PL201608B1 - Sposób i zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty oraz zastosowanie zmiany germinalnej w obrębie genu NBS1 - Google Patents
Sposób i zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty oraz zastosowanie zmiany germinalnej w obrębie genu NBS1Info
- Publication number
- PL201608B1 PL201608B1 PL360642A PL36064203A PL201608B1 PL 201608 B1 PL201608 B1 PL 201608B1 PL 360642 A PL360642 A PL 360642A PL 36064203 A PL36064203 A PL 36064203A PL 201608 B1 PL201608 B1 PL 201608B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- pcr
- prostate cancer
- gene
- germinal
- predisposition
- Prior art date
Links
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 101150016316 NBS1 gene Proteins 0.000 title claims description 41
- 230000008859 change Effects 0.000 title claims description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 7
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 title 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims abstract description 66
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 37
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 19
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 10
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 6
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 claims description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 claims description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 14
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 6
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 abstract description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 abstract description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 abstract 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 7
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000004485 Nijmegen breakage syndrome Diseases 0.000 description 4
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 4
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- 101000669028 Homo sapiens Zinc phosphodiesterase ELAC protein 2 Proteins 0.000 description 3
- 101100017043 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HIR3 gene Proteins 0.000 description 3
- 102100039877 Zinc phosphodiesterase ELAC protein 2 Human genes 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000001531 micro-dissection Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100519158 Arabidopsis thaliana PCR2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100519159 Arabidopsis thaliana PCR3 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000037051 Chromosomal Instability Diseases 0.000 description 2
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 101150102573 PCR1 gene Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000013188 needle biopsy Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 102100027962 2-5A-dependent ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101100290346 Arabidopsis thaliana MBS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010003594 Ataxia telangiectasia Diseases 0.000 description 1
- 108700020463 BRCA1 Proteins 0.000 description 1
- 102000036365 BRCA1 Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010053138 Congenital aplastic anaemia Diseases 0.000 description 1
- 102100026278 Cysteine sulfinic acid decarboxylase Human genes 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 102100039116 DNA repair protein RAD50 Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 201000004939 Fanconi anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000000729 Fisher's exact test Methods 0.000 description 1
- 101150025519 HPC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001080057 Homo sapiens 2-5A-dependent ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 101000743929 Homo sapiens DNA repair protein RAD50 Proteins 0.000 description 1
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 102000014119 Nibrin Human genes 0.000 description 1
- 108050003990 Nibrin Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 101100124656 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HPC2 gene Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 108010064775 protein C activator peptide Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
1. Sposób wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty, znamienny tym, ze w próbce materia lu genetycznego pobranej od pacjenta bada si e obecno sc zmia- ny germinalnej w obr ebie genu NBS1, przy czym obecno sc rzeczonej zmiany wskazuje na predyspo- zycj e do raka prostaty. 2. Sposób wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze bada si e obecno sc mutacji 657del5. 6. Zastosowanie wed lug zastrz. 5, znamienne tym, ze zmian a germinaln a jest mutacja9. Ze- staw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty metod a opart a o PCR, znamienny tym, ze sk lada si e przynajmniej z dwóch ró znych oligonukleotydów pozwa- laj acych na amplifikacj e regionu zawieraj acego zmian e germinaln a w obr ebie genu NBS1, przy czym korzystnie amplifikowany region zawiera mutacj e 657del5. 9. Zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty metod a opart a o PCR, znamienny tym, ze sk lada si e przynajmniej z dwóch ró znych oligonukleotydów pozwalaj acych na amplifikacj e regionu zawieraj acego zmian e germinaln a w obr ebie genu NBS1, przy czym korzystnie amplifikowany region zawiera mutacj e 657del5. 10. Zestaw do ASO-PCR wed lug zastrz. 8, znamienny tym, ze zawiera primery Nbsex6f, Nb- sex6r oraz Nbsdel5. PL PL PL PL
Description
C12Q 1/68 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 13.06.2003
Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej
| (54) Sposób i zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji (54) do raka prostaty oraz zastosowanie zmiany germinalnej w obrębie genu NBS1 | |
| (43) Zgłoszenie ogłoszono: 27.12.2004 BUP 26/04 | (73) Uprawniony z patentu: Cybulski Cezary,Przecław,PL Lubiński Jan,Szczecin,PL Górski Bohdan,Szczecin,PL Gliniewicz Bartłomiej,Szczecin,PL Sikorski Andrzej,Szczecin,PL Pomorska Akademia Medyczna,Szczecin,PL |
| (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.04.2009 WUP 04/09 | (72) Twórca(y) wynalazku: Cezary Cybulski,Przecław,PL Jan Lubiński,Szczecin,PL Bohdan Górski,Szczecin,PL Bartłomiej Gliniewicz,Szczecin,PL Andrzej Sikorski,Szczecin,PL |
| (74) Pełnomocnik: Rafał Witek, WTS sp.p. |
(57) 1. Sposób wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty, znamienny tym, że w próbce materiału genetycznego pobranej od pacjenta bada się obecność zmiany germinalnej w obrębie genu NBS1, przy czym obecność rzeczonej zmiany wskazuje na predyspozycję do raka prostaty.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bada się obecność mutacji 657del5.
6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że zmianą germinalną jest mutacja9. Zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty metodą opartą o PCR, znamienny tym, że składa się przynajmniej z dwóch różnych oligonukleotydów pozwalających na amplifikację regionu zawierającego zmianę germinalną w obrębie genu NBS1, przy czym korzystnie amplifikowany region zawiera mutację 657del5.
9. Zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty metodą opartą o PCR, znamienny tym, że składa się przynajmniej z dwóch różnych oligonukleotydów pozwalających na amplifikację regionu zawierającego zmianę germinalną w obrębie genu NBS1, przy czym korzystnie amplifikowany region zawiera mutację 657del5.
10. Zestaw do ASO-PCR według zastrz. 8, znamienny tym, że zawiera primery Nbsex6f, Nbsex6r oraz Nbsdel5.
PL 201 608 B1
Opis wynalazku
Przedmiotami wynalazku są sposób i zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty oraz zastosowanie zmiany germinalnej w obrębie genu NBS1 do wykrywania takiej predyspozycji. Ogólnie wynalazek dotyczy nowej metody diagnostycznej. Przedmioty wynalazku służą do syntezy DNA oraz identyfikacji anomalii w materiale genetycznym pacjenta, które są skorelowane z dziedziczną predyspozycją do raka prostaty.
Rak prostaty (PC) jest wiodącą przyczyną zachorowalności i śmiertelności mężczyzn na świecie. Badania epidemiologiczne sugerują, że około 5-10% przypadków zachorowań na raka prostaty można przypisać wysokiej dziedzicznej predyspozycji. Najdobitniej o wpływie czynników genetycznych świadczą badania zachowań na nowotwory u bliźniąt jednojajowych, które wykazują aż 42% zgodność zachorowań na PC (1). Badania te również wskazują na złożoną patogenezę PC i zakładają, że istnieje wiele genów o zróżnicowanej ekspresji predysponujących do PC. Poznano kilka regionów chromosomalnych (loci), które prawdopodobnie zawierają geny wysokiego ryzyka raka prostaty: HPC1, HPC2, PCAP, CAPB, HPCX, 20q13, 16q23, lecz dotychczas w obrębie tych loci nie udało się zidentyfikować konkretnego genu związanego ze znaczącym ryzykiem PC, który miałby istotne znaczenie kliniczne. Jedynie dwa badania zakończyły się sklonowaniem konkretnych genów w obrębie powyższych regionów chromosomalnych - geny RNASEL (HPC1) i ELAC2 (HPC2) (2;3). Jednak liczne analizy sugerują, że owe geny mają jedynie ograniczone znaczenie w rozwoju dziedzicznego PC (4-6).
Zgłoszenie patentowe WO0012694 (Myriad Genetics, Inc) opisuje gen HPC1 oraz obserwowane w nim mutacje, których występowanie skorelowano z rakiem prostaty. Gen składa się z 15 egzonów, które po splicingu mogą tworzyć liczne warianty transkrypcyjne. US20030045704A1 ujawnia sposoby i produkty służące do wykrywania genu HPC2, warunkującego predyspozycję do raka prostaty oraz wybrane allele tego genu, których występowanie skorelowano z rakiem prostaty.
Zgłoszenie patentowe WO0047773 (Urocor, Inc) ujawnia sekwencję genu UC41, który może być wykorzystywany jako marker genetyczny w diagnozowaniu raka prostaty. Ujawniono także sposoby leczenia raka prostaty wykorzystujące konstrukty antysensowne lub przeciwciała specyficzne wobec produktów genu UC41.
Większość nowotworów człowieka jest związana z niestabilnością chromosomalną. W komórce istnieje układ rozpoznawania i naprawy uszkodzeń DNA, który pełni kluczową rolę w utrzymaniu integralności genomu w odpowiedzi na czynniki mutagenne. Badania wskazują, że układ ten bierze udział w patogenezie PC. Mutacje germinalne wywoł ują ce zespoł y ł amliwoś ci chromosomów takie jak Nijmegen (NBS), Bloom, Fanconi anaemia and ataxia telangiectasia, związane są z uszkodzeniem tego szlaku naprawy DNA, dlatego tez zespoły te charakteryzują się niestabilnością chromosomalną, niedoborami immunologicznymi oraz predyspozycją do nowotworów [7,8]. Gen wywołujący zespół Nijmegen - NBS1 został zlokalizowany na chromosomie 8q21 i sklonowany [9].
W zgłoszeniu WO9955716 wskazano liczne polimorfizmy genu NBS1 i mutacje skorelowane z występowaniem zespołu Nijmegen.
Produkt ekspresji genu NBS1, nibryna (lub p95), jest częścią składową kompleksu nuklezay hMRE11/hRAD50/NBS1. Kompleks ten z kolei wchodzi w skład dużego kompleksu białkowego, którego centralnym ogniwem jest białko BRCA1 (BRCA1-asociated genome surveillance complex (BASC)) odpowiedzialnego za naprawę DNA [8]. U większości pacjentów z zespołem NBS stwierdzono homozygotyczną delecję germinalną 5 nukleotydów w obrębie eksonu 6 genu NBS1 (657del5). Zdecydowana większość pacjentów dotkniętych zespołem Nijmegen pochodzi z krajów słowiańskich, gdyż heterozygotyczne nosicielstwo mutacji założycielskiej 657del5 jest bardzo częste (0,6%) w tych krajach (Polska, Ukraina i Czechy) [10]. Dlatego wszyscy pacjenci z zespołem NBS słowiańskiego pochodzenia są homozygotami prostymi 657del5. Dotychczas opisano, że zaburzenia germinalne genu NBS1 są związane z rozwojem białaczki, czerniaka, raka piersi oraz jajnika (11-14), a nie badano znaczenia mutacji genu NBS1 w rozwoju PC.
Mimo długotrwałych wysiłków badawczych zmierzających do pozyskania sposobu diagnozowania predyspozycji do raka prostaty istnieje ciągłe zapotrzebowanie na tego rodzaju narzędzia diagnostyczne.
Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobów i produktów, które mogłyby być zastosowane do wykrywania wrodzonej predyspozycji do raka prostaty.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty, charakteryzujący się tym, że w próbce materiału genetycznego pobranej od
PL 201 608 B1 pacjenta bada się obecność zmiany germinalnej w obrębie genu NBS1, przy czym obecność rzeczonej zmiany wskazuje na predyspozycję do raka prostaty. Korzystnie, w sposobie według wynalazku bada się obecność mutacji 657del5, natomiast pacjent jest osobą pochodzenia słowiańskiego. W jednej z możliwych realizacji sposobu obecność zmiany germinalnej bada się techniką wybraną spośród ASO PCR (ang. Allele specific - PCR), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), sekwencjonowanie, ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment lenght polymorphism - polymerase chain reaction).
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie zmiany germinalnej w obrębie genu NBS1 do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty u człowieka. Korzystnie, zmianą germinalną jest mutacja 657del5, natomiast predyspozycję do raka prostaty wykrywa się u osoby pochodzenia słowiańskiego. W jednej z możliwych realizacji wykrywania wykorzystuje się technikę wybraną spośród ASO PCR (ang. Allele specific - PCR), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), bezpośrednie sekwencjonowanie, ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment lenght polymorphism - polymerase chain reaction).
Przedmiotem wynalazku jest także zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty metodą opartą o PCR, charakteryzujący się tym, że składa się przynajmniej z dwóch różnych oligonukleotydów pozwalających na amplifikację regionu zawierającego zmianę germinalną w obrębie genu NBS1, przy czym korzystnie amplifikowany region zawiera mutację 657del5. Korzystnie, zestaw do ASO-PCR według wynalazku zawiera primery Nbsex6f, Nbsex6r oraz NbsdelS.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, nieoczekiwanie ustalono, że uszkodzenie genu NBS1 ma związek z rozwojem PC. Pozwoliło to na uzyskanie nowych sposobów i produktów, które mogą być zastosowane do wykrywania wrodzonej predyspozycji do raka prostaty. Dla lepszego zilustrowania wynalazku opis wzbogacono o załączone figury.
Na figurze 1 przedstawiona została analiza LOH w tkankach nowotworowych PC u probanda rodziny nr 8 (linie 1-5) oraz u probanda rodziny 9 (linie 1b-5b) z użyciem markerów położonych w pobliżu genu NBS1 (linie 1-3 oraz linie 1b-3b) i za pomocą amplifikacji eksonu6 genu NBS1 (linie 4-5, linie 4b-5b). Utrata allela dzikiego genu NBS1 w tkance nowotworowej PC jest zaznaczona strzałkami. Kropki wskazują na allele zawierające mutację 657del5 genu NBS1.
Na figurze 2 przedstawione zostały rodowody przedstawiające rodziny z mutacją założycielską genu NBS1. Segregacja mutacji NBS1 z występowaniem raka prostaty w rodzinie została pokazana w rodzinach 8, 9 11, 12. Wiek pacjenta jest podany po prawej stronie nazwy nowotworu. Kropka (•) przy prawym dolnym rogu symbolu wskazuje, że próbka krwi pacjenta była badana. Plus (+) przy prawym dolnym rogu symbolu wskazuje na obecność heterozygotycznej mutacji MBS1 u badanego pacjenta, a minus (-) wskazuje pacjentów, u których nie stwierdzono mutacji. Strzałki wskazują na probandów. Całkowicie zaczernione symbole oznaczają pacjentów z nowotworem, w przypadku których dotarto do wyników histopatologicznych potwierdzających rozpoznanie nowotworu, w ¾ zaczernione symbole wskazują pacjentów, w przypadku których nie udało się dotrzeć do wyników histopatologicznych. Typ nowotworu znajduje się pod każdym symbolem.
Figura 3 prezentuje Fragment sekwencji genomowej genu NBS1 zawierający ekson 6 genu (zaznaczony pogrubionymi literami) Sekwencja pochodzi z Banku Genów (Genbank, Accession AB013139) (Matsuura,S., Tauchi,H., Nakamura,A., Kondo,N., Sakamoto,S., Endo,S., Smeets,D., Solder,B., Belohradsky,B.H., Kaloustian,V.M., Oshimura,M, Isomura,M., Nakamura,Y. and Komatsu,K. Positional cloning of the gene for Nijmegen breakage syndrome Nat. Genet. 19 (2), 179-181 (1998)) Mutacja 657del5 obejmuje nukleotydy zaznaczone pochylonymi literami.
Dla ułatwienia realizacji wynalazku został on zilustrowany poniższymi przykładami, które nie powinny być jednak uznane za ograniczenie jego zakresu.
P r z y k ł a d 1. Ustalanie korelacji pomiędzy zmianą germinalną w obrębie genu NBS1, a predyspozycją do raka prostaty - na przykładzie mutacji 657del5. Zasady testu, wybór grup pacjentów.
Przeprowadziliśmy analizę występowania mutacji 657del5 w grupie kolejnych 340 raków prostaty zdiagnozowanych w Klinice Urologii w Szczecinie oraz w grupie kolejnych 56 rodzinnych przypadków PC zdiagnozowanych w Ośrodku Nowotworów Dziedzicznych w Szczecinie, w których proband i co najmniej jeden krewny pierwszego lub drugiego stopnia zachorowali na PC. Podejrzenie PC stawiano na postawie stwierdzenia poziomu PSA powyżej 4,0 ng/ml i/lub badania przezodbytniczego prostaty; PC diagnozowano w Klinice Urologii na podstawie biopsji gruboigłowej wykonywanej pod kontrolą USG we wszystkich kolejnych przypadkach podejrzanych o PC kierowanych do Kliniki; każdy
PL 201 608 B1 wycinek ze stercza oznaczony był oddzielnie a uzyskany materiał histologiczny badano metodami standartowymi w Zakładzie Genetyki i Patomorfologii PAM w Szczecinie. Ostateczna diagnoza raka prostaty była stawiana zawsze po ocenie jednego patologa konsultującego - prof. Jana Lubińskiego.
Grupę kontrolną stanowiło 1000 osób z populacji wybranych losowo przez lekarzy rodzinnych w Szczecinie. W celu wykrycia częstej mutacji genu NBS1 stosowano technikę ASO-PCR oraz bezpośrednie sekwencjonowanie DNA wyizolowanego z limfocytów krwi obwodowej.
Aby stwierdzić czy gen NBS1 ulega somatycznej inaktywacji w tkance raka prostaty przeprowadziliśmy analizę utraty heterozygotyczności (LOH). Do analizy LOH zakwalifikowano 9 z 12 guzów nowotworowych, z których było możliwe wykonanie mikrodissekcji ognisk komórek nowotworowych, (od 5 pacjentów były to tkanki uzyskane za pomocą biopsji gruboigłowej a od 4 tkanki uzyskane w drodze prostatektomii). Po starannej mikrodyssekcji tkanki nowotworowej, przyprowadziliś my badanie LOH za pomocą markerów mikrosatelitarnych D8S88, D8S1811 (11, 12), oraz za pomocą amplifikacji PCR eksonu 6 genu NBS1 ze starterami znakowanymi fluorescencyjnie.
P r z y k ł a d 2. Wykrywanie mutacji 657del5 genu NBS1
Izolacja genomowego DNA
Krew obwodową pobraną w ilości 5 ml mieszano z 100 μΐ 1M EDTA a następnie wirowano w 50 ml polipropylenowych probówkach typu „Falcon przez 10 minut przy 3000 g w temperaturze 4°C. Górną warstwę osocza odciągano, zaś dolną mieszano z 45 ml buforu 2X (0,1 M NH4Cl, 0,25 M KHCO3, 1 mM EDTA) i pozostawiano na 15 minut w temperaturze 4°C. Następnie mieszaninę wirowano przy 3000 g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Supernatant zawierający zhemolizowane erytrocyty zlewano. Osad leukocytów ponownie zalewano buforem 2X i wirowano przy 3000 g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Wyżej wymienioną czynność powtarzano 3-krotnie, do uzyskania czystego osadu leukocytarnego. Następnie osad mieszano z 3 ml buforu trawiącego (50 mM NaCl, 25 mM MgCl2, 1 mM EDTA; pH 8.0) z dodatkiem 200 μΐ 10% SDS i 500 μg Proteinazy K. Trawienie przeprowadzano w cieplarce o temperaturze 37°C przez okres 24 godzin.
Produkty trawienia mieszano z 3 ml fenolu buforowanego 0,5 M Tris HCl (pH 8,4), a następnie do roztworu dodawano 3 ml mieszaniny chloroformu i alkoholu izoamylowego w stosunku objętości 1:25. Całą mieszaninę wstrząsano przez około 1 minutę aż do uzyskania homogennej emulsji, po czym wirowano przy 8000 g przez 10 minut w temperaturze 20°C. Po odwirowaniu uzyskiwano bezbarwną górną fazę wodną zawierającą DNA, pierścień białka w interfazie oraz dolną organiczną fazę zawierającą chloroform i fenol. Fazę górną przenoszono do odrębnej probówki, mieszano z taką samą ilością chloroformu po czym wirowano przy 8000 g przez 10 minut. Wyżej opisane oczyszczanie chloroformem powtarzano 3-krotnie aż do zaniku pierścienia białkowego w interfazie.
Tak oczyszczoną fazę wodną zawierającą DNA mieszano z 5M NaCl (stosunek objętości fazy wodnej do NaCl - 10:1) i 96% alkoholem etylowym (stosunek objętości fazy wodnej z NaCl do etanolu - 1:10). Mieszaninę pozostawiano przez noc w temperaturze 20°C. Uzyskany „kłaczek DNA przenoszono do odrębnej probówki, przemywano zimnym 70% alkoholem etylowym po czym suszono przez 30 minut w otwartej probówce w temperaturze 37°C. Oczyszczony DNA po rozpuszczeniu w 400 μl buforu TE (25 mM Tris HCl, 1 mM EDTA; pH 8.4) przechowywano w 4°C.
Allele specific - PCR (ASO-PCR)
Reakcję ASO-PCR przeprowadzano w automatycznym termocyklerze (DNA ThermalCycler 9600 - Perkin Elmer). Mieszanina reakcyjna o objętości 25 μl zawierała: 1 μl (50 ng) genomowego DNA, 4 pmol startera Nbsex6f, 6 pmol startera Nbsex6r, 10 pmol startera Nbsdel5, 2.5 μl buforu reakcyjnego (100 mM Tris-HCl, 500 mM KCL, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml żelatyny; pH 8.6), 200 μM każdego z deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP i dTTP) oraz 1 U Taq polimerazy DNA. W każdej reakcji stosowano 2 kontrole dodatnie (kontrole z DNA od heterozygoty NBS1 oraz homozygoty NBS1) oraz 2 kontrole ujemne (kontrola z DNA od pacjenta bez mutacji NBS1 oraz kontrola, która nie zawierała DNA).
Amplifikację przeprowadzano w następujących warunkach:
a) wstępna denaturacja - 95°C 5 minut
b) wstępnych 11 cykli składających się z: denaturacji - 94°C 30 sekund przyłączania starterów - 62 do 56°C 30 sekund* wydłużania komplementarnego DNA - 72°C 30 sekund
c) kolejnych 30 cykli, każdy składający się z: denaturacji - 94°C 30 sekund
PL 201 608 B1 przyłączania starterów - 56°C 30 sekund wydłużania komplementarnego DNA - 72°C 30 sekund * - podczas pierwszych 11 cykli temperatura przyłączania starterów była obniżana o 0,6°C w każ dym kolejnym cyklu (w pierwszym cyklu wynosił a 62°C, w drugim 61,4°C, w trzecim 60,8°C, w czwartym 60,2°C, w pią tym 59,6°C, w szóstym 59°C, siódmym 58,4°C, w ósmym 57,8°C, w dziewiątym 57,2°C, w dziesiątym 56,6°C, jedenastym 56°C)
Sekwencja primerów użytych w reakcji ASO-PCR:
Nbsex6f, 5' CACCTCTTGATGAACCATCT
Nbsex6r, 5' CGTTAACAACTACTGATAAGAG
Nbsdel5, 5' GGACGGCAGGAAAGAAATCTT (starter specyficzny dla 657del5)
Produkty reakcji PCR w ilości 5 μΐ mieszano z 10 μΐ buforu „Stop (roztwór sacharozy zabarwiony barwnikiem bromophenol blue) i poddawano elektroforezie w żelu agarozowym (1.5% agaroza (SeaKem FMC), IX bufor TBE, 25 μg/ml bromku etydyny) w warunkach 6V/cm przez 30 min. Rozdzielone produkty uwidaczniano w świetle UV. Wszystkie przypadki, w których uwidocznił się na żelu agarozowym dodatkowy, krótszy, prążek opowiadający produktowi amplifikacji z starterem specyficznym dla delecji 657del5, były sekwencjonowane w celu potwierdzenia obecności mutacji genu NBS1.
Sekwencjonowanie
PCR preparatywny
Amplifikację eksonu 6 genu NBS1 przeprowadzono ze starterami Nbsex6f i Nbsex6r w analogicznych warunkach eksperymentalnych jak powyżej opisana reakcja ASO-PCR. Jedyna różnica polegała na tym, że w reakcji PCR preparatywny nie stosowano startera NbsdelS.
Oczyszczanie produktów PCR
Produkty amplifikacji eksonu 6 genu NBS1 przenoszono na kolumienkę Microcon-100 (Amicon) umieszczoną na probówce Eppendorf, dodawano 400 μl wody destylowanej i wirowano przy 1850 g przez 15 minut. Przesącz zawierający startery i pozostałości mieszaniny reakcyjnej PCR wylewano, zaś produkty reakcji pozostałe na filtrze kolumienki zalewano 400 μl H2O i wirowano ponownie przez 15 minut przy 1850 g. Ostatnią czynność powtarzano 3-krotnic. W celu odzyskania oczyszczonych produktów PCR odwróconą o 180° kolumienkę przenoszono na nową probówkę i wirowano przez 3 minuty przy 9000 g. Wszystkie wirowania przeprowadzono w temp 25°C. Uzyskiwano w ten sposób około 5 gl czystego produktu, który rozcieńczano wodą do objętości 20 gl.
PCR sekwencyjny
Asymetryczny PCR sekwencyjny wykonywano w automatycznym termocyklerze Gene Amp PCR System 9600 firmy Perkin Elmer w 20 gl mieszaninie reakcyjnej zawierającej: 1 pmol startera Nbsexl6f, 4 gl oczyszczonego matrycowego produktu PCR, 8 gl BigDye Terminator Ready Reaction Kit v3.0 (Applied Biosystems). W celu potwierdzenia wyników sekwencjonowania z starterem Nbsex6f w każdym przypadku przeprowadzono oddzielną reakcję sekwencjonowania z użyciem startera Nbsex6r.
Parametry sekwencyjnego PCR:
wstępna denaturacja - 96°C 30 sekund cykli, każdy składający się z:
denaturacji - 94°C 30 sekund przyłączania starterów - 56°C 30 sekund wydłużania komplementarnego DNA - 72°C 30 sekund
Całość produktów sekwencjonowania (20 gl) przenoszono do probówki Eppendorf o pojemności 0,5 ml, zalewano 60 gl 96% etanolu oraz dodawano 1 gl kwaśnego octanu sodu (pH 5,0) w celu wytrącenia produktów PCR. Probówki wirowano w 3000 g przez 20 min w 25°C. Po żwirowaniu etanol wylewano, a osad zawierający produkty PCR-u sekwencyjnego przepłukiwano zalewając go 200 gl 70% etanolu oraz wirowano w 3000 g przez 5 min w 25°C. Następnie cały alkohol ostrożnie wylewano, a pozostały w probówce osad suszono w aparacie próżniowym Eppendorf Concentrator 5301 przez 20 - 30 min, po czym rozpuszczano w 4 gl sekwencyjnego buforu obciążającego (150 gl formamidu dejonizowanego, 50 gl 50 mM EDTA, 0.05% Dextran Blue). Rozpuszczone w buforze obciążającym produkty denaturowano przez 4 minuty w 94°C, przenoszono do łaźni z lodem, po czym nanoszono na denaturujący poliakrylamidowy żel sekwencyjny (4% akrylamid - 19:1, 1 x TBE, 6M mocznik). Rozdział elektroforetyczny dokonywano w automatycznym aparacie do sekwencjonowania ABI PRISM 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems). Zbieranie danych w trakcie elektroforezy oraz ich
PL 201 608 B1 analiza odbywały się za pomocą programów ABI PRISM 377 Collection Software and Sequencing Analysis Software Version 3.0 (Applied Biosystems).
P r z y k ł a d 3. Badanie utraty heterozygotyczności (LOH) w tkance nowotworowej raka prostaty.
Mikrodyssekcja tkanek i izolacja DNA
Utrwalone w formalinie i zarchiwizowane w bloczkach parafinowych tkanki od pacjentów z rakiem prostaty (tkanki pochodzące z biopsji gruboigłowej lub tkanki pochodzące z postatektomii radykalnej) zostały skrojone za pomocą mikrotomu oraz umieszczone na czystych szkiełkach podstawkowych. Od każdego pacjenta tkanki skrojono na 6 szkiełek. Tkanki na jednym ze szkiełek były zabarwione hematoksyliną i eozyną. Tkanki umieszczone na pozostałych 5 szkiełkach posłużyły jako materiał do izolacji DNA. Przed mirodyssekcją, aby skrawki tkankowe uległy dokładnemu przyklejeniu do szkiełek, inkubowano je w cieplarce w 60°C przez noc. Następnie tkanki na szkiełkach były deparafinizowane w xylenie przez 24 h w temperaturze pokojowej. Po deparafinizacji skrawki przeprowadzono 2 razy przez roztwór 96% etanolu, jednokrotnie przez roztwór 70% etanolu (po 5 minut w każ dym roztworze) i następnie umieszczono naczyniu z w dH2O. Uwodnione w ten sposób tkanki zabarwiono nanosząc na szkiełko kroplę hematoksyliny, a następnie nadmiar hematoksyliny spłukiwano wkładając szkiełka do naczynia z wodą i miesząc. Posługując się mikroskopem świetlnym wybierano możliwie jednolite ogniska raka prostaty w preparatach barwionych HE, oraz znajdywano te same ogniska w preparatach wybarwionych jedynie hematoksylin ą przygotowanych do izolacji DNA. Pod mikroskopem świetlnym, za pomocą igły do iniekcji wycinano ogniska komórek nowotworowych (unikając zanieczyszczenia komórkami prawidłowymi) i przenoszono je do 1,5 ml probówek Eppendorf. Równolegle z tych samych szkiełek przeprowadzano mikrodyssekcję tkanek prawidłowych, które umieszczano w oddzielnych probówkach. W ten sposób powstał y pary probówek zawierają cych tkankę nowotworową i tkankę prawidłową od tego samego pacjenta uzyskanych z tego samego fragmentu tkankowego.
Następnie tkanki zalewano 1 ml buforu trawiącego (50 mM TrisHCl, 1 mM CaCl2, pH 8.0) z dodatkiem 20 μΐ 10% SDS i 500 μg Proteinazy K. W każdej serii stosowano kontrole ujemne - próbki, które nie zawierały tkanek. Trawienie przeprowadzano w cieplarce o temperaturze 55°C przez okres 2 tygodni. W tym czasie dodatkowo dodawano dwukrotnie po 100 μg proteinazy K do próbek w trzecim i szóstym i dziewiątym dniu trawienia. Następnie probówki umieszczano w 96°C przez 10 min w celu inaktywacji enzymu. Około 600 μl mieszaniny uzyskanej po trawieniu oczyszczano na kolumienkach Microcon-100 (Amicon) według opisanej powyżej procedury oczyszczania produktów PCR preparatywnego. Po oczyszczeniu uzyskiwano około 5 μl roztworu zawierającego DNA, który rozcieńczano dH2O do 50 gl. W ten sposób od każdego nosiciela mutacji genu NBS1 uzyskano próbkę DNA zarówno z tkanki nowotworowej raka prostaty jak i próbkę zawierającą DNA z tkanki prawidłowej gruczołu krokowego.
Analiza utraty heterozygotyczności (LOH)
Analizę przeprowadzano za pomocą 3 reakcji PCR:
1) PCR1 z pimerami D8S88f - 5' TCCAGCAGAGAAAGGGTTAT; D8S88r - 5' GGCAAAGAGAACTCATCAGA
2) PCR2 z starterami D8S1811f - 5' CCCACCCCCAAAATGC; D8S1811r - 5' GGGTTTAGGGAAGTGCAGAA).
3) PCR3 z użyciem znakowanych fluorescencyjnie starterów Nbsex6f i Nbsex6r amplifikujących ekson 6 genu NBS1 zawierający mutacje założycielską 657del5.
Reakcje PCR przeprowadzano w automatycznym termocyklerze (DNA ThermalCycler 9600 Perkin Elmer). Mieszanina reakcyjna o objętości 25 gl zawierała: 4 gl izolowanego z tkanek DNA, 2.5 gl buforu reakcyjnego (100 mM Tris-HCl, 500 mM KCL, 1 5 mM MgCl2, 1 mg/ml żelatyny; pH 8.6), 200 gM każdego z deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP i dTTP) oraz 1 U Taq polimerazy DNA oraz 10 gg albuminy surowicy wołowej (ang. bovine serum albumin) (BSA - Fermentas). Mieszanina PCR1 zawierała dodatkowo po 5 pmol starterów D8S88f oraz D8S88r, PCR2 - po 5 pmol starterów D8S1811f oraz D8S1811r, PCR3 - po 5 pmol starterów Nbsex6f i Nbsex6r.
W każdej reakcji stosowano kontrole dodatnie z DNA izolowanego z krwi obwodowej heterozygotycznych nosicieli mutacji NBS1 i kontrole ujemne PCR-u (PCR bez dodatku matrycowego DNA) i kontrole ujemne izolacji DNA z tkanek.
Wszystkie reakcje przeprowadzano w następujących warunkach:
a) wstępna denaturacja - 95°C 5 minut
b) 42 cykli składających się z: denaturacji - 94°C 30 sekund
PL 201 608 B1 przyłączania starterów 56°C 30 sekund wydłużania komplementarnego DNA - 72°C 30 sekund
Jeden μΐ produktu PCR rozpuszczano w 10 μΐ sekwencyjnego buforu obciążającego (150 μΐ formamidu dejonizowanego, 50 μl 50 mM EDTA, 0.05% Dextran Blue). Rozpuszczone w buforze obciążającym produkty denaturowano przez 4 minuty w 94°C, przenoszono do łaźni z lodem, po czym 1 μl nanoszono na denaturujący poliakrylamidowy żel (4% akrylamid - 19:1, 1x TBE, 8M mocznik). Rozdział elektroforetyczny dokonywano w automatycznym aparacie do sekwencjonowania 377A DNA Sequencer (Applied Biosystems). Zbieranie danych w trakcie elektroforezy oraz ich analiza odbywały się za pomocą programów using ABI PRISM 377 Collection Software and GenScan Analysis Software Version 3.0 (Applied Biosystems). Obniżenie sygnału jednego z alleli powyżej 75% odczytywano jako utratę heterozygotyczności.
Analizy statystyczne wyników uzyskanych w powyższych przykładach wykonano stosując Fisher's exact test.
Nosicielstwo mutacji germinalnej 657del5 stwierdziliśmy w 9 (2,6%) z 340 kolejnych przypadków PC, w 5 z 56 (9%) rodzinnych przypadków oraz wóz 1000 (0,6%) osób z grupy kontrolnej za pomocą technik ASO-PCR i sekwencjonowanie. Częstość populacyjna 657del5 wykryta w naszym badaniu jest podobna do częstości opisanej w krajach słowiańskich przez Varona i wsp. (10). W 8 z 9 guzów poddanych mikrodyssekcji udało się wyizolować DNA o jakości wystarczającej do reakcji PCR. Utratę allela dzikiego genu NBS1 wykazaliśmy w 7 z 8 badanych guzów za pomocą amplifikacji eksonu 6 oraz z użyciem markerów polimorficznych (fig. 1). W 4 z 5 rodzinnych przypadków raka prostaty wykazaliśmy segregację mutacji z chorobą (fig. 2).
Niniejszy wynalazek po raz pierwszy ujawnia znaczenie mutacji genu NBS1 w rozwoju PC. Nieoczekiwanie wykazano znamiennie częstsze występowanie mutacji założycielskiej genu NBS1 w grupie kolejnych (p-0,005, RR-2,365, 95% przedział ufności - 1,548-3,611) i rodzinnych raków prostaty (p-0,002, RR-8,571, 95% przedział ufności 4,274-17,190) w porównaniu do populacji kontrolnej oraz stwierdzono utratę allela dzikiego genu NBS1 w tkance nowotworowej PC u nosicieli mutacji 657del5. Wyniki te jednoznacznie wskazują na znaczenie mutacji NBS1 w patogenezie PC. Wydaje się, że nosicielstwo mutacji 657del5 może być związane nie tylko z predyspozycją do PC w populacjach słowiańskich, lecz również u osób słowiańskiego pochodzenia zamieszkujących inne kraje. Mutacja ta jest bardzo częsta i stanowi 100% wszystkich zaburzeń genu NBS1 wykrytych dotychczas u pacjentów z zespołem NBS w krajach słowiańskich. Tak wiec diagnostyka PC może być znacząco usprawniona, co najmniej w tej grupie etnicznej, poprzez wykrywanie tej mutacji założycielskiej genu NBS1 prostą techniką ASO-PCR.
Ryzyko raka prostaty wynosi około 3% w populacji Polski liczącej blisko 40 milionów osób. Biorąc pod uwagę 2,6% częstość występowania mutacji założycielskiej genu NBS1 u pacjentów z PC, u około 15 000 (14%) nosicieli defektu genu NBS1 rozwinie się PC. Ponieważ mutacje 657del5 wykryto statystycznie istotnie częściej w przypadkach rodzinnych w porównaniu do przypadków kolejnych (p-0,04, RR-2,526, 95% przedział ufności 1,201-5,313), ryzyko PC jest prawdopodobnie kilkukrotnie wyższe, gdy krewny nosiciela NBS1 jest dotknięty rakiem prostaty. Szczegółowa analiza penetracji ryzyka PC związanego z uszkodzeniem genu NBS1 wymaga badań na znacznie większej grupie przypadków.
Literatura
1. Lichtenstein P, Holm NV, Verkasalo PK, Iliadou A, Kaprio J, Koskenvuo M, Pukkala E, Skytthe A, Hemminki K. Environmental and heritable factors in the causation of cancer-analyses of cohorts of twins from Sweden, Denmark, and Finland. N Engl J Med 2000 Jul 13;343(2):78-85
2. Tavtigian SV, Simard J, Teng DH, Abtin V, Baumgard M, Beck A, Camp NJ, Carillo AR, Chen Y, Dayananth P, Desrochers M, Dumont M, Farnham JM, Frank D, Frye C, Ghaffari S, Gupte JS, Hu R, Iliev D, Janecki T, Kort EN, Laity KE, Leavitt A, Leblanc G, McArthur-Morrison J, Pederson A, Penn B, Peterson KT, Reid JE, Richards S, Schroeder M, Smith R, Snyder SC, Swedlund B, Swensen J, Thomas A, Tranchant M, Woodland AM, Labrie F, Skolnick MH, Neuhausen S, Rommens J, Cannon-Albright LA. A candidate prostate cancer susceptibility gene at chromosome 17p. Nat Genet 2001 Feb;27(2):172-80
3. Carpten J, Nupponen N, Isaacs S, Sood R, Robbins C, Xu J, Faruque M, Moses T, Ewing C, Gillanders E, Hu P, Bujnovszky P, Makalowska I, Baffoe-Bonnie A, Faith D, Smith J, Stephan D, Wiley K, Brownstein M, Gildea D, Kelly B, Jenkins R, Hostetter G, Matikainen M, Schleutker J, Klinger K, Connors T, Xiang Y, Wang Z, De Marzo A, Papadopoulos N, Kallioniemi OP, Burk R, Meyers D,
PL 201 608 B1
Gronberg H, Meltzer P, Silverman R, Bailey-Wilson J, Walsh P, Isaacs W, Trent J. Germline mutations in the ribonuclease L gene in families showing linkage with HPC1. Nat Genet 2002 Feb;30(2):181-4
4. Wang L, McDonnell SK, Elkins DA, Slager SL, Christensen E, Marks AF, Cunningham JM, Peterson BJ, Jacobsen SJ, Cer-han JR, Blute ML, Schaid DJ, Thibodeau SN (2001) Role of HPC2/ELAC2 in hereditary prostate cancer. Cancer Res 61:6494-6499
5. Xu J, Zheng SL, Carpten JD, Nupponen NN, Robbins CM, Mestre J, Moses TY, Faith DA, Kelly BD, Isaacs SD, Wiley KE, Ewing CM, Bujnovszky P, Chang B, Bailey-Wilson J, Bleecker ER, Walsh PC, Trent JM, Meyers DA, Isaacs WB (2001) Evaluation of linkage and association of HPC2/ELAC2 in patients with familial or sporadic prostate cancer. Am J Hum Genet 68:901-911
6. Rebbeck TR, Walker AH, Zeigler-Johnson C, Weisburg S, Martin AM, Nathanson KL, Wein AJ, Malkowicz SB (2000) Association of HPC2/ELAC2 genotypes and prostate cancer. Ani J Hum Genet 67:1014-1019
7. Digweed M. (1993) Human genetic instability syndromes: single gene defects with increased risk of cancer. Toxicol. Lett; 67: 259-281.
8. Futaki M, and Lui JM. (2001) Chromosome breakage syndromes and the BRCA1 genome surveillance complex. Trends Mol Med; 7: 560-565.
9. Varon R, Vissinga C, Platzer M, Cerosaletti KM, Chrzanowska KH, Saar K, et al. (1998) Nibrin, a novel DNA double-strand break repair protein, is mutated in Nijmegen breakage syndrome. Cell; 93: 467-76
10. Varon R, Seemanova E, Chrzanowska K, Hnateyko O, Piekutowska-Abramczuk D, Krajewska-Walasek M, et al. (2000) Clinical ascertainment of Nijmegen breakage syndrome (NBS) and prevalence of the major mutation, 657del5, in three Slav populations. Eur J Hum Genet; 8: 900-902
11. Górski B, Dębniak T, Masojć B, Mierzejewski M, Medrek K, Cybulski C, Jakubowska A, Kurzawski G, ChosiaM, ScottRJ, Lubiński J. Germline 657del5 mutation in the NBS1 gene in breast cancer patients. Int J Cancer 2003 in press
12. Dębniak T, Górski B, Cybulski C, Jakubowska A, Kurzawski G, LenerM, Mierzejewski M, Masojć B, Mędrek K, Kładny J, Załuga E, Maleszka R, Chosia M, Lubiński J Germline 657del5 mutation in the NBS1 gene in patients with malignant melanoma of the skin Melanoma Research 2003, Vol 13 No X
13. Varon R, Reis A, Henze G, von Einsiedel HG, Sperling K, Seeger K. Mutations in the Nijmegen Breakage Syndrome gene (NBS1) in childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL).(2001) Cancer Res; 61(9):3570-2
14. Plisiecka-HaLasa J, Dansonka-Mieszkowska A, Rembiszewska A, Bidzinski M, Steffen J, Kupryjanczyk J. Nijmegen breakage syndrome gene (NBS1) alterations and its protein (nibrin) expression in human ovarian tumours. Ann Hum Genet 2002 Nov;66(Pt 6):353-9
15. Steffen J, Varon R, Thomas M, Maurer M, Stumm M, Nowakowska D, Rubach M, Kosakowska D, Ruka W, Nowacki Z, Rutkowski P, Demkow T, Piekutowska-Abramczuk D, Sperlink K. Frequency of the Heterozygous Germline NBS1 mutation 657del5 in Cancer Patients from Poland. International Workshop on Nijmegen Breakage Syndrome, Prague, Czech Republic 2002
16. Voelkel-Johnson C, Voeks DJ, Greenberg NM, Barrios R, Maggouta F, Kurtz DT, Schwartz DA, Keller GM, Papen-brock T, Clawson GA, Norris JS (2000) Genomic instability-based transgenic models of prostate cancer. Carcinogenesis 21:1623-627
17. Fan Z, Chakravarty P, Alfieri A, Pandita TK, Vikram B, Guha C (2000) Adenovirusmediated antisense ATM gene transfer sensitizes prostate cancer cells to radiation. Cancer Gene Ther 7:1307-1314
18. Koivisto PA, Rantala 1 (1999) Amplification of the androgen receptor gene is associated with P53 mutation in hormone-refractory recurrent prostate cancer. J Pathol 187:237-241
19. Gayther SA, de Foy KA, Harrington P, Pharoah P, Dunsmuir WD, Edwards SM, Gillett C, Ardern-Jones A, Dearnaley DP, Easton DF, Ford D, Shearer RJ, Kirby RS, Dowe AL, Kelly J, Stratton MR, Ponder BA, Barnes D, Eeles RA (2000) The frequency of germ-line mutations in the breast cancer predisposition genes BRCA1 and BRCA2 in familial prostate cancer. The Cancer Research Campaign/British Prostate Group United Kingdom Familial Prostate Cancer Study Collaborators. Cancer Res 60:4513-4518
20. Dong X, Wang L, Taniguchi K, Wang X, Cunningham JM, McDonnell SK, Qian C, Marks AF, Slager SL, Peterson BJ, Smith DI, Cheville JC, Blute ML, Jacobsen SJ, Schaid to DJ, Tindall DJ,
PL 201 608 B1
Thibodeau SN, Liu W. Mutations in CHEK2 associated with prostate cancer risk. Am J Hum Genet 2003 Feb;72(2):270-80.
Claims (10)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty, znamienny tym, że w próbce materiału genetycznego pobranej od pacjenta bada się obecność zmiany germinalnej w obrębie genu NBS1, przy czym obecność rzeczonej zmiany wskazuje na predyspozycję do raka prostaty.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bada się obecność mutacji 657del5.
- 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pacjent jest osobą pochodzenia słowiańskiego.
- 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obecność zmiany germinalnej bada się techniką wybraną spośród ASO PCR (ang. Allele specific - PCR), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), sekwencjonowanie, ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment lenght polymorphism - polymerase chain reaction).
- 5. Zastosowanie zmiany germinalnej w obrębie genu NBS1 do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty u człowieka.
- 6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że zmianą germinalną jest mutacja 657del5.
- 7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że predyspozycję do raka prostaty wykrywa się u osoby pochodzenia słowiańskiego.
- 8. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że do wykrywania wykorzystuje się technikę wybraną spośród ASO PCR (ang. Allele specific - PCR), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), bezpośrednie sekwencjonowanie, ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment lenght polymorphism - polymerase chain reaction).
- 9. Zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty metodą opartą o PCR, znamienny tym, że składa się przynajmniej z dwóch różnych oligonukleotydów pozwalających na amplifikację regionu zawierającego zmianę germinalną w obrębie genu NBS1, przy czym korzystnie amplifikowany region zawiera mutację 657del5.
- 10. Zestaw do ASO-PCR według zastrz. 8, znamienny tym, że zawiera primery Nbsex6f, Nbsex6r oraz Nbsdel5.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL360642A PL201608B1 (pl) | 2003-06-13 | 2003-06-13 | Sposób i zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty oraz zastosowanie zmiany germinalnej w obrębie genu NBS1 |
| UAA200600302A UA93344C2 (ru) | 2003-06-13 | 2004-06-14 | ПОЛИМОРФИЗМ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ГЕНА NBS1 657del5, КОТОРЫЙ ИСПОЛЬЗУЕТСЯ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ УНАСЛЕДОВАННОЙ СКЛОННОСТИ K РАКУ ПРОСТАТЫ ИЛИ ИНВАЗИВНОГО РАКУ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ДОЛЬКОВОГО ПОДТИПА |
| PCT/PL2004/000044 WO2004111272A2 (en) | 2003-06-13 | 2004-06-14 | Polymorphism in the human nbs1 gene useful in diagnostic of inherited predisposition to cancer |
| EA200600012A EA011608B1 (ru) | 2003-06-13 | 2004-06-14 | Полиморфизм человеческого гена nbs1, полезный для диагностики наследственной предрасположенности к раку |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL360642A PL201608B1 (pl) | 2003-06-13 | 2003-06-13 | Sposób i zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty oraz zastosowanie zmiany germinalnej w obrębie genu NBS1 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL360642A1 PL360642A1 (pl) | 2004-12-27 |
| PL201608B1 true PL201608B1 (pl) | 2009-04-30 |
Family
ID=33550530
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL360642A PL201608B1 (pl) | 2003-06-13 | 2003-06-13 | Sposób i zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty oraz zastosowanie zmiany germinalnej w obrębie genu NBS1 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA011608B1 (pl) |
| PL (1) | PL201608B1 (pl) |
| UA (1) | UA93344C2 (pl) |
| WO (1) | WO2004111272A2 (pl) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11261494B2 (en) | 2012-06-21 | 2022-03-01 | The Chinese University Of Hong Kong | Method of measuring a fractional concentration of tumor DNA |
| ES2908347T3 (es) | 2015-02-10 | 2022-04-28 | Univ Hong Kong Chinese | Detección de mutaciones para cribado de cáncer y análisis fetal |
| PT3967775T (pt) | 2015-07-23 | 2023-10-10 | Univ Hong Kong Chinese | Análise de padrões de fragmentação de adn sem células |
| WO2018137685A1 (en) | 2017-01-25 | 2018-08-02 | The Chinese University Of Hong Kong | Diagnostic applications using nucleic acid fragments |
| CN111051536A (zh) | 2017-07-26 | 2020-04-21 | 香港中文大学 | 利用不含细胞的病毒核酸改善癌症筛选 |
| CN118126155B (zh) * | 2024-02-05 | 2025-04-25 | 中山大学附属第七医院(深圳) | 一种人nbs1蛋白赖氨酸388位点乳酸化抗原、抗体及其制备方法与应用 |
| CN120005898B (zh) * | 2024-12-06 | 2025-11-28 | 南京中医药大学 | 三棱胰蛋白酶抑制剂基因SsBBI和SsBBI3基因及其编码产物和应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999055716A1 (en) * | 1998-04-27 | 1999-11-04 | Virginia Mason Research Center | A gene associated with nijmegen breakage syndrome, its gene product and methods for their use |
-
2003
- 2003-06-13 PL PL360642A patent/PL201608B1/pl not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-06-14 EA EA200600012A patent/EA011608B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2004-06-14 WO PCT/PL2004/000044 patent/WO2004111272A2/en not_active Ceased
- 2004-06-14 UA UAA200600302A patent/UA93344C2/ru unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL360642A1 (pl) | 2004-12-27 |
| EA200600012A1 (ru) | 2007-08-31 |
| EA011608B1 (ru) | 2009-04-28 |
| WO2004111272A2 (en) | 2004-12-23 |
| UA93344C2 (ru) | 2011-02-10 |
| WO2004111272A3 (en) | 2005-06-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3206812B2 (ja) | ハロタイプとして隣接するおよび遠い遺伝子座のアレルを検出するイントロン配列分析の方法 | |
| Etzler et al. | RNA‐based mutation analysis identifies an unusual MSH6 splicing defect and circumvents PMS2 pseudogene interference | |
| Li et al. | Carrier Frequency of the Bloom SyndromeblmAshMutation in the Ashkenazi Jewish Population | |
| US6200747B1 (en) | Method and kits for detection of fragile X specific, GC-rich DNA sequences | |
| Mutch et al. | Germline mutations in the multiple endocrine neoplasia type 1 gene: evidence for frequent splicing defects | |
| WO1990013668A1 (en) | Method for genetic analysis of a nucleic acid sample | |
| US7745133B2 (en) | Determining a predisposition to cancer | |
| NO324963B1 (no) | Fremgangsmate til deteksjon av Ki-ras mutasjoner og oligonukleotidprimer molekyl for anvendelse til deteksjonen. | |
| EP2635706A1 (en) | Method for detecting the presence of a dna minor contributor in a dna mixture | |
| EP2310528B1 (en) | A genetic marker test for brachyspina and fertility in cattle | |
| Sterchi | Molecular pathology—in situ hybridization | |
| Purandare et al. | Genotyping of PCR-based polymorphisms and linkage-disequilibrium analysis at the NF1 locus | |
| El-Hashemite et al. | Single cell detection of beta-thalassaemia mutations using silver stained SSCP analysis: an application for preimplantation diagnosis. | |
| PL201608B1 (pl) | Sposób i zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty oraz zastosowanie zmiany germinalnej w obrębie genu NBS1 | |
| EP0873426A1 (en) | Method of detection of polymorphism and loss of heterozygosity in a lung tumor suppressor gene | |
| Schipper et al. | Mutational analysis of the nf2 tumour suppressor gene in three subtypes of primary human malignant mesotheliomas | |
| Poncin et al. | Optimizing the APC gene mutation analysis in archival colorectal tumor tissue | |
| Watling et al. | Loss of heterozygosity analysis of chromosomes 9, 10 and 17 in gliomas in families | |
| EP3933051A1 (en) | Method for detecting duplications and/or deletions in chromosomal region 22q11.2 | |
| KR20220081554A (ko) | 진도개의 체고 조기 예측 유전자 마커 개발 | |
| US20020034742A1 (en) | Disease association by stratification | |
| US6207376B1 (en) | Method of detection of polymorphism and loss of heterozygosity in a lung tumor suppressor gene | |
| Yokozaki et al. | Allele frequency of D17S855 microsatellite locus in Japanese people | |
| CN115927585A (zh) | WAS致病突变基因及在制备Wiskott-Aldrich综合征诊断试剂盒中的应用 | |
| EP2110441A1 (en) | Method and probes for the genetic diagnosis of hemochromatosis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20110613 |