pełny adiuwant Freunda. Postulujemy, że wykazana efektywność adiuwantowa kompozycji według wynalazku związana jest z przekazywaniem sygnałów kostymulujących komórkom przez różne typy receptorów - receptor o wysokim powinowactwie do mannozy dla części laktoferynowej i TLR dla MPL zawartego w kompozycji. Ten nowy typ adiuwantu może znaleźć zastosowanie w szczepionkach ze względu na wysoką efektywność i niską pirogenność.

Dla lepszego ujawnienia zdefiniowanego powyżej wynalazku poniżej zaprezentowano wybrane przykłady jego realizacji. Specjalista powinien być w stanie zrealizować zdefiniowany powyżej wynalazek w oparciu o wskazówki zawarte w niniejszym opisie oraz powszechną wiedzę należącą do stanu techniki.

P r z y k ł a d 1.

Otrzymywanie i charakterystyka składników kompozycji adiuwantowej składającej się z LF i MPL.

Dokładna charakterystyka laktoferyny została przedstawiona przez Baker i współpr. (20).

Monofosforylową pochodną lipidu A (MPL) uzyskano dla lipidu A, izolowanego z LPS Hafnia alvei PCM 1200. Szczep pochodzi z Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (Polish Collection of Microorganisms; PCM) Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu. W celu izolacji MPL-Ha1200 bakterie hodowano w temp. 37^oC, na syntetycznej pożywce minimalnej wzbogaconej w hydrolizat kazeiny (0,5%) i kwas nikotynowy (0,00001%), silnie napowietrzanej przez wytrząsanie. Po 24-godzinnej hodowli bakterie zabijano 0,5% roztworem fenolu odwirowywano przy użyciu wirówki przepływowej CEPA LE (39000 obr./min.) i przemywano 3 litrami wody. Otrzymaną masę bakteryjną

PL 204 477 B1 zawieszano w wodzie i liofilizowano (21). Lipopolisacharydy izolowano przez ekstrakcję wodnofenolową. Zliofilizowaną masę bakteryjną dokładnie zawieszano w wodzie (2g/25 ml) i dodawano równą objętość 90% fenolu. Tak uzyskanym 45% roztworem fenolu ekstrahowano lipopolisacharydy w temperaturze 65^oC przez 15 minut, wedł ug metody Westphala i wsp. (22). Ekstrakt schładzano do 4^oC, a następnie wirowano przez 30 minut, przy 3000 x g. Zbierano fazę wodną, a pozostałą fazę fenolową uzupełniano wodą do początkowej objętości i ponownie ekstrahowano. Połączone fazy wodne dializowano do wody destylowanej przez 72 godziny. Po dializie preparat liofilizowano. LPS oddzielano od kwasów nukleinowych przez trzykrotne ultrawirowanie (105000 x g, 6 godzin). Osad, będący oczyszczonym lipopolisacharydem, zawieszano w wodzie destylowanej i liofilizowano. Oczyszczony lipopolisacharyd (200 mg liofilizatu) poddawano łagodnej hydrolizie w 40 ml 1,5 % roztworu kwasu octowego i 2% SDS w 100^oC przez 15 minut. Roztwór schładzano i liofilizowano. SDS usuwano przez pięciokrotne przemywanie 97% roztworem etanolu wirując za każdym razem (13000 x g, 20 min.). Przemyty osad zawieszano w wodzie, a następnie wirowano (13000 x g, 20 min.). Osad będący lipidem A liofilizowano. Monofosforylową pochodną lipidu A uzyskiwano poddając lipid A H. alvei PCM 1200 hydrolizie z użyciem 0,1 M HCl w temperaturze 100^oC przez 30 min. Uzyskany MPL był oczyszczany przez wirowanie (8000 x g; 15 min).

Badania strukturalne lipopolisacharydu H. alvei PCM 1200, prowadzone technikami analizy chemicznej oraz przy użyciu spektroskopii NMR i spektrometrii masowej MALDI-TOF, pozwoliły dokładnie opisać strukturę chemiczną MPL. Jest to cząsteczka złożona ze szkieletu cukrowego, w skład którego wchodzi reszta D-glukozaminy (reszta dystalna) połączona wiązaniem β-(1 6) glikozydowym z drugą cząsteczką α-D-glukozaminy (reszta proksymalna), podstawionego w pozycji 4 dystalnej glukozaminy grupą fosforanową. Obie cząsteczki GlcN podstawione są w pozycji 2 i 4 odpowiednio estrowo i amidowo związanymi kwasami 3-hydroksy-tetradekanowymi (3-OH-14:0). Kwasy tłuszczowe podstawiające dystalną resztę GlcN są dodatkowo związane wiązaniem estrowym z kwasem dodekanowym i tetradekanowym.

P r z y k ł a d 2.

Kompleksy LF z MPL.

Wiązanie bydlęcej laktoferyny z lipopolisacharydem, lipidem A oraz MPL H. alvei PCM 1200 badano według metody opisanej przez Belanger i współpr. (23). Lipopolisacharyd, lipid A lub MPL (2 mg) inkubowano 1 godzinę z 2 mg bydlęcej laktoferyny w buforowanej soli fizjologicznej (PBS, pH 7,4, 1 ml) w temperaturze 37°C z mieszaniem. Mieszaninę poddano ultrawirowaniu (6 godzin, 200 000 x g, 15°C). Jako kontroli użyto bydlęcej laktoferyny inkubowanej w PBS. Otrzymany osad kompleksów laktoferyny z LPS, LA lub MPL przemywano dwukrotnie PBS wirując za każdym razem w warunkach opisanych powyżej. Osady zawieszono w 0,5 ml PBS i poddano analizie przy użyciu elektroforezy w żelu poliakryloamidowym w warunkach denaturujących. Elektroforezę prowadzono w 8,5% żelu poliakryloamidowym z 2,5% żelem zagęszczającym o wymiarach 10 x 8 x 1 mm według Laemmliego (24), z następującą modyfikacją: preparaty kompleksów, MPL, LA, LPS oraz laktoferyny mieszano z buforem denaturującym w stosunku 1:1 (62,5 mM Tris-HCl [pH 6,8], 2% SDS, 10% glycerol, 5% β-mercaptoetanol, 0,025% błękit bromofenolowy) i gotowano przez 15 minut. Próbki nanoszono na ścieżkę w objętości 10 ml. Elektroforezę prowadzono przez ok. 1 godzinę, przy natężeniu prądu 25 mA na płytkę. Żel po rozdziale barwiono srebrem według procedury opisanej przez Tsai i Frasch (25) oraz z użyciem Coomassie brilliant blue. Główny prążek obecny na żelu po przeprowadzonej elektroforezie i barwieniu i odpowiadający LF (masa około 78 kDa) obecny był jedynie w tych próbkach, w których białko inkubowano w obecności LPS, LA lub MPL. Nie obserwowano prążka odpowiadającego LF w przypadku próbki kontrolnej. Obraz na żelu uzyskany dla roztworów LPS, LA i MPL w PBS także wskazywał na brak prążka odpowiadającego masie 78 kDa, który mógłby pochodzić od białkowego zanieczyszczenia preparatów LPS, LA i MPL.

Otrzymane kompleksy scharakteryzowano pod względem ilości zawartego w nich białka, które oznaczano metodą Lowry'ego (26). Osady kompleksów LF-LPS, LA, MPL zawieszono w 500 μl PBS. Krzywą standardową sporządzono używając standardu bydlęcej laktoferyny. Roztwory MPL i LA w PBS zostały użyte jako kontrole. Ekstynkcję mierzono przy długości fali równej 720 nm na czytniku Shimadzu UV-1202. Stosunki wagowe LF do LPS, LA i MPL w otrzymanych kompleksach wynosiły odpowiednio 0,3; 0,36 i 0,43. MPL podobnie jak LA lub LPS izolowane z H. alvei PCM 1200, użyte w ilości 2 mg wiązały od 30 do 43% z użytych w doświadczeniu 2 mg LF.

Analizę kinetyki wiązania bydlęcej laktoferyny z LPS izolowanymi z H. alvei przeprowadzano przy użyciu techniki plazmonowego rezonansu powierzchniowego w aparacie BIAcore™ 1000.

PL 204 477 B1

LF (50 μg/ml w 10 mM octanie sodu, pH 4,0) wiązano kowalencyjnie poprzez grupy aminowe do płytki CM5 przy użyciu zestawu oryginalnych odczynników firmy BIAcore. Ilość LF związanej w tych warunkach odpowiadała 1100 jednostkom rezonansowym, przy czym 1 jednostka odpowiada około 1 ng/mm² związanego ligandu. Pozostałe zaktywowane, ale nie biorące udziału w wiązaniu grupy karboksylowe zablokowano etanolaminą. Pomiary kinetyki reakcji LF z LPS przeprowadzano w roztworze soli fizjologicznej buforowanym HEPES (HBS). Próbki LPS, LA, MPL zawieszano w HBS (10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, and 3,4 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 7,4). Do próbek dodawano trójetyloaminę w stosunku molowym 1:1 do ujemnie naładowanych grup występujących w cząsteczkach LPS, LA czy MPL. Próbki zawieszano przez 1 min. przy użyciu sondy ultradźwiękowej. Roztwory LPS w HBS w stężeniu 125 μM przepływały przez opłaszczony kanał z prędkością 5 ^/min. Powierzchnię płytki regenerowano 3 min. 50% roztworem glikolu etylenowego, a następnie 0,05% SDS. Stałe asocjacji (KA) i dysocjacji (KD) obliczano przy użyciu oprogramowania BIA evaluation 3.0. Lipopolisacharyd szczepu H. alvei PCM 1200 wybrano spośród innych lipopolisacharydów H. alvei w oparciu o najsilniejszą reakcję obserwowaną podczas przeprowadzonych analiz. Obliczone stałe asocjacji i dysocjacji dla LPS H. alvei PCM 1200 wynosiły odpowiednio 2,1 x 10⁴ M^-1 i 4,87 x 10^-5 M. Wartości KA i KD obliczone dla pozostałych fragmentów LPS pozostawały odpowiednio w zakresie 1,2 x 10⁴ do 2,0 x 10⁴ M^-1 oraz 5,1 x 10⁵ do 8,7 x 10^-5 M.

Uzyskane wyniki badań fizykochemicznych pokazały, że bydlęca laktoferyna tworzy trwałe kompleksy z monofosforylowanym lipidem A, lipidem A oraz LPS izolowanymi z H. alvei PCM 1200.

P r z y k ł a d 3.

Testy immunologiczne

W badaniach stosowano kompozycję adiuwantową LF-MPL-Ha1200 o proporcji wagowej 20:1. Kompozycja o takim stosunku wagowym wykazywała najlepsze właściwości immunoregulatorowe w teście proliferacyjnym splenocytów mysich. Laktoferyna znajduje się w takiej mieszaninie w znacznym nadmiarze w stosunku do MPL-Ha1200. Kompozycje adiuwantową zawierającą kompleksy według wynalazku przygotowywano przez godzinną inkubację w temperaturze pokojowej połączonych roztworów laktoferyny i MPL-Ha1200 w odpowiednich proporcjach.

Oceniono wpływ kompozycji adiuwantowej na odpowiedź humoralną, immunizując dootrzewnowo myszy suboptymalną dawką krwinek barana (0,2 ml 0,5% roztwór SRBC) razem z analizowanymi adiuwantami (250 μg LF, 12,5 μg MPL-Ha1200, 262,5 μg LF-MPL-Ha1200). Po czterech dniach izolowano śledziony i homogenizowano w celu otrzymania jednorodnej zawiesiny komórek. Produkcję przeciwciał oznaczano za pomocą testu miejscowej hemolizy w żelu agarowym według metody opracowanej przez Mishell i Dutton (27). Kompozycja adiuwantową zwiększała statystycznie istotnie liczbę komórek wytwarzających przeciwciała anty-SRBC ponad poziomy osiągane w grupie kontrolnej i w grupach, którym podano SRBC razem z samą laktoferyną lub MPL-Ha1200, w dawkach odpowiadających ich zawartości w kompleksie (Fig. 3).

W teście nadwrażliwości typu opóźnionego (DTH) myszy uczulano podskórnie modelowym antygenem - owalbuminą (OVA) (10 μg) razem z kompozycją adiuwantową według wynalazku i jej składnikami (50 μg LF, 2,5 μg MPL-Hal200, 52,5 μg LF-MPL-Ha1200), zemulgowanymi w niepełnym adiuwancie Freunda. Po czterech dniach powtórnie uczulono myszy samą owalbuminą (50 μg). Zmierzona 24 h później opuchlizna łap była większa w grupie OVA+LF-MPL-Ha1200 (wynik istotny statystycznie), porównywalna do odczynu uzyskanego w grupie immunizowanej OVA w pełnym adiuwancie Freunda. Składniki kompozycji użyte pojedynczo wywoływały znacznie mniejszą reakcję (Fig. 4). Świadczy to o nieoczekiwanym synergistycznym efekcie charakteryzującym kompozycję adiuwantową według wynalazku.

Sprawdzono również aktywność kompozycji w teście DTH, podając myszom drogą doustną zawiesinę prątków gruźlicy (BCG 1 mg) razem z adiuwantami (1 mg LF, 0,05 mg MPL-Ha1200, 1,05 mg LF-MPL-Ha1200). Kompozycja adiuwantową według wynalazku zwiększała reakcję DTH, wywołaną 0,1 mg BCG, ponad wartości osiągane przez składniki kompleksu użyte oddzielnie (Fig. 5).

Działanie prozapalne kompozycji adiuwantowej według wynalazku badano w modelu in vitro oraz in vivo. Komórki linii monocytarno-makrofagowej P3888D1 (ICLC ATL97013), potraktowane adiuwantem według wynalazku, wytwarzały znacznie mniej TNF alpha po 24 godzinach hodowli w porównaniu do komórek poddanych działaniu tylko MPL-Ha1200. Poziom TNF alpha oznaczano metodą biologiczną wg Espevik i Hansen (28, 29). W teście in vivo kompozycję, LF i MPL-Ha1200 (LF 50 μg; MPL-Ha1200 2,5 μg i 52,5 μg kompozycji) emulgowano w niepełnym adiuwancie Freunda i podawano myszom podskórnie (100 μθ w tylną łapę. Obrzęk łapy mierzono suwmiarką przez okres 28 dni.

PL 204 477 B1

Wyrażony przyrostem grubości łapy odczyn zapalny po podaniu kompozycji adiuwantowej według wynalazku przez cały okres doświadczenia był mniejszy od odczynu wywołanego przez pełny adiuwant Freunda (Tabela 1).

T a b e l a 1

Indukcja odczynu zapalnego w teście skórnym pod wpływem adiuwanta zawierającego kompleks LF-MPL-Ha1200

Grupa:	Średni przyrost grubości opuszki łapy (%)
po 1 dniu	po 4 dniach	po 28 dniach
Kontrola iFa	85,94 ± 2,14	102,61 ± 3,34	42,34 ± 2,84
Kontrola cFa	130,19 ± 6,44	96,20 ± 5,51	82,1 ± 4,89
iFa/LF 50 pg	79,53 ± 4,06	62,86 ± 3,05	57,09 ± 1,97
iFa/MPL 2,5 pg	90,75 ± 5,12	120,14 ± 6,43	61,36 ± 2,60
iFa/LF-MPL (20:1) 52,5 pg	75,79 ± 4,21	71,52 ± 2,25	54,42 ± 1,84

P r z y k ł a d 4.

Protokoły immunizacyjne

1. Stymulacja odpowiedzi typu komórkowego na BCG (potencjalne znaczenie przy szczepieniach ochronnych przeciwgruźliczych).

Myszy otrzymują przez sondę, dożołądkowo 1 mg BCG z dodatkiem 5% kompleksu LF-MPL (1-10 mg) zawieszone w 3% roztworze wodorowęglanu sodowego w celu zmniejszenia/zapobieżenia degradacji BCG i LF przez sok żołądkowy. Stan nadwrażliwości typu opóźnionego (DTH) oceniany jest po upływie 4 dni przez podanie podskórne w tylnią łapę 100 μg BCG lub 0,1 ml 500x rozcieńczonej starej tuberkuliny (OT).

2. Stymulacja wytwarzania przeciwciał na antygen bakteryjny z Plesiomonas shigelloides.

Myszy są immunizowane mieszaniną 5 μg antygenu bakteryjnego z 100 - 200 μg kompleksu

LF-MPL (5-10%) w vehiculum (skwalen z dodatkiem lecytyny 12% w/w i Tween 80 0,5% w/w lub niepełny adiuwant Freunda), podskórnie lub dootrzewnowo. Po upływie 2 tygodni myszy otrzymują przypominającą dawkę antygenu w podobnej kompozycji. Miano przeciwciał w surowicy jest mierzone po upływie 2 tygodni po pierwszej immunizacji i po 7 dniach od drugiej immunizacji.

Stosując analogiczny protokół immunizacji można użyć także szczepionkę bakteryjną z innego rodzaju i szczepu bakterii.

3. Stymulacja wytwarzania przeciwciał na antygen bakteryjny (Plesiomonas shigelloides) z zastosowaniem rozłącznym MPL i LF.

Myszy są immunizowane mieszaniną 5 μg antygenu bakteryjnego z dodatkiem MPL (5 -20 μg) w vehiculum, podskórnie lub dootrzewnowo. Po upływie 2 tygodni myszy otrzymują przypominającą dawkę antygenu w podobnej kompozycji oraz do picia 0,5% roztwór LF w celu zwiększenia puli komórek pamięciowych. Po upływie 7 i 14 dni pobierana jest krew do oznaczenia poziomu przeciwciał.

4. Proponowany protokół immunizacji ludzi na BCG.

A BCG będzie podawane doustnie razem z 5% kompleksem LF-MPL (100 mg). Dawkę antygenu można powtórzyć po 1 i 3 miesiącach.

B BCG będzie podawane doustnie razem z 1 mg MPL. Po upływie 2 tygodni będzie podawana LF doustnie w tabletkach, codziennie przez okres 10 dni (50 mg dziennie) w celu zwiększenia puli komórek pamięciowych.

W oparciu o dostępny stan techniki można również zaproponować inne skuteczne protokoły immunizacyjne. Poniżej przywołano dokumenty, które należy uwzględnić jako szczególnie pomocne w realizacji niniejszego wynalazku.

Literatura

1. O'Hagan D.T. Recent advances in immunological adjuvants: the development of particulate antigen delivery systems. Exp. Opin. Invest. Drugs, 1998; 7; 349 - 359.

1. O'Hagan D.T., Mackichan M.L., Singh M. 2001: Recent developments in adjuvants for vaccines against infectious diseases. Biomol. Eng. 18: 69-85.

2. Gluck R., Walti E.: Biophysical validation of Epaxal Berna, a hepatitis A vaccine adjuvanted with immunopotentiating reconstituted influenza virosomes (IRIV). Dev. Biol. (Basel) 2000, 103, 189-197.

PL 204 477 B1

3. Jensen F.C., Savary J.R., Diveley J.P., Chang J.C.: Adjuvant activity of incomplete Freund's adjuvant. Adv. Drug Deliv. Rev. 1998, 32, 173-186.

4. Persing D.H., Coler R.N., Lacy M.J., Johnson D.A., Baldridge J.R., Hershberg R.M., Reed

S.G.: Taking toll: lipid A mimetics as adjuvants and immunomodulators. Trends Microbiol. 2002, 10(10 Suppl), S32-37.

5. De Becker G., Moulin V., Pajak B., Brack C, Francotte M., Thiriart C, Urbain J., Moser M.: The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells. Int. Immunol. 2000, 12, 807-815.

6. Zhou F., Huang L.: Monophosphoryl lipid A enhances specific CTL induction by a soluble protein antigen entrapped in liposomes. Vaccine 1993, 11, 1139-1144.

7. Baldridge J.R., Yorgensen Y., Ward J.R., Ulrich J.T.: Monophosphoryl lipid A enhances mucosal and systemic immunity to vaccine antigens following intranasal administration. Vaccine 2000, 18, 2416-2425.

8. Zimecki M, Kruzel ML Immunol Lett. 2000 Nov 1;74(3): 183-8 Systemic or local co-administration of lactoferrin with sensitizing dose of antigen enhances delayed type hypersensitivity in mice.

9. Baveye S, Elass E, Mazurier J, Spik G, Legrand D. Lactoferrin: a multifunctional glycoprotein involved in the modulation of the inflammatory process. Clin Chem Lab Med. 1999 Mar;37(3):281-6.

10. Bhimani RS, Vendrow Y, Furmanski P. Influence of lactoferrin feeding and injection against systemic staphylococcal infections in mice. J Appl Microbiol 1999; 86: 135-144.

11. Sato R, Inanami O, Tanaka Y, Takese M, Naito Y. Oral administration of bovine lactoferrin for treatment of intractable stomatitis in feline immunodeficiency virus (FlV)-positive and FIV-negative cats. Am J Vet Res 1996; 57: 1443-1446.

12. Wakabayashi H, Abe S, Okutomi T, Tansho S, Kawase K, Yamaguchi H. Cooperative anti-Candida effects of lactoferrin or its peptides in combination with azole antifungal agents. Microbiol Immunol 1996; 40: 821-825.

13. Iigo M, Kuhara T, Ushida Y, Sekine K, Moore MA, Tsuda H. Inhibitory effects of bovine lactoferrin on colon carcinoma 26 lung metastasis in mice. Clin Exp Metastasis. 1999 Feb;17(1):35-40.

14. Zimecki M, Mazurier J, Machnicki M, Wieczorek Z, Montreuil J, Spik G. Immunostimulatory activity of lactotransferrin and maturation of CD4- CD8-murine thymocytes. Immunol Lett. 1991 Sep;30(1):119-23.

15. Zimecki M, Mazurier J, Spik G, Kapp JA. Human lactoferrin induces phenotypic and functional changes in murine splenic B cells. Immunology. 1995 Sep;86(1): 122-7.

16. Van Berkel PH, Geerts ME, van Veen HA, Mericskay M, de Boer HA, Nuijens JH. N-terminal stretch Arg2, Arg3, Arg4 and Arg5 of human lactoferrin is essential for binding to heparin, bacterial lipopolysaccharide, human lysozyme and DNA. Biochem J. 1997 Nov 15;328(Pt 1):145-51.

17. Appelmelk BJ, An YQ, Geerts M, Thijs BG, de Boer HA, MacLaren DM, de Graaff J, Nuijens JH. Lactoferrin is a lipid A-binding protein. Infect Immun. 1994 Jun;62(6):2628-32.

18. Brandenburg K, Jurgens G, Muller M, Fukuoka S, Koch MH.Biol Chem. 2001 Aug;382(8):1215-25. Biophysical characterization of lipopolysaccharide and lipid A inactivation by lactoferrin.

19. Baker H.M., Anderson B.F., Kidd R.D., Shewry S.C. Baker E.N. Lactoferrin threedimensional structure: a framework for interpreting function. W: Lactoferrin: Structure, Function and Applications, red.: Shimazaki K., Tsuda H., Tomita M., Kuwata T., Perraudin J.P. Elsevier Science BV, Amsterdam 2000, 3-16.

20. Petersson, C, Niedziela, T., Jachymek, W., Kenne, L., Zarzecki, P. and Lugowski, C. (1997) Structural studies of the O-specific polysaccharide of Hafnia alvei strain PCM 1206 lipopolysaccharide containing D-allothreonine. European Journal of Biochemistry 244, 580-6.

21. Westphal, O.and Jann, K. (1965) Bacterial lipopolysacharides: Extraction with Phenol-Water and further applications of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-89.

22. Belanger, M., Begin, C.and Jacques, M. (1995) Lipopolysaccharides of Actinobacillus pleuropneumoniae bind pig hemoglobin. Infect. Immun. 63, 656-662.

23. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-5.

24. Tsai, C. M. and Frasch, C. E. (1982) A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry 119, 115-9.

PL 204 477 B1

25. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L.andRandall, R. J. (1951) Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275.

26. Mishell RI, Dutton RW. 1967 Immunization of dissociated spleen cell cultures from normal mice. J Exp Med 126, 423-42.

27. Espevik, T. and Nissen-Meyer, J. (1986) A highly sensitive cell line, WEHI 164 clone 13, for measuring cytotoxic factor/tumor necrosis factor from human monocytes. J. Immunol. Methods 95, 99-105.

28. Hansen, M.B., Nielsen, S.E. and Berg, K. (1989) Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J. Immunol. Methods 119, 203-210.

PL 204 477 B1

Wykaz sekwencji <110> Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN <120> Kompozycja farmaceutyczna i jej zastosowanie <130> PK/0109/RW <160> 7 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 689 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 1

Ala

Pro

Arg

Lys

Asn

Val

Arg

Trp

Cys

Thr

Ile

Ser

Gin

Pro

Glu

Trp

1

5

10

15

Phe

Lys

Cys

Arg

Arg

Trp

Gin

Trp

Arg

Met

Lys

Lys

Leu

Gly

Ala

Pro

20

25

30

Ser

Ile

Thr

Cys

Val

Arg

Arg

Ala

Phe

Ala

Leu

Glu

Cys

Ile

Arg

Ala

35

40

45

Ile

Ala

Glu

Lys

Lys

Ala

Asp

Ala

Val

Thr

Leu

Asp

Gly

Gly

Met

Val

50

55

60

Phe

Glu

Ala

Gly

Arg

Asp

Pro

Tyr

Lys

Leu

Arg

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

65

70

75

80

Ile

Tyr

Gly

Thr

Lys

Glu

Ser

Pro

Gin

Thr

His

Tyr

Tyr

Ala

Val

Ala

85

90

95

Val

Val

Lys

Lys

Gly

Ser

Asn

Phe

Gin

Leu

Asp

Gin

Leu

Gin

Gly

Arg

100

105

110

Lys

Ser

Cys

His

Thr

Gly

Leu

Gly

Arg

Ser

Ala

Gly

Trp

Ile

Ile

Pro

115

120

125

Met

Gly

Ile

Leu

Arg

Pro

Tyr

Leu

Ser

Trp

Thr

Glu

Ser

Leu

Glu

Pro

130

135

140

Leu

Gin

Gly

Ala

Val

Ala

Lys

Phe

Phe

Ser

Ala

Ser

Cys

Val

Pro

Cys

145

150

155

160

Ile

Asp

Arg

Gin

Ala

Tyr

Pro

Asn

Leu

Cys

Gin

Leu

Cys

Lys

Gly

Glu

Gly

165

170

175

Glu

Asn

Gin

Cys

Ala

Cys

Ser

Ser

Arg

Glu

Pro

Tyr

Phe

Gly

Tyr

180

185

190

Ser

Gly

Ala

Phe

Lys

Cys

Leu

Gin

Asp

Gly

Ala

Gly

Asp

Val

Ala

Phe

195

200

205

Val

Lys

Glu

Thr

Thr

Val

Phe

Glu

Asn

Leu

Pro

Glu

Lys

Ala

Asp

Arg

210

215

220

Asp

Gin

Tyr

Glu

Leu

Leu

Cys

Leu

Asn

Asn

Ser

Arg

Ala

Pro

Val

Asp

225

230

235

240

Ala

Phe

Lys

Glu

Cys

His

Leu

Ala

Gin

Val

Pro

Ser

His

Ala

Val

Val

245

250

255

Ala

Arg

Ser

Val

Asp

Gly

Lys

Glu

Asp

Leu

Ile

Trp

Lys

Leu

Leu

Ser

260

265

270

Lys

Ala

Gin

Glu

Lys

Phe

Gly

Lys

Asn

Lys

Ser

Arg

Ser

Phe

Gin

Leu

275

280

285

Phe

Gly

Ser

Pro

Pro

Gly

Gin

Arg

Asp

Leu

Leu

Phe

Lys

Asp

Ser

Ala

290

295

300

Leu

Gly

Phe

Leu

Arg

Ile

Pro

Ser

Lys

Val

Asp

Ser

Ala

Leu

Tyr

Leu

305

310

315

320

Gly

Ser

Arg

Tyr

Leu

Thr

Thr

Leu

Lys

Asn

Leu

Arg

Glu

Thr

Ala

Glu

325

330

335

Glu

Val

Lys

Ala

Arg

Tyr

Thr

Arg

Val

Val

Trp

Cys

Ala

Val

Gly

Pro

340

345

350

Glu

Glu

Gin

Lys

Lys

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Gin

Gin

Ser

Gly

Gin

Asn

355

360

365

Val

Thr

Cys

Ala

Thr

Ala

Ser

Thr

Thr

Asp

Asp

Cys

Ile

Val

Leu

Val

370

375

380

Leu

Lys

Gly

Glu

Ala

Asp

Ala

Leu

Asn

Leu

Asp

Gly

Gly

Tyr

Ile

Tyr

PL 204 477 B1

385

390

395

400

Thr

Ala

Gly

Lys

Cys

Gly

Leu

Val

Pro

Val

Leu

Ala

Glu

Asn

Arg

Lys

405

410

415

Ser

Ser

Lys

His

Ser

Ser

Leu

Asp

Cys

Val

Leu

Arg

Pro

Thr

Glu

Gly

420

425

430

Tyr

Leu

Ala

Val

Ala

Val

Val

Lys

Lys

Ala

Asn

Glu

Gly

Leu

Thr

Trp

435

440

445

Asn

Ser

Leu

Lys

Asp

Lys

Lys

Ser

Cys

His

Thr

Ala

Val

Asp

Arg

Thr

450

455

460

Ala

Gly

Trp

Asn

Ile

Pro

Met

Gly

Leu

Ile

Val

Asn

Gin

Thr

Gly

Ser

465

470

475

480

Cys

Ala

Phe

Asp

Glu

Phe

Phe

Ser

Gin

Ser

Cys

Ala

Pro

Gly

Ala

Asp

485

490

495

Pro

Lys

Ser

Arg

Leu

Cys

Ala

Leu

Cys

Ala

Gly

Asp

Asp

Gin

Gly

Leu

500

505

510

Asp

Lys

Cys

Val

Pro

Asn

Ser

Lys

Glu

Lys

Tyr

Tyr

Gly

Tyr

Thr

Gly

515

520

525

Ala

Phe

Arg

Cys

Leu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Asp

Val

Ala

Phe

Val

Lys

530

535

540

Asn

Asp

Thr

Val

Trp

Glu

Asn

Thr

Asn

Gly

Glu

Ser

Thr

Ala

Asp

Trp

545

550

555

560

Ala

Lys

Asn

Leu

Asn

Arg

Glu

Asp

Phe

Arg

Leu

Leu

Cys

Leu

Asp

Gly

565

570

575

Thr

Arg

Lys

Pro

Val

Thr

Glu

Ala

Gin

Ser

Cys

His

Leu

Ala

Val

Ala

580

585

590

Pro

Asn

His

Ala

Val

Val

Ser

Arg

Ser

Asp

Arg

Ala

Ala

His

Val

Lys

595

600

605

Gin

Val

Leu

Leu

His

Gin

Gin

Ala

Leu

Phe

Gly

Lys

Asn

Gly

Lys

Asn

610

615

620

Cys

Pro

Asp

Lys

Phe

Cys

Leu

Phe

Lys

Ser

Glu

Thr

Lys

Asn

Leu

Leu

625

630

635

640

Phe

Asn

Asp

Asn

Thr

Glu

Cys

Leu

Ala

Lys

Leu

Gly

Gly

Arg

Pro

Thr

645

650

655

Tyr

Glu

Glu

Tyr

Leu

Gly

Thr

Glu

Tyr

Val

Thr

Ala

Ile

Ala

Asn

Leu

660

665

670

Lys

Lys

Cys

Ser

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu

Glu

Ala

Cys

Ala

Phe

Leu

Thr

675

680

695

Arg

<2io> :

2

<211>

692

<212>

PRT

<213> 1

Homo

sapiens

<400>

2

Gly

Arg

Arg

Arg

Arg

Ser

Val

Gin

Trp

Cys

Ala

Val

Ser

Gin

Pro

Glu

1

5

10

15

Ala

Thr

Lys

Cys

Phe

Gin

Trp

Gin

Arg

Asn

Met

Arg

Lys

Val

Arg

Gly

20

25

30

Pro

Pro

Val

Ser

Cys

Ile

Lys

Arg

Asp

Ser

Pro

Ile

Gin

Cys

Ile

Gin

35

40

45

Ala

Ile

Ala

Glu

Asn

Arg

Ala

Asp

Ala

Val

Thr

Leu

Asp

Gly

Gly

Phe

50

55

60

Ile

Tyr

Glu

Ala

Gly

Leu

Ala

Pro

Tyr

Lys

Leu

Arg

Pro

Val

Ala

Ala

65

70

75

80

Gin

Val

Tyr

Gly

Thr

Glu

Arg

Gin

Pro

Arg

Thr

His

Tyr

Tyr

Ala

Val

85

90

95

Ala

Val

Val

Lys

Lys

Gly

Gly

Ser

Phe

Gin

Leu

Asn

Glu

Leu

Gin

Gly

PL 204 477 B1

100

105

110

Leu

Lys

Ser

Cys

His

Thr

Gly

Leu

Arg

Arg

Thr

Ala

Gly

Trp

Asn

Val

115

120

125

Pro

Thr

Gly

Thr

Leu

Arg

Pro

Phe

Leu

Asn

Trp

Thr

Gly

Pro

Pro

Glu

130

135

140

Pro

Ile

Glu

Ala

Ala

Val

Ala

Arg

Phe

Phe

Ser

Ala

Ser

Cys

Val

Pro

145

150

155

160

Gly

Ala

Asp

Lys

Gly

Gin

Phe

Pro

Asn

Leu

Cys

Arg

Leu

Cys

Ala

Gly

165

170

175

Thr

Gly

Glu

Asn

Lys

Cys

Ala

Phe

Ser

Ser

Gin

Glu

Pro

Tyr

Phe

Ser

180

185

190

Tyr

Ser

Gly

Ala

Phe

Lys

Cys

Leu

Arg

Asp

Gly

Ala

Gly

Asp

Val

Ala

195

200

205

Phe

Ile

Arg

Glu

Ser

Thr

Val

Phe

Glu

Asp

Leu

Ser

Asp

Glu

Ala

Glu

210

215

220

Arg

Asp

Glu

Tyr

Glu

Leu

Leu

Cys

Pro

Asp

Asn

Thr

Arg

Lys

Pro

Val

225

230

235

240

Asp

Lys

Phe

Lys

Asp

Cys

His

Leu

Ala

Arg

Val

Pro

Ser

His

Ala

Val

245

250

255

Val

Ala

Arg

Ser

Val

Asn

Gly

Lys

Glu

Asp

Ala

Ile

Trp

Asn

Leu

Leu

260

265

270

Arg

Gin

Ala

Gin

Glu

Lys

Phe

Gly

Lys

Asp

Lys

Ser

Pro

Lys

Phe

Gin

275

280

285

Leu

Phe

Gly

Ser

Pro

Ser

Gly

Gin

Lys

Asp

Leu

Leu

Phe

Lys

Asp

Ser

290

295

300

Ala

Ile

Gly

Phe

Ser

Arg

Val

Pro

Pro

Arg

Ile

Asp

Ser

Gly

Leu

Tyr

305

310

315

320

Leu

Gly

Ser

Gly

Tyr

Phe

Thr

Ala

Ile

Gin

Asn

Leu

Arg

Lys

Ser

Glu

325

330

335

Glu

Glu

Val

Ala

Ala

Arg

Arg

Ala

Arg

Val

Val

Trp

Cys

Ala

Val

Gly

340

345

350

Glu

Gin

Glu

Leu

Arg

Lys

Cys

Asn

Gin

Trp

Ser

Gly

Leu

Ser

Glu

Gly

355

360

365

Ser

Val

Thr

Cys

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Thr

Glu

Asp

Cys

Ile

Ala

Leu

370

375

380

Val

Leu

Lys

Gly

Glu

Ala

Asp

Ala

Met

Ser

Leu

Asp

Gly

Gly

Tyr

Val

385

390

395

400

Tyr

Thr

Ala

Cys

Lys

Cys

Gly

Leu

Val

Pro

Val

Leu

Ala

Glu

Asn

Tyr

405

410

415

Lys

Ser

Gin

Gin

Ser

Ser

Asp

Pro

Asp

Pro

Asn

Cys

Val

Asp

Arg

Pro

420

425

430

Val

Glu

Gly

Tyr

Leu

Ala

Val

Ala

Val

Val

Arg

Arg

Ser

Asp

Thr

Ser

435

440

445

Leu

Thr

Trp

Asn

Ser

Val

Lys

Gly

Lys

Lys

Ser

Cys

His

Thr

Ala

Val

450

455

460

Asp

Arg

Thr

Ala

Gly

Trp

Asn

Ile

Pro

Met

Gly

Leu

Leu

Phe

Asn

Gin

465

470

475

480

Thr

Gly

Ser

Cys

Lys

Phe

Asp

Glu

Tyr

Phe

Ser

Gin

Ser

Cys

Al a

Pro

485

490

495

Gly

Ser

Asp

Pro

Arg

Ser

Asn

Leu

Cys

Ala

Leu

Cys

Ile

Gly

Asp

Glu

500

505

510

Gin

Gly

Glu

Asn

Lys

Cys

Val

Pro

Asn

Ser

Asn

Glu

Arg

Tyr

Tyr

Gly

515

520

525

Tyr

Thr

Gly

Ala

Phe

Arg

Cys

Leu

Ala

Glu

Asn

Ala

Gly

Asp

Val

Ala

530

535

540

Phe

Val

Lys

Asp

Val

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Thr

Asp

Gly

Asn

Asn

Asn

545

550

555

560

Glu

Ala

Trp

Ala

Lys

Asp

Leu

Lys

Leu

Ala

Asp

Phe

Ala

Leu

Leu

Cys

565

570

575

Leu

Asp

Gly

Lys

Arg

Lys

Pro

Val

Thr

Glu

Ala

Arg

Ser

Cys

His

Leu

580

585

590

PL 204 477 B1

Ala Met

Ala 595

Pro Asn His Ala

Val 600

Val

Ser

Arg Met Asp Lys Val 605

Glu

Arg

Leu

Lys

Gin

Val

Leu

Leu

His

Gin

Gin

Ala

Lys

Phe

Gly

Arg

Asn

610

615

620

Gly

Ser

Asp

Cys

Pro

Asp

Lys

Phe

Cys

Leu

Phe

Gin

Ser

Glu

Thr

Lys

625

630

635

640

Asn

Leu

Leu

Phe

Asn

Asp

Asn

Thr

Glu

Cys

Leu

Ala

Arg

Leu

His

Gly

645

650

655

Lys

Thr

Thr

Tyr

Glu

Lys

Tyr

Leu

Gly

Pro

Gin

Tyr

Val

Ala

Gly

Ile

660

665

670

Thr

Asn

Leu

Lys

Lys

Cys

Ser

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu

Glu

Ala

Cys

Glu

675

680

685

Phe

Leu

Arg

Lys

690 <210> 3 <211> 689 <212> PRT <213> Eguus caballus <400> 3

Ala

Pro

Arg

Lys

Ser

Val

Arg

Trp

Cys

Thr

Ile

Ser

Pro

Ala

Glu

Ala

1

5

10

15

Ala

Lys

Cys

Ala

Lys

Phe

Gin

Arg

Asn

Met

Lys

Lys

Val

Arg

Gly

Pro

20

25

30

Ser

Val

Ser

Cys

Ile

Arg

Lys

Thr

Ser

Ser

Phe

Glu

Cys

Ile

Gin

Ala

35

40

45

Ile

Ala

Ala

Asn

Lys

Ala

Asp

Ala

Val

Thr

Leu

Asp

Gly

Gly

Leu

Val

50

55

60

Tyr

Glu

Ala

Gly

Leu

His

Pro

Tyr

Lys

Leu

Arg

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

65

70

75

80

Val

Tyr

Gin

Thr

Arg

Gly

Lys

Pro

Gin

Thr

Arg

Tyr

Tyr

Ala

Val

Ala

85

90

95

Val

Val

Lys

Lys

Gly

Ser

Gly

Phe

Gin

Leu

Asn

Gin

Leu

Gin

Gly

Val

100

105

110

Lys

Ser

Cys

His

Thr

Gly

Leu

Gly

Arg

Ser

Ala

Gly

Trp

Asn

Ile

Pro

115

120

125

Ile

Gly

Thr

Leu

Arg

Pro

Tyr

Leu

Asn

Trp

Thr

Gly

Pro

Pro

Glu

Pro

130

135

140

Leu

Gin

Lys

Ala

Val

Ala

Asn

Phe

Phe

Ser

Ala

Ser

Cys

Val

Pro

Cys

145

150

155

160

Ala

Asp

Gly

Lys

Gin

Tyr

Pro

Asn

Leu

Cys

Arg

Leu

Cys

Ala

Gly

Thr

165

170

175

Glu

Ala

Asp

Lys

Cys

Ala

Cys

Ser

Ser

Gin

Glu

Pro

Tyr

Phe

Gly

Tyr

180

185

190

Ser

Gly

Ala

Phe

Lys

Cys

Leu

Glu

Asn

Gly

Ala

Gly

Asp

Val

Ala

Phe

195

200

205

Val

Lys

Asp

Ser

Thr

Val

Phe

Glu

Asn

Leu

Pro

Asp

Glu

Ala

Asp

Arg

210

215

220

Asp

Lys

Tyr

Glu

Leu

Leu

Cys

Pro

Asp

Asn

Thr

Arg

Lys

Pro

Val

Asp

225

230

235

240

Ala

Phe

Lys

Glu

Cys

His

Leu

Ala

Arg

Val

Pro

Ser

His

Ala

Val

Val

245

250

255

Ala

Arg

Ser

Val

Asp

Gly

Arg

Glu

Asp

Leu

Ile

Trp

Arg

Leu

Leu

His

260

265

270

Arg

Ala

Gin

Glu

Glu

Phe

Gly

Arg

Asn

Lys

Ser

Ser

Ala

Phe

Gin

Leu

275

280

285

Phe

Lys

Ser

Thr

Pro

Glu

Asn

Lys

Asp

Leu

Leu

Phe

Lys

Asp

Ser

Ala

290 295 300

PL 204 477 B1

Leu

Gly

Phe

Val

Arg

Ile

Pro

Ser

Gin

Ile

Asp

Ser

Gly

Leu

Tyr

Leu

305

310

315

320

Gly

Ala

Asn

Tyr

Leu

Thr

Ala

Thr

Gin

Asn

Leu

Arg

Glu

Thr

Ala

Ala

325

330

335

Glu

Val

Ala

Ala

Arg

Arg

Glu

Arg

Val

Val

Trp

Cys

Ala

Val

Gly

Pro

340

345

350

Glu

Glu

Glu

Arg

Lys

Cys

Lys

Gin

Trp

Ser

Asp

Val

Ser

Asn

Arg

Lys

355

360

365

Val

Ala

Cys

Ala

Ser

Ala

Ser

Thr

Thr

Glu

Glu

Cys

Ile

Ala

Leu

Val

370

375

380

Leu

Lys

Gly

Glu

Ala

Asp

Ala

Leu

Asn

Leu

Asp

Gly

Gly

Phe

Ile

Tyr

385

390

395

400

Val

Ala

Gly

Lys

Cys

Gly

Leu

Val

Pro

Val

Leu

Ala

Glu

Asn

Gin

Lys

405

410

415

Ser

Gin

Asn

Ser

Asn

Ala

Pro

Asp

Cys

Val

His

Arg

Pro

Pro

Glu

Gly

420

425

430

Tyr

Leu

Ala

Val

Ala

Val

Val

Arg

Lys

Ser

Asp

Ala

Asp

Leu

Thr

Trp

435

440

445

Asn

Ser

Leu

Ser

Gly

Lys

Lys

Ser

Cys

His

Thr

Gly

Val

Gly

Arg

Thr

450

455

460

Ala

Ala

Trp

Asn

Ile

Pro

Met

Gly

Leu

Leu

Phe

Asn

Gin

Thr

Gly

Ser

4 65

470

475

480

Cys

Lys

Phe

Asp

Lys

Phe

Phe

Ser

Gin

Ser

Cys

Ala

Pro

Gly

Ala

Asp

485

490

495

Pro

Gin

Ser

Ser

Leu

Cys

Ala

Leu

Cys

Val

Gly

Asn

Asn

Glu

Asn

Glu

500

505

510

Asn

Lys

Cys

Met

Pro

Asn

Ser

Glu

Glu

Arg

Tyr

Tyr

Gly

Tyr

Thr

Gly

515

520

525

Ala

Phe

Arg

Cys

Leu

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

Asp

Val

Ala

Phe

Val

Lys

530

535

540

Asp

Val

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Thr

Asp

Gly

Lys

Asn

Ser

Glu

Pro

Trp

545

550

555

560

Ala

Lys

Asp

Leu

Lys

Gin

Glu

Asp

Phe

Glu

Leu

Leu

Cys

Leu

Asp

Gly

565

570

575

Thr

Arg

Lys

Pro

Val

Ala

Glu

Ala

Glu

Ser

Cys

His

Leu

Ala

Arg

Ala

580

585

590

Pro

Asn

His

Ala

Val

Val

Ser

Gin

Ser

Asp

Arg

Ala

Gin

His

Leu

Lys

595

600

605

Lys

Val

Leu

Phe

Leu

Gin

Gin

Asp

Gin

Phe

Gly

Gly

Asn

Gly

Pro

Asp

610

615

620

Cys

Pro

Gly

Lys

Phe

Cys

Leu

Phe

Lys

Ser

Glu

Thr

Lys

Asn

Leu

Leu

625

630

635

640

Phe

Asn

Asp

Asn

Thr

Glu

Cys

Leu

Ala

Glu

Leu

Gin

Gly

Lys

Thr

Thr

645

650

655

Tyr

Glu

Gin

Tyr

Leu

Gly

Ser

Glu

Tyr

Val

Thr

Ser

Ile

Thr

Asn

Leu

660

665

670

Arg

Arg

Cys

Ser

Ser

Ser

Pro

Leu

Leu

Glu

Ala

Cys

Ala

Phe

Leu

Arg

675

680

685

Ala <210> 4 <211> 704 <212> PRT <213> Sus scrofa domestica <220>

PL 204 477 B1

<221> SIGNAL

<222>

(1) ·

< 19)

<223>

<400> ‘

1

Met

Lys

Leu

Phe

Ile

Pro

Ala

Leu

Leu

Phe

Leu

Trp

Thr

Leu

Gly

Leu

1

5

10

15

Cys

Leu

Ala

Ala

Pro

Lys

Lys

Gly

Val

Arg

Trp

Cys

Val

Ile

Ser

Thr

20

25

30

Ala

Glu

Tyr

Ser

Lys

Cys

Arg

Gin

Trp

Gin

Ser

Lys

Ile

Arg

Arg

Thr

35

40

45

Asn

Pro

Ile

Phe

Cys

Ile

Arg

Arg

Ala

Ser

Pro

Thr

Asp

Cys

Ile

Arg

50

55

60

Ala

Ile

Ala

Ala

Lys

Arg

Ala

Asp

Ala

Val

Thr

Leu

Asp

Gly

Gly

Leu

65

70

75

80

Val

Phe

Glu

Ala

Gly

Gin

Tyr

Lys

Leu

Arg

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Ile

85

90

95

Tyr

Gly

Thr

Glu

Glu

Asn

Pro

Gin

Thr

Tyr

Tyr

Tyr

Ala

Val

Ala

Val

100

105

110

Val

Lys

Lys

Gly

Phe

Asn

Phe

Gin

Leu

Asn

Gin

Leu

Gin

Gly

Arg

Lys

115

120

125

Ser

Cys

His

Ile

Gly

Leu

Gly

Arg

Ser

Ala

Gly

Trp

Asn

Ile

Pro

Ile

130

135

140

Gly

Leu

Leu

Arg

Arg

Phe

Leu

Asp

Trp

Ala

Gly

Pro

Pro

Glu

Pro

Leu

145

150

155

160

Gin

Lys

Ala

Val

Ala

Lys

Phe

Phe

Ser

Gin

Ser

Cys

Val

Pro

Cys

Ala

165

170

175

Asp

Gly

Asn

Ala

Tyr

Pro

Asn

Leu

Cys

Gin

Leu

Cys

Ile

Gly

Lys

Gly

180

185

190

Lys

Asp

Lys

Cys

Ala

Cys

Ser

Ser

Gin

Glu

Pro

Tyr

Phe

Gly

Tyr

Ser

195

200

205

Gly

Ala

Phe

Asn

Cys

Leu

His

Lys

Gly

Ile

Gly

Asp

Val

Ala

Phe

Val

210

215

220

Lys

Glu

Ser

Thr

Val

Phe

Glu

Asn

Leu

Pro

Gin

Lys

Ala

Asp

Arg

Asp

225

230

235

240

Lys

Tyr

Glu

Leu

Leu

Cys

Pro

Asp

Asn

Thr

Arg

Lys

Pro

Val

Glu

Ala

245

250

255

Phe

Arg

Glu

Cys

His

Leu

Ala

Arg

Val

Pro

Ser

His

Ala

Val

Val

Ala

260

265

270

Arg

Ser

Val

Asn

Gly

Lys

Glu

Asn

Ser

Ile

Trp

Ser

Leu

Leu

Tyr

Gin

275

280

285

Ser

Gin

Lys

Lys

Phe

Gly

Lys

Ser

Asn

Pro

Gin

Glu

Phe

Gin

Leu

Phe

290

295

300

Gly

Ser

Pro

Gly

Gin

Gin

Lys

Asp

Leu

Leu

Phe

Arg

Asp

Ala

Thr

Ile

305

310

315

320

Gly

Phe

Leu

Lys

Ile

Pro

Ser

Lys

Ile

Asp

Ser

Lys

Leu

Tyr

Leu

Gly

325

330

335

Leu

Pro

Tyr

Leu

Thr

Ala

Ile

Gin

Gly

Leu

Arg

Glu

Thr

Ala

Ala

Glu

340

345

350

Val

Glu

Ala

Arg

Gin

Ala

Lys

Val

Val

Trp

Cys

Ala

Val

Gly

Pro

Glu

355

360

365

Glu

Leu

Arg

Lys

Cys

Arg

Gin

Trp

Ser

Ser

Gin

Ser

Ser

Gin

Asn

Leu

370

375

380

Asn

Cys

Ser

Leu

Ala

Ser

Thr

Thr

Glu

Asp

Cys

Ile

Val

Gin

Val

Leu

385

390

395

400

Lys

Gly

Glu

Ala

Asp

Ala

Met

Ser

Leu

Asp

Gly

Gly

Phe

Ile

Tyr

Thr

405

410

415

Ala

Gly

Lys

Cys

Gly

Leu

Val

Pro

Val

Leu

Ala

Glu

Asn

Gin

Lys

Ser

420

425

430

PL 204 477 B1

Arg

Gin Ser 435

Ser

Ser

Ser Asp Cys 440

Val His Arg Pro

Thr Gin Gly Tyr 445

Phe

Ala

Val

Ala

Val

Val

Arg

Lys

Ala

Asn

Gly

Gly

Ile

Thr

Trp

Asn

450

455

460

Ser

Val

Arg

Gly

Thr

Lys

Ser

Cys

His

Thr

Ala

Val

Asp

Arg

Thr

Ala

465

470

475

480

Gly

Trp

Asn

Ile

Pro

Met

Gly

Leu

Leu

Val

Asn

Gin

Thr

Gly

Ser

Cys

485

490

495

Lys

Phe

Asp

Glu

Phe

Phe

Ser

Gin

Ser

Cys

Ala

Pro

Gly

Ser

Gin

Pro

500

505

510

Gly

Ser

Asn

Leu

Cys

Ala

Leu

Cys

Val

Gly

Asn

Asp

Gin

Gly

Val

Asp

515

520

525

Lys

Cys

Val

Pro

Asn

Ser

Asn

Glu

Arg

Tyr

Tyr

Gly

Tyr

Thr

Gly

Ala

530

535

540

Phe

Arg

Cys

Leu

Ala

Glu

Asn

Ala

Gly

Asp

Val

Ala

Phe

Val

Lys

Asp

545

550

555

560

Val

Thr

Val

Leu

Asp

Asn

Thr

Asn

Gly

Gin

Asn

Thr

Gin

Glu

Trp

Ala

565

570

575

Arg

Glu

Leu

Arg

Ser

Asp

Asp

Phe

Glu

Leu

Leu

Cys

Leu

Asn

Gly

Thr

580

585

590

Arg

Lys

Pro

Val

Thr

Glu

Ala

Gin

Asn

Cys

His

Leu

Ala

Val

Ala

Pro

595

600

605

Ser

His

Ala

Val

val

Ser

Arg

Lys

Glu

Lys

Ala

Ala

Gin

Val

Glu

Gin

610

615

620

Met

Leu

Leu

Thr

Glu

Gin

Ala

Gin

Phe

Gly

Arg

Tyr

Gly

Lys

Asp

Cys

625

630

635

640

Pro

Asp

Lys

Phe

Cys

Leu

Phe

Arg

Ser

Glu

Thr

Lys

Asn

Leu

Leu

Phe

645

650

655

Asn

Asp

Asn

Thr

Glu

Cys

Leu

Ala

Gin

Leu

Gin

Gly

Lys

Thr

Thr

Tyr

660

665

670

Glu

Lys

Tyr

Leu

Gly

Ser

Glu

Tyr

Val

Thr

Ala

Ile

Ala

Asn

Leu

Lys

675

680

685

Gin

Cys

Ser

Val

Ser

Pro

Leu

Leu

Gly

Ala

Cys

Ala

Phe

Met

Met

Arg

690 695 700 <Ż10> 5 <211> 707 <212> PRT <213> Mus musculus <220>

<221> :

31GNAŁ

<222>

(1) ..

(19)

<223>

<400>

5

Met Arg

Leu

Leu

Ile

Pro

Ser

Leu

Ile

Phe

Leu

Glu

Ala

Leu

Gly

Leu

1

5

10

15

Cys Leu

Ala

Lys

Ala

Thr

Thr

Val

Gin

Trp

Cys

Ala

Val

Ser

Asn

Ser

20

25

30

Glu Glu

Glu

Lys

Cys

Leu

Arg

Trp

Gin

Asn

Glu

Met

Arg

Lys

Val

Gly

35

40

45

Gly Pro

Pro

Leu

Ser

Cys

Val

Lys

Lys

Ser

Ser

Thr

Arg

Gin

Cys

Ile

50

55

60

Gin Ala

Ile

Val

Thr

Asn

Arg

Ala

Asp

Ala

Met

Thr

Leu

Asp

Gly

Gly

70 75 80

PL 204 477 B1

Thr Met

Phe Asp Ala 85

Gly Lys< Pro

Pro

Tyr 90

Lys

Leu

Arg

Pro

Val 95

Ala

Ala

Glu

Val

Tyr

Gly

Thr

Lys

Glu

Gin

Pro

Arg

Thr

His

Tyr

Tyr

Ala

100

105

110

Val

Ala

Val

Val

Lys

Asn

Ser

Ser

Asn

Phe

His

Leu

Asn

Gin

Leu

Gin

115

120

125

Gly

Leu

Arg

Ser

Cys

His

Thr

Gly

Ile

Gly

Arg

Ser

Ala

Gly

Trp

Lys

130

135

140

Ile

Pro

Ile

Gly

Thr

Leu

Arg

Pro

Tyr

Leu

Asn

Trp

Asn

Gly

Pro

Pro

145

150

155

160

Ala

Ser

Leu

Glu

Glu

Ala

Val

Ser

Lys

Phe

Phe

Ser

Lys

Ser

Cys

Val

165

170

175

Pro

Gly

Ala

Gin

Lys

Asp

Arg

Phe

Pro

Asn

Leu

Cys

Ser

Ser

Cys

Ala

180

185

190

Gly

Thr

Gly

Ala

Asn

Lys

Cys

Ala

Ser

Ser

Pro

Glu

Glu

Pro

Tyr

Ser

195

200

205

Gly

Tyr

Ala

Gly

Ala

Leu

Arg

Cys

Leu

Arg

Asp

Asn

Ala

Gly

Asp

Val

210

215

220

Ala

Phe

Thr

Arg

Gly

Ser

Thr

Val

Phe

Glu

Glu

Leu

Pro

Asn

Lys

Ala

225

230

235

240

Glu

Arg

Asp

Gin

Tyr

Lys

Leu

Leu

Cys

Pro

Asp

Asn

Thr

Trp

Lys

Pro

245

250

255

Val

Thr

Glu

Tyr

Lys

Glu

Cys

His

Leu

Ala

Gin

Val

Pro

Ser

His

Ala

260

265

270

Val

Val

Ser

Arg

Ser

Thr

Asn

Asp

Lys

Glu

Glu

Al a

Ile

Trp

Glu

Leu

275

280

285

Leu

Arg

Gin

Ser

Gin

Glu

Lys

Phe

Gly

Lys

Lys

Gin

Ala

Ser

Gly

Phe

290

295

300

Gin

Leu

Phe

Ala

Ser

Pro

Ser

Gly

Gin

Lys

Asp

Leu

Leu

Phe

Lys

Glu

305

310

315

320

Ser

Ala

Ile

Gly

Phe

Val

Arg

Val

Pro

Gin

Lys

Val

Asp

Val

Gly

Leu

325

330

335

Tyr

Leu

Thr

Phe

Ser

Tyr

Thr

Thr

Ser

Ile

Gin

Asn

Leu

Asn

Lys

Lys

340

345

350

Gin

Gin

Asp

Val

Ile

Ala

Ser

Lys

Ala

Arg

Val

Thr

Trp

Cys

Ala

Val

355

360

365

Gly

Ser

Glu

Glu

Lys

Arg

Lys

Cys

Asp

Gin

Trp

Asn

Arg

Ala

Ser

Arg

370

375

380

Gly

Arg

Val

Thr

Cys

Ile

Ser

Phe

Pro

Thr

Thr

Glu

Asp

Cys

Ile

Val

385

390

395

400

Ala

Ile

Met

Lys

Gly

Asp

Ala

Asp

Ala

Met

Ser

Leu

Asp

Gly

Gly

Tyr

405

410

415

Ile

Tyr

Thr

Ala

Gly

Lys

Cys

Gly

Leu

Val

Pro

Val

Leu

Ala

Glu

Asn

420

425

430

Gin

Lys

Ser

Ser

Lys

Ser

Asn

Gly

Leu

Asp

Cys

Val

Asn

Arg

Pro

Val

435

440

445

Glu

Gly

Tyr

Leu

Ala

Val

Alą

Ala

Val

Arg

Arg

Glu

Asp

Ala

Gly

Phe

450

4 55

460

Thr

Trp

Ser

Ser

Leu

Arg

Gly

Lys

Lys

Ser

Cys

His

Thr

Ala

Val

Asp

4 65

470

475

480

Arg

Thr

Ala

Gly

Trp

Asn

Ile

Pro

Met

Gly

Leu

Leu

Ala

Asn

Gin

Thr

485

490

495

Arg

Ser

Cys

Lys

Phe

Asn

Glu

Phe

Phe

Ser

Gin

Ser

Cys

Ala

Pro

Gly

500

505

510

Ala

Asp

Pro

Lys

Ser

Asn

Leu

Cys

Ala

Leu

Cys

Ile

Gly

Asp

Glu

Lys

515

520

525

Gly

Glu

Asn

Lys

Cys

Ala

Pro

Asn

Ser

Lys

Glu

Arg

Tyr

Gin

Gly

Tyr

530

535

540

Thr

Gly

Ala

Leu

Arg

Cys

Leu

Ala

Glu

Lys

Ala

Gly

Asn

Val

Ala

Phe

545

550

555

560

Leu

Lys

Asp

Ser

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Thr

Asp

Gly

Lys

Asn

Thr

Glu

PL 204 477 B1

565

570

575

Glu

Trp

Ala

Arg

Asn

Leu

Lys

Leu

Lys

Asp

Phe

Glu

Leu

Leu

Cys

Leu

580

585

590

Asp

Asp

Thr

Arg

Lys

Pro

Val

Thr

Glu

Ala

Lys

Asn

Cys

His

Leu

Ala

595

600

605

Ile

Ala

Pro

Asn

His

Ala

Val

Val

Ser

Arg

Thr

Asp

Lys

Val

Glu

Val

610

615

620

Leu

Gin

Gin

Val

Leu

Leu

Asp

Gin

Gin

Val

Gin

Phe

Gly

Arg

Asn

Gly

625

630

635

640

Gin

Arg

Cys

Pro

Gly

Glu

Phe

Cys

Leu

Phe

Gin

Ser

Lys

Thr

Lys

Asn

645

650

655

Leu

Leu

Phe

Asn

Asp

Asn

Thr

Glu

Cys

Leu

Ala

Lys

Ile

Pro

Gly

Lys

660

665

670

Thr

Thr

Ser

Glu

Lys

Tyr

Leu

Gly

Lys

Glu

Tyr

Val

Ile

Ala

Thr

Glu

675

680

685

Arg

Leu

Lys

Gin

Cys

Ser

Ser·

Ser

Pro

Leu

Leu

Glu

Ala

Cys

Ala

Phe

690 695 700

Leu Thr Gin 705 <210> 6 <211> 708 <212> PRT <213> Capra hircus

<220>

<221> SIGNAL

<222>

(1) · ·

(19)

<223>

<400> (

5

Met

Lys

Leu

Phe

Val

Pro

Ala

Leu

Leu

Ser

Leu

Gly

Ala

Leu

Gly

Leu

1

5

10

15

Cys

Leu

Ala

Ala

Pro

Arg

Lys.

Asn

Val

Arg

Trp

Cys

Ala

Ile

Ser

Leu

20

25

30

Pro

Glu

Trp

Ser

Lys

Cys

Tyr

Gin

Trp

Gin

Arg

Arg

Met

Arg

Lys

Leu

35

40

45

Gly

Ala

Pro

Ser

Ile

Thr

Cys

Val

Arg

Arg

Thr

Ser

Ala

Leu

Glu

Cys

50

55

60

Ile

Arg

Ala

Ile

Ala

Gly

Lys

Asn

Ala

Asp

Ala

Val

Thr

Leu

Asp

Ser

65

70

75

80

Gly

Met

Val

Phe

Glu

Ala

Gly

Arg

Asp

Pro

Tyr

Lys

Leu

Arg

Pro

Val

85

90

95

Ala

Ala

Glu

Ile

Tyr

Gly

Thr

Glu

Lys

Ser

Pro

Gin

Thr

His

Tyr

Tyr

100

105

110

Ala

Val

Ala

Val

Vai

Lys

Lys

Gly

Ser

Asn

Phe

Lys

Leu

Asp

Gin

Leu

115

120

125

Gin

Gly

Gin

Lys

Ser

Cys

His

Met

Gly

Leu

Gly

Arg

Ser

Ala

Gly

Trp

130

135

140

Asn

Ile

Pro

Val

Gly

Ile

Leu

Arg

Pro

Pro

Leu

Ser

Trp

Thr

Glu

Ser

145

150

155

160

Ala

Glu

Pro

Leu

Gin

Gly

Ala

Val

Ala

Arg

Phe

Phe

Ser

Ala

Ser

Cys

165

170

175

Val

Pro

Cys

Val

Asp

Gly

Lys

Ala

Tyr

Pro

Asn

Leu

Cys

Gin

Leu

Cys

180

185

190

Lys

Gly

Val

Gly

Glu

Asn

Lys

Cys

Ala

Cys

Ser

Ser

Gin

Glu

Pro

Tyr

PL 204 477 B1

195

200

205

Phe

Gly

Tyr

Ser

Gly

Ala

Phe

Lys

Cys

Leu

Gin

Asp

Gly

Ala

Gly

Asp

210

215

220

Val

Ala

Phe

Val

Lys

Glu

Thr

Thr

Val

Phe

Glu

Asn

Leu

Pro

Glu

Lys

225

230

235

240

Ala

Asp

Arg

Asp

Gin

Tyr

Glu

Leu

Leu

Cys

Leu

Asn

Asn

Thr

Arg

Ala

245

250

255

Pro

Val

Asp

Ala

Phe

Lys

Glu

Cys

His

Leu

Ala

Gin

Val

Pro

Ser

His

260

265

270

Ala

Val

Val

Ala

Arg

Ser

Val

Asp

Gly

Lys

Glu

Asn

Leu

Ile

Trp

Glu

275

280

285

Leu

Leu

Arg

Lys

Ala

Gin

Glu

Lys

Phe

Gly

Lys

Asn

Lys

Ser

Gin

Arg

2 90

295

300

Phe

Gin

Leu

Phe

Gly

Ser

Pro

Glu

Gly

Arg

Arg

Asp

Leu

Leu

Phe

Lys

305

310

315

320

Asp

Ser

Ala

Leu

Gly

Phe

Val

Arg

Ile

Pro

Ser

Lys

Val

Asp

Ser

Ala

325

330

335

Leu

Tyr

Leu

Gly

Ser

Arg

Tyr

Leu

Thr

Ala

Leu

Lys

Asn

Leu

Arg

Glu

340

345

350

Thr

Ala

Glu

Glu

Leu

Lys

Ala

Arg

Cys

Thr

Arg

Val

Val

Trp

Cys

Ala

355

360

365

Val

Gly

Pro

Glu

Glu

Gin

Ser

Lys

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Glu

Gin

Ser

370

375

380

Gly

Gin

Asn

Val

Thr

Cys

Ala

Thr

Ala

Ser

Thr

Thr

Asp

Asp

Cys

Ile

385

390

395

400

Ala

Leu

Val

Leu

Lys

Gly

Glu

Ala

Asp

Ala

Leu

Ser

Leu

Asp

Gly

Gly

405

410

415

Tyr

Ile

Tyr

Thr

Ala

Gly

Lys

Cys

Gly

Leu

Val

Pro

Val

Met

Ala

Glu

420

425

430

Asn

Arg

Lys

Ser

Ser

Lys

Tyr

Ser

Ser

Leu

Asp

Cys

Val

Leu

Arg

Pro

435

440

445

Thr

Glu

Gly

Tyr

Leu

Ala

Val

'Ala

Val

Val

Lys

Lys

Ala

Asn

Glu

Gly

450

455

460

Leu

Thr

Trp

Asn

Ser

Leu

Lys

Gly

Lys

Lys

Ser

Cys

His

Thr

Ala

Val

465

470

475

480

Asp

Arg

Thr

Ala

Gly

Trp

Asn

Ile

Pro

Met

Gly

Leu

Ile

Ala

Asn

Gin

485

490

495

Thr

Gly

Ser

Cys

Ala

Phe

Asp

Glu

Phe

Phe

Ser

Gin

Ser

Cys

Ala

Pro

500

505

510

Gly

Ala

Asp

Pro

Lys

Ser

Ser

Leu

Cys

Ala

Leu

Cys

Ala

Gly

Asp

Asp

515

520

525

Gin

Gly

Leu

Asp

Lys

Cys

Val

Pro

Asn

Ser

Lys

Glu

Lys

Tyr

Tyr

Gly

530

535

540

Tyr

Thr

Gly

Ala

Phe

Arg

Cys

Leu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Asp

Val

Ala

545

550

555

560

Phe

Val

Lys

Asn

Asp

Thr

Val

Trp

Glu

Asn

Thr

Asn

Gly

Glu

Ser

Ser

565

570

575

Ala

Asp

Trp

Ala

Lys

Asn

Leu

Asn

Arg

Glu

Asp

Phe

Arg

Leu

Leu

Cys

580

585

590

Leu

Asp

Gly

Thr

Thr

Lys

Pro

Val

Thr

Glu

Ala

Gin

Ser

Cys

Tyr

Leu

595

600

605

Ala

Val

Ala

Pro

Asn

His

Ala

Val

Val

Ser

Arg

Ser

Asp

Arg

Ala

Ala

610

615

620

His

Val

Glu

Gin

Val

Leu

Leu

His

Gin

Gin

Ala

Leu

Phe

Gly

Lys

Asn

625

630

635

640

Gly

Lys

Asn

Cys

Pro

Asp

Gin

Phe

Cys

Leu

Phe

Lys

Ser

Glu

Thr

Lys

645

650

655

Asn

Leu

Leu

Phe

Asn

Asp

Asn

Thr

Glu

Cys

Leu

Ala

Lys

Leu

Gly

Gly

660

665

670

Arg

Pro

Thr

Tyr

Glu

Lys

Tyr

Leu

Gly

Thr

Glu

Tyr

Val

Thr

Ala

Ile

675

680

685

PL 204 477 B1

Ala Asn Leu Lys Lys Cys Ser Thr Ser Pro Leu Leu Glu Ala Cys Ala 690 695 700

Phe Leu Thr Arg

705 <210> 7 <211> 708 <212> PRT <213> Bubalus bubalis <220>

<221> SIGNAL <222> (1)..(19) <223>

<400> 7

Met

Lys

Leu

Phe

Val

Pro

Ala

Leu Leu Ser Leu Gly Ala Leu Gly Leu

1

5

10

15

Cys

Leu

Ala

Ala

Pro

Arg

Lys

Asn

Val

Arg

Trp

Cys

Thr

Ile

Ser

Gin

20

25

30

Pro

Glu

Trp

Leu

Lys

Cys

His

Arg

Trp

Gin

Trp

Arg

Met

Lys

Lys

Leu

35

40

45

Gly

Ala

Pro

Ser

Ile

Thr

Cys

Val

Arg

Arg

Ala

Phe

Val

Leu

Glu

Cys

50

55

60

Ile

Arg

Ala

Ile

Thr

Glu

Lys

Lys

Ala

Asp

Ala

Val

Thr

Leu

Asp

Gly

65

70

75

80

Gly

Met

Val

Phe

Glu

Ala

Gly

Leu

Asp

Pro

Tyr

Lys

Leu

Arg

Pro

Val

85

90

95

Ala

Ala

Glu

Ile

Tyr

Gly

Thr

Lys

Glu

Ser

Pro

Gin

Thr

His

Tyr

Tyr

100

105

110

Ala

Val

Ala

Val

Val

Lys

Lys

Gly

Ser

Asn

Phe

Gin

Leu

Asp

Gin

Leu

115

120

125

Gin

Gly

Arg

Asn

Ser

Cys

His

Thr

Gly

Leu

Gly

Arg

Ser

Ala

Gly

Trp

130

135

140

Asn

Ile

Pro

Met

Gly

Ile

Leu

Arg

Pro

Tyr

Leu

Ser

Trp

Thr

Glu

Ser

145

150

155

160

Leu

Glu

Pro

Phe

Gin

Gly

Ala

Val

Ala

Lys

Phe

Phe

Ser

Ala

Ser

Cys

165

170

175

Val

Pro

Cys

Val

Asp

Arg

Gin

Ala

Tyr

Pro

Asn

Leu

Cys

Gin

Leu

Cys

180

185

190

Lys

Gly

Glu

Gly

Glu

Asn

Gin

Cys

Ala

Cys

Ser

Pro

Arg

Glu

Pro

Tyr

195

200

205

Phe

Gly

Tyr

Ser

Gly

Ala

Phe

Lys

Cys

Leu

Gin

Asp

Gly

Ala

Gly

Asp

210

215

220

Val

Ala

Phe

Val

Lys

Glu

Thr

Thr

Val

Phe

Glu

Asn

Leu

Pro

Glu

Lys

225

230

235

240

Ala

Asp

Arg

Asp

Gin

Tyr

Glu

Leu

Leu

Cys

Leu

Asn

Asn

Thr

Arg

Ala

245

250

255

Pro

Val

Asp

Ala

Phe

Lys

Glu

Cys

His

Leu

Ala

Gin

Val

Pro

Ser

His

260

265

270

Ala

Val

Val

Ala

Arg

Ser

Val

Asp

Gly

Lys

Glu

Asp

Leu

Ile

Trp

Lys

275

280

285

Leu

Leu

Ser

Lys

Ala

Gin

Glu

Lys

Phe

Gly

Lys

Asn

Lys

Ser

Gly

Ser

290

295

300

Phe

Gin

Leu

Phe

Gly

Ser

Pro

Pro

Gly

Gin

Arg

Asp

Leu

Leu

Phe

Lys

305

310

315

320

PL 204 477 B1

Asp

Cys

Ala Leu

Gly 325

Phe

Leu

Arg

Ile

Pro 330

Ser

Lys

Val

Asp

Ser 335

Ala

Leu

Tyr

Leu Gly

Ser

Arg

Tyr

Leu

Thr

Ala

Leu

Lys

Asn

Leu

Arg

Glu

340

345

350

Thr

Ala

Glu Glu

Val

Gin

Ala

Arg

Arg

Ala

Arg

Val

Val

Trp

Cys

Ala

355

360

365

Val

Gly

Pro Glu

Glu

Gin

Lys

Lys

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Gin

Gin

Ser

370

375

380

Gly

Gin

Ile Val

Thr

Cys

Ala

Thr

Ala

Ser

Thr

Thr

Asp

Asp

Cys

Ile

385

390

395

400

Ala

Leu

Val Leu

Lys

Gly

Glu

Ala

Asp

Ala

Leu

Ser

Leu

Asp

Gly

Gly

405

410

415

Tyr

Ile

Tyr Thr

Ala

Gly

Lys

Cys

Gly

Leu

Val

Pro

Val

Leu

Ala

Glu

420

425

430

Asn

Arg

Lys Ser

Ser

Lys

His

Ser

Ser

Leu

Asp

Cys

Val

Leu

Arg

Pro

435

440

445

Thr

Glu

Gly Tyr

Leu

Ala

Val

Ala

Val

Val

Lys

Lys

Ala

Asn

Glu

Gly

450

455

460

Leu

Thr

Trp Asn

Ser

Leu

Lys

Gly

Lys

Lys

Ser

Cys

His

Thr

Ala

Val

465

470

475

480

Asp

Arg

Thr Ala

Gly

Trp

Asn

Ile

Pro

Met

Gly

Leu

Ile

Ala

Asn

Gin

485

490

495

Thr

Gly

Ser Cys

Ala

Phe

Asp

Glu

Phe

Phe

Ser

Gin

Ser

Cys

Ala

Pro

500

505

510

Gly

Ala

Asp Pro

Lys

Ser

Arg

Leu

Cys

Ala

Leu

Cys

Ala

Gly

Asp

Asp

515

520

525

Gin

Gly

Leu Asp

Lys

Cys

Val

Pro

Asn

Ser

Lys

Glu

Lys

Tyr

Tyr

Gly

530

535

540

Tyr

Thr

Gly Ala

Phe

Arg

Cys

Leu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Asp

Val

Ala

545

550

555

560

Phe

Val

Lys Asn

Asp

Thr

Val

Trp

Glu

Asn

Thr

Asn

Gly

Glu

Ser

Thr

565

570

575

Ala

Asp

Trp Ala

Lys

Asn

Leu

Asn

Arg

Glu

Asp

Phe

Arg

Leu

Leu

Cys

580

585

590

Leu

Asp

Gly Thr

Arg

Lys

Pro

Val

Thr

Glu

Ala

Gin

Ser

Cys

His

Leu

595

600

605

Ala

Val

Ala Pro

Asn

His

Ala

Val

Val

Ser

Leu

Ser

Glu

Arg

Ala

Ala

610

615

620

His

Val

Glu Gin

Val

Leu

Leu

His

Gin

Gin

Ala

Leu

Phe

Gly

Glu

Asn

625

630

635

640

Gly

Lys

Asn Cys

Pro

Asp

Lys

Phe

Cys

Leu

Phe

Lys

Ser

Glu

Thr

Lys

645

650

655

Asn

Leu

Leu Phe

Asn

Asp

Asn

Thr

Glu

Cys

Leu

Ala

Lys

Leu

Gly

Gly

660

665

670

Arg

Pro

Thr Tyr

Glu

Glu

Tyr

Leu

Gly

Thr

Glu

Tyr

Val

Thr

Ala

Ile

675

680

685

Ala

Asn

Leu Lys

Lys

Cys

Ser

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu

Glu

Ala

Cys

Ala

690

695

700

Phe

Leu

Thr Arg

705

PL 204 477 B1

Claims (15)

1. Kompleks składając się z laktoferyny (LF) i monofosforylowanego lipidu A (MPL) o wzorze:

przy czym korzystnie stosunek wagowy LF do MPL wynosi około 0,4, korzystnie około 0,43.

2. Kompleks według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że laktoferyna została wybrana z grupy składającej się z laktoferyny ludzkiej, bydlęcej, mysiej, koziej, wieprzowej, końskiej i bawolej, albo ich znanych pochodnych, natomiast MPL jest monofosforanem lipidu A pochodzącego z jednej z następujących bakterii: Hafnia alvei, zwłaszcza Hafnia alvei PCM 1200, Escherichia coli, Salmonella enteritica sv. Typhimurium albo Yersinia enterocolitica.

3. Kompleks według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że LF posiada jedną z sekwencji aminokwasowych przedstawionych na SEQ ID No. 1 do 7.

4. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera laktoferynę (LF) oraz monofosforylowany lipid A (MPL) otrzymany z bakteryjnego lipopolisacharydu, przy czym korzystnie laktoferyna została wybrana z grupy składającej się z laktoferyny ludzkiej, bydlęcej, mysiej, koziej, wieprzowej, końskiej i bawolej, albo ich znanych pochodnych, natomiast MLP jest monofosforanem lipidu A pochodzącego z jednej z następujących bakterii: Hafnia alvei, zwłaszcza Hafnia alvei PCM 1200, Escherichia coli, Salmonella enteritica sv. Typhimurium albo Yersinia enterocolitica.

5. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 4, znamienna tym, że LF posiada jedną z sekwencji aminokwasowych przedstawionych na SEQ ID No. 1 do 7.

6. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 4, znamienna tym, że MPL jest związkiem według wzoru

7. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 4, znamienna tym, że ma postać roztworu.

PL 204 477 B1

8. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 4 albo 7, znamienna tym, że zawiera kompleks LF z MPL według jednego z zastrzeżeń od 1 do 3.

9. Kompozycja farmaceutyczna według jednego z zastrz. od 4 do 8, znamienna tym, że stosunek wagowy LF do MPL wynosi od 0,3 do 30:1, korzystnie około 20:1.

10. Kompozycja farmaceutyczna według jednego z zastrz. od 4 do 9, znamienna tym, że jest kompozycją adiuwantową.

11. Szczepionka zawierająca antygen i adiuwant oraz ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako adiuwant zawiera kompozycję według zastrz. od 4 do 10.

12. Szczepionka według zastrz. 11, znamienna tym, że adiuwant jest podawany wraz z antygenem.

13. Szczepionka według zastrz. 11, znamienna tym, że adiuwant jest podawany osobno, w dawce nie zawierającej antygenu.

14. Zastosowanie kompozycji farmaceutycznej według jednego z zastrz. od 4 do 10 jako adiuwanta do wytwarzania szczepionek.

15. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że wytwarzana szczepionka jest przeznaczona do podawania co najmniej jedną drogą wybraną spośród: podawania przez iniekcję, podawania przezśluzówkowego, doustnie, dootrzewnowo, dożołądkowo, podskórnie,

14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że wytwarzana szczepionka jest przeznaczona do podawania wraz z osobną dawką zawierającą przynajmniej jeden ze składników kompozycji według zastrz. od 4 do 10 poprzedzającą, towarzyszącą lub następującą po podaniu szczepionki.