PL200947B1 - Niesteroidowy ligand receptora estrogenu oraz zastosowanie tego związku i jego analogu - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest niesteroidowy ligand receptora estrogenu o wzorze (I), wykazujący zależne od tkanki działanie estrogenowe i przeciwestrogenowe oraz zastosowanie tego związku i jego analogu do wytwarzania leku do leczenia i zapobiegania rakowi sutka.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest niesteroidowy ligand receptora estrogenu, wykazujący zależne od tkanki działanie estrogenowe i przeciwestrogenowe oraz zastosowanie tego związku i jego analogu do wytwarzania leku do leczenia i zapobiegania rakowi sutka. Opisano także sposoby wytwarzania związków tego rodzaju i ich zastosowanie w leczeniu wielu stanów chorobowych.

Estrogeny stanowią istotną klasę hormonów steroidowych, które pobudzają rozwój i utrzymanie podstawowych cech płciowych u ludzi. W przeszłości stwierdzono, że estrogeny są przydatne w leczeniu pewnych stanów medycznych i zaburzeń. Tak np. estradiol, steroidowy hormon wytwarzany przez jajniki, jest przydatny w leczeniu osteoporozy, choroby sercowo-naczyniowej, zespołu przedmiesiączkowego, naczynioruchowych objawów związanych z menopauzą, zanikowego zapalenia pochwy, marskości sromu, hipogonadyzmu u kobiet, pierwotnej niewydolności jajników, nadmiernego porostu włosów i raka gruczołu krokowego. Niestety z podawaniem tych steroidów związane są liczne skutki uboczne, takie jak zawał mięśnia sercowego, zakrzep z zatorami, choroba sercowo-naczyniowa i rak trzonu macicy.

Stwierdzono np., że hormonalna terapia zastępcza (HTZ) estrogenem jest klinicznie skutecznym sposobem leczenia osteoporozy u kobiet po menopauzie, z tym, że obecnie HTZ przepisuje się kobietom w mniej niż 15% możliwych przypadków, mimo iż próby kliniczne wykazały zmniejszenie o 50% pęknięcia biodra i zmniejszenie o 30% przypadków choroby sercowo-naczyniowej. Brak akceptacji wynika z obaw pacjentów i lekarzy, związanych z dwukrotnym wzrostem ryzyka raka trzonu macicy, obserwowanego w przypadku HTZ z zastosowaniem samego estrogenu, a także z powiązaniem terapii estrogenowej z rakiem sutka. Mimo braku potwierdzenia klinicznego, podejrzewane ryzyko doprowadziło do tego, że HTZ nie jest wskazana w przypadku znaczącej liczby kobiet po menopauzie. Wykazano, że terapia skojarzona z progestynami chroni macicę przed rakiem przy zachowaniu osteoochronnego działania estrogenu, z tym że progestyna wywołuje inne skutki uboczne, takie jak krwawienie po przerwaniu podawania, ból piersi i zmiany nastroju.

W świetle problemów związanych z terapią estrogenową przeprowadzono znaczące prace badawcze w celu zidentyfikowania skutecznych niesteroidowych związków estrogenowych i przeciwestrogenowych. Ogólnie związki takie można określić zarówno jako estrogenowe, jak i przeciwestrogenowe, gdyż z uwagi na to, że wszystkie te związki wiążą się z receptorem estrogenu, mogą wywoływać działanie estrogenowe lub przeciwestrogenowe, w zależności od położenia receptora. W przeszłości postulowano, że wiązanie się różnych niesteroidowych związków estrogenowych i przeciwestrogenowych z receptorem estrogenu spowodowane było obecnością wspólnego farmakoforu (przedstawionego poniżej na schemacie A), powtarzającego się w chemicznej strukturze tych związków.

Schemat A

Ten farmakofor stał się później szkieletem strukturalnym, wokół którego konstruowano niesteroidowe związki estrogenowe i przeciwestrogenowe. Jego obecność w konstrukcjach różnych związków, takich jak heksestrol, tamoksyfen, chroman, trifenyloetylen, DES, klomifen, centchroman, nafoksyden, trioksyfen, toremifen, zindoksyfen, raloksyfen, droloksyfen, DABP, TAT-59 i inne strukturalnie pokrewne związki, przyjęto w tej dziedzinie jako klucz cząsteczkowy zapewniający specyficzność wiązania z receptorem estrogenu.

Przykładem jednego znaczącego niesteroidowego przeciwestrogenu jest tamoksyfen (TAM), (Z)-1,2-difenylo-1-[4-[2-(dimetyloamino)etoksy]-fenylo]-1-buten, będący pochodną trifenyloetylenu. Tamoksyfen skutecznie antagonizuje pobudzające wzrost działanie estrogenów w pierwotnych tkankach docelowych, np. w sutku i w jajnikach. Obecnie ten niesteroidowy estrogen, a także strukturalnie zbliżony związek, znany jako raloksyfen, wprowadzono do leczenia i/lub profilaktyki osteoporozy, choroby sercowo-naczyniowej i raka sutka, oprócz zastosowania w leczeniu i/lub profilaktyce szeregu innych stanów chorobowych. Stwierdzono, że obydwa środki wykazują działanie osteoochronne

PL 200 947 B1 na mineralną gęstość kości, w połączeniu z dodatnim oddziaływaniem na poziom cholesterolu w osoczu i znacznie zmniejszoną liczbą przypadków raka sutka i macicy. Niestety tamoksyfen i raloksyfen wykazują w niedopuszczalnie wysokim stopniu zagrażające życiu skutki uboczne, takie jak rak trzonu macicy i rak wątrobowokomórkowy.

W związku z tym pożądane byłoby opracowanie serii niesteroidowych związków, zachowujących pożądaną charakterystykę, np. w odniesieniu do działania osteoochronnego, przy ograniczeniu do minimum niepożądanych skutków ubocznych. Jakkolwiek przyjęto, że wspomniany wyżej szkielet farmakoforu jest odpowiedzialny za specyficzność wiązania się z receptorem estrogenu, stwierdzono, że można skonstruować nowe ligandy wiążące się z receptorem estrogenu, przedstawione poniżej, które zawierają określone grupy w związkach opartych na tym farmakoforze, zwiększające do maksimum korzystne charakterystyki, takie jak działanie osteoochronne przy ograniczeniu do minimum niepożądanych charakterystyk, takich jak zwiększone ryzyko raka.

Na Fig. 1 przedstawiono reprezentatywne dane dotyczące działania uterotroficznego opisanych tutaj związków u niedojrzałych szczurów.

Na Fig. 2 przedstawiono reprezentatywne dane dotyczące gęstości mineralnej kości u szczurów z wyciętymi jajnikami w kręgosłupie lędźwiowym i kości piszczelowej.

Niesteroidowy ligand receptora estrogenu według wynalazku przedstawiony jest poniższym wzorem

Wynalazek obejmuje także swym zakresem zastosowanie tego związku do wytwarzania leku do leczenia i zapobiegania rakowi sutka.

Ponadto w zakres wynalazku wchodzi zastosowanie niesteroidowego liganda receptora estrogenu o wzorze określonym poniżej

co₂h do wytwarzania leku do leczenia i zapobiegania rakowi sutka.

Wskazane powyżej związki są reprezentatywnymi przedstawicielami grupy związków opisanych poniższym wzorem (I). Związki o wzorze (I) zostały zamieszczone w niniejszym opisie jedynie dla celów informacyjnych, stanowiąc odpowiednie odniesienie dla niniejszego wynalazku, przydatne dla właściwego zrozumienia opisanych tu zagadnień.

Wzór (I) (i)

PL 200 947 B1 w którym:

R- oznacza -(CH2)nCR⁵=CR⁶R⁷; -(CH2)mC(X)NR⁸R⁹; lub

(CH₂)_p ^każd^y z ^r2 i ^r3 oznacza niezateżnie ^H, -C^H3 -O^H, -OC^H3, -O^CH2C^H3 to^b -C^H2(C^H3)^2;

R⁴ o^znac^za ^-CN, ^-NO ², ^-CH^{3, -}CH²CH^{3, -}CH²CH^2-Y ltib ^-Y^; każdy z R⁵ i r6 oznacza niezależnie H, -C-m alkil, -C2-4 alkenyl, -C2-4 alkinyl, -X-C-i-3 alkil, -X-C2-4 alkenyl, -X-C2-4 alkinyl lub -Y;

R⁷ o^znac^za ^-CN ^-C14 alkikOH ^-C⁽O)O⁽CH³)^{3, -}C⁽O⁾NR¹⁰R^{11, -}C⁽O)NR¹²R^{13, -}C14 alkil^-NR¹⁰R^{11, -}C⁽O)R^{12, -}C⁽O)OR^{12, -}C⁽O)NR¹²OR^13, -C(O)NHC(O)Ri2, -C(O)NHCH2Ri2, -C(NH2)(NORi²), -S(O)Ri2, -S(O)(O)(OR¹²), S(O)(O)(NHCO²R¹²), PO₃R^12, -P(O)(NR¹²R¹³)(NR¹²R¹³), ^-P⁽O⁾⁽NR¹²R¹³⁾⁽OR^14), -CONR-²(CH2)qOCH3, -CONR-²(CH2)qNR⁸R9 lub oksadiazol podstawiony metylem;

każdy z r8 i r9 oznacza niezależnie atom wodoru, -C1-7 alkil, -C3-7 cykloalkil, -O-C1-7 alkil,

-Ci- 7 alkil-Y lub fenyl;

11 każdy z R i R oznacza niezależnie metyl lub etyl albo, tworzą one razem grupę morfolinową połączoną poprzez jej atom azotu;

13 14 każdy z R ,R i R oznacza niezależnie H, -C 1-12 alkil, -C2-12 alkenyl, C2-12 alkinyl, - O-C1-12 alkil, O-C2-12 alkenyl, O-C2-12 alkinyl, -C3-7 cykloalkil, C3-7 cykloalkenyl, liniowy i cykliczny heteroalkil, aryl, heteroaryl lub -Y;

X oznacza atom tlenu lub siarki;

Y oznacza atom fluorowca;

n oznacza liczbę całkowitą wybraną spośród 0, ii 2; m oznacza liczbę całkowitą 1 lub 2; p oznacza liczbę całkowitą wybraną spośród 1 - 4; a q oznacza liczbę całkowitą 1-12.

W użytym tutaj znaczeniu termin „alkil”, sam lub w kombinacji, oznacza nasyconą grupę węglowodorową o prostym łańcuchu lub o rozgałęzionym łańcuchu, wybraną spośród C1-C7, o ile nie została poprzedzona określeniem definiującym inną długość łańcucha. Termin „niższy alkil” oznacza C1-C4, o ile nie został poprzedzony określeniem definiującym inną długość łańcucha. Do przykładowych grup alkilowych należy metyl, etyl, n-propyl, izopropyl, izobutyl, n-butyl, n-heksyl itp.

Termin „fluorowcoalkil” oznacza alkil podstawiony jednym lub większą liczbą atomów fluorowca. Termin „cykloalkil” obejmuje cykliczne rodniki węglowodorowe C3-C7. Do pewnych przykładowych rodników cykloalkilowych należy cyklonropyl, cyklobutyl, cyklobutyl i cyklopentyl.

Termin „aryl”, sam lub w kombinacji, oznacza grupę monocykliczną lub policykliczną, korzystnie grupę monocykliczną lub bicykliczną, np. fenyl lub naftyl, który może być niepodstawiony lub podstawiony, np. jednym lub większą liczbą, zwłaszcza 1-3 podstawnikami wybranymi z grupy obejmującej atom fluorowca, alkil, hydroksyl, alkoksyl, fluorowcoalkil, grupę nitrową, grupę aminową, grupę acyloaminową, grupę alkiltio, alkilsulfinyl i alkilsulfonyl. Do pewnych przykładowych grup arylowych należy fenyl, 2-chlorofenyl, 3-chlorofenyl, 4-chlorofenyl, 2-metylofenyl, 4-metoksyfenyl, 3-trifluorometylofenyl, 4-nitrofenyl itp.

Termin „heteroaryl” oznacza 5-członową lub 6-członową heterocykliczną grupę aromatyczną, która może ewentualnie zawierać skondensowany pierścień benzenowy i która może być niepodstawiona lub podstawiona, np. jednym lub większą liczbą, zwłaszcza 1-3 podstawnikami wybranymi z grupy obejmującej atom fluorowca, alkil, hydroksyl, alkoksyl, fluorowcoalkil, grupę nitrową, grupę aminową, grupę acyloaminową, grupę alkiltio, alkilsulfinyl i alkilsulfonyl.

Termin „atom fluorowca” oznacza atom fluoru, chloru, bromu i jodu.

Terminy „liniowy i cykliczny heteroalkil” odpowiadają określeniu „alkil”, z odpowiednim zastąpieniem atomów węgla pewnymi innymi atomami, takimi jak atomy azotu lub siarki, które mogą zapewnić powstanie chemicznie trwałej grupy.

PL 200 947 B1

Ponadto w pewnych grupach funkcyjnych podanych powyżej wprowadzono nawiasy „()” otaczające pewne atomy lub grupy atomów, gdy wydaje się celowe uściślenie struktury cząsteczkowej lub układu wiązań. W szczególności pojedynczy atom, taki jak „O”, lub grupa atomów, taka jak „NH2”, może być umieszczona w nawiasach we wzorze jednej z grup funkcyjnych podanych powyżej [patrz np. przypadek, gdy R⁷ oznacza.. -C(O)R¹², -C(O)OR¹², -C(O)NR¹²OR¹³, -C(NH2)(NOR1²), itp.]. W takiej sytuacji celem nawiasu jest podanie, że zawarte w nim atomy lub grupy atomów połączone są z najbliższym chemicznie odpowiednim atomem, który nie znajduje się w nawiasie.

W szczególności -C(O)R12 oznacza np. grupę funkcyjną, w której atom tlenu połączony jest z atomem węgla, najbliższym poprzedzającym atomem, który nie znajduje się w nawiasie i zgodnie z klasyczną teorią elektronowych orbitali wiązania jest zdolny do utworzenia wiązania chemicznego. Natomiast -C(NH2)(NOR1²) oznacza grupę funkcyjną, w której atomy azotu w grupach NH2 i NOR12 są połączone z atomem węgla, najbliższym poprzedzającym atomem nie znajdującym się w nawiasie. Przykłady te zilustrowano poniżej jako (a) i (b). Dla specjalistów jasne jest, że odpowiednie typy wiązań (np. wiązanie pojedyncze, podwójne itp.) wynikają w sposób oczywisty z reguł orbitali wiązania.

-C-R¹² -C-NOR¹² u . u o NH2 (a) (b)

Ponadto pewne grupy funkcyjne wspomniane wyżej zawierają nawiasy „()” otaczające pewne atomy lub grupy atomów, przy czym bezpośrednio po tych nawiasach występuje literowy lub cyfrowy indeks dolny [patrz np. przypadek, gdy r7 oznacza..-CONR1²(CH3)qOCH3]: W takiej sytuacji atom lub grupa atomów znajdująca się w nawiasie występuje w grupie funkcyjnej jako wielokrotność określona indeksem dolnym. Tak np. gdy q = 2 w grupie R oznaczającej -CONR (CH3)qOCH3, to R = ^-CONR¹²CH²CH²OCH3.

W związkach o wzorze (I) występują centra stereochemiczne. W związku z tym wszystkie możliwe stereoizomery i izomery geometryczne związków o wzorze (I), oraz związki racemiczne, jak również optycznie czynne izomery mogą stanowić przedmiot zainteresowania specjalistów. Gdy związek o wzorze (I) pożądany jest jako pojedynczy enancjomer, można go otrzymać przez rozdzielanie produktu końcowego lub na drodze syntezy stereospecyficznej z izomerycznie czystego materiału wyjściowego lub dogodnego produktu pośredniego. Rozdzielanie produktu końcowego, produktu pośredniego lub materiału wyjściowego można przeprowadzić dowolnym znanym sposobem. Patrz np. Stereochemistry of Carbon Compounds, E. L. Eliel (Mcgraw Hill, 1962) oraz Tables of Resolving Agents, S. H. Wilen. Dodatkowo, w przypadkach, gdy jest to możliwe, wszystkie tautomeryczne postaci związków o wzorze (I) mogą stanowić przedmiot zainteresowania specjalistów.

Poniżej zestawiono pewne konkretne związki o wzorze (I), których syntezę przeprowadzano w sposób opisany poniżej w przykładach.

Związek Nr:

1.3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-N, N-dietyloakryloamid;

2. 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]N,N-dietylopropionamid;

3. dietyloamid kwasu 2-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]cyklopropanokarboksylowego;

4. 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-N,N-dietylo-2-metyloakryloamid;

5. dietyloamid kwasu 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-but-2-enowego;

6. ester metylowy kwasu 3-[4-(1,2-difenylobut-1-eylo)fenylo]akrylowego;

7. 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]akrylonitryl.

8. ester t-butylowy kwasu 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]akrylowego;

9. kwas 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]akrylowy;

10. 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-1-morfolin-4-yloprop-2-en-1-on;

11.3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-N-(3-metoksypropylo)akryloamid;

12. N,N-dicykloheksylo-3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]akryloamid;

13. N-(2-dimetyloaminoetylo)-3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-N-etyloakryloamid;

14. 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-N-metylo-N-oktyloakryloamid;

15. 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]akryloamid;

PL 200 947 B1

16. 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-N-etyloakryloamid;

17. oksym 1-amino-3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]prop-2-en-1-onu;

18. 3-{2-[4(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]winylo}-5-metylo-[1,2,4]-oksadiazol;

19. 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]prop-2-en-1-ol;

20. {3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]allilo}dimetyloamina;

21.3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-N,N-dietylotioakryloamid;

22. 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-N-(3-hydroksypropylo)akryloamid.

Ogólnie związki o wzorze (I) można wytwarzać sposobami przedstawionymi na poniższych schematach reakcji. Dla specjalisty oczywiste jest, że na wszystkich poniższych schematach w razie potrzeby należy stosować grupy zabezpieczające, zgodnie z ogólnymi zasadami chemii. Takie grupy zabezpieczające usuwa się w końcowych etapach w warunkach zasadowych lub kwasowych albo na drodze hydrogenolizy, w sposób dobrze znany specjalistom. Stosując odpowiednie manipulacje i zabezpieczanie dowolnej grupy funkcyjnej, przeprowadzić można syntezę dowolnych związków o wzorze (I) niewyszczególnionych w opisie, sposobami analogicznymi do zilustrowanych poniżej na schematach B - G oraz sposobami opisanymi w przykładach.

Ogólnie syntezę stosowaną przy wytwarzaniu opisanych tu związków zaprojektowano tak, aby osiągnąć dostęp do analogów pierścienia B z konfiguracją E centralnego, tetrapodstawionego wiązania podwójnego. Jeden sposób wytwarzania związków o wzorze (I) przedstawiono poniżej na schemacie B, zgodnie z którym odpowiedni bromek, taki jak bromek (b) [np. (E)-1-bromo-2-fenylo-1-(trimetylsililo)-1-buten] wytwarza się w ilościach wielu gramów z acetylenu (a), sposobem Millera (patrz Miller, R. B.; Al-Hassan, M. I., Stereospecific Synthesis of (Z)-Tamoxifen via Carbometalation of Alkynylsilanes. J. Org. Chem. 1985, 50, 2121-2123). Bromek (b) sprzęga się z odpowiednim kwasem aryloboronowym, takim jak (c), w obecności katalizatora palladowego, otrzymując żądany aldehyd (d) [np. (Z)-1,2-difenylo-1-(4-formylofenylo)-1-buten], jako pojedynczy izomer. Bromek (b) i aldehyd (d) stanowią uniwersalne związki pośrednie w syntezie B-pierścieniowych analogów tamoksyfenu.

Jak to zilustrowano poniżej na schemacie C, w wyniku sprzęgania bromku (b) z kwasem aryloboronowym (e) otrzymuje się a,b-nienasycony dietyloamid (g), będący związkiem nr 1 wymienionym powyżej i opisanym poniżej w przykładzie 2. Należy podkreślić, że synteza tego dietyloamidu takim sposobem może spowodować osiągnięcie niskiej wydajności, prawdopodobnie z uwagi na nietrwałość termiczną kwasu aryloboronowego (e). Przy opracowywaniu opisanych tutaj związków stwierdzono również, że zidentyfikowanie dietyloamidu (g) jako żądanego związku (czyli związku nr 1: 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-N,N-dietyloakryloamidu) podyktowało konieczność znalezienia wydajniejszej syntezy przy wytwarzaniu analogu. Stwierdzono, że w reakcji Hornera-Emmonsa aldehydu (d) z fosfonianem (f) otrzymuje się dietyloamid (g) ze znacząco wyższą wydajnością.

PL 200 947 B1

Dodatkowo, powyższy schemat C ilustruje, że a,b-nienasycony dietyloamid (g) można przekształcić w:

(a) tioamid (h), [związek nr 21: 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-N,N-dietylotioakryloamid], przy użyciu odczynnika Lawessona;

(b) nasycony amid (i), [związek nr 2: 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-N,N-dietylopropionamid] przez uwodornienie; lub (c) (j), [zwi-ązek nr 3: dietyloamid kwasu 2-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]cyklopropanokarboksylowego] z ilidem Corey'a.

Zgodnie z poniższym schematem D, analogi dietyloamidu (g) zawierające tripodstawione a,b-nienasycone wiązanie podwójne można zsyntetyzować z odpowiedniego aldehydu, takiego jak (d), lub z odpowiedniego ketonu, takiego jak (n). W szczególności przeprowadzić można reakcję Hornera-Emmonsa metylofosfonianu (k) z aldehydem (d) w celu otrzymania a-metyloamidu (1) [związek nr 4: 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-N,N-dietylo-2-metyloakryloamid) jako pojedynczego izomeru, a reakcję fosfonianu (f) z ketonem (n) można przeprowadzić w celu otrzymania mieszaniny E i Z b-metyloamidów (o, p) [związku nr 5: dietyloamidu kwasu 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-but-2-enowego - izomery (Z) i (E)], które można rozdzielić metodą chromatografii szybkiej, a ich względną stereochemię można następnie ustalić na podstawie analizy ¹H NMR NOE.

PL 200 947 B1

Jak przedstawiono poniżej na schemacie E, kwas karboksylowy (r) [związek nr 9: kwas 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]akrylowy] można otrzymać przez zmydlanie estru metylowego (q) [związku nr 6: estru metylowego kwasu 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]akrylowego], który z kolei można zsyntetyzować na drodze kondensacji aldehydu (d) z fosfonooctanem trimetylu, jak to przedstawiono na schemacie D. Na schemacie E przedstawiono także, jak kwas karboksylowy (r) można zastosować jako kluczowy związek pośredni w syntezie odrębnej serii a,b-nienasyconych amidów w wyniku sprzęgania z szeregiem liniowych i cyklicznych amin alkilowych i heteroalkilowych.

PL 200 947 B1

Jak przedstawiono poniżej na schemacie F, oksadiazol (v) [związek nr 18: 3-{2-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]winylo)-5-metylo-[1,2,4]-oksadiazol] można zsyntetyzować z nitrylu (t) [związku nr 7: 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]akrylonitrylu] w reakcji z hydroksyloaminą, w której otrzymuje się oksym amidu (u) [związek nr 18: 3-{2-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]winylo}-5-metylo-[1,2,4]oksadiazol], który poddaje się cyklizacji z bezwodnikiem octowym.

Jak przedstawiono poniżej na schemacie G, alkohol (x) [związek nr 19: 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-prop-2-en-1-ol] i dimetyloaminę (y) [związek nr 20: {3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]allilo}-dimetyloaminę] można zsyntetyzować z estru t-butylowego (w) [związku nr 8: estru t-butylowego kwasu 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]akrylowego] przez redukcję wodorkiem, a następnie mesylowanie i alkilowanie dimetyloaminą.

PL 200 947 B1

Procedury ogólne

O ile nie zaznaczono tego inaczej, wszystkie materiały wyjściowe otrzymano od handlowych dostawców i stosowano je bez dalszego oczyszczania. Temperatury topnienia oznaczano w kapilarach w aparacie Mel-Temp i nie korygowano ich. Widma ¹H NMR i ¹³C NMR otrzymywano w spektrometrach Varian Unity-300 i Varian XRL-300, z TMS jako wzorcem wewnętrznym, w CDCh. Przesunięcia chemiczne podano w ppm (s); krotności zaznaczono jako s (singlet), d (dublet), t (triplet), q (kwartet), m (multiplet), br (poszerzony). Stałe sprzęgania (J) podano w Hz. Mikroanalizy wykonywano w Atlantic Microlabs, Inc. i wszystkie wartości podano z dokładnością ± 0,4% wartości teoretycznej. Widma mas wykonywano w aparacie JEOL JMS-AX505HA Mass Spectrometer z jonizacją na drodze bombardowania szybkimi atomami. Widma w podczerwieni rejestrowano w aparacie Perkin-Elmer 1280 Infrared Spectrometer. Analityczną chromatografię cienkowarstwową wykonywano na płytkach szklanych EM Science powlekanych krzemionką 60 F254; z wizualizacją z użyciem promieniowania UV, jodu lub molibdenianu amonu. Chromatografię szybką wykonywano na żelu krzemionkowym EM Science o uziarnieniu 230-400 mesh. MPLC wykonywano w układzie Pharmacia LKB Series z użyciem detektora Rainin Dynamax UV-C kolumny z żelem krzemionkowym Merck Lobar Si60 (40-63 mm). HPLC wykonywano w aparacie Shimadzu LC-6A Series HPLC z użyciem kolumny Rainin Dynamax C18 RP lub kolumny Rainin Dynamax Silica. Wszystkie odczynniki były czyste i stosowano je bez dalszego oczyszczania. (E)-1-Bromo-2-fenylo-1-(trimetylosililo)-1-buten [patrz (b), schemat B, powyżej] otrzymano metodą Millera, powołaną powyżej, a kwas 4-formyloboronowy otrzymano metodą Noth'a (patrz Feulner, H.; Linti, G.; Noth, H. Preparation and Structural Characterization of p-Formylbenzeneboronic Acid. Chem. Ber. 1990, 123, 1841-1843. Kwasy boronowe [patrz (e) i (m), odpowiednio schematy C i D] otrzymano w Glaxo Group Research Ltd., Hertfordshire, UK, odpowiednio

PL 200 947 B1 z 3-(4-bromofenylo)-N,N-dietyloakryloamidu i 4-bromoacetofenonu, metodą Gilman (patrz Gilman, H.; Santucci, L.; Swayampati, D.R.; Ranck, R.O. Hydroxybenzeneboronic Acids and Anhydrides. J. Am. Chem. Soc. 1957, 79, 3077-3082.

Następujące związki otrzymano zgodnie z ogólnymi procedurami syntezy, podanymi powyżej, w celu lepszego zilustrowania sposobów wytwarzania różnych opisanych tutaj związków.

P r z y k ł a d 1 (Z)-1,2-difenylo-1-(4-formylofenylo)-1-buten

Roztwór 1,0 g (3,5 mmola) (E)-1-bromo-2-fenylo-1-(trimetylsililo)-1-butenu, 625 mg (4,2 mmola,

1,2 równ.) kwasu boronowego [patrz (c), schemat B] i 400 mg (0,35 mmola, 0,1 równ.) Pd(PPh3)4 w 10 ml DME potraktowano 2 ml 2 N Na2CO3, a następnie ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 6 godzin. Roztwór ochłodzono do temperatury pokojowej, wylano do NaHCO3 (40 ml), wyekstrahowano octanem etylu (2 x 40 ml), wysuszono (MgSO4) i rozpuszczalnik usunięto pod próżnią. W wyniku oczyszczania metodą chromatografii szybkiej na żelu krzemionkowym, z użyciem heksanu/octanu etylu 20/1 jako eluentu, otrzymano 700 mg (69%) żądanego związku, o nazwte ^po^danej ^pow^y^ w ^pos^tacⁱ żółtej sitostancji stałej: ¹IH ^NMR (CDCl·,. ^{300 MH}z) s ^9,82 (s, W), 7^,55^-7^,00 14H) 2^,48 (ą 2H) 0^,97 (L 3H^); MS o małe^j ro^zd^zielc^zości m/e 313 ⁽MH⁺). [^patrz n^p. (d) schemat B, powyżej].

P r z y k ł a d 2

3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-N,N-dietyloakryloamid

Procedura A. Roztwór 51 mg (0,18 mmola, 1,1 równ.) (E)-1-bromo-2-fenylo-1-(trimetylsililo)-1-butenu, 40 mg (0,16 mmola) kwasu aryloboronowego [patrz (e), schemat C] i 20 mg (16,2 mmola, 0,1 równ.) Pd(PPh3)4 w 5 ml DME potraktowano 0,5 ml 2 N Na2CO3, a następnie ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 2 godziny. Roztwór ochłodzono do temperatury pokojowej, wylano do NaHCO3 (20 ml), wyekstrahowano octanem etylu (2 x 20 ml), wysuszono (MgSO4) i rozpuszczalnik usunięto pod próżnią. W wyniku oczyszczania metodą chromatografii szybkiej na żelu krzemionkowym, z użyciem heksanu/octanu etylu 3/1 jako eluentu, otrzymano 10 mg (15%) żądanego związku, o nazwie podanej powyżej, w postaci białej substancji stałej: t.t. 138-140°C; ¹H NMR (CDCh, 300 MHz) s 7,53 (d, 1H, J=15,4), 7,38-7,11 (m, 12H), 6,86 (d, 2H, J=8,3), 6,66 (d, 1H, J=15,4), 3,40 (m, 4H), 2,47 (q, 2H, J=7,3), 1,19 (m, 6H), 0,93 (t, 3H, J=7,3); MS o wysokiej rozdzielczości. Obliczono 410,2483, Stwierdzono 410,2484.

Procedura B. W wyniku użycia dietylokarbamoilometylenofosfonianu dietylu [patrz (f), schemat C], jak to podano w ogólnej procedurze sprzęgania Hornera-Emmonsa (patrz przykład 7, poniżej) z aldehydem, (Z)-1,2-difenylo-1-(4-formylofenylo)-1-butenem, oraz oczyszczania metodą chromatografii szybkiej na żelu krzemionkowym z gradientem heksan/octan etylu 20/1 do 2/1 jako eluentu, otrzymano 110 mg (42%) żądanego związku, o nazwie podanej powyżej, w postaci białej substancji stałej: t.t. 137-138°C; ¹H NMR (CDCla, 300 MHz) s 7,53 (d, 1H, J=15,4), 7,36-7,11 (m, 12H), 6,86 (d, 2H, J=8,3), 6,66 (d, 1H, J=15,4), 3,42 (m, 4H), 2,47 (q, 2H, J=7,3), 1,19 (m, 6H), 0,93 (t, 3H, J=7,3); Anal. (C29H31NO) C, H, N. [patrz np. (g), schemat C, powyżej].

P r z y k ł a d 3

3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-N,N-dietylotioakryloamid

Mieszaninę 65 mg (0,16 mmola) 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-N,N-dietyloakryloamidu (patrz przykład 2) i 39 mg (95,2 mmola, 0,6 równ.) odczynnika Lawessona ogrzewano w 2 ml suchego toluenu w 85°C przez 2 godziny. Roztwór ochłodzono do temperatury pokojowej i umieszczono bezpośrednio w kolumnie do chromatografii szybkiej z żelem krzemionkowym. W wyniku oczyszczania przez eluowanie mieszaniną heksan/octan etylu 10/1 otrzymano 54 mg (83%) tioamidu żądanego związku, o nazwie podanej powyżej, w postaci żółtej pianki: t.t. 43-61°C; ¹H NMR (CDCh, 300 MHz) s 7,85 (d, 0,5H), 7,75 (d, 0,5H), 7,65 (d, 0,5H), 7,40-6,80 (m, 13,5H), 4,05 (m, 2H), 3,70 (m, 2H), 2,45 ^(m 2H) 1^,30 ^(m 6H) 0^,95 ^(m 3H^{); 13}C NMR (CDC^ 75 MHz) s 193^ 144^ 143^

143,11, 141,92, 138,26, 133,00, 131,22, 130,83, 129,66, 128,28, 128,01, 127,91, 127,86, 127,70, 127,48, 127,02, 126,83, 126,45, 124,04, 48,54, 46,40, 29,19, 13,86, 13,67, 13,62, 11,66; IR (CHCls) 3050, 1520, 1210, 950, 750; Anal. (C29H31NS) C, H, N. [patrz np. (h), schemat C, powyżej].

P r z y k ł a d 4

3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-N,N-dietylopropionamid

Roztwór 50 mg (0,12 mmola) 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-N,N-dietyloakryloamid (patrz przykład 2) i 3 mg chlorku tris(trifenylfosfina)-rodu(I) (katalizatora Wilkinsona) w 1 ml suchego toluenu mieszano w atmosferze H2 w 50°C przez 16 godzin. Roztwór ochłodzono do temperatury pokojowej

PL 200 947 B1 i toluen usunięto pod próżnią. W wyniku oczyszczania pozostałości metodą chromatografii szybkiej na żelu krzemionkowym, z użyciem heksanu/octanu etylu 2/1 jako eluentu, otrzymano 48 mg (95%) żądanego związku, o nazwie podanej powyżej, w postaci klarownego, bezbarwnego oleju: ¹H NMR (CDCla, 300 MHz) s 7,37-7,11 (m, 10H), 6,85 (d, 2H, J=8,3), 6,78 (d, 2H, J=8,3), 3,31 (q, 2H, J=7,1), 3,08 (q, 2H, J=7,3), 2,81 (t, 2H, J=8,3), 2,44 (m, 4H), 1,03 (m, 6H), 4 0,91 (t, 3H, J=7,3); MS o małej rozdz^czo^ m^/a ⁴¹² (^MH+)^; Anal· (^C2^9H33^NO) C, H, ^N. [^pa^trz n^p. (i), sc^hema^t C, ^pow^yżej].

P r z y k ł a d 5

Dietyloamid kwasu 2- [4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]cyklopropanokarboksylowego

Roztwór 12 mg (0,24 mmola, 2,0 równ.) wodorku sodu (50% w oleju) i 54 mg (0,24 mmola, 2,4 równ.) jodku trimetyloksosulfoniowego w 2 ml suchego dimetylosulfotlenku mieszano 30 min w temperaturze pokojowej; w tym czasie zanikło wydzielanie się gazu. Następnie dodano roztwór 50 mg (0,12 mmola) amidu otrzymanego w przykładzie 2 w 0,5 ml dimetylosulfotlenku i otrzymany roztwór ogrzewano w 50°C przez 16 godzin. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury pokojowej, wylano do 20 ml H2O i wyekstrahowano octanem etylu (2 x 20 ml). Warstwy organiczne połączono, wysuszono (MgSO4) i rozpuszczalnik usunięto pod próżnią. W wyniku oczyszczania pozostałości metodą MPLC na żelu krzemionkowym, z użyciem heksanu/octanu etylu 4/1 jako eluentu, otrzymano 32 mg (62%) żądanego związku, o nazwie podanej powyżej, w postaci białej substancji stałej: t.t. 42-44°C; ¹H NMR (CDCls, 300 MHz) s 7,37-7,10 (m, 10H), 6,76 (m, 4H), 3,38 (q, 4H, J=7,1), 2,45 (q, 2H, J=7,4), 2,30 (m, 1H), 1,79 (m, 1H), 1,55 (m, 1H), 1,11 (m, 7H), 0,92 (t, 3H, J=7,4); MS o małej rozidz^czo^ m^/a ⁴²⁴ (^MH+)^; Anal· (^C30^H33^NO) C, H, ^N. [^pa^trz n^p. 0) sc^hema^t C, ^pow^yżej].

P r z y k ł a d 6

Dietylokarbamoilometylenofosfonian metylo-dietylu

Roztwór 4,4 ml (2,2 mmola, 1,1 równ.) KN(TMS)2 (0,5 M w toluenie) dodano do zimnego (-78°C) roztworu 500 mg (2,0 mmola) dietylokarbamoilometylenofosfonianu dietylu w 5 ml suchego THF. Otrzymany roztwór mieszano 10 minut, po czym dodano 0,15 ml (2,4 mmola, 1,2 równ.) czystego jodku metylu. Otrzymany roztwór pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej i mieszano 1 godzinę, po czym wylano do solanki (70 ml) i wyekstrahowano octanem etylu (2 x 60 ml). Warstwy organiczne połączono, wysuszono (MgSO4) i rozpuszczalnik usunięto pod próżnią. W wyniku oczyszczania żółtej pozostałości drogą destylacji w wyparce rotacyjnej otrzymano 525 mg (100%) żądanego związku, o nazwie podanej powyżej, w postaci klarownego, bezbarwnego oleju: t.w. 155°C pod ciśnieniem 0,15 tora; ¹H NMR (CDCls, 300 MHz) s 4,18 (m, 4H), 3,60 (m, 1H), 3,22 (m, 4H), 1,37 (m, 9H), 1,18 (m, 6H). [patrz np. (k), schemat C, powyżej].

P r z y k ł a d 7

Ogólna procedura reakcji Hornera-Emmonsa z (Z)-1,2-difenylo-1-(4-formylofenylo)-1-butenem.

Roztwór 1,2 równ. KN(TMS)2 (0,5 M w toluenie) dodano do mieszanego w 0°C roztworu

1,2 równ. odpowiedniego fosfonianu w suchym THF. Otrzymany roztwór mieszano 15 min. w 0°C, po czym ochłodzono do -78°C i wkroplono roztwór (Z)-1,2-difenylo-1-(4-formylofenylo)-1-butenu w THF. Otrzymany roztwór pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej i mieszano 4 godziny, po czym ogrzewano w 50°C przez 2 godziny, aby zapewnić doprowadzenie reakcji do końca. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury pokojowej, wylano do solanki i wyekstrahowano 2 razy octanem etylu. Warstwy organiczne połączono, wysuszono (MgSO4), rozpuszczalnik usunięto pod próżnią i pozostałość oczyszczano metodą chromatografii szybkiej na żelu krzemionkowym.

P r z y k ł a d 8

3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-N,N-dietylo-2-metylo-akryloamid

W wyniku użycia dietylokarbamoilometylenofosfonianu metylo-dietylu w sposób opisany powyżej, oraz oczyszczania metodą chromatografii szybkiej, z użyciem mieszaniny heksan/octan etylu 3/1 jako eluentu, otrzymano 36 mg (53%) żądanego związku, o nazwie podanej powyżej, w postaci klarowne^ ^bez^barwne^go oteju: ¹IH ^NMR (CDC^ ^{300 MH}z) s T³⁹-^7,11 (m, 10H), ^6,97 (d, ²H ^J=^8,0) 6,85 (d, 2H, J=8,3), 6,32 (s, 1H), 3,38 (m, 4H), 2,47 (q, 2H, J=7,3), 2,00 (s, 3H), 1,14 (t, 6H, J=7,1), 0,93 (t, 3H, J=7,3); MS o małej rozdzielczości m/a 424; Anal. (C30H33NO) C, H, N. [patrz np. (1), schemat D, powyżej].

P r z y k ł a d 9

Dietyloamid kwasu (Z)- i (E)-3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]but-2-enowego

W wyniku użycia dietylokarbamoilometylenofosfonianu dietylu w sposób opisany powyżej, oraz oczyszczania metodą chromatografii szybkiej, z użyciem mieszaniny heksan/octan etylu 5/2, otrzymano 95 mg (49%) (Z)-izomeru żądanego związku, o nazwie podanej powyżej, w postaci białej substancji

PL 200 947 B1 stałej i 11 mg (6%) (E)-izomeru, w postaci bezbarwnego oleju. Dane analityczne dla Z-izomeru. t.t. 109-111°C; ¹H NMR (CDCla, 300 MHz) s 7,39-7,09 (m, 12H), 6,85 (d, 2H, J=8,3), 6,20 (d, 1H, J=1,0), 3,44 (q, 2H, J=7,1), 3,33 (q, 2H, J=7,1), 2,47 (q, 2H, J=7,5), 2,16 (d, 3H, J=1,0), 1,13 (m, 6H), 0,93 (t, 3H, J=7,6); MS o małej rozdzielczości m/a 424; Anal. (C30H33NO) C, H, N. Dane analityczne dla (E)-izomeru: ¹E NMR (CDCh, 300 MHz) s 7,36-7,09 (m, 10H), 7,00 (d, 2H, J=8,3), 6,81 (d, 2H, J=8,2), 5,80 (d, 1H, J=1,0), 3,22 (q, 2H, J=7,2), 2,91 (q, 2H, J=7,1), 2,45 (q, 2H, J=7,6), 2,04 (d, 3H, J=1,0), 0,89 (m, 6H), 0,74 (t, 3H, J=7,6); MS o małej rozdzielczości m/a 424. [patrz np. (o, p), schemat D; powyżej].

P r z y k ł a d 10

Ester metylowy kwasu 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]akrylowego

W wyniku użycia fosfonooctanu trimetylu w sposób opisany powyżej, oraz oczyszczania metodą chromatografii szybkiej na żelu krzemionkowym, z użyciem heksanu/octanu etylu 20/1 jako eluentu, otrzymano 2,33 g (100%) żądanego związku, o nazwie podanej powyżej, w postaci białej substancji stałej: t.t. 133-135°C; ¹H NMR (CDCh, 300 MHz) s 7,53 (d, 1H, J=16,0), 7,39-7,10 (m, 12H), 6,88 (d, 2H, J=8,3), 6,27 (d, 1H, J=16,0), 3,76 (s, 3H), 2,48 (q, 2H, J=7,3), 0,93 (t, 3H, J=7,3); MS o małej rozdzielczości m/a 369; Anal. (C26H24O2) C, H, N. [patrz np. (q), schemat E, powyżej].

P r z y k ł a d 11

3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]akrylonitryl

W wyniku użycia cyjanometylofosfonianu dietylu w sposób opisany powyżej, z oczyszczaniem metodą chromatografii szybkiej na żelu krzemionkowym, z użyciem mieszaniny heksan/octan etylu 10/1 jako eluentu, otrzymano 125 mg (93%) żądanego związku, o nazwie podanej powyżej, w postaci klarownego, bezbarwnego oleju, który zestalił się po odstawieniu: t.t. 101-102°C; ¹H NMR (CDCh, 300 MHz) s 7,40-7,07 (m, 13H), 6,90 (d, 2H, J=8,6), 5,79 (d, 1H, J=16,6), 2,48 (q, 2H, J=7,3), 0,93 (t, 3H, J=7,3); Anal. (C25H21N) C, H, N. [patrz np. (t), schemat F, powyżej].

P r z y k ł a d 12

Ester t-butylowy kwasu 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]akrylowego

W wyniku użycia dietylofosfonooctanu t-butylu w sposób opisany powyżej, z oczyszczaniem metodą chromatografii szybkiej na żelu krzemionkowym, z użyciem heksanu/octanu etylu 20/1 jako eluentu, a następnie rekrystalizacji z gorącego heksanu otrzymano 52 mg (95%) żądanego związku, o nazwie podanej powyżej, w postaci białej substancji stałej: t.t. 139-140°C; ¹H NMR (CDCh, 300 MHz) s 7,44-7,09 (m, 13H), 6,86 (d, 2H, J=8,3), 6,20 (d, 1H, J=16,1), 2,47 (q, 2H, J=7,4), 1,49 (s, 9H), ^0,93 (t, ³H ^J=^7,4)^{; MS} o matej roz^dzⁱe^lczo^ścⁱ m^/a ^373, no ^MH+; Anat (^C29^H3o^O2) C, ^H. [^patez n^p. (w), schemat G, powyżej].

P r z y k ł a d 13

1-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]etanon

Roztwór 172 mg (0,60 mmola) (E)-1-Bromo-2-fenylo-1-(trimetylsililo)-1-butenu [patrz (b), schemat B, powyżej], 125 mg (0,60 mmola, 1,0 równ.) kwasu boronowego [patrz (m), schemat D] i 70 mg (0,06 mmola, 0,1 równ.) Pd(PPh3)4 w 8 ml DME potraktowano 0,4 ml 2 N Na2CO3, a następnie ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 18 godzin. Roztwór ochłodzono do temperatury pokojowej, wylano do solanki (20 ml), wyekstrahowano octanem etylu (2 x 20 ml), wysuszono (MgSO4) i rozpuszczalnik usunięto pod próżnią. W wyniku oczyszczania metodą chromatografii szybkiej na żelu krzemionkowym, z użyciem mieszaniny heksan/octan etylu 20/1 jako eluentu, otrzymano 152 mg (78%) żądanego związku, o nazwie podanej powyżej, w postaci żółtej substancji stałej: ¹H NMR (CDCls, 300 MHz) s 7,6 (d, 2H), 7,45-7,10 (m, 10H), 6,98 (d, 2H), 2,48 (m, 3H), 0,94 (t, 3H). [patrz np. (n), schemat D, powyżej].

P r z y k ł a d 14

Kwas 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]akrylowy

Roztwór 50 ml (16 mmoli, 10,0 równ.) 0,2 M KOH wkroplono w ciągu 2 minut do roztworu 600 mg estru otrzymanego w przykładzie 10 (1,6 mmola, 1,0 równ.) w 90 ml metanolu/THF 1/2. Otrzymany roztwór mieszano 18 godzin w temperaturze pokojowej i rozpuszczalnik usunięto pod próżnią. Pozostałość rozpuszczono w 30 ml 1 M HCl i wyekstrahowano octanem etylu (2 x 60 ml). Warstwy organiczne połączono, wysuszono (MgSO4) i rozpuszczalniki usunięto pod próżnią. W wyniku oczyszczania pozostałości metodą chromatografii szybkiej na żelu krzemionkowym, z użyciem mieszaniny chlorek metylenu/metanol 95/5 jako eluentu, otrzymano 370 mg (63%) żądanego związku, o nazwie podanej powyżej, w postaci białej substancji stałej: t.t. 148-150°C; ¹H NMR (CDCl3, 300 MHz) s 7,60 (d, 1H, J=15,9), 7,39-7,10 (m, 12H), 6,89 (d, 2H, J=8,1), 6,27 (d, 1H,

PL 200 947 B1

J=15,9), 2,48 (q, 2H, J=7,3), 0,93 (t, 3H, J=7,3); MS o małej rozdzielczości m/a 356; Anal. C25H22O2) C, H. [patrz np. (r), schemat E, powyżej].

P r z y k ł a d 15

Ogólna procedura reakcji sprzęgania z kwasem 3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]akrylowym

Do roztworu 1,0 równoważnika kwasu (20) w suchym chlorku metylenu dodano 1,0 równ. EDC,

1,3 równ. HOBT i 1,0 równ. Et₃N, a następnie 1,2 równ. odppwiedniej aminy. Otrzzmany rootwór mieszano 18 godzin w temperaturze pokojowej, po czym wylano go do 20 ml H2O i wyekstrahowano 2 razy octanem etylu (2 x 60 ml). Warstwy organiczne połączono, przemyto H2O (1 x 20 ml), wysuszono (MgSO4), rozpuszczalnik usunięto pod próżnią i pozostałość oczyszczano metodą chromatografii szybkiej na żelu krzemionkowym, MPLC na żelu krzemionkowym, lub przez rekrystalizację.

P r z y k ł a d 16

3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)-fenylo]-1-morfolin-4-yloprop-2-en-1-on

W wyniku użycia morfoliny, oraz oczyszczania metodą MPLC na żelu krzemionkowym, z użyciem heksanu/octanu etylu 2/1 jako eluentu, a następnie rekrystalizacji z gorącego heksanu otrzymano 12 mg (14%) żądanego związku, o nazwie podanej powyżej, w postaci białej substancji stałej: t.t. 150-154°C; ¹H NMR (CDCty 300 MHz) s 7,53 (d, 1H, J=15,4), 7,39-7,10 (m, 12H), 6,87 (d, 2H, J=8,3), 6,67 (d, 1H, J=15,4), 3,65 (m, 8H), 2,48 (q, 2H, J=7,3), 1,26 (szeroki, 8H), 0,93 (t, 3H, J=7,3); MS o małej rozdzielczości m/e 424; Anal. (C29H29NO2) C, H, N. [patrz np. (s), schemat E, powyżej].

P r z y k ł a d 17

3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-N-(3-metoksypropylo)akryloamid

W wyniku użycia 3-metoksypropyloaminy, oraz oczyszczania przez rekrystalizację z gorącego heksanu/octanu etylu 2/1, oraz metodą MPLC na żelu krzemionkowym, z użyciem heksanu/octanu etylu 1/2 jako eluentu, otrzymano 20 mg (30%) żądanego związku, o nazwie podanej powyżej, w ^pos^tac^{i bi}a^łej sulosten^ stótej: LL ¹³²-¹³⁵°C^{; 1}IH ^NMR (CDCh, ^{300 MH}z) s ^7,43 (d 1H, J=15,7), 7,36-7,10 (m, 12H), 7,86 (d, 2H, J=8,3), 6,20 (d, 1H, J=15,7), 3,46 (m, 4H), 3,34 (s, 1H), 2,48 (q, 2H, J=7,5), 1,80 (m, 2H), 0,92 (t, 3H, J=7,5); MS o małej rozdzielczości m/e 426; Anal. (C29H31NO2) C, H, N. [patrz np. (s), schemat E, powyżej].

P r z y k ł a d 18

N,N-Dicykloheksylo-3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]akryloamid

W wyniku użycia dicykloheksyloaminy, oraz oczyszczania przez rekrystalizację z gorącego heksanu/octanu etylu 2/1 otrzymano 29 mg (28%) żądanego związku, o nazwie podanej powyżej, w ^pos^tac^{i bi}a^łej sitoston^ stotej: LL ¹⁹⁴-²⁰⁰°C^{; 1}IH ^NMR (^{CDCl3, 300 MH}z) s T⁴³-^7,11 (m, 13H), ^6,86 (d, 2H, J=8,3), 6,69 (d, 1H, J=15,4), 3,50 (m, 2H), 2,48 (q, 2H, J=7,3), 2,25 (m, 2H), 1,77-1,62 (2 m, 12H), 1,30-1,10 (m, 8H), 0,93 (t, 3H, J=7,3); MS o małej rozdzielczości m/a 518; Anal. (C37H43NO) C, H, N. [patrz np. (s), schemat E, powyżej].

P r z y k ł a d 19

Wodoroszczawian N-(2-dimetvloaminoetylo)-3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-N-etyloakryloamidu

W wyniku użycia 2-dimetyloaminoetyloaminy, oraz oczyszczania metodą chromatografii szybkiej na żelu krzemionkowym, z użyciem mieszaniny chlorek metylenu/metanol 15/1 jako eluentu, a następnie wytworzenia wodoroszczawianu w reakcji z 1,1 równoważnika kwasu szczawiowego w Et2O otrzymano 58 mg (53%) żądanego związku, o nazwie podanej powyżej, w postaci białej substancji stałej: t.t. 145-147°C; ¹H NMR (CDCla, 300 MHz) s 7,51 (d, 1H, J=15,1), 7,38-7,10 (m, 12H), 6,88 (d, 2H), 6,60 (d, 1H, J=15,1), 6,12 (m, 2H), 3,70 (m, 2H), 3,47 (m, 3H), 3,35 (m, 2H), 2,90 (m, 4H), 2,48 (q, 2H, J=7,4), 1,20 (m, 2H), 0,93 (t, 3H, J=7,4); MS o małej rozdzielczości m/a 453; Anal. (C31H36N2O C2H2O4) C, H, N. [patrz np. (s), schemat E, powyżej].

P r z y k ł a d 20

3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]-N-(3-hydroksypropylo)akryloamid

W wyniku użycia 3-hydroksypropyloaminy, oraz oczyszczania metodą MPLC na żelu krzemionkowym z gradientem od heksan/octan etylu 2/1 do 100% octanu etylu jako eluentu, a następnie przez rekrystalizację z gorącego neksanu otrzymano 14 mg (15%) żądanego związku, o nazwie podanej ^pow^yżej^, w ^pos^tacⁱ toatej sitoston^ stótej: LL ¹⁴⁴-¹⁴⁶°C^{; 1}IH ^NMR (CDCty ^{300 MH}z) s ^7,47 (d 1H, J=15,6). 7,36-7,10 (m, 12H), 7,86 (d, 2H, J=8,3), 6,22 (d, 1H, J=15,6), 3,62 (m, 2H), 3,51 (m, 2H), 3,25 (t, 1H), 2,47 (q, 2H, J=7,3), 1,71 (m, 2H), 0,94 (t, 3H, J=7,3); MS o małej rozdzielczości m/a 412; Anal. (C28H29NO2) C, H, N. [patrz np. (s), schemat E, powyżej].

PL 200 947 B1

P r z y k ł a d 21

3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo1-N-metylo-N-oktyloakryloamid

W wyniku użycia N-metylo-N-oktyloaminy, oraz oczyszczania metodą MPLC na żelu krzemionkowym, z użyciem heksanu/octanu etylu 3/1 jako eluentu, otrzymano 56 mg (41%) żądanego związku, o nazwie podanej powyżej, w postaci białej substancji stałej: t.t. 108-109°C; ¹H NMR (CDCh, 300 MHz) s 7,52 (d, 1H, J=15,4), 7,38-7,14 (m, 12H), 6,86 (d, 2H, J=7,8), 6,68 (dd, 1H, J=15,4), 3,00 (d, 4H), 2,48 (q, 2H, J=7,3), 1,26 (m, 8H), 0,93 (t, 3H, J=7,3), 0,86 (m, 6H); MS o małej rozdzielczości m/a 480; Anal. (C34H41NO) C, H, N. [patrz np. (s), schemat E. powyżej].

P r z y k ł a d 22

3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo1akryloamid

W wyniku użycia nasyconego roztworu amoniaku w C^CL, oraz oczyszczania metodą MPLC na żelu krzemionkowym, z użyciem heksanu/octanu etylu 2/1 jako eluentu, otrzymano 39 mg (39%) żądanego związku, o nazwie podanej powyżej, w postaci białej substancji stałej: t.t. 200-202°C; ¹H NMR (CDCls, 300 MHz) s 7,47 (d, 1H, J=15,6), 7,39-7,10 (m, 12H), 6,87 (d, 2H, J=8,3), 6,27 (d, 1H, J=15,6), 2,48 (q, 2H, J=7,3), 0,93 (t, 3H, J=7,3); MS o małej rozdzielczości m/a 354; Anal. (C25H23NO) C, H, N.

P r z y k ł a d 23

3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo1-N-etyloakryloamid

Roztwór 0,2 ml (0,4 mmola, 1,2 równ.) chlorku oksalilu (2 M w CH2CD dodano do mieszanego w 0°C roztworu 120 mg (0,3 mmola) kwasu otrzymanego w przykładzie 14 w 2 ml suchego chlorku metylenu. Otrzymany roztwór pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej i mieszano przez noc. Rozpuszczalnik usunięto pod próżnią i pozostałość rozpuszczono w 2 ml eteru, a następnie dodano do szybko mieszanego roztworu 23 ml etyloaminy (70% wag. w H2O) (0,4 mmola, 1,2 równ.) w 2 ml 1 M NaOH. Otrzymany roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Mieszaninę reakcyjną wylano do octanu etylu i wyekstrahowano; warstwę wodną przemyto octanem etylu (3 x 10 ml). Warstwy organiczne połączono, wysuszono (MgSO4), rozpuszczalnik usunięto pod próżnią i pozostałość oczyszczano przez rekrystalizację z gorącego octanu etylu, otrzymując 45 mg (35%) żądanego związku, o nazwie podanej powyżej, w postaci białej substancji stałej; t.t. 192 -193°C; ¹H NMR (CDCla, 300 MHz) s 7,45 (d, 1H, J=15,6), 7,39-7,10 (m, 12H), 6,86 (d, 2H, J=8,1), 6,20 (d, 1H, J=15,6), 3,38 (m, 2H, J=7,3), 2,48 (q, 2H, J=7,3), 1,17 (t, 3H, J=7,3), 0,93 (t, 3H, J=7,3); MS o małej rozdzielczości m/a 382; Anal. (C27H27NO) C, H, N. [patrz np. (s), schemat E, powyżej].

P r z y k ł a d 24

Oksym 1-amino-3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylojprop-2-en-1-onu

Roztwór 1,16 ml (1,16 mmola, 3,1 równ.) metanolanu sodu w metanol (1,0 M) dodano do roztworu 78 mg (1,12 mmola, 3,0 równ.) chlorowodorku hydroksyloaminy w 4 ml suchego metanolu. Otrzymany roztwór ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 15 minut, po czym ochłodzono do temperatury pokojowej. Dodano roztwór 125 mg (0,37 mmola) nitrylu otrzymanego w przykładzie 11 w 2 ml suchej mieszaniny metanol/THF 2/1 i mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 16 godzin. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono, wylano do 20 ml solanki, wyekstrahowano octanem etylu (2 x 20 ml), wysuszono (MgSO4) i rozpuszczalniki usunięto pod próżnią. W wyniku oczyszczania metodą chromatografii szybkiej na żelu krzemionkowym otrzymano 61 mg (47%) żądanego związku, o nazwie podanej powyżej, w postaci białej substancji stałej: t.t. 182-185°C; ¹H NMR (CDCls, 300 MHz) s 7,38-7,07 (m, 12H), 6,85 (d, 2H, J=8,0), 6,68 (d, 1H, J=16,7), 6,32 (d, 1H, J=16,7), 4,60 (s, br, 2H), 2,47 (q, 2H, J=7,6), 2,17 (s, 1H), 0,93 (t, 3H, J=7,6); MS o małej rozdzielczości m/e 369; Anal. (C25H24N2O) C, H, N. [patrz np. (u), schemat F, powyżej].

P r z y k ł a d 25

3-{2-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo1winylo}-5-metylo-[1,2,41-oksadiazol

Roztwór 60 mg (0,16 mmola) oksymu amidu otrzymanego powyżej w przykładzie 24 w 5 ml bezwodnika octowego ogrzewano w 80°C przez 18 godzin, ochłodzono do temperatury pokojowej, wylano do 10 ml 4 N NaOH i wyekstrahowano octanem etylu (2 x 20 ml). Warstwy organiczne połączono, wysuszono (MgSO4) i rozpuszczalnik usunięto pod próżnią. Surowy materiał oczyszczano metodą chromatografii szybkiej, z użyciem heksanu/octanu etylu 10/1 jako eluentu, otrzymując 21 mg nieznacznie zanieczyszczonego produktu, który rekrystalizowano z gorącej mieszaniny metanol/octan etylu 10/1, otrzymując 13 mg (20%) żądanego związku, o nazwie podanej powyżej, w postaci białej, krystehcznej sutetan^ statej: t.t. ¹⁵⁸-⁵⁹°^{C; 1}IH ^NMR (^{CDCl3, 300 MH}z) s ^7,50 (d, 1H, ^J=^16,4) ^7,37

PL 200 947 B1

-7,12 (m, 13H), 6,87 (m, 2H), 2,58 (s, 3H), 2,47 (q, 2H, J=7,3), 0,93 (t, 3H, J=7,3); MS o małej rozdzielczości m/a 392; Anal. (C27H24N2O) C, H, N. [patrz np. (v), schemat F, powyżej].

P r z y k ł a d 26

3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]prop-2-en-1-ol

Roztwór 1,35 ml (1,35 mmola, 2,5 równ.) 1,0 M DIBAL-H w THF wkroplono do oziębionego do -78°C roztworu estru otrzymanego powyżej w przykładzie 12 w 3 ml THF. Otrzymany roztwór mieszano 30 min w -78°C, po czym ogrzano do temperatury pokojowej i mieszano 16 godzin. Nadmiar DIBAL-H rozłożono 1 N HCl i mieszaninę reakcyjną wylano do 20 ml 1 N HCl i wyekstrahowano octanem etylu (2 x 20 ml). Warstwy organiczne połączono, wysuszono (MgSO4) i rozpuszczalniki usunięto pod próżnią. W wyniku oczyszczania pozostałości metodą chromatografii szybkiej na żelu krzemionkowym, z użyciem mieszaniny heksan/octan etylu 5/1 jako eluentu, otrzymano 94 mg (60%) żądanego związku, o nazwie podanej powyżej, w postaci białej substancji stałej: t.t. 80-83°C; ¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) s 7,41-7,02 (m, 12H), 6,82 (d, 2H, J=8,3), 6,45 (d, 1H, J=15,8), 6,23 (dt, 1H, J=5,8, 15,9), 4,24 (m, 2H), 2,47 (q, 2H, J=7,6), 1,31 (t, 1H, J=5,9), 0,93 (t, 3H, J=7,6); MS o małej rozdzielczości m/a 340; Anal. (C25H24O) C, H. [patrz np. (x), schemat G, powyżej].

P r z y k ł a d 27 {3-[4-(1,2-difenylobut-1-enylo)fenylo]allilo}-dimetyloamina

Roztwór 90 mg (0,27 mmola) alkoholu otrzymanego powyżej w przykładzie 26 i 41 mg (0,32 mmola, 1,2 równ.) diizopropyloetyloaminy w 2 ml suchego dichlorometanu potraktowano 33 mg (0,29 mmola, 1,1 równ.) chlorku metanosulfonylu i otrzymany roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Roztwór wylano następnie do 10 ml octanu etylu i wyekstrahowano 10 ml solanki, wysuszono (MgSO4) i rozpuszczalniki usunięto pod próżnią, otrzymując 108 mg (97%) gęstego oleju o barwie złotej. Materiał ten natychmiast rozpuszczono w 3 ml suchego metanolu, po czym dodano 1 ml dimetyloaminy. Otrzymany roztwór mieszano 16 godzin w temperaturze pokojowej, po czym rozpuszczalniki usunięto pod próżnią. Pozostałość rozpuszczono w 10 ml octan etylu i wyekstrahowano 1 N HCl. Warstwę wodną oddzielono i zalkalizowano przez dodanie 3 N NaOH, a następnie wyekstrahowano octanem etylu (2 x 10 ml). Zasadowe ekstrakty połączono, wysuszono (MgSO4) i rozpuszczalnik usunięto pod próżnią. W wyniku oczyszczania pozostałości metodą MPLC na żelu krzemionkowym, z użyciem mieszaniny dichlorometan/metanol 15/1 jako eluentu, otrzymano 37 mg (40%) żądanego związku, o nazwie podanej powyżej, w postaci klarownego, bezbarwnego oleju: ¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) s 7,37-7,09 (m, 10H), 7,02 (d, 2H, J=8,5), 6,81 (d, 2H, J=8,1), 6,34 (d, 1H, J=15,9), 6,14 (dt, 1H, J=6,6, 15,9), 3,17 (d, 2H, J=6,6), 2,59-2,42 (m, 6H), 1,01 (t, 6H, J=7,3), 0,92 (t, 3H, J=7,4); MS o małej rozdzielczości m/a 396; Anal. (C2gH₃₃N) C, H, N. [patrz np. (y), schemat G, powyżej].

Związki o wzorze (I), które zawierają grupy kwasowe, mogą tworzyć farmaceutycznie dopuszczalne sole z odpowiednimi kationami. Do odpowiednich farmaceutycznie dopuszczalnych kationów należą kationy metali alkalicznych (np. sodu lub potasu) i metali ziem alkalicznych (np. wapnia lub magnezu). W świetle powyższego jakiekolwiek odniesienie do każdego opisanego tutaj związku dotyczy zarówno związków o wzorze (I), jak i ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli oraz solwatów.

Jak to zaznaczono wyżej, opisane tutaj związki są przydatne w leczeniu i/lub profilaktyce różnych zaburzeń lub stanów, takich jak choroba sercowo-naczyniowa, rak sutka, osteoporoza i stany artretyczne. Do pewnych innych zaburzeń lub stanów, w których leczeniu i/lub profilaktyce mogą być przydatne związki według wynalazku, należy zespół przedmiesiączkowy, naczynioruchowe objawy związane z menopauzą, zanikowe zapalenie pochwy, marskości sromu, hipogonadyzm u kobiet, pierwotna niewydolność jajników, nadmierny porost włosów i rak gruczołu krokowego.

Dla specjalistów zrozumiałe jest, że odniesienia do leczenia obejmują nie tylko leczenie określonych chorób lub objawów, ale także profilaktykę. Ponadto zrozumiałe jest, że ilość związku do stosowania w leczeniu będzie zmieniać się w zależności od charakteru leczonego stanu oraz wieku i stanu pacjenta, oraz będzie ostatecznie uzależniona od prowadzącego lekarza lub weterynarza. Zazwyczaj jednak dawki stosowane w leczeniu dorosłych ludzi będą wynosić od 0,001 do około 100 mg/kg/dzień. Pożądana dawka może być stosowana jako dawka pojedyncza lub w postaci dawek podzielonych, podawanych w odpowiednich odstępach czasu, np. jako dwie, trzy, cztery lub więcej poddawek dziennie.

Opisano także środki farmaceutyczne zawierające związki o wzorze (I). Jakkolwiek związki te można podawać w celach terapeutycznych jako takie, korzystnie stanowią one substancje czynne wchodzące w skład środka farmaceutycznego. Środki tego rodzaju zawierają związek o wzorze (I) lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól, wraz z jednym lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych

PL 200 947 B1 nośników, oraz, ewentualnie, innych składników o działaniu terapeutycznym i/lub profilaktycznym. Nośnik(i) muszą być „dopuszczalne” w tym znaczeniu, że są kompatybilne z innymi składnikami środka i nie są szkodliwe dla jego biorcy.

Środki farmaceutyczne można podawać w zwykły sposób w leczeniu wskazanych chorób, np. doustnie, pozajelitowe, podjęzykowo, przezskórnie, doodbytniczo, przed wdychanie lub dopoliczkowo. W przypadku podawania dopoliczkowego środek może być w postaci tabletek lub pastylek, wykonanych w zwykły sposób. Tak np. tabletki i kapsułki do podawania doustnego mogą zawierać typowe substancje pomocnicze, takie jak środki wiążące (np. syrop, gumę arabską, żelatynę, sorbitol, tragakant, klej skrobiowy lub poliwinylopirolidon), wypełniacze (np. laktozę, cukier, celulozę mikrokrystaliczną, skrobię kukurydzianą, fosforan wapnia lub sorbitol), środki smarujące (np. stearynian magnezu, kwas stearynowy, talk, glikol polietylenowy lub krzemionkę), środki ułatwiające rozpad (np. skrobię ziemniaczaną lub sól sodową glikolanu skrobi) lub środki zwilżające, takie jak laurylosiarczan sodu. Tabletki mogą być powlekane znanymi sposobami.

Alternatywnie opisane powyżej związki można wprowadzać do doustnych ciekłych preparatów, takich jak np. wodne lub olejowe zawiesiny, roztwory, emulsje, syropy lub eliksiry. Ponadto preparaty zawierające takie związki mogą być w postaci suchego produktu do roztwarzania przed użyciem w wodzie lub innym odpowiednim nośniku. Takie ciekłe preparaty mogą zawierać typowe dodatki, takie jak środki dyspergujące, np. syrop sorbitolowy, metyloceluloza, syrop glukozowo/cukrowy, żelatyna, hydroksyetyloceluloza, karboksymetyloceluloza, żel stearynianu glinu lub uwodornione tłuszcze jadalne; środki emulgujące, takie jak lecytyna, monooleinian sorbitanu lub guma arabska; niewodne nośniki (które mogą zawierać oleje jadalne), takie jak olej migdałowy, frakcjonowany olej kokosowy, estry oleiste, glikol propylenowy lub alkohol etylowy; oraz środki konserwujące, takie jak phydroksybenzoesan metylu lub propylu, albo kwas sorbinowy.

Takie preparaty można wytwarzać jako czopki, np. zawierające typowe podłoża czopkowe, takie jak masło kakaowe lub inne glicerydy. Środki do wdychania zazwyczaj wytwarza się w postaci roztworu, zawiesiny lub emulsji, którą można podawać jako suchy proszek lub w postaci aerozolu, z użyciem zwykłych gazów nośnych, takich jak dichlorodifluorometan lub trichlorofluorometan. Typowe środki przezskórne zawierają zwykłe wodne lub niewodne nośniki, takie jak kremy, maści, płyny lub pasty, albo są w postaci plastra, opatrunku lub błony, zawierających lek.

Ponadto środki farmaceutyczne można wytwarzać jako preparaty pozajelitowe do podawania drogą iniekcji lub ciągłej infuzji. Środki do iniekcji mogą być np. w postaci zawiesin, roztworów lub emulsji w nośnikach olejowych lub wodnych, oraz mogą zawierać środki pomocnicze, takie jak środki dyspergujące, stabilizujące i/lub dyspergujące. Alternatywnie substancja czynna może być w postaci proszku do roztwarzania w odpowiednim nośniku (np. w jałowej, wolnej od pirogenów wodzie) przed użyciem.

Środki farmaceutyczne można także wytwarzać jako preparaty typu depot. Takie długo działające preparaty można podawać przez wszczepianie (np. podskórnie lub domięśniowo) lub przez iniekcję domięśniową. W związku z tym związki można łączyć z odpowiednimi polimerycznymi lub hydrofobowymi materiałami (np. w postaci emulsji w dopuszczalnym oleju), z żywicami jonowymiennymi lub stosować jako trudno rozpuszczalne pochodne, np. jako trudno rozpuszczalne sole.

Działanie biologiczne opisanych tutaj związków można ocenić zgodnie z następującymi procedurami, a odpowiednie otrzymane dane zamieszczono poniżej. W szczególności związki o wzorze (I) można oceniać pod względem ich działania osteoochronnego i profili przeciwuterotroficznych, z użyciem metod podanych w poniższych procedurach.

Dla specjalistów zrozumiałe jest, że znanych jest i dostępnych wiele dopuszczalnych rodzajów testów na wiązanie szczurzego receptora estrogenu, do selekcjonowania związków według wynalazku pod względem zdolności do wiązania się z odpowiednim receptorem. Związki wstępnie oceniano w sposób opisany poniżej w teście wiązania szczurzego receptora estrogenu pod względem zdolności do hamowania wiązania [³H]estradiolu. Związki, które wykazują IC₅₀ < 10 μΜ zastosowano w funkcjonalnym teście in vitro działania estrogennego w linii komórek guza gruczolistego Ishikawy.

Komórki Ishikawy-Var I w stanie subkofluencji usunięto z pożywki do podtrzymywania wzrostu i ponownie zawieszono w wolnym od czerwieni fenolowej DMEM-F12, zawierającym 5% FBS przepuszczonej przez węgiel drzewny i 2 mM glutaminę, w stężeniu 58 500 komórek/ml. Komórki wysiano w ilości 13 000 komórek/cm² i umieszczono w inkubatorze (37°C, 5% CO2) na 3 dni. Komórki zebrano i ponownie zawieszono w wolnym od czerwieni fenolowej DMEM-F12, zawierającym 1% FBS przepuszczonej przez węgiel drzewny, 2 mM glutaminę, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny,

PL 200 947 B1 w stężeniu 83 000 komórek/ml. Komórki wysiano w ilości 8300 komórek/studzienkę w 96 studzienkowych płytkach i pozostawiono na noc, umożlwiając ich przyczepienie się do studzienek. Odpowiednie leki dodano w stężeniach 2 X, w 0,1 ml pożywki zawierającej 0,2% DMSO. Płytki inkubowano przez 2 dni. Pożywki odessano i płytki przemyto jeden raz 300 μΙ sterylnego 0,9% roztworu soli. Płytki zamrożono w -70°C, a następnie ogrzano do temperatury pokojowej. Przyczepione komórki oceniono pod względem aktywności fosfatazy alkalicznej, przez dodanie 200 μl 5 mM fosforanu p-nitrofenylu w 1 M dietanolaminie, pH 10,4, zawierającej 0,1% (wag./obj.) Tritonu X-100, inkubację w 37°C przez 30 minut i pomiar absorbancji przy 405 nm w czytniku płytek Molecular Devices ThermoMax.

Związki badano w sposób opisany powyżej w celu określenia ich zdolności do wywoływania ekspresji fosfatazy alkalicznej, odpowiedzi in vitro specyficznej dla agonistów estrogenu, skorelowanej, jak to wykazano, z odpowiedzią uterotroficzną in vivo agonistów estrogenu u szczurów. W poniższej tabeli 1 wyniki przedstawiono jako stężenia różnych przykładowych związków wywołujące 50% maksymalnej aktywności fosfatazy alkalicznej (E_max), przy czym ta maksymalna aktywność wyrażana jest jako procent aktywności fosfatazy alkalicznej wywoływanej przez estradiol w stężeniu odpowiadającym stanowi nasycenia. W dodatkowych badaniach wykazano, że wszystkie związki, w przypadku których E_max < 20%, działają jako antagoniści estradiolu w stężeniach odzwierciedlających ich powinowactwo do wiązania się z receptorem.

T a b e l a 1

Aktywność agonistów estrogenu

Związek nr	EC50 (nM)b	Emax (%)c
Estradiol	0,01	100
Tamoksyfen	33	16,5 ± 0,6
1	2,3	11,9 ± 1,2
3	4,9	15,7 ± 1,8
4	20	18,8 ± 2,3
5	7,3	15,0 ± 3,0
9	58	3,8 ± 0,9
10	6,9	14,8 ± 2,4
11	11	14,0 ± 1,5
12	70	19,4 ± 2,0
13	4,6	16,5 ± 1,7
14	12	6,3 ± 1,2
15	8,6	8,9 ± 1,4
16	18	11,8 ± 1,9
21	6,9	18,8 ± 2,6
22	17	15,3 ± 2,4

Stwierdzono, że związek nr 1 wiąże się z receptorem estrogenu z około 10 krotnie wyższym powinowactwem niż tamoksyfen, o czym świadczy niższa wartość EC50 w teście funkcjonanym z komórkami Ishikawy (patrz tabela 1). Na dodatek związek nr 1 wykazuje znacząco niższą aktywność jako agonista (E_max) niż tamoksyfen. Zbadano szereg amidowych analogów związku nr 1 w celu ustalenia strukturalnych wymagań zapewniających obniżenie EC50 i zwiększenie do maksimum E_max w teście funkcjonalnym z komórkami Ishikawy. Wyniki wskazują, że wiele różnych cech strukturalnych (lipofilowość, objętość, donory i akceptory wiązań wodorowych) jest tolerowanych w tym obszarze cząsteczki i że tylko rozbudowany przestrzennie związek nr 12 wykazuje zmniejszone powinowactwo względem receptora. Związek nr 1 wykazywał najwyższe powinowactwo w teście wiązania z receptorem i najniższą wartość EC50 w teście funkcjonalnym, z tym że przy analizowaniu wartości E_max związki nr 9, 14 i 15 wykazały najniższą resztkową aktywność agonisty.

PL 200 947 B1

W celu dokonania oceny wyżej podanych związków odnośnie działania przeciwuterOtroficznego in vivo, grupy 21-dniowych samic szczura SD (30-35 g) zważono i wyliczono średnią wagę dla każdej grupy, co pokazano na Fig. 1. Roztwory podstawowe (10 X) trifenyloetylenowych analogów w etanolu rozcieńczono 0,5% roztworem metylocelulozy i dawkę 10 ąmoli/kg podano zwierzętom przez zgłębnik. Estradiol rozpuszczono w oleju sezamowym i dawkę 100 ąmola/kg wstrzyknięto podskórnie. Zwierzętom podawano środki przez 3 dni, po czym uśmiercono je 4 dnia przez asfiksję CO2. Ciała zważono, po czym macice usunięto, osuszono bibułą i zważono. Wyniki podano jako masa macicy/masa ciała ± błąd standardowy. Pełne słupki przedstawiają dane dla zwierząt, którym podano sam związek. Puste słupki przedstawiają dane dla zwierząt, którym podano badane związki na 6 godzin przed podaniem estradiolu. Związki 9 i 15 wykazują mniejszą resztkową aktywność agonisty niż tamoksyfen.

W celu przykładowego przedstawienia oddziaływania opisanych tu związków na kości, oceniono działanie związku nr 9 na zahamowanie ubytku gęstości mineralnej kości (BMD) u 90-dniowych samic szczura z wyciętymi jajnikami, z deficytem estrogenu. 90-dniowe szczury SD podzielono na grupy po 6 osobników. Samicom z 3 grup wycięto chirurgicznie jajniki. Dwa dni po wycięciu jajników zwierzętom podawano przez zgłębnik 10 ąmoli/kg związku nr 9 w 0,5% roztworze metylocelulozy lub nośnik, raz dziennie przez 23 dni. Zwierzęta z jednej grupy zostały pozornie zoperowane tzn. zasymulowano wycięcie jajników, a po 2 dniach podano im nośnik, 1 raz dziennie przez 28 dni. W dniach 0, 14 i 28 szczury znieczulano izofluranem i umieszczono na grzbiecie, z kręgosłupami równoległymi do wzdłużnej osi stolika densytometru. Wykonywano skaning rdzenia lędźwiowego z użyciem kości miednicy jako punktu odniesienia. W celu wykonania skaningu prawej kości piszczelowej nogę przymocowano taśmą w pozycji równoległej do wzdłużnej osi stolika i wykonano skaning do połączenia z kością udową. Analizę rdzenia lędźwiowego wykonano przez podzielenie kręgów i przestrzeni międzykręgowych z użyciem oprogramowania do zwykłej analizy i uwzględnienie tylko docelowego kręgu w ogólnym obszarze zainteresowań. Analizę prawej kości piszczelowej wykonano z użyciem oprogramowania do wysokorozdzielczej analizy podobszarów, ze skupieniem się na obszarze odległym o 3-5 mm od płytki wzrostowej, zidentyfikowanym uprzednio jako obszar o przyspieszonym ubytku kości na skutek wycięcia jajników. Wyniki otrzymane w dniu 14 i 28 nie różniły się znacząco. Wyniki w 28 dniu przedstawiono na Fig. 2.

Z Fig. 2 wynika, że związek nr 9 podany w dawce doustnej 10 ąmoli/kg wykazuje pełne działanie agonisty i utrzymuje BMD na poziomie takim jak u rzekomo operowanych szczurów, podczas badań trwających 28 dni. Dane biochemiczne wykazały, że mechanizm działania obejmował hamowanie resorpcji kości, zgodne z działaniem związków jako agonistów estrogenu w kościach. BMD oznaczano metodą absorpcjometrii rentgenowskiej dwuenergetycznej przy użyciu densytometru kostnego Hologic QDR-2000, z pakietem oprogramowania do wysokorozdzielczej analizy podobszarów, przy standardowych wartościach skanowania, długości, szerokości, odstępu linii i rozdzielczości punktowej odpowiednio 2, 0,75, 0,01 i 0,005 cala.

Claims (3)

1. Niesteroidowy ligand receptora estrogenu o wzorze

HO co₂h

PL 200 947 B1

2. Zastosowanie niesteroidowego liganda receptora estrogenu o wzorze do wytwarzania leku do leczenia i zapobiegania rakowi sutka.

3. Zastosowanie niesteroidowego liganda receptora estrogenu o wzorze do wytwarzania leku do leczenia i zapobiegania rakowi sutka.

PL 200 947 Β1

Rysunki

Fig-1

V = nośnik E = estradiol T = tamoksyfen

Fig.2

BMD = mineralna gęstość kości