PL204275B1 - Kwas nukleinowy kodujący apoptynę i AAP-1, kompozycja białka, wektor, komórka gospodarza, zastosowanie kwasu nukleinowego jako farmaceutyku, zastosowanie sekwencji kwasu nukleinowego do wytwarzania leku i zastowanie AAP-1 do wytwarzania leku - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kwas nukleinowy kodujący apoptynę i AAP-1, kompozycja białka, wektor, komórka gospodarza, zastosowanie kwasu nukleinowego jako farmaceutyku, zastosowanie sekwencji kwasu nukleinowego do wytwarzania leku i zastosowanie AAP-1 do wytwarzania leku. Apoptoza jest aktywnym i zaprogramowanym procesem fizjologicznym, prowadzącym do eliminacji nadmiarowych, zmienionych lub nowotworowych komórek (Earnshaw, 1995, Duke i wsp. 1996). Apoptozę cechuje kurczenie się komórek, segmentacja jądra, kondensacja i cięcie DNA na fragmenty o wielkoś ci domeny, po którym w wię kszoś ci komórek następuje degradacja internukleosomalna. Komórki apoptotyczne rozpadają się na otoczone błoną ciałka apoptotyczne. W końcu, sąsiednie komórki i/lub makrofagi gwałtownie fagocytują takie umierające komórki (Wyllie i wsp., 1980, White, 1996). Za pomocą związków barwiących DNA, takich jak DAPI, które silnie i regularnie barwi DNA normalnych komórek, a słabo i nieregularnie barwi DNA komórek apoptotycznych, można określić które z komórek rosnących w warunkach hodowli komórkowych lub komórek pobranych z tkanek są apoptotyczne (Noteborn i wsp., 1994, Telford i wsp., 1992).

Proces apoptozy może być zapoczątkowany przez różne bodźce regulatorowe (Wyllie, 1995, White 1996, Levine, 1997). Zmiany tempa przeżywalności komórek grają ważną rolę w patogenezie wielu ludzkich chorób, na przykład w rozwoju nowotworów i chorobach autoimmunologicznych, w których obserwuje się zwiększoną proliferację komórek i zmniejszenie ich umieralności (Kerr i wsp., 1994, Paulovich, 1997). W komórkach nowotworowych apoptozę można wywołać różnymi związkami chemoterapeutycznymi i promieniowaniem, w wielu przypadkach proces ten następuje przy udziale białka typu dzikiego p53 (Thompson, 1995, Bellamy i wsp., 1995, Steller, 1995, McDonell i wsp., 1995).

Jednakże, komórki wielu nowotworów w czasie swojego rozwoju nabywają mutacji białka p53, często skorelowanej ze słabą odpowiedzią na terapię przeciwnowotworową. Pewne geny transformujące onkogennych wirusów DNA mogą inaktywować p53 przez bezpośrednie się z nim wiązanie (Teodoro, 1997). Przykładem takiego czynnika jest duży antygen T nowotworowego wirusa DNA SV40. W przypadku kilku nowotworów (biał aczek), wysoki poziom ekspresji proto-onkogenu Bcl-2 lub Bcr-abl związany jest z silną opornością na różne wywołujące apoptozę środki chemoterapeutyczne (Hockenberry 1994, Sachs i Lotem, 1997).

Dla takich nowotworów nie posiadających funkcjonalnego genu p53 (stanowiących ponad połowę wszystkich nowotworów) rozwijane są alternatywne terapie przeciwnowotworowe oparte na wywołaniu apoptozy niezależnej od p53 (Thompson 1995, Paulovich i wsp., 1997). Należy więc szukać czynników biorących udział w wywoływaniu apoptozy, która nie zależy od p53 i/lub nie jest blokowana przez przeciwapoptotyczne aktywności, takie jak Bcl-2 lub podobne do Bcr-abl. Czynniki takie mogą być częścią odrębnej drogi apoptotycznej lub mogą znajdować się daleko poniżej działania czynników hamujących apoptozę.

Apoptyna jest małym białkiem pochodzącym z wirusa anemii kurcząt (CAV; Noteborn i De Boer, 1995, Noteborn i wsp., 1991, Noteborn i wsp., 1994; 1998a), które wywołuje apoptozę w nowotworowych lub transformowanych ludzkich liniach komórkowych, ale nie wywołuje apoptozy w nietransformowanych ludzkich liniach komórkowych. In vitro apoptyna nie jest w stanie wywołać programowanej śmierci komórek w normalnych komórkach limfoidalnych, skórnych, naskórkowych, śródbłonkowych i komórkach mięśni gładkich. Jednakże, kiedy normalne komórki transformuje się, stają się one podatne na apoptozę wywołaną przez apoptynę. Długotrwała ekspresja apoptyny w normalnych ludzkich fibroblastach wykazała, że apoptyna nie ma w takich komórkach działania toksycznego ani transformującego Danen-van Oorschot, 1997 i Noteborn, 1996).

W normalnych komórkach apoptyna znajdowana jest przede wszystkim w cytoplazmie, podczas gdy w komórkach transformowanych lub nowotworowych, na przykład cechujących się hyperplazją, metaplazją, dysplazją lub aplazją, znajdowana jest przede wszystkim w jądrze, sugerując, że lokalizacja apoptotyny związana jest z jej aktywnością (Danen-Van Oorschot i wsp., 1997). Apoptoza wywołana przez apoptynę zachodzi przy braku funkcjonalnego p53 (Zhuang i wsp., 1995a), i nie jest hamowana przez Bcl-2, Bcr-abl (Zhuang i wsp., 1995), lub związane z Bcl-2 białko BAG-1 (Danen-Van Oorschot, 1997a, Noteborn, 1996).

Dlatego, apoptyna jest związkiem terapeutycznym selektywnie niszczącym komórki nowotworowe lub inne komórki cechujące się hyperplazją, metaplazją, dysplazją lub aplazją, a przede wszystkim takie komórki nowotworowe, które ze względu na brak funkcjonalnego genu p53, nadekspresję

PL 204 275 B1

Bcl-2 i innych czynników hamujących apoptozę są oporne na apoptozę wywołaną przez chemoterapię (Noteborn i Pieter-sen, 1998). Wydaje się, że nawet komórki przednowotworowe, komórki minimalnie transformowane są wrażliwe na wywołujące śmierć działanie apoptyny. Ponadto, Noteborn i Zhang (1998) wykazali, że apoptoza wywołana przez apoptynę może być używana do diagnozy komórek podatnych na proces nowotworzenia i monitorowania przebiegu traktowania takich komórek.

Fakt, że apoptyna, przynajmniej in vitro, nie wywołuje apoptozy w normalnych ludzkich komórkach, wskazuje, że toksyczne działanie leczenia apoptyną in vivo będzie bardzo małe. Noteborn i Pietersen (1998) i Pietersen i wsp. (1998) wykazali, ż e apoptyna eksprymowana przez adenowirusy nie wykazuje ostrego toksycznego działania in vivo. Ponadto, na nagich myszach wykazano, że apoptyna ma silne działanie przeciwnowotworowe.

Jednakże, w celu dalszego zwiększenia liczby dostępnych związków przeciwnowotworowych i związków przeciw chorobom autoimmunologicznym pożądane jest opracowanie dodatkowych związków terapeutycznych, które działają pojedynczo, kolejno lub łącznie z apoptyną, szczególnie w tych przypadkach, w których gen p53 (częściowo) nie funkcjonuje. Związki te mogłyby dostarczyć nowych możliwości leczenia, na przykład nowych terapii kombinowanych, w których te związki terapeutyczne działałyby pojedynczo, kolejno lub łącznie z apoptyną, szczególnie w tych przypadkach, w których gen p53 (częściowo) nie funkcjonuje.

Przedmiotem wynalazku jest zatem kwas nukleinowy kodujący apoptynę i AAP-1, przy czym wspomniany AAP-1 zawiera aminokwasy 23 do 250 przedstawione na Fig. 3. Korzystnie kwas nukleinowy według wynalazku kodujący AAP-1 może zawierać kwasy nukleinowe 142 do 892 przedstawione na Fig. 2.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja białka charakteryzująca się tym, że zawiera rekombinowaną apoptynę i AAP-1, przy czym wspomniany AAP-1 zawiera aminokwasy 23 do 250 przedstawione na Fig. 3.

Przedmiotem wynalazku jest również wektor, który zawiera kwas nukleinowy kodujący apoptynę i AAP-1, gdzie wspomniany AAP-1 zawiera aminokwasy 23 do 250 przedstawione na Fig. 3 lub korzystnie kwas nukleinowy kodujący AAP-1, który zawiera kwasy nukleinowe 142 do 892 przedstawione na Fig. 2.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka gospodarza transfekowana kwasem nukleinowym kodującym AAP-1, przy czym wspomniany AAP-1 zawiera aminokwasy 23 do 250 przedstawione na Fig. 3 i które to komórki gospodarza są ponadto transfekowane kwasem nukleinowym kodującym apoptynę.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie kwasu nukleinowego kodującego apoptynę i AAP-1, gdzie wspomniany AAP-1 zawiera aminokwasy 23 do 250 przedstawione na Fig. 3 lub kwasu nukleinowego kodującego AAP-1, który zawiera kwasy nukleinowe 142 do 892 przedstawione na Fig. 2, lub kompozycji białka zawierającej rekombinowaną apoptynę i AAP-1 opisane powyżej, jako farmaceutyku.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie sekwencji kwasu nukleinowego kodującej AAP-1, który to wspomniany AAP-1 zawiera aminokwasy 23 do 250 przedstawione na Fig. 3 do wytwarzania leku do leczenia raka lub choroby autoimmunologicznej, przy czym wspomniane leczenie obejmuje ponadto dostarczenie kwasu nukleinowego kodującego apoptynę.

Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku kwas nukleinowy kodujący AAP-1 zawiera kwasy nukleinowe 142 do 892 przedstawione na Fig. 2.

Wynalazek dotyczy także zastosowania AAP-1, opisanego powyżej do wytwarzania leku do leczenia raka lub choroby autoimmunologicznej, przy czym wspomniane leczenie obejmuje ponadto dostarczenie białka apoptyny.

Wynalazek dostarcza zatem kwasu nukleinowego, kodującego substancję białkową współdziałającą z apoptyną, zdolną do wywołania apoptozy samodzielnie lub w połączeniu z innymi substancjami wywołującymi apoptozę, na przykład apoptyną. Wspomniana substancja białkowa zdefiniowana jest jako substancja zawierająca peptyd, polipeptyd lub białko, które mogło być ewentualnie zmodyfikowane, na przykład przez glikozylację, mirystylizację, fosforylację, przyłączenie lipidów, przez homologiczną lub heterogeniczną di- lub multimeryzację lub jakąkolwiek inną (posttranslacyjną) modyfikację znaną w stanie techniki.

Współdziałanie z apoptyną definiuje się jako przynależność do kaskady związków specyficznie biorących udział w kaskadzie zdarzeń prowadzących do wystąpienia apoptozy, takiej jak wywołana

PL 204 275 B1 przez apoptynę, korzystnie takich substancji, które specyficznie biorą udział w drodze apoptozy niezależnej od p53.

Kodowana substancja białkowa współdziałająca z apoptyną może występować razem z innymi związkami wywołującymi apoptozę, na przykład apoptyną, jeżeli obie te substancje występują w jednej komórce. W normalnych nietransformowanych komórkach obie substancje wywołujące apoptozę występują w tych samych miejscach w cytoplazmie, podczas gdy w komórkach transformowanych lub nowotworowych obie substancje wywołujące apoptozę występują w tych samych miejscach w jądrze. Substancja białkowa współdziałająca z apoptyną zdolna jest do wiązania się z mysim czynnikiem transkrypcyjnym YY1, o którym wiadomo, że wiąże się z RYBP, mysim homologiem AAP-1(Garcia i wsp., 1999). Kwas nukleinowy kodujący substancję białkową współdziałającą z apoptyną, zdolną do wywołania apoptozy, jest wyizolowany z biblioteki cDNA, korzystnie biblioteki cDNA kręgowców, takich jak biblioteka cDNA drobiu, a bardziej korzystnie z biblioteki cDNA ssaków, która korzystnie zawiera cDNA ludzi.

Kwas nukleinowy kodujący substancję białkową współdziałającą z apoptyną, zdolną do wywołania apoptozy jest zdolny do hybrydyzacji z cząsteczką kwasu nukleinowego kodującą substancję białkową współdziałającą z apoptyną, zdolną do wywołania apoptozy, i pokazaną na figurach 1 lub 2, a szczególnie kodującą nowe białko zdolne do wywoływania apoptozy nazwane białkiem współdziałającym z apoptyną 1 (skrót AAP-1). W wynalazku opisuje się także kwas nukleinowy kodujący dodatkową substancję białkową współdziałającą z apoptyną, zdolną do współdziałania z białkiem AAP-1, a szczegół owy opis tu zamieszczony dostarcza sposobów i metod znajdowania takich dodatkowych białek biorących udział w kaskadzie związanej z apoptyną.

Wyizolowany lub rekombinowany kwas nukleinowy, kodujący substancję białkową współdziałającą z apoptyną, zdolną do wywołania apoptozy, może być w przynajmniej 70% homologiczny, korzystnie w przynajmniej 80% homologiczny, bardziej korzystnie w przynajmniej 90% homologiczny, najbardziej korzystnie w przynajmniej 95% homologiczny z cząsteczką kwasu nukleinowego, jej funkcjonalnym odpowiednikiem lub jej fragmentem kodującym substancję białkową współdziałającą z apoptyną, zdolną do wywołania apoptozy i pokazaną na figurach 1 lub 2.

Ponadto, wynalazek dostarcza wektora zawierającego kwas nukleinowy według wynalazku. Przykłady takich wektorów opisane są w części szczegółowej i obejmują wektor pMT2SM-AAP-1-a lub b, wektor pMT2SM zawierający cDNA AAP-1-a lub AAP-1-b ze znacznikiem Myc, plazmid zawierający fragment białka współdziałającego z apoptyną, wektory pMAL i pET22b zawierające kwas nukleinowy według wynalazku i umożliwiające nadekspresję w komórkach E. coli. Te i inne wektory są przydatne, na przykład do znajdowania dodatkowych substancji białkowych współdziałających z apoptyną i biorących udział w zdefiniowanej powyżej kaskadzie zdarzeń, lub do uzyskania nadekspresji białka, kodowanego przez kwas nukleinowy wytworzony sposobem według wynalazku.

Wektor zawierający kwas nukleinowy według wynalazku może dodatkowo zawierać czynnik przenoszący geny, co czyni go bardziej użytecznym w terapii genowej. Wyposażając czynnik przenoszący geny w kwas nukleinowy według wynalazku i wprowadzając taki czynnik do komórki lub komórek, które nadmiernie się rozmnażają i/lub wykazują zmniejszone tempo śmierci, stwarza się tej komórce lub tym komórkom warunki niezbędne do zajścia procesu apoptozy, co daje bardzo duże możliwości terapeutyczne.

Ponadto, wynalazek dostarcza także komórek gospodarza zawierających kwas nukleinowy według wynalazku. Korzystnymi komórkami gospodarza według wynalazku są transformowane komórki eukariotyczne, takie jak komórki drożdży lub komórki kręgowców, takie jak komórki ssaków lub komórki Cos transformowane lub transfekowane kwasem nukleinowym według wynalazku. Komórki takie są zdolne do ekspresji lub wytwarzania substancji białkowej współdziałającej z apoptyną, zdolnej do wywołania apoptozy.

W oparciu o niniejszy wynalazek można dostarczyć takż e wyizolowanej lub rekombinowanej substancji białkowej współdziałającej z apoptyną, zdolną do wywołania apoptozy. Jak dla przykładu pokazano na Fig. 4, ekspresja takiej substancji białkowej współdziałającej z apoptyną w komórkach, takich jak komórki nowotworowe lub inne komórki nadmiernie się rozmnażające, wyzwala w nich apoptozę. Substancja ta może wywoływać apoptozę samodzielnie lub w obecności innych substancji wywołujących apoptozę, takich jak apoptyna, a szczególnie substancja ta może wywoływać apoptozę niezależną od p53, co wskazuje, że nawet w przypadkach braku (funkcjonalnego) białka p53, taka substancja białkowa zdolna jest do wywołania apoptozy. Jeżeli takiej substancji białkowej współdziałającej z apoptyną i zdolnej do wywołania apoptozy używa się razem z inną substancją wywołującą

PL 204 275 B1 apoptozę, na przykład z apoptyną, obie substancje białkowe znajduje się w tym samym miejscu w cytoplazmie komórek normalnych i nie wywoł ują one apoptozy. Podczas gdy w transformowanych lub nowotworowych komórkach obie wywołujące apoptozę substancje białkowe znajduje się w tym samym miejscu w jądrze i wywołują one apoptozę. W oparciu o wynalazek można dostarczyć także substancji białkowej, która wiąże się z mysim czynnikiem transkrypcyjnym YY1, o którym wiadomo, że wiąże się z RYBP, mysim homologiem AAP-1. Szczególnie można dostarczyć substancji białkowej kodowanej przez kwas nukleinowy według wynalazku, na przykład zawierającej przynajmniej część sekwencji aminokwasowej pokazanej na Fig. 3 samodzielnie lub w połączeniu z innymi substancjami wywołującymi apoptozę, takimi jak apoptyna.

W oparciu o wynalazek moż liwe jest również dostarczenie wyizolowanego lub syntetycznego przeciwciała specyficznie rozpoznającego substancję białkową wytworzoną jak opisano w wynalazku. Przeciwciała takie otrzymuje się na przykład przez immunizację zwierząt doświadczalnych substancją białkową, jej immunogennym fragmentem lub odpowiednikiem i zbieranie przeciwciał poliklonalnych wytwarzanych przez takie immunizowane zwierzęta (tak jak opisano w części szczegółowej). Przeciwciała takie otrzymuje się także innymi znanymi w stanie techniki metodami, takimi jak wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych, lub przeciwciał jednołańcuchowych lub wiązanie białek eksprymowanych z rekombinowanych kwasów nukleinowych pochodzących z bibliotek kwasów nukleinowych, na przykład uzyskanych przy pomocy techniki prezentowania przez fagi.

Razem z takim przeciwciałem, dostarcza się też substancji białkowej specyficznie rozpoznawalnej przez takie przeciwciało, na przykład otrzymane metodą immunoprecypitacji, Western blotting lub innymi technikami immunologicznymi znanymi w stanie techniki.

Wynalazek dostarcza także zastosowania kwasu nukleinowego lub kompozycji białka według wynalazku w celu wywołania apoptozy, tak jak dla przykładu pokazano na Fig. 4, zwłaszcza do wywołania apoptozy niezależnej od p53. Szczególnie, dostarcza się także zastosowanie kwasu nukleinowego kodującego apoptynę. Jak pokazano na Fig. 4, połączenie tych substancji wywołujących apoptozę zwiększa procent apoptozy w traktowanych komórkach.

Takie zastosowanie według wynalazku jest szczególnie użyteczne z terapeutycznego punktu widzenia. W oparciu o niniejszy wynalazek można dostarczyć kompozycję farmaceutyczną zawierającą kwas nukleinowy, wektor, komórki gospodarza lub kompozycję białkową według wynalazku. Taka kompozycja farmaceutyczna może zawierać dodatkowo kwas nukleinowy kodujący apoptynę.

Takiej kompozycji farmaceutycznej dostarcza się szczególnie w celu wywołania apoptozy, na przykład apoptozy niezależnej od p53, w celu leczenia chorób, w przebiegu których stwierdza się zwiększone namnażanie komórek lub zmniejszenie śmierci komórek, ogólnie przypadki, w których choroby takie obejmują choroby nowotworowe i choroby auto-immunologiczne. Dzięki temu można wdrożyć leczenie ludzi chorych na takie choroby, w przebiegu których stwierdza się zwiększone namnażanie się komórek lub zmniejszenie śmierci komórek, który to sposób obejmuje podanie takiemu pacjentowi kompozycji farmaceutycznej według wynalazku. Kompozycje takie zawierają czynnik drogi apoptotycznej, specyficzny dla komórek transformowanych. Kompozycje takie są niezbędne do nowego leczenia, ale także do diagnozowania chorób związanych z zaburzeniami procesu apoptozy, takich jak choroby nowotworowe i choroby autoimmunologiczne.

Na polu diagnozowania w oparciu o niniejszy wynalazek dostarcza się też sposobu wykrywania obecności komórek nowotworowych lub komórek podatnych na proces nowotworzenia w określonej próbce komórek. Sposób taki obejmuje transfekowanie tej próbki komórek kwasem nukleinowym lub wektorem według wynalazku, hodowanie takich komórek i określenie procentu komórek apoptotycznych występujących w tej próbce komórek. Na przykład, można wywnioskować, że wewnątrzkomórkowa lokalizacja AAP-1 w komórkach nowotworowych/transformowanych różni się od jego wewnątrzkomórkowej lokalizacji w nietransformowanych, normalnych komórkach. Co więcej, akumulacja AAP-1 w ją drze komórkowym jest skorelowana z wywoł aniem apoptozy, a akumulacja AAP-1 w cytoplazmie jest skorelowana z normalną proliferacyjną aktywnością komórek. Dostarcza się też sposobu wykrywania obecności komórek nowotworowych lub komórek podatnych na proces nowotworzenia w określonej próbce komórek, który obejmuje transfekowanie tej próbki komórek kwasem nukleinowym lub wektorem według wynalazku i określenie wewnątrzkomórkowej lokalizacji substancji białkowej wytwarzanej z takiego kwasu nukleinowego lub wektora przez komórki tej próbki. Obecność takiej substancji białkowej w takich komórkach określa się metodami barwienia immunologicznego takich komórek za pomocą przeciwciała, takimi jak test immunofluorescencyjny lub inne testy immunologiczne znane w stanie techniki.

PL 204 275 B1

Niniejszy wynalazek pozwala także na opracowanie metody wykrywania potencjalnych związków rakotwórczych, takich jak geny powodujące transformację lub ich funkcjonalne fragmenty, obejmującej poddanie komórek działaniu takiego związku, na przykład przez transfekcję albo po prostu dodając takiego związku do podłoża do hodowli i następnie wykrycie obecności komórek nowotworowych lub komórek podatnych na proces nowotworzenia w traktowanej próbce komórek.

Możliwe jest zatem także wykrywanie podatności na proces nowotworzenia komórek w określonej próbce, a dzięki temu wykrywanie podatności na proces nowotworzenia pacjenta, od którego pobrano tę próbkę komórek, który obejmuje poddanie tej próbki komórek działaniu czynnika rakotwórczego, takiego jak promieniowanie nadfioletowe i następnie wykrycie obecności komórek nowotworowych lub komórek podatnych na proces nowotworzenia w traktowanej próbce komórek.

SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU

Do wykrycia składników komórkowych współdziałających z apoptyną, które są niezbędne do wywołania apoptozy używa się drożdżowego systemu dwuhybrydowego (Durfee i wsp., 1993). System ten przedstawia strategię in vivo wykrywania ludzkich białek zdolnych do fizycznego oddziaływania z apoptyn ą . Sytemu tego uż ywa się do sprawdzania biblioteki cDNA w celu wykrycia klonów kodują cych białka zdolne do wiązania się z badanym białkiem (Fields i Song, 1989, Yang i wsp., 1992). Dostarcza się na przykład nowego białka współdziałającego z apoptyną, nazwanego białkiem współdziałającym z apoptyną 1 (skrót AAP-1). Dostarcza się także metody wywoływania apoptozy przez oddziaływanie na funkcje tego nowoodkrytego białka AAP-1, jego funkcjonalnych odpowiedników lub fragmentów i/lub wywołania apoptozy przez wywołanie (nad)ekspresji AAP-1 lub powiązanych genów, ich funkcjonalnych odpowiedników lub fragmentów.

Dostarcza się także metody leczenia chorób nowotworowych opartej na oddziaływaniu na funkcje białek podobnych do białka AAP-1 i/lub na wywołaniu ich (nad)ekspresji. W unieśmiertelnionych liniach komórkowych, białka podobne do białka AAP-1 nie występują zbyt powszechnie. Dlatego nienormalna wysoka ekspresja białek podobnych do białka AAP-1 wywołuje proces przeciwny do transformacji komórek, a mianowicie apoptozę. Dostarcza się także czynnika wywołującego apoptozę zależną od apoptyny, który jest specyficzny dla komórek nowotworowych. Dostarcza się także metody leczenia chorób nowotworowych, chorób autoimmunologicznych oraz podobnych chorób opartych na białku podobnym do białka AAP-1, działającym pojedynczo lub w połączeniu z apoptyną lub związkami podobnymi do apoptyny.

Konstruowanie pGBT9-VP3

W celu wytworzenia plazmidu przynęty, który umoż liwia identyfikację białek współdziałających z apoptyn ą za pomocą droż d ż owego systemu dwuhybrydowego, plazmid pET-16b-VP3 (Noteborn, dane niepublikowane) traktuje się enzymami restrykcyjnymi Ndel i BamHI. Fragment Ndel-BamHI DNA o wielkości 0,4 kilopar zasad izoluje się przez elektroforezę w żelu agarozowym o niskim punkcie topnienia. Plazmid pGBT9 (Clontech Laboratories, Inc, Palo Alto, USA) traktuje się enzymami restrykcyjnymi EcoRI i BamHI. Izoluje się fragment DNA o wielkości około 5,4 kilopar zasad i łączy z linkerem EcoRI-Ndel, a następnie wstawia fragment DNA o wielkości 0,4 kilopar zasad zawierający sekwencje kodujące apoptynę, rozpoczynające się od kodonu początku transkrypcji ATG. Produkt końcowy zawierający gen połączony zawierający sekwencję domeny wiążącej GAL4 i apoptynę pod kontrolą drożdżowego promotora ADH nazwano pGBT9-VP3. Prawidłowość plazmidu sprawdza się trawiąc enzymami restrykcyjnymi i sekwencjonując jego DNA metodą Sangera (1977).

Wszystkie etapy klonowania prowadzi się stopniowo tak jak opisał Maniatis i wsp., (1992). Plazmid pGBT9-VP3 oczyszcza się metodą wirowania w gradiencie CsCl i chromatografii kolumnowej na żywicy Sephacryl S550 (Pharmacia).

Biblioteka cDNA zawierająca domeny aktywowane GAL4

Do wykrycia białek współdziałających z apoptyną używa się wektora ekspresyjnego pACT, zawierającego cDNA ludzkich limfocytów B transformowanych virusem Epstain-Barra i połączonych z domeną aktywacji transkrypcji GAL4. Bibliotekę cDNA w pACT otrzymuje się z biblioteki cDNA lambda-ACT tak jak opisał Durfee i wsp., 1993.

Szczepy drożdży i bakterii

Do transformacji plazmidami pGBT9 i pGBT-VP3 używa się szczepu JM109 E. coli. Do transformacji niezbędnej dla otrzymania pACT-cDNA związanego z apoptyną używa się szczepu electromax/DH10B, kupionego w GIBCO-BRL, USA.

Do przeszukiwania biblioteki cDNA i wszystkich innych transformacji będących częścią drożdżowego systemu dwuhybrydowego używa się szczepu drożdżowego Y190.

PL 204 275 B1

Pożywki

Selekcję prowadzi się na płytkach z podłożem Luria Broth (LB) zawierającym ampicylinę (50 mikrogramów na mililitr). Podłoża do hodowli drożdży YPD i S.C. przygotowuje się tak jak opisał Rose i wsp. (1990).

Transformacja kompetentnych komórek szczepu Y190 plazmidem pGBT-VP3 i pACT-cDNA i badanie pod kątem aktywności beta-galaktozydazy

Otrzymuje się kompetentne komórki drożdży szczepu Y190 i prowadzi się ich transformację tak jak opisał Klebe i wsp., (1983). Komórki drożdży transformuje się najpierw plazmidem pGBT-VP3, a następnie plazmidem pACT-cDNA. Transformowane komórki droż dż y hoduje się na płytkach z podłożem bez histydyny, leucyny i tryptofanu.

Błony Hybond-N nakłada się na kolonie drożdży, które są histydyno-pozytywne i pozwala się im na całkowite nawilżenie. Filtry podnosi się i zanurza w ciekłym azocie w celu uprzepuszczalnienia błon komórek drożdży. Filtry rozmraża się, kładzie stroną zawierającą kolonie do góry na bibule Whatmann 3MM w płytkach Petriego z buforem Z (na litr: 16,1 g Na2HPO4 x 7H2O, 5,5 g NaH2PO4 x H2O, 0,75 g KCl i 0,246 g MgSO4 7H2O, pH 7,0) zawierającym 0,27% beta-merkaptoetanolu i 1 mg/ml X-gal. Filtry inkubuje się przez przynajmniej 15 minut lub przez noc.

Odzyskanie plazmidu z drożdży

Całkowite DNA komórek drożdży, które są histydyno-pozytywne i wytwarzają beta-galaktozydazę otrzymuje się metodą lizy alkalicznej z użyciem glusulazy opisanej przez Hoffmana i Winstona (1987). Metodą elektroporacji przy uż yciu aparatu Bio-Rad GenePulser i wedł ug zaleceń producenta, tym DNA transformuje się komórki bakterii Electro-max/DHlOB. Transformowane komórki wysiewa się na płytki zawierające podłoże LB zawierające ampicylinę.

Izolacja klonów zawierających współdziałające z apoptyną pACT

Metodą testu kolonii na filtrach otrzymane kolonie lizuje się hybrydyzuje ze znakowanych radioizotopem 17-mer oligonukleotydem, specyficznym do pACT (patrz także w sekcji Analiza sekwencji). Plazmidowe DNA izoluje się z klonów zawierających pACT i obecność wstawki cDNA potwierdza się trawiąc enzymem restrykcyjnym XhoI.

Analiza sekwencji

Klony zawierające sekwencje kodujące białka współdziałające z apoptyną sekwencjonuje się metodą didezoksynukleotydów według metody Sangera. Analizę wykonała firma Euro-gentec, (Seraing, Belgia). Do analizy używa się startera specyficznego do pACT o wielkości 17-mer zawierającego sekwencję 5' -TACCACTACAATGGATG- 3‘.

Uzyskane sekwencje cDNA współdziałających z apoptyną porównuje się ze znanymi sekwencjami genów zawartych w EMBL/Genbank.

Konstruowanie plazmidów pMAL-AAPl i pET22b-AAP1

W celu wytworzenia plazmidów ekspresyjnych, które umoż liwiają wytwarzanie i izolację biał ka współdziałającego z apoptyną używa się plazmidów pMALTB i pET22b. Plazmid pMALTB pochodzi od plazmidu pMAL-C2 (New England Biolabs), w którym zamieniono miejsce czynnika Xa na miejsce trombiny. Plazmid pMALTB trawi się enzymami restrykcyjnymi BamHI i Sall i po elektroforezie w żelu agaroza/TBE zestawem do ekstrakcji z żelu firmy QIAGEN izoluje się fragment DNA o wielkości ±7,0 kilopar zasad. Sekwencję AAP-1 kodującą kompletną otwartą ramkę odczytu otrzymuje się za pomocą reakcji PCR, przy użyciu plazmidu pACT-AAP-1b i startera PCR zgodnego z kierunkiem trakskrypcji:

5'AACGGGATCCGGCGGCATGGGCGACAAGAAGAGCCCGACC 3' i startera PCR przeciwnego do kierunku trakskrypcji:

5'AAAAGTCGACTCAGAAAGATTCATCATTGACTGCTGACAT 3'. Produkt PCR o wielkości ±7,0 kilopar zasad trawi się enzymami restrykcyjnymi BamHI i Sall i po elektroforezie w żelu agaroza/TBE izoluje się zestawem do ekstrakcji z żelu firmy QIAGEN). Produkt końcowy zawierający gen połączony, zawierający gen MBP i gen AAP1 pod kontrolą promotora tac indukowanego przez IPTG nazwano pMAL-AAP-1.

Plazmid pET22b (Novagen) trawi się enzymami restrykcyjnymi Ndel i Notl i po elektroforezie w żelu agaroza/TBE zestawem do ekstrakcji z żelu firmy QIAGEN izoluje się fragment DNA o wielkości ±5,5 kilopar zasad. Sekwencję AAP1 kodującą otwartą ramkę odczytu otrzymuje się za pomocą reakcji PCR przy użyciu plazmidu pACT-AAP-1b i startera PCR zgodnego z kierunkiem trakskrypcji:

5' GGGAATTCCATATGGGCGACAAGAAGAGCCCGACC 3' i startera PCR przeciwnego do kierunku trakskrypcji:

5' AAGGAAGTACGCGGCCGCGAAAGATTCATCATTGACTGCTGACATGT 3'.

PL 204 275 B1

Produkt PCR trawi się enzymami restrykcyjnymi Ndel i Notl i po elektroforezie w żelu agaroza/TBE zestawem do ekstrakcji z żelu firmy QIAGEN izoluje się fragment o wielkości ±0,7 kilopar zasad. Produkt końcowy zawierający gen połączony, zawierający gen AAP1 i (His)6-koniec pod kontrolą promotora T7lac indukowanego przez IPTG nazwano pET22b-AAP1.

Prawidłowość obu konstruktów sprawdza się trawiąc enzymami restrykcyjnymi i sekwencjonując ich DNA metodą Sangera (1977).

Wszystkie etapy klonowania prowadzi się dokładnie tak jak opisał Maniatis i wsp. (1992).

Szczepy bakteryjne do nadekspresji MBP-AAP1 i AAP1-(His)6

W celu wytworzenia białka uż ywa się plazmidu pMAL-AAP1 i szczepu E. coli B834(XDE3) i plazmidu pET22b-AAPl oraz szczepu E. coli BL21(DE3). Oba szczepy kupiono w Novagen.

WYNIKI I DYSKUSJA

Apoptyna specyficznie wywołuje apoptozę w komórkach transformowanych, takich jak linie komórkowe pochodzące z ludzkich nowotworów. W celu zidentyfikowania najważniejszych elementów takiego specyficznego dla komórek transformowanych i/lub komórek nowotworowych szlaku przekazywania sygnałów apoptozy prowadzi się przeszukiwanie genetyczne drożdży. Do tego używa się ludzkiej biblioteki cDNA, która oparta jest na wektorach plazmidowych pACT zawierających kompletne kopie cDNA otrzymane z ludzkich limfocytów B transformowanych virusem Epstain-Barra (Durfee i wsp., 1993).

Otrzymanie plazmidu przynęty wytwarzającego produkt genu połączonego, domena wiążąca DNA GAL4 / apoptyna

W celu potwierdzenia istnienia biał ek współ dział ają cych z apoptyną w bibliotece cDNA ludzkich transformowanych lub nowotworowych komórek, konstruuje się tak zwany plazmid przynętę. W tym celu miejsce wielokrotnego klonowania plazmidu pGBT9 wstawia się kompletny region kodujący apoptynę, zawierający dodatkowo około 40 par zasad poniżej genu apoptyny.

Prawidłowość końcowego produktu nazwanego pGBT9-VP3 sprawdza się trawiąc enzymami restrykcyjnymi i sekwencjonując miejsce połączenia pomiędzy apoptyną i domeną wiążącą DNA GAL4.

Fragment genu kodujący białko współdziałające z apoptyną określa się dzięki transaktywacji drożdżowego promotora zależnego od GAL4.

Gen apoptyny łączy się z domeną wiążącą DNA GAL4 plazmidu pGBT9-VP3, a wszystkie cDNA pochodzące z transformowanych ludzkich komórek B łączy się z domeną aktywacji GAL4 plazmidu pACT. Jeżeli jedna z substancji białkowych kodowanych przez te cDNA wiąże się z apoptyną domena wiążąca DNA GAL4 znajdzie się w pobliżu domeny aktywacji GAL4, co spowoduje aktywację promotora zależnego od GAL4, który reguluje gen reporterowy HIS3 i LacZ.

Klony drożdży zawierające plazmid eksprymujący apoptynę i plazmid eksprymujący fragment białka współdziałającego z apoptyną rosną na podłożu bez histydyny i barwią się na niebiesko w teście na aktywność beta-galaktozydazy. Plazmid zawierający wstawkę cDNA kodującą białko współdziałające z apoptyną izoluje się i charakteryzuje.

Jednak zanim się to zrobi, należy sprawdzić czy transformacja komórek drożdżowych pojedynczym plazmidem pGBT9-VP3 lub w połączeniu z pustym wektorem pACT nie powoduje aktywacji promotora zależnego od GAL4.

Identyfikacja białek współdziałających z apoptyną kodowanych przez cDNA, pochodzące z transformowanych ludzkich linii komórek B

W trakcie badań znaleziono dwa klony droż d ż owe, które po transformacji plazmidami pGBT9-VP3 i pACT rosną na podłożu bez histydyny (pozbawionym także leucyny i tryptofanu) i barwią się na niebiesko w teście na aktywność beta-galaktozydazy. Wyniki te wskazują, że znalezione kolonie drożdży zawierają obok plazmidu przynęty pGBT9-VP3 także plazmid pACT, kodujący potencjalne białko współdziałające z apoptyną.

DNA plazmidowy izoluje się ze znalezionych kolonii drożdży i transformuje do bakterii. Testem hybrydyzacji na filtrach przy użyciu znakowanej sondy specyficznej do pACT określa się czy wyizolowane klony zawierają plazmid pACT. Następnie, pACT DNA izoluje się i trawi enzymem restrykcyjnym XhoI, który nie tnie DNA jeżeli zawiera ono wstawkę cDNA. W końcu, plazmidy pACT zawierające wstawki cDNA sekwencjonuje się metodą Sangera (Sanger i wsp., 1977).

Opis białek współdziałających z apoptyną

Genetyczne przeszukanie drożdży w celu znalezienia białek współdziałających z apoptyną pozwoliło na wykrycie dwóch klonów cDNA, klonu A i B, zawierających jeden typ białka, nowe białko

PL 204 275 B1 nazwane białkiem współdziałającym z apoptyną 1, oznaczone skrótem AAP-1. Klon cDNA AAP-1-b zawiera kompletną otwartą ramkę odczytu z kodonem początku transkrypcji ATG. Klon cDNA AAP-1-a zawiera część otwartej ramki odczytu AAP-1, która jest całkowicie homologiczna z sekwencją DNA AAP-1-b.

Sekwencje DNA klonów cDNA AAP-1-a i AAP-1-b pokazane są odpowiednio na figurach 1 i 2. Sekwencja aminokwasowa określona na podstawie znalezionej sekwencji DNA klonu AAP-1-b, która pokrywa całkowitą sekwencję aminokwasową AAP-1 pokazana jest na Fig. 3.

Konstruowanie wektora ekspresyjnego służącego do identyfikacji białka AAP-1 w komórkach ssaków

W celu stwierdzenia, czy klony cDNA AAP-1-a i AAP-1-b w rzeczywistości kodują białka współdziałające z apoptyną przeprowadzono następujące doświadczenia.

Plazmid DNA pMT2SM zawierający główny późny promotor (MLP) adenowirusa 5 i regon początku transkrypcji wirusa SV40 umożliwia uzyskanie wysokiego poziomu ekspresji obcych genów, w transformowanych komórkach ssaków, takich jak komórki Cos transformowane wirusem SV40. Wektor pMT2SM zawiera także znacznik Myc (aminokwasy EQKLISEEDL), w położeniu zgodnym z ramką odczytu obcego genu. Taki znacznik Myc umożliwia rozpoznanie obcego białka, na przykład białek współdziałających z apoptyną za pomocą przeciwciała 9E10 specyficznie rozpoznającego znacznik Myc.

Wektory pMT2SM zawierające cDNA AAP-1-a i AAP-1-b zakończone znacznikiem Myc konstruuje się następująco: klony cDNA pACT-AAP-1-a i pACT-AAP-1-b trawi się enzymem restrykcyjnym XhoI i izoluje wstawkę cDNA. Wektory do ekspresji pMT2SM trawi się enzymem restrykcyjnym XhoI, traktuje fosfatazą alkaliczną jelita wołu i łączy z wyizolowaną wstawką cDNA AAP-1. Konstrukty pMT2SM zawierające cDNA AAP-1-a i AAP-1-b we właściwym położeniu identyfikuje się metodą sekwencjonowania.

Wprowadzając metodą transfekcji plazmid pMT2SM-AAP-1-a i pMT2SM-AAP-1-b do komórek Cos bada się ekspresję białka AAP-1, zawierającego znacznik Myc. Jako kontroli negatywnej używa się komórek Cos, transfekowanych pustym wektorem. Dwa dni po transfekcji komórki lizuje się i analizuje metodą Western blot przy użyciu przeciwciała 9E10 specyficznie rozpoznającego znacznik Myc.

Komórki Cos transfekowane plazmidem pMT2SM-AAP-1-a i pMT2SM-AAP-1-b wytwarzają produkt AAP-1 zawierający znacznik Myc, o spodziewanej wielkości około 33 kDa (AAP-1-a) lub 35 kDa (AAP-1-b). Zgodnie z oczekiwaniami lizaty komórek Cos transfekowanych pustym wektorem nie zawierają produktu białkowego specyficznie reagującego z przeciwciałem przeciw znacznikowi Myc.

Wyniki te wskazują, że wyizolowano cDNA, którego produkt białkowy jest zdolny do współdziałania z apoptyną w wywoływaniu apoptozy.

Immunoprecypitacja białka AAP-1 zawierającego znacznik Myc i apoptyny z transformowanych komórek ssaków

Współdziałanie apoptyny i białka AAP-1 analizuje się metodą immunoprecypitacji, przy użyciu przeciwciała 9E10 specyficznie rozpoznającego znacznik Myc. Przeciwciało 9E10 nie wiąże się z apoptyn ą co umoż liwia jego uż ycie do immunoprecypitacji apoptyny razem z biał kiem współ dział ają cym z apoptyną, zawierającym znacznik Myc.

Komórki Cos transfekuje się jednocześnie plazmidem pCMV-VP3 kodującym apoptynę i plazmidem pMT2SM-AAP-1-a. Jako kontroli negatywnej używa się komórek transfekowanych plazmidem pCMV-VP3 i plazmidem pcDNA3.1.LacZ-myc/His-LacZ kodującym białko beta-galaktozydazy połączone ze znacznikiem Myc.

Dwa dni po transfekcji komórki lizuje się w buforze zawierającym 50 mM Tris (7,5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% Triton X100, 1 mg/ml Na4P2O7 i świeżo przygotowany roztwór inhibitorów proteaz, takich jak PMSF, inhibitor trypsyny, Leupeptynę i Na3VO4. Odpowiednie białka immunoprecypituje się tak jak opisali Noteborn i wsp., (1998) przy użyciu przeciwciała 9E10 specyficznie rozpoznającego znacznik Myc i analizuje techniką Western blot.

Barwienie błony Western blot przeciwciałami 9E10 i 111.3, które specyficznie rozpoznają odpowiednio znacznik Myc i apoptynę, wykazuje, że całkowite lizaty komórek zawierają apoptynę i zawierające znacznik Myc białko AAP-1 lub białko beta-galaktozydazy. Immunoprecypitacji białka AAP-1 połączonego ze znacznikiem Myc towarzyszy wytrącanie się białka apoptyny o wielkości 16 kDa. Dla odmiany, immunoprecypitacji białka beta-galaktozydazy, połączonego ze znacznikiem Myc nie towarzyszy istotne wytrącanie się białka apoptyny. Podsumowując, wykonano trzy niezależne do10

PL 204 275 B1 świadczenia z immunoprecypitacją i wszystkie wykazały, że białko AAP-1 ma zdolność wiązania się z biał kiem apoptyny.

Wyniki te wskazują, że nowo znalezione białko AAP-1 jest zdolne do specyficznego oddziaływania z apoptyną nie tylko w komórkach drożdży, ale także w transformowanych komórkach ssaków.

Nadekspresja nowego białka AAP-1 w ludzkich transformowanych komórkach wywołuje apoptozę

Następnie bada się czy białko AAP-1 ma zdolność wywoływania apoptozy. Po pierwsze określa się wewnątrzkomórkową lokalizację nowego białka AAP-1, w ludzkich transformowanych komórkach. W tym celu, ludzkie komórki Saos-2, pochodz ące z nowotworu koś ci transfekuje się , tak jak opisał Danen-van Oorschot (1997), plazmidem pMT2SM-AAP-1-a lub pMT2SM-AAP-1-b kodującymi odpowiednio białko AAP-1-a lub AAP-1-b połączone ze znacznikiem myc.

Metodą pośredniej immunofluorescencji przy użyciu przeciwciała 9E10 specyficznie rozpoznającego znacznik Myc i DAPI, które barwi DNA w jądrze komórkowym, wykazano, że zarówno fragment białka AAP-1 jak i całe białko AAP-1 obecne jest w jądrze komórek. W rzeczywistości umiejscowione są one w tych samych miejscach, w strukturach chromatyna/DNA.

Następnie bada się czy nadekspresja cDNA kodującego kompletne białko AAP-1 lub jego fragment wywołuje apoptozę. Cztery dni po tranfekcji większość komórek zawierających AAP-1 wykazuje zaburzenia barwienia DAPI, co wskazuje na wystąpienie apoptozy (Telford, 1992, Danen-Van Oorschot, 1997).

Jednoczesna ekspresja apoptyny i kompletnego białka AAP-1 lub jego fragmentu w ludzkich komórkach nowotworowych, takich jak komórki Saos-2, wywołuje apoptozę szybciej niż pojedyncza ekspresja apoptyny lub białka AAP-1. Wyniki opisujące aktywność apoptotyczną kompletnego białka AAP-1 pokazano na figurze 4. Ponieważ białko AAP-1 zdolne jest do wywołania apoptozy w komórkach Saos-2 pozbawionych białka p53 wskazuje, że AAP-1 jest zdolne do wywołania apoptozy niezależnej od p53. Wyniki te wskazują także, że AAP-1 może być używane jako związek przeciwnowotworowy w przypadkach, w których związki chemoterapeutyczne zawodzą. Ponadto, odkrycie, że zarówno apoptyna jak i AAP-1 wywołują apoptozę niezależną od p53 wskazuje, że AAP-1 należy do drogi przekazywania sygnałów reprezentowanej przez apoptynę.

Wspólna wewnątrzkomórkowa lokalizacja apoptyny i AAP-1 w ludzkich komórkach nowotworowych

W celu stwierdzenia czy apoptyna i AAP-1 umiejscawiają się w tych samych miejscach w ludzkich transformowanych komórkach, komórki Saos-2 transfekuje się plazmidami kodującymi apoptynę i AAP-1. Ekspresję apoptyny i AAP-1 określa się metodą pośredniej immunofluorescencji przy użyciu konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej i przeciwciała 9E10 specyficznie rozpoznającego znacznik Myc i oraz poliklonalnego przeciwciała VP3-C, specyficznie rozpoznającego C-koniec apoptyny.

Komórki transfekowane jednocześnie plazmidem kodującym białko AAP-1 i białko apoptyny eksprymują oba białka przede wszystkim w jądrze. Zarówno apoptyna jak i AAP-1 tworzą charakterystyczne opisane powyżej granularne struktury. Za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej stwierdza się, że AAP-1 i apoptyna występują w tych strukturach razem.

Podsumowując, zidentyfikowano białko współdziałające z apoptyną, czyli nowe białko AAP-1, występujące w jądrze i zdolne do wywołania apoptozy (niezależnej od p53) w ludzkich komórkach nowotworowych. Ponadto, jeżeli AAP-1 i apoptyna są eksprymowane w tych samych komórkach, oba białka wywołujące apoptozę znajdowane są w tych samych miejscach w jądrze ludzkich komórek nowotworowych.

W normalnych diploidalnych ludzkich komórkach białko AAP-1 znajduje się w strukturach cytoplazmatycznych

Następnie sprawdza się, czy w normalnych diploidalnych nietransformowanych ludzkich komórkach AAP-1 zachowuje się tak samo jak w ludzkich komórkach nowotworowych.

W tym celu ludzkie diploidalne fibroblasty VH10 (Danen-Van Oorschot, 1997) transfekuje się przy użyciu Fugene, według protokołu dostarczonego przez wytwórcę (Roche, Almere, The Netherlands) plazmidem pMT2SM-AAP-1b kodującym kompletne białko AAP połączone ze znacznikiem Myc. Jednocześnie tym plazmidem transfekuje się pochodzące z ludzkiego nowotworu komórki Saos-2.

Metodą pośredniej immunofluorescencji przy użyciu przeciwciała 9E10 specyficznie rozpoznającego znacznik Myc wykazano, że w normalnych diploidalnych ludzkich fibroblastach VH10 białko

PL 204 275 B1

AAP-1 znajdowane jest w cytoplazmie. Zgodnie z oczekiwaniami w ludzkich nowotworowych komórkach Saos-2, białko AAP=1 znajdowane jest w jądrze.

Ponadto, zbadano wpływ na wewnątrzkomórkową lokalizację AAP-1 w ludzkich fibroblastach VH10 jednoczesnej ekspresji białka AAP-1 i apoptyny. Immunofluorescencja wykazała, że zarówno apoptyna jak i AAP-1 znajdowane są w strukturach cytoplazmatycznych. Wyniki te wskazują, że jednoczesna ekspresja AAP-1 i apoptyny nie powoduje przemieszczenia się któregokolwiek z tych białek do jądra w normalnych ludzkich diploidalnych komórkach.

Wspólna wewnątrzkomórkowa lokalizacja apoptyny i AAP-1 w ludzkich fibroblastach

W celu stwierdzenia czy apoptyna i AAP-1 umiejscawiają się w tych samych miejscach w ludzkich nietransformowanych komórkach, komórki VH10 transfekuje się plazmidami kodującymi apoptynę i AAP-1. Ekspresję apoptyny i AAP-1 okreś la się metodą pośredniej immunofluorescencji przy użyciu konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej i przeciwciała 9E10, specyficznie rozpoznającego znacznik Myc oraz poliklonalnego przeciwciała VP3-c, specyficznie rozpoznającego C-koniec apoptyny. Poszukuje się komórek wykazujących (wspólną) wewnątrzkomórkową lokalizację apoptyny i AAP-1 oraz komórek wykazujących objawy apoptozy po barwieniu DAPI.

Komórki transfekowane jednocześnie plazmidem kodującym białko AAP-1 i białko apoptyny eksprymują oba białka przede wszystkim w cytoplazmie. Zarówno apoptyna jak i AAP-1 tworzą skupiska lub granule. Za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej stwierdza się, że AAP-1 i apoptyna wystę pują w tych strukturach razem. Wystę powanie podobnych struktur w cytoplazmie stwierdza się jeżeli AAP-1 transfekowane jest osobno, lub gdy apoptyna transfekowana jest osobno.

Stwierdza się, że w obecności lub przy braku apoptyny, białko AAP-1 umiejscawia się w cytoplazmie i tworzy skupi-ska-granule w ludzkich nietransformowanych fibroblastach.

Podsumowując, zidentyfikowano białko współdziałające z apoptyną, czyli nowe białko AAP-1, które w ludzkich diploidalnych nietransformowanych komórkach występuje w cytoplazmie, a w komórkach nowotworowych występuje w jądrze komórkowym. Wyniki te wskazują, że białko AAP-1 inaczej działa w ludzkich diploidalnych, nietransformowanych komórkach, a inaczej w komórkach nowotworowych. Ponadto, jeżeli AAP-1 i apoptyna są eksprymowane w tych samych normalnych komórkach nietransformowanych, oba białka wywołujące apoptozę znajdowane są w tych samych miejscach w cytoplazmie.

Wpływ na stymulację kowalencyjnego wiązania sygnału lokalizacji jądrowej dużego antygenu T wirusa SV40 i białka apoptyny

W opisanych poniżej doświadczeniach bada się czy ekspresja chimerowego białka zawierającego apoptynę i sygnał lokalizacji jądrowej dużego antygenu T wirusa SV40 (aminokwasy N-koniecProlina-Prolina-Lizyna-Lizyna-Lizyna-Arginina-Lizyna-Walina-C-koniec dużego antygenu T wirusa SV40 kowalencyjnie połączone z N-końcem Apoptyny) powoduje wystąpienie apoptozy w nietransformowanych i transformowanych komórkach człowieka. Białko chimerowe nazwane zostało NLSapoptyna.

W tym celu ludzkie nietransformowane fibroblasty VH10 i ludzkie komórki Saos-2, pochodzące z nowotworu koś ci (Danen-Van Oorschot, 1997) transfekuje się plazmidem koduj ą cymi biał ko chimerowe NLS-apoptyna. W transformowanych komórkach człowieka ekspresja białka NLS-apoptyny powoduje jądrowe umiejscowienie apoptyny i wywołuje apoptozę. Ekspresja białka NLS-apoptyny w normalnych komórkach człowieka także powoduje ją drowe umiejscowienie apoptyny, ale nie wywołuje apoptozy. Wyniki te wskazują, że wymuszony transport apoptyny do jądra komórkowego, nie uruchamia jej aktywności apoptotycznej per se. Wydaje się, że do wywołania aktywności apoptotycznej apoptyny konieczne jest wystąpienie dodatkowych zjawisk związanych z procesem nowotworzenia.

Wpływ ekspresji NLS-apoptyny na AAP-1 w normalnych ludzkich fibroblastach

Następnie sprawdza się, czy ekspresja NLS-apoptyny wpływa na wewnątrzkomórkową lokalizację AAP-1 i/lub jego aktywność apoptotyczną w normalnych ludzkich fibroblastach. W tym celu ludzkie fibroblasty VH10 transfekuje się jednocześnie plazmidami kodującymi NLS-apoptynę i białko AAP-1. Metodą pośredniej immunofluorescencji i barwienia DAPI przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego stwierdza się jednoznacznie, że zarówno apoptyna jak i AAP-1 znajdują się w jądrze komórkowym ale proces apoptozy nie występuje. Wyniki te wskazują, że wymuszony przez NLS-apoptynę transport AAP-1 do jądra komórkowego, nie uruchamia jej aktywności apoptotycznej per se. Podobnie jak w przypadku apoptyny, wydaje się, ż e do wywołania aktywności apoptotycznej AAP-1 konieczne jest wystąpienie dodatkowych zjawisk związanych z procesem nowotworzenia.

PL 204 275 B1

AAP-1 nie wywołuje apoptozy w normalnych diploidalnych ludzkich komórkach nietransformowanych.

W opisanych poniżej doświadczeniach bada się czy ekspresja samego AAP-1 lub w połączeniu z apoptyną jest zdolna do wywołania apoptozy w normalnych diploidalnych nietransformowanych ludzkich fibroblastach, tak jak to występuje w komórkach nowotworowych/transformowanych.

W tym celu komórki VH10 transfekuje się plazmidem pMT2SM-AAP-1b, tak jak opisano powyżej. Transfekowane komórki analizuje się metodą pośredniej immunofluorescencji przy użyciu przeciwciała specyficznie rozpoznającego znacznik Myc lub przeciwciała specyficznie rozpoznającego apoptynę i barwienia DAPI. DAPI barwi nienaruszony DNA w inny sposób niż DNA komórek apoptotycznych (Telford i wsp., 1992). Wyniki jasno wskazują, że fibroblasty VH10 zawierające samo białko AAP-1 lub białko AAP-1 razem z apoptyną nie wchodzą w apoptozę.

Otrzymane wyniki wskazują także, że białka związane z apoptyną takie jak AAP-1 mogą się zachowywać w różny sposób w komórkach zdrowych i w komórkach nowotworowych.

Test diagnostyczny na obecność komórek nowotworowych

W oparciu o otrzymane wyniki można stwierdzić, że wewnątrzkomórkowa lokalizacja AAP-1 jest inna w ludzkich komórkach nowotworowych/transformowanych, a inna w normalnych komórkach nietransformowanych. Ponadto, nagromadzenie się AAP-1 w jądrze skorelowane jest z indukcją apoptozy, a nagromadzenie się AAP-1 w cytoplazmie skorelowane jest z normalnym stanem komórki i jest normalną aktywnością proliferacyjną. Na tej podstawie można opracować test diagnostyczny umożliwiający identyfikację (ludzkich) komórek nowotworowych i ich odróżnienie od normalnych zdrowych komórek nietransformowanych.

Test obejmuje transfekowanie podejrzanych (ludzkich) komórek, na przykład komórek pochodzenia ludzkiego, plazmidem kodującym AAP-1, lub zainfekowanie komórek wektorem wirusowym eksprymującym AAP-1. Następnie transfekowane komórki bada się: 1) pod kątem zdolności do wchodzenia w apoptozę w wyniku nadekspresji genu AAP-1; i 2) pod kątem wewnątrzkomórkowej lokalizacji lub przesunięcia lokalizacji AAP-1 z cytoplazmy do jądra.

Wewnątrzkomórkową lokalizację AAP-1 określa się technikami immunofluorescencyjnymi, za pomocą przeciwciał monoklonalnych, specyficznych do AAP-1 i/lub specyficznie rozpoznających znacznik przyłączony do AAP-1, taki jak opisany tu znacznik Myc. Jeżeli procent komórek w apoptozie lub komórek cechujących się jądrową lokalizacją AAP-1 w populacji analizowanych komórek eksprymujących AAP-1 jest znacząco wyższy niż w kontroli zawierającej zdrowe komórki, można wnioskować, że badane komórki stają się komórkami nowotworowymi/transformowanymi. Jako kontroli pozytywnej można użyć znanych ludzkich linii komórek nowotworowych transfekowanych AAP-1.

Wspólna ekspresja dużego antygenu T wirusa SV40 i białka AAP-1 powoduje przesunięcie AAP-1 do jądra i wywołanie apoptozy.

Zbadano wpływ ekspresji genów transformujących komórki ssaków na proces apoptozy zależny od AAP-1 w normalnych, ludzkich komórkach pochodzących od zdrowych ochotników. W tym celu komórki VH10 transfekuje się jednocześnie plazmidem pMT2SM-AAP-1b, kodującym kompletne białko AAP-1 i plazmidem pR-s884 kodującym duży antygen T wirusa SV40 lub jako kontrola negatywna plazmidem pCMV-neo (Noteborn i Zhang, 1998).

Transfekowane komórki analizuje się metodą pośredniej immunofluorescencji pod kątem występowania zależnej od AAP-1 apoptozy. Normalne komórki VH10 nie wchodzą w apoptozę po transfekcji AAP-1 lub plazmidem pCMV-neo, jako kontrolą negatywną. Wyniki wskazują, że ekspresja AAP-1 nie jest w stanie wywołać apoptozy w normalnych ludzkich komórkach diploidalnych, co potwierdza wcześniejsze wyniki. Jednakże, w normalnych ludzkich komórkach diploidalnych eksprymujących zarówno AAP-1 jak i duży antygen T wirusa SV40, stwierdza się występowanie AAP-1 zależnej apoptozy.

Przejście normalnych ludzkich komórek od oporności na AAP-1 do wrażliwości na AAP-1 można wyjaśnić przemieszczeniem białka APP-1 z cytoplazmy do jądra. Przemieszczenie takie staje się wyraźne już dwa dni po transfekcji plazmidem kodującym transformujące białko dużego antygenu T wirusa SV40. Wyniki wskazują, że zdarzenie opisane w tym przykładzie wynika z ekspresji czynnika transformującego pochodzącego z DNA zawartego w wirusie, który powoduje przemieszczenie się eksprymowanego białka AAP-1 z cytoplazmy do jądra i w następstwie takiego przemieszczenia wywołanie apoptozy.

Test diagnostyczny do wykrywania genów i związków indukujących procesy nowotworowe oraz do wykrywania skłonności do nowotworzenia oparty na wykrywaniu apoptozy związanej z AAP-1

PL 204 275 B1

Otrzymane wyniki pozwoliły na opracowanie testu diagnostycznego do wykrywania genów i związków indukujących procesy nowotworowe/transformacji.

Test pierwszego typu obejmuje transfekowanie normalnych komórek, na przykład komórek pochodzenia ludzkiego, plazmidem kodującym AAP-1, lub zainfekowanie komórek wektorem wirusowym eksprymującym AAP-1, jednocześnie z plazmidem kodującym potencjalny gen powodujący transformację nowotworową/wywołujący nowotwory. Następnie transfekowane komórki bada się: 1) pod kątem zdolności do wchodzenia w apoptozę w wyniku nadekspresji genu AAP-1; i 2) pod kątem wewnątrzkomórkowej lokalizacji lub przesunięcia lokalizacji AAP-1 z cytoplazmy do jądra.

Wewnątrzkomórkową lokalizację AAP-1 określa się technikami immunofluorescencyjnymi, za pomocą przeciwciał monoklonalnych specyficznych do AAP-1 i/lub specyficznie rozpoznających znacznik przyłączony do AAP-1, taki jak opisany tu znacznik Myc. Jeżeli procent komórek w apoptozie i/lub komórek cechujących się jądrową lokalizacją AAP-1 w populacji normalnych komórek eksprymujących AAP-1 i potencjalny gen powodujący transformację nowotworową/wywołujący nowotwory jest znacząco wyższy niż w kontroli zawierającej normalne komórki eksprymujące plazmid kontrolny, można wnioskować, że badany gen rzeczywiście powoduje transformację nowotworową/wywołuje nowotwory.

Test drugiego typu oparty jest na traktowaniu hodowli normalnych komórek diploidalnych związkiem podejrzanym o działanie rakotwórcze. Związek taki dodaje się na przykład do hodowli komórkowych na różny okres czasu. Następnie komórki transfekuje się plazmidem kodującym AAP-1. Można też najpierw transfekować/infekować plazmidem normalne diploidalne komórki, a następnie traktować takie komórki badanym związkiem.

Kolejne etapy testu są takie same jak opisane powyżej w części opisującej test pierwszego typu. Jeżeli procent komórek w apoptozie i/lub komórek cechujących się jądrową lokalizacją AAP-1 w populacji normalnych komórek eksprymujących AAP-1 i traktowanych potencjalnym związkiem rakotwórczym jest znacząco wyższy niż w kontroli, zawierającej normalne komórki eksprymujące ten plazmid i traktowane związkiem kontrolnym, można wnioskować, że badany związek rzeczywiście ma działanie rakotwórcze.

Test trzeciego typu oparty jest na traktowaniu normalnych komórek diploidalnych pobranych metodą biopsji skóry od pacjenta podejrzanego o podatność na chorobę nowotworową i hodowanych w odpowiednim podł oż u. Komórki takie naś wietla się promieniami ultrafioletowymi i transfekuje plazmidem kodującym AAP-1 lub infekuje wektorem wirusowym eksprymującym AAP-1. Komórki można także najpierw transfekować/infekować a potem naświetlić. Jednocześnie jako kontroli używa się diploidalnych komórek od zdrowego człowieka.

Kolejne etapy testu są takie same jak opisane powyżej w części opisującej test pierwszego typu. Jeżeli po napromieniowaniu procent komórek w apoptozie i/lub komórek cechujących się jądrową lokalizacją AAP-1 w populacji diploidalnych komórek pobranych od pacjenta podejrzanego o podatność na chorobę nowotworową jest znacząco wyższy niż w napromieniowanej kontroli zawierającej normalne komórki eksprymujące AAP-1, można wnioskować, że badana osoba wykazuje podatność na chorobę nowotworową.

AAP-1 i YY1 wiążą się ze sobą w transformowanych komórkach

Mysi homolog AAP-1, RYBP (Garcia i wsp., 1999) oddziałuje z YY1. YY1 może aktywować lub hamować ekspresję w komórkach białek wirusowych. Oddziaływania typu białko/białko wpływają na aktywność YY1. AAP-1 może oddziaływać z YY1. Oddziaływanie AAP-1 z YY1 może wpływać na aktywność YY1, co powoduje hamowanie transkrypcji lub jej aktywację. Transkrypcja genów może być z kolei waż na z punktu widzenia aktywnoś ci apoptotycznej apoptyny i/lub AAP-1.

W celu zbadania, czy AAP-1 tworzy kompleks z YY1 in vitro, plazmidami kodującymi AAP-1 i YY1 ((pCMV-HAVY-1; prezent od Dr Yang Shi, Harvard Medical School, Boston, USA) transfekuje się komórki Cos. Jako kontroli negatywnej używa się plazmidów YY1 i LacZ. Komórki lizuje się i przeprowadza się test immunoprecypitacji, przy użyciu przeciwciała specyficznie rozpoznającego znacznik Myc białka AAP-1 (lub LacZ), przeciwciało 9E10, i przeciwciała specyficznie rozpoznającego YY1. Powstające kompleksy bada się metodą Western blot. Zgodnie z oczekiwaniami, w lizatach komórkowych stwierdza się obecność AAP-1 i/lub YY1 i/lub LacZ.

W komórkach transfekowanych AAP-1 i YY1 wyraź nie widać, że jeżeli immunoprecypitację prowadzi się przy użyciu przeciwciała specyficznie rozpoznającego znacznik myc białka AAP-1, wykrywa się zarówno AAP-1 jak i YY1. Blot wykazuje obecność prążka wielkości 32 kDa (AAP-1) jak

PL 204 275 B1 i prążka wielkości 67 kDa (YY1). Jeżeli immunoprecypitację prowadzi się przy użyciu przeciwciała specyficznie rozpoznającego YY1, metodą Western blot także wykrywa się zarówno AAP-1 jak i YY1.

W komórkach transfekowanych tylko AAP-1 wykrywa się tylko AAP-1. W komórkach transfekowanych tylko YY1 wykrywa się tylko YY1, nie wykrywa się AAP-1. W celu wykluczenia niespecyficznego wiązania AAP-1 i YY1 komórki transfekuje się AAP-1 i LacZ a immunoprecypitację prowadzi się przy użyciu przeciwciała specyficznie rozpoznającego LacZ. Chociaż metodą Western blot wyraźnie wykrywa się białko LacZ, nie wykrywa się białka LacZ.

Otrzymane wyniki wskazują, że AAP-1 specyficznie wiąże się z czynnikiem transkrypcyjnym YY1.

Wytwarzanie i izolowanie MBP-AAP1 i AAP1-(His)6

W celu wytworzenia białek połączonych MBP-AAP1 i AAP1-(His)6 kwas nukleinowy kodujący otwartą ramkę odczytu AAP-1 klonuje się w kasety, pozwalające na nadekspresję białka pMALTB i pET22b.

Wywołanie ekspresji w komórkach E. coli sposobem rekomendowanym przez wytwórcę (Novagen) umożliwia wytworzenie rozpuszczalnego białka połączonego.

Izolację białka połączonego MBP-AAP1 prowadzi się metodą chromatografii powinowactwa (żywica amylozowa, New England Biolabs) i chromatografii jonowymiennej (High-S, Biorad). Otrzymuje się białko pełnej długości o czystości 90 do 95%. Chromatografia żelowa (Pharmacia Superose 6 HR 10/30) tego białka wykazała, że większa część preparatu MBP-AAP1 zachowuje się jak jednorodna substancja, homotri- lub homotetramer. Wyniki te wskazują, że rekombinowane białko AAP-1 (w postaci białka połączonego MBP-AAP1) jest zdolne do przyjęcia odpowiedniej konformacji i jest wysoce prawdopodobne, że jest ono aktywne biologicznie.

Izolacja białka AAP1-(His)6 metodą chromatografii powinowactwa (Ni²⁺-NTA, QIAGEN) pozwoliła na otrzymanie białka o czystości 80%.

Podsumowując, połączenie AAP1 z MBP prowadzi do otrzymania rozpuszczalnego białka AAP1 o prawidłowej konformacji i jest wysoce prawdopodobne, że jest ono aktywne biologicznie.

Wytwarzanie przeciwciał poliklonalnych przeciw białku AAP-1

W celu wytworzenia przeciwciał poliklonalnych przeciw biał ku AAP-1 syntetyzuje się domniemany peptyd immunogenny (peptyd AAP-1 zawiera aminokwasy N/koniec-CTKTSETNHTSRPRLKC/koniec; EuroGentec SA, Belgia. Następnie zgodnie ze standardowymi procedurami zalecanymi przez producenta zsyntetyzowanym peptydem nastrzykuje się króliki.

Od królików nastrzykniętych zsyntetyzowanym peptydem AAP-1 otrzymuje się surowicę. Metodami ELISA i Western blot wykazano, że otrzymana surowica specyficznie rozpoznaje opisane powyżej białko AAP-1. Wyniki te wskazują, że udało się wytworzyć przeciwciała, które mogą być używane do wykrywania białka APP-1 współdziałającego z apoptyną.

Podsumowując, sposobem według wynalazku dostarcza się dowodów, że pewne specyficzne czynniki wpływają na funkcje białek AAP-1 i powodują wywołanie apoptozy. Wykorzystując to zjawisko wpływania na funkcję białka AAP-1 można opracować sposoby leczenia oparte na wywoływaniu apoptozy (niezależnej od p53). Jednym z takich czynników wpływających na funkcje białek AAP-1 jest apoptyna. Innym białkiem pochodzącym z CAV, o którym wiadomo, że zwiększa aktywność apoptyny jest VP2 (Noteborn i wsp., 1991).

OPIS FIGUR

Fig. 1 przedstawia częściową sekwencję wektora pMT2SM-AAP-1-a. Sekwencja cDNA AAP-1-a pokazana jest czcionką pogrubioną.

Fig. 2 przedstawia częściową sekwencję wektora pMT2SM-AAP-1-b. Sekwencja cDNA AAP-1-b pokazana jest czcionką pogrubioną.

Fig. 3 przedstawia sekwencję aminokwasową analizowanego regionu białka współdziałającego z apoptyną AAP-1-b (czcionka pogrubiona). Ponadto w celu wykazania, że sekwencja aminokwasowa AAP-1, położona jest zgodnie z ramką odczytu domeny aktywacji GAL4, pokazano także trzy aminokwasy C-końca H-E-G miejsca wielokrotnego klonowania pACT. Świadczy to, że region AAP-1 jest w rzeczywistości syntetyzowany przez komórki drożdży. Należy zauważyć, że na figurze 3 aminokwas w pozycji 23 odpowiada pierwszemu aminokwasowi białka podobnego do AAP-1. Na rysunku można zidentyfikować pewne domeny funkcjonalne lub ich fragmenty, na przykład domena wiążąca czynnik transkrypcyjny rozciąga się od aminokwasu w pozycji 1 (aminokwas 23 na figurze 3) do około aminokwasu w pozycji 54; motyw palca cynkowego, domena oddziaływania białko/białko i/lub wiązania białko-kwas nukleinowy rozciąga się od aminokwasu w pozycji 25 (aminokwas 47 na figurze 3) do około

PL 204 275 B1 aminokwasu w pozycji 42; region związany z apoptozą rozciąga się od aminokwasu w pozycji 32 do aminokwasu w pozycji 226; sygnał lokalizacji jądrowej rozciąga się od aminokwasu w pozycji 74 do aminokwasu w pozycji 81; sygnał lokalizacji jądrowej rozciąga się od aminokwasu w pozycji 102 do aminokwasu w pozycji 108, lub odpowiednich pozycji w innych białkach podobnych do białka AAP-1.

Fig. 4 ilustruje aktywność apoptotyczną białka AAP-1 w komórkach Saos-2, jeżeli ulega ekspresji pojedynczo (pełne kwadraty) lub razem z apoptyną (puste kwadraty). Pokazany jest także procent apoptozy wywołanej przez samą apoptynę (pełne trójkąty).

LITERATURA

1. Bellamy, C.O.C., Malcomson, R.D.G., Harrison, D.J. i Wyllie, H. 1995. Cell death and disease: The biology and regulation of apoptosis. Seminars in Cancer Biology 6, 3-12.

2. Danen-Van Oorschot, A.A.A.M., Fischer, D.F., Grimbergen, J.M., Klein, B., Zhuang, S.-M., Falkenburg, J.H.F., Backendorf, C, Quax, P.H.A., Van der Eb, J.A. i Noteborn, M.H.M. (1997). Apoptin induces apoptosis in human transformed and malignant cells but not in normal cells. Proceedings National Academy Sciences, USA: 94, 5843-5847.

3. Danen-Van Oorschot, A.A.A.M, Den Hollander, A., Takayama, S., Reed, J., Van der Eb, A.J. i Noteborn, M.H.M. (1997a). BAG-1 inhibits p53-induced but not apoptin-induced apoptosis. Apoptosis 2, 395-402.

4. Duke, R.C., Ocjius, D.M., Young, J, D-E. (1996). Cell sui cide in health and disease. Scientific American December 1996, 48-55.

5. Durfee, T., Becherer, K., Chen, P.-L., Yeh,S.-H., Yang, Y., Kilburn, A.E., Lee, W.-H. i Elledge, S.J. (1993). The retinoblastoma protein associates with the protein phosphate type I catalytic subunit. Genes and Development 7, 555-569.

6. Earnshaw, W.C., 1995. Nuclear changes in apoptosis. Current Opinion in Cell Biology 7, 337-343.

7. Fields, S. i Song, O.K. (1989). A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature 340, 245-246.

8. Garcia, E., Marcos-Gutierrez, C, Del Mar Lorente, M., Moreno, J.C. i Vidal, M. RYBP, a new repressor protein that interacts with components of the mammalian polycomb complex, and with the transcription factor YY1. (1999). EMBO Journal 18, 3404-3418.

9. Hockenberry, D.M. (1994). Bcl-2 in cancer, development and apoptosis. Journal of Cell Science, Supplement 18, 51-55.

10. Hoffman, C.S. i Winston, F. (1987). A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene 57, 267-272.

11. Kerr, J.F.R., Winterford, CM. i Harmon, B.V. (1994). Apoptosis: Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer 73, 2013-2026.

12. Klebe, R.J., Harriss, J.V., Sharp, Z.D. i Douglas, M.G. (1983). A general method for polyetylene-glycol-induced genetic transformation of bacteria and yeast. Gene 25, 333-341.

13. Levine, A.J. (1997). p53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell 88, 323-331.

14. Maniatis, T., Fritsch, E.F. i Sambrook, J. (1982). Molecular Cloning: A Laboratory Manual.

CSHL Press, New York, USA.

15. McDonell, T.J., Meyn, R.E., Robertson, L.E. (1995). Implications of apoptotic cell death regulation in cancer therapy. Seminars in Cancer Biology 6, 53-60.

16. Noteborn, M.H.M. (1996). PCT application WO 96/41191. Apoptin induces apoptosis in human transformed and malignant cells but not in normal cells as essential characteristic for the development of an anti-tumor therapy.

17. Noteborn, M.H.M. i De Boer, G.F. (1996). Patent USA/No. 030335.

18. Noteborn, M.H.M., De Boer, G.F., Van Roozelaar, D., Karreman, C, Kranenburg, O., Vos, J., Jeurissen, S., Zantema, A., Hoeben, R., Koch, G., Van Ormondt, H. i Van der Eb, A.J. (1991). Characterization of cloned chicken anemia virus DNA that contains all elements for the infectious replication cycle. Journal of Virology 65, 3131-3139.

19. Noteborn, M.H.M. i Pietersen, A. (1998). A gene delivery vehicle expressing the apoptosisinducing proteins VP2 and/or apoptin. PCT Application no. PCT/NL98/00213.

20. Noteborn, M.H.M., Todd, D., Verschueren, C.A.J., De Gauw, H.W.F.M., Curran, W.L., Veldkamp, S., Douglas, A.J., McNulty, M.S., Van der Eb, A.J. i Koch, G. (1994). A single chicken anemia virus protein induces apoptosis. Journal of Virology 68, 346-351.

PL 204 275 B1

21. Noteborn, M.H.M., Verschueren, C.A.J., Koch, G. i Van der Eb, A.J. (1998). Simultaneous expression of recombinant baculovirus-encoded chicken anemia virus (CAV) proteins VP1 and VP2 is required for formation of the CAV-specific neutralizing epitope. Journal General Virology, 79, 30733077.

22. Noteborn, M.H.M. i Zhang, Y. (1998). Methods and means for determining the transforming capability of agents, for determining the predisposition of cells to become transformed and prophylactic treatment of cancer using apoptin-like activity. PCT Application no, PCT/NL98/00457.

23. Noteborn, M.H.M., Danen-van Oorschot, A.A.A.M., Van der Eb, A.J. (1998a). Chicken anemia virus: Induction of apoptosis by a single protein of a single-stranded DNA virus. Seminars in Virology 8, 497-504.

24. Paulovich, A.G., Toczyski, D., Hartwell, H. (1997). When checkpoints fail. Cell 88, 315-321.

25. Pietersen, A.M., Van der Eb, M.M,, Rademaker, H.J., Van den Wollenberg, D.J.M., Rabelink, M.J.W.E., Kuppen, P.J.K., Van Dierendonck, J.H., Van Ormondt, H., Masman, D., Van de Velde, C.J.H., Van der Eb, Hoeben, R.C. i Noteborn, M.H.M. (1998). Specific tumor-cell killing with adenovirus vectors containing the apoptin gene. Gene Therapy 6, 882-892.

26. Rose, M.D., Winston, F. i Hieter, P. (1990). Methods in yeast genetics. A laboratory course manual. Cold-Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA.

27. Sachs, L. i Lotem, J. (1993). Control of programmed cell death in normal and leukemia cells: New implications for therapy. Blood 82, 15-21.

28. Sanger, F., Nicklen, S. i Coulsen, A.R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings National Academic Sciences USA 74, 5463-5467.

29. Steller, H. (1995). Mechanisms and genes of cellular suicide. Science 267, 1445-1449.

30. Telford, W.G., King, I.E., Fraker, P.J. (1992). Comparative evaluation of several DNA binding dyes in the detection of apoptosis-associated chromatin degradation by flow cytometry. Cytometry 13, 137-143.

31. Teodoro, J.G. i Branton, P.E. (1997). Regulation of apoptosis by viral gene products. Journal of Virology 71, 1739-1746.

32. Thompson, C.B. (1995). Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science 267, 1456-1462.

33. White, E. (1996). Life, death, and the pursuit of apoptosis. Genes and Development 10, 1-15.

34. Wyllie, A.H. (1995). The genetic regulation of apoptosis. Current Opinion in Genetics and Development 5, 97-104.

35. Wyllie, A.H., Kerr, J.F.R., Currie, A.R. (1990). Cell death: The significance of apoptosis. International Review of Cytology 68, 251-306.

36. Yang, X., Hubbard, E.J.A. i Carlson, M. (1992). A protein kinase substrate identified by the two-hybrid system. Science 257, 680-682.

37. Zhuang, S.-M., Landegenc, J.E., Verschueren, C.A.J., Falkenburg, J.H.F., Van Ormondt, H., Van der Eb, A.J., Noteborn, M.H.M. (1995). Apoptin, a protein encoded by chicken anemia virus, induces cell death in various human hematologic malignant cells in vitro. Leukemia 9 S1, 118-120.

38. Zhuang, S.-M., Shvarts, A., Van Ormondt, H., Jochemsen, A.-G., Van der Eb, A.J., Noteborn, M.H.M. (1995). Apoptin, a protein derived from chicken anemia virus, induces a p53- independent apoptosis in human osteosarcoma cells. Cancer Research 55, 486-489.

Claims (9)

1. Kwas nukleinowy kodujący apoptynę i AAP-1, znamienny tym, że wspomniany AAP-1 zawiera aminokwasy 23 do 250 przedstawione na Fig. 3.

2. Kwas nukleinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomniany kwas nukleinowy kodujący AAP-1 zawiera kwasy nukleinowe 142 do 892 przedstawione na Fig. 2.

3. Kompozycja białka, znamienna tym, że zawiera rekombinowaną apoptynę i AAP-1, przy czym wspomniany AAP-1 zawiera aminokwasy 23 do 250 przedstawione na Fig. 3.

4. Wektor, znamienny tym, że zawiera kwas nukleinowy zdefiniowany w zastrz. 1 lub 2.

5. Komórka gospodarza transfekowana kwasem nukleinowym kodującym AAP-1, przy czym wspomniany AAP-1 zawiera aminokwasy 23 do 250 przedstawione na Fig. 3 i które to komórki gospodarza są ponadto transfekowane kwasem nukleinowym kodującym apoptynę.

PL 204 275 B1

6. Zastosowanie kwasu nukleinowego zdefiniowanego z zastrz. 1 lub 2, lub kompozycji białka zdefiniowanej w zastrz. 3 jako farmaceutyku.

7. Zastosowanie sekwencji kwasu nukleinowego kodującej AAP-1, znamienne tym, że wspomniane AAP-1 zawiera aminokwasy 23 do 250 przedstawione na Fig. 3 do wytwarzania leku do leczenia raka lub choroby autoimmunologicznej, przy czym wspomniane leczenie obejmuje ponadto dostarczenie kwasu nukleinowego kodującego apoptynę.

8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że kwas nukleinowy kodujący AAP-1 zawiera kwasy nukleinowe 142 do 892 przedstawione na Fig. 2.

9. Zastosowanie AAP-1, znamienne tym, że wspomniane AAP-1 zawiera aminokwasy 23 do 250 przedstawione na Fig. 3 do wytwarzania leku do leczenia raka lub choroby autoimmunologicznej, przy czym wspomniane leczenie obejmuje ponadto dostarczenie białka apoptyny.