PL198789B1

PL198789B1 - Zastosowanie gamma-winyloGABA (GVG), jego farmaceutycznie tolerowanej soli albo jego enancjomeru, albo jego mieszaniny racemicznej

Info

Publication number: PL198789B1
Application number: PL347912A
Authority: PL
Inventors: Stephen L. Dewey; Jonathan D. Brodie; Charles R. Ashby Jr.
Original assignee: Brookhaven Science Ass Llc
Priority date: 1998-08-05
Filing date: 1999-08-05
Publication date: 2008-07-31
Also published as: AU772715B2; WO2000007583A2; EP1102583B1; CA2339192C; DE69931789D1; CZ2001394A3; DE69931789T2; CA2339192A1; ES2267287T3; WO2000007583A3; PT1102583E; BR9912760A; ATE328588T1; NZ509682A; MXPA01001268A; TWI243674B; US6906099B2; US20020037925A1; EP1102583A2; NO20010539L

Abstract

1. Zastosowanie gamma-winyloGABA (GVG), jego farmaceutycznie tolerowanej soli albo jego enancjomeru, albo jego mieszaniny racemicznej do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawiera- jacej jako jedyn a substancj e aktywn a GVG oraz ewentualnie zawieraj acej ponadto srodki wspomaga- jace, rozpuszczalniki lub no sniki, która to kompozycja jest podawana w skutecznie dzia laj acej ilo sci, wystarczaj acej do zmiany uzale znienia odnosz acego si e do zachowa n ssaków zwi azanych z g lodem co najmniej jednego nadu zywanego leku, wybranego z grupy obejmuj acej kokain e, heroin e, metamfe- tamin e, nikotyn e i alkohol etylowy. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy zastosowania gamma-winyloGABA (GVG), jego farmaceutycznie tolerowanej soli albo jego enancjomeru, albo jego mieszaniny racemicznej do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej stosowanej do zmiany uzależnień od substancji chemicznych oraz do modyfikacji zachowań związanych z uzależnieniem od substancji chemicznych. Uzależnienia od substancji chemicznych, takie jak nadużywanie leków, oraz wynikające stąd zachowania związane z uzależnieniami stanowią wielkie, wciąż narastające problemy społeczne i ekonomiczne.

Uzależnienie od substancji chemicznych może występować przy korzystaniu z różnych substancji dostępnych na rynku zarówno legalnie jak i nielegalnie. Nikotyna, kokaina, amfetamina, metamfetamina, etanol, heroina, morfina i inne substancje uzależniające są łatwo dostępne i powszechnie używane.

Liczne nadużywane leki są substancjami występującymi w naturze. Taką substancją jest np. kokaina. Jest to nieamfetaminowy środek stymulujący, pochodzący z liści rośliny koka Erythroylon coca. Liście koki zawierają tylko około pół procentu czystego alkaloidu kokainy. Podczas żucia uwalniają się jedynie stosunkowo skromne ilości kokainy i wchłanianie żołądkowo-jelitowe jest powolne. To oczywiście wyjaśnia, dlaczego zwyczaj żucia liści koki nigdy nie stanowił problemu zdrowia publicznego w Ameryce Łacińskiej. Sytuacja ta gwałtownie zmienia się w przypadku nadużywania samego alkaloidu.

Stwierdzono, że uzależniające związki chemiczne, takie jak nikotyna, kokaina, amfetamina, metamfetamina, etanol, heroina i morfina, podwyższają (w niektórych przypadkach bezpośrednio, a w innych przypadkach pośrednio lub nawet transsynaptycznie) poziom dopaminy (DA) w środkowokresomózgowiowym obiegu nagradzania/wzmacniania przedmózgowia, przypuszczalnie wywołując podwyższenie nagradzania mózgu, które czyni użytkowników tych związków „wielkimi”. Zmiany działania tych układów DA powodują występowanie uczucia głodu tych związków, a w konsekwencji powrót, u zdrowiejących narkomanów, do nałogu ich zażywania. Na przykład kokaina działa na te układy DA przez wiązanie czynników przenoszących dopaminę (DAT), zapobiegając ponownemu wychwytowi DA do komórek presynaptycznych.

Istnieją poważne dowody na to, że ryzyko uzależnienia od nikotyny, kokainy, amfetaminy, metamfetaminy, etanolu, heroiny, morfiny i innych nadużywanych związków chemicznych jest związane z blokadą ponownego wychwytu na drogach nagradzania/wzmacniania w ośrodkowym układzie nerwowym (CNS). Na przykład wywołane kokainą podwyższenia poziomu pozakomórkowej DA wiązano z jej nagradzającymi i pożądaniowymi skutkami działania u gryzoni. U ludzi farmakokinetyczny profil wiązania kokainy znakowanej ¹¹C wskazuje, że wychwyt znakowanej kokainy jest bezpośrednio skorelowany z własną opinią „wielkości”. Ponadto ludzie uzależnieni od kokainy, narażeni na sygnały ze środowiska związanego z kokainą, doznawali podwyższonego głodu kokainy, który jest antagonizowany przez haloperidol, antagonistę receptora DA. Bazując na przypuszczalnym związku między ryzykiem uzależnienia kokainowego oraz obiegiem nagradzania/wzmacniania DA w przedmózgowiu proponowano liczne farmakologiczne strategie leczenia uzależnienia od kokainy.

Dotychczas jedną ze strategii leczenia było bezpośrednie atakowanie DAT analogiem kokainy o wysokim powinowactwie, blokując w ten sposób wiązania kokainowe. Inną strategią leczenia było modulowanie synaptycznej DA bezpośrednio przez stosowanie agonistów lub antagonistów DA. Jeszcze inną strategią leczenia było modulowanie synaptycznej DA pośrednio lub transsynaptycznie przez specjalne atakowanie funkcjonalnie związanego, ale biochemicznie odmiennego układu przekaźników nerwowych.

Proponowano liczne leki do stosowania przy odzwyczajaniu osób zażywających kokainę od tego nałogu. Hipotetyczne działanie niektórych środków terapeutycznych określano jako „utrata dopaminy”. Dowiedziono, że kokaina blokuje powtórny wychwyt dopaminy, ostro podwyższając stężenia synaptycznej dopaminy. Jednakże w obecności kokainy synaptyczna dopamina ulega metabolizmowi jako 3-metoksytyramina i jest usuwana. Synaptyczne straty dopaminy powodują zapotrzebowanie ciała na wzmożoną syntezę dopaminy, czego dowiedziono przez podwyższenie aktywności hydroksylazy tyrozynowej po podaniu kokainy. Gdy wyczerpie się dostarczanie prekursora, rozwija się niedobór dopaminy. Hipoteza ta prowadziła do badania bromokryptyny, która jest antagonistą receptorów dopaminy. Innym podejściem do zagadnienia było podawanie amantydyny, która uwalnia dopaminę. Jeszcze innym podejściem było podejście również bazujące na hipotezie utraty dopaminy, polegające na dostarczaniu prekursora dopaminy, takiego jak L-dopa.

Agoniści nie są korzystnymi środkami terapeutycznymi. Dany agonista może działać na szereg receptorów, albo na podobne receptory w różnych komórkach, a nie tylko na określone receptory lub komórki, które powinny być pobudzane. Podobnie, jak rozwija się tolerancja na lek (przez zmiany liczby

PL 198 789 B1 receptorów oraz ich powinowactwa do leku), może rozwijać się tolerancja na agonistę. W przypadku agonisty bromokryptyny szczególny problem polega np. na tym, że może on sam wzbudzać uzależnienie od leku. Dotychczas stosowane strategie leczenia nie przynosiły więc ulgi chorym spragnionym kokainy. Ponadto przy stosowaniu niektórych agonistów, takich jak bromokryptyna, chory może zamienić jeden głód na inny.

Innym związkiem, który często jest nadużywany, jest nikotyna. Alkaloid (-)-nikotyna występuje w papierosach i innych produktach tytoniowych, które pali się lub żuje. Stwierdzono, że nikotyna powoduje powstawanie lub rozwój różnych chorób, takich jak rak, choroby serca, choroby dróg oddechowych. Używanie tytoniu stanowi czynnik wysokiego ryzyka, zwłaszcza w odniesieniu do chorób serca.

Przeciwko używaniu tytoniu lub nikotyny prowadzono energiczne kampanie, jednak zaprzestanie używania tytoniu powoduje liczne nieprzyjemne objawy odstawienia, obejmujące skłonność do podrażnień, lęk, niepokój, brak koncentracji, uczucie zawrotu głowy, bezsenność, drżenie, powiększone łaknienie i przyrost wagi oraz naturalnie silny głód tytoniu.

Uzależnienia od tytoniu wiązano z jego oddziaływaniem na funkcjonowanie układu nagradzania/wzmacniania w mózgu, zwłaszcza jego wpływami na neurony DA na drogach nagradzania w mózgu (Nisell i in., 1995; Pontieri i In., 1996). Na przykład ostre układowe podawanie nikotyny, a także licznych innych nadużywanych związków chemicznych, powoduje podwyższenie poziomów pozakomórkowej DA w jądrach półleżących (NACC), ważnego składnika w układzie nagradzania (Damsma i in., 1989; Di Chiara i Imperato, 1988; Imperato i in., 1986; Nisell i in., 1994a, 1995; Pontieri i in., 1996). Podobnie wlew nikotyny do brzusznego obszaru odcinkowego (VTA) gryzoni powoduje znaczny wzrost poziomów DA w NACC (Nisell i in., 1994b).

Istnieje szereg środków farmaceutycznych użytecznych w leczeniu uzależnienia nikotynowego, do których zaliczyć należy gumy nikotynowe, przezskórne plastry nikotynowe, płyny do rozpylania do nosa, inhalatory nikotynowe i bupropion, a zatem środki stosowane w zastępczym leczeniu nikotyną oraz doniesienia o pierwszych nienikotynowych leczeniach w celu zaprzestania palenia (Henningfield, 1995; Hurt i in., 1997).

Zastępcze leczenie nikotyną polega jednak niestety na wprowadzaniu nikotyny do organizmu i wprawdzie zazwyczaj początkowo prowadzi do odstawienia nikotyny, ale często występuje z powrotem skłonność do ponownego popadania w nałóg używania produktów tytoniowych. Istnieje więc zapotrzebowanie na leczenie, które wykazując nawet pewien niewielki profil działań ubocznych, pozwalałoby na uwolnienie się od objawów związanych z odstawieniem nikotyny, w tym objawów długotrwałego głodu nikotynowego.

Innymi dobrze znanymi substancjami uzależniającymi są narkotyczne leki przeciwbólowe, takie jak morfina, heroina i inne opioidy, zarówno naturalne, jak i półsyntetyczne. Nadużywanie opioidów powoduje tolerancję i uzależnienie. Objawy związane z odstawieniem po zaprzestaniu zażywania opioidów bardzo różnią się co do ich intensywności w zależności od licznych czynników, obejmujących dawki zażywanych opioidów, stopień, w jakim wpływy danego opioidu są wywierane na CNS w sposób ciągły, czas trwania przewlekłego zażywania oraz prędkość, z jaką dany opioid jest usuwany z receptorów. Te objawy związane z odstawieniem obejmują głód, lęk, zaburzenia nastroju, ziewanie, pocenie się, łzawienie, wyciek wodnisty z nosa, niespokojny i przerywany sen, drażliwość, rozszerzone źrenice, bóle w kościach, plecach i mięśniach, jeżenie się włosów, napady gorąca i zimna, mdłości, wymioty, biegunkę, utratę wagi, gorączkę, podwyższone ciśnienie krwi, tętno i prędkość oddychania, drganie mięśni oraz kurczowe ruchy dolnych kończyn.

Medyczne powikłania, związane ze wstrzykiwaniem opioidów, obejmują różne patologiczne zmiany w CNS, w tym zwyrodnieniowe zmiany w gałce bladej, martwicę kręgowej istoty szarej, poprzeczne zapalenie rdzenia, niedowidzenie, zapalenie splotu nerwowego, neuropatię obwodową, zespoły parkinsonowskie, upośledzenie umysłowe, zmiany osobowości i patologiczne zmiany w mięśniach i nerwach obwodowych. Całkiem częste są też zakażenia skóry i narządów układowych, obejmujące gronkowcowe zapalenie wątroby, gruźlicę, zapalenie wsierdzia, posocznicę, wirusowe zapalenie wątroby, ludzki wirus niedoboru odporności (HIV), malarię, tężec i zapalenie szpiku. Przewidywana długość życia narkomanów opioidowych jest znacznie obniżona w wyniku przedawkowania, zakażeń związanych z narkotykami, samobójstw i morderstw.

Farmaceutyczne środki, stosowane w leczeniu uzależnienia od opioidów, obejmują metadon, który jest opioidem, i antagonistów opioidów, przede wszystkim nalokson i naltrekson. Wykazano też, że klonidynina tłumi niektóre objawy związane z odstawieniem opioidów, ale wywoduje niepożądane działania uboczne, takie jak obniżenie ciśnienia krwi lub uspokojenie polekowe, które mogą być nawet

PL 198 789 B1 niebezpiecznie ekstremalne. W połączeniu ze środkami farmaceutycznymi stosowana jest psychologiczna terapia pomocnicza, zmieniająca zachowania. Wciąż jednak istnieje zapotrzebowanie na terapie pozwalające uwalniać się od uzależnienia od opioidów i objawów związanych z ich odstawieniem.

Z opisu US 5 189 064 jest znane zastosowanie gamma-winylo GABA (GVG) oraz zastosowanie kompozycji podwyższającej poziom GABA do leczenia nałogu kokainowego, przy czym gamma-winylo GABA (GVG) jest tu stosowany wyłącznie w leczeniu skojarzonym, przez łączne podawanie inhibitora endorfinazy i encefalinazy oraz GVG.

Z opisu US 5 760 049 jest znane zastosowanie Sabrilu (tj. gamma-winylo GABA (GVG)) do kontrolowania używania tytoniu i łagodzenia objawów spowodowanych zaprzestaniem jego używania. GVG jest tu stosowany również wyłącznie w leczeniu skojarzonym, tzn. w łącznym podawaniu inhibitora acetylocholinoesterazy oraz GVG. Obydwa zatem dokumenty ujawniają zastosowanie GVG w kompozycjach zawierających poza GVG inne składniki czynne.

W większości kultur prawdopodobnie najczęściej używanym i nadużywanym depresantem oraz środkiem będącym przyczyną wielu chorób i zwiększonej umieralności jest etanol. Powtarzalne spożywanie dużych ilości etanolu wpływa negatywnie prawie na każdy układ narządowy ciała, a zwłaszcza na przewód żołądkowo-jelitowy, układ sercowo-naczyniowy oraz ośrodkowy układ nerwowy i obwodowe układy nerwowe. Skutki działania na układ żołądkowo-jelitowy obejmują zapalenie żołądka, wrzody żołądka, wrzody dwunastnicy, marskość wątroby i zapalenie trzustki. Ponadto częściej występuje rak przełyku, żołądka i innych części przewodu żołądkowo-jelitowego. Skutki działania na układ sercowo-naczyniowy obejmują nadciśnienie, kardiomiopatię i inne miopatie, znacznie podwyższone poziomy trójglicerydów i cholesterolu lipoprotein o niskiej gęstości. Te skutki sercowo-naczyniowe mają udział w znacznym wzroście ryzyka chorób sercowych. Może występować neuropatia obwodowa, przejawiająca się osłabieniem mięśni, paratezją i obniżonym odczuciem obwodowym. Skutki działania na ośrodkowy układ nerwowy obejmują braki pojmowania, ostre zmiany zwyrodnieniowe upośledzenia pamięci w móżdżku oraz wywołane etanolem utrzymujące się zaburzenia pamięci, w których zdolność do kodowania nowej pamięci jest ciężko upośledzona. Najczęściej skutki te są związane z niedoborem witamin, zwłaszcza witaminy B.

Osoby uzależnione od etanolu lub narkomani wykazują objawy i zmiany psychiczne, obejmujące niestrawność, mdłości, wzdęcia, żylaki przełyku, guzy krwawnicowe, drżenie, niepewny chód, bezsenność, dysfunkcję erekcji, zmniejszenie rozmiarów jąder, skutki feminizacyjne, związane z obniżonymi poziomami testosteronu, samoistne poronienia oraz alkoholowy zespół płodowy. Objawy związane z zaprzestaniem używania lub odstawieniem etanolu obejmują mdłości, wymioty, zapalenie żołądka, krwawe wymioty, suchość w ustach, nalaną plamistą cerę oraz obrzęk obwodowy.

Ogólnie przyjęte leczenie uzależnienia etanolowego i odstawienia etanolu prowadzi się przez podawanie łagodnych leków uspokajających, takich jak chlorodiazopoksyd. Najczęściej podaje się również witaminy, zwłaszcza witaminę B. Ewentualnie podaje się także siarczan magnezu i/lub glukozę. Mdłości, wymioty i biegunkę leczy się objawowo według uznania lekarza leczącego. Można też podawać disulfiram dla pomocy w utrzymaniu abstynencji. Jeśli jednak spożywa się etanol po podaniu disulfiramu, to w organizmie gromadzi się aldehyd octowy, powodujący mdłości i spadek ciśnienia. Istnieje zatem również zapotrzebowanie na terapię pozwalającą uwalniać się od uzależnienia od etanolu i objawów związanych z jego odstawieniem, ale wykazującą mniej działań ubocznych, jakie są skutkiem stosowania terapii znanych.

Z ostatnich doniesień wynika, że w alarmującym tempie wzrasta nadużywanie wielu leków lub mieszanin leków. Na przykład kokainę i heroinę często nadużywa się wraz z mieszaninami leków zwanymi „pospiesznymi mieszaninami”. Uważa się, że przy stosowaniu tego rodzaju mieszanin, występuje synergizm działania składników, a efektem jest dodatkowy wzrost euforii zażywających.

Istnieje tez więc zapotrzebowanie na nowe środki i ich zastosowania do leczenia uzależnień od nadużywanych związków chemicznych i ich mieszanin, mogących przynieść ulgę chorym, w szczególności środki wpływające na zmianę farmakologicznych działań nadużywanych leków na ośrodkowy układ nerwowy.

Zgodne z wynalazkiem jest zastosowanie gamma-winyloGABA (GVG), jego farmaceutycznie tolerowanej soli, albo jego enancjomeru, albo jego mieszaniny racemicznej do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierającej jako jedyną substancję aktywną GVG oraz ewentualnie zawierającej ponadto środki wspomagające, rozpuszczalniki lub nośniki, która to kompozycja jest podawana w skutecznie działającej ilości, wystarczającej do zmiany uzależnienia odnoszącego się do zachowań ssaPL 198 789 B1 ków związanych z głodem co najmniej jednego nadużywanego leku, wybranego z grupy obejmującej kokainę, heroinę, metamfetaminę, nikotynę i alkohol etylowy.

W szczególnym przypadku kompozycja jest podawana w ilości wystarczającej do osłabienia, powstrzymania lub usunięcia zachowań, związanych z głodem kokainy, heroiny i metamfetaminy, przy czym stosuje się tę kompozycję bez wywoływania reakcji wzbudzających niechęć do GVG lub głód GVG. Korzystna stosowana dawka dzienna GVG wynosi od 100 do 300 mg na kg masy ciała ssaka albo od 150 do 300 mg na kg masy ciała ssaka. Kompozycję tę stosuje się do zmiany uzależnienia odnoszącego się do warunkowej preferencji miejsca, przy czym stosuje się ją bez zmiany nagradzających/pobudzających skutków działania pożywienia u naczelnych oraz bez zmiany czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce u naczelnych.

Szczególnie korzystnie kompozycję tę stosuje się do osłabienia, powstrzymania lub usunięcia zachowań związanych z głodem heroiny lub metamfetaminy, zwłaszcza w przypadkach gdy ssak należy do rzędu naczelnych i stosuje się ją do obniżenia wszystkich charakterystyk uzależnień od heroiny metamfetaminy. Stosowanie kompozycji nie wywołuje przy tym reakcji wzbudzających niechęć do GVG lub głód GVG, a także nie wpływa na czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce u ssaków.

W innym szczególnym przypadku stosowania GVG według wynalazku nadużywanym lekiem jest nikotyna. Również w tym przypadku kompozycję stosuje się bez wywoływania reakcji wzbudzających niechęć do GVG lub głód GVG. Korzystna stosowana dawka dzienna GVG wynosi od 15 mg do g na kg masy ciała ssaka, albo od 15 do 600 mg na kg masy ciała ssaka, albo od 100 do 300 mg na kg masy ciała ssaka, albo też od 75 do 150 mg na kg masy ciała ssaka. Kompozycję tę w przypadku uzależnienia od nikotyny stosuje się szczególnie korzystnie w przypadkach gdy ssak jest z rzędu naczelnych, zwłaszcza do zmiany uzależnienia odnoszącego się do warunkowej preferencji miejsca oraz do osłabienia, powstrzymania lub usunięcia nagradzająco/pobudzających zachowań związanych z używaniem nikotyny, przy czym stosuje się ją bez zmiany czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce u ssaków oraz bez zmiany nagradzających/pobudzających skutków działania pożywienia u naczelnych.

Kompozycję tę stosuje się do osłabienia, zahamowania lub usunięcia charakterystyk uzależnienia nikotynowego, przy czym stosuje się ją bez wywoływania reakcji wzbudzających niechęć do GVG lub głód GVG oraz bez zmiany czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce.

Kompozycję tę stosuje się do osłabienia, zahamowania lub usunięcia symptomów będących rezultatem przerwy lub odstawienia nikotyny, bez wywoływania reakcji wzbudzających niechęć do GVG lub głód GVG.

W jeszcze innym szczególnym przypadku stosowania GVG według wynalazku kompozycja jest podawana do osłabienia, powstrzymania lub usunięcia zachowań, związanych z głodem lub stosowaniem co najmniej jednego nadużywanego leku, który stanowi dowolną kombinację nadużywanych leków, wybranych z grupy obejmującej kokainę, heroinę, metamfetaminę, nikotynę i alkohol etylowy. Również w tym przypadku kompozycję stosuje się bez wywoływania reakcji wzbudzających niechęć do GVG lub głód GVG, przy czym dawka dzienna GVG wynosi od 15 mg do 600 mg na kg masy ciała ssaka.

Szczególną kombinacją nadużywanych leków jest kokaina i heroina i w tym szczególnym przypadku stosowania GVG według wynalazku kompozycję stosuje się do zmiany uzależnienia odnoszącego się do warunkowej preferencji miejsca, przy czym stosowanie jej następuje bez zmiany nagradzających/pobudzających skutków działania pożywienia u ssaków a nagradzające/pobudzające skutki działania kombinacji nadużywanych leków osłabia się bez zmiany czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce u naczelnych.

Również w tym przypadku kompozycję stosuje się do obniżenia charakterystyk uzależnień od co najmniej jednego nadużywanego leku, w dawce dziennej GVG wynoszącej od 15 mg do 600 mg na kg masy ciała ssaka, przy czym stosuje się ją bez wywoływania reakcji wzbudzających niechęć do GVG lub głód GVG oraz bez zmiany czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce u naczelnych.

W kolejnym, szczególnym przypadku stosowania GVG według wynalazku, do osłabienia, powstrzymania lub usunięcia zachowań, związanych z głodem lub stosowaniem nadużywanych leków wybranych z grupy obejmującej kokainę, heroinę, metamfetaminę, nikotynę i alkohol etylowy stosuje się kompozycję zawierającą racemiczną mieszaninę GVG lub enancjomer GVG. Również w tym przypadku kompozycję stosuje się bez wywoływania reakcji wzbudzających niechęć do GVG lub głód GVG, przy czym dawka dzienna GVG wynosi od 15 do 600 mg na kg masy ciała ssaka. Kompozycję tę stosuje się do zmiany uzależnienia odnoszącego się do warunkowej preferencji miejsca, bez zmiany nagradzających/pobudzających skutków działania pożywienia u naczelnych oraz bez zmiany czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce u naczelnych.

PL 198 789 B1

Kompozycję tę stosuje się do obniżenia charakterystyk uzależnień od środków wybranych z grupy obejmującej kokainę, heroinę, metamfetaminę, nikotynę i alkohol etylowy i wówczas dawka dzienna GVG wynosi od 15 do 600 mg na kg masy ciała ssaka. Charakterystyki uzależnień obniża się bez reakcji wzbudzających niechęć do GVG lub głód GVG oraz bez zmiany czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce u naczelnych.

Korzystnie w wymienionym jako ostatni, szczególnym przypadku stosowania GVG według wynalazku stosuje się kompozycję zawierającą enancjomer S(+)-gamma-winyloGABA lub jego farmaceutycznie tolerowaną sól, albo alternatywnie kompozycję zawierającą enancjomer R(-)-gamma-winyloGABA lub jego farmaceutycznie tolerowaną sól.

Opis rysunków

Figura 1 przedstawia wykres, ilustrujący procentowe zmiany objętości rozkładu (DV) dla trzech grup zwierząt, którym podawano kokainę.

Figura 2 przedstawia zdjęcie transosiowych parametrycznych obrazów stosunku DV mózgu naczelnych, nie będących ludźmi, na poziomie ciała prążkowanego.

Figury 3A i 3B przedstawiają wykresy, ilustrujące skutki działania GVG na zachowania czynnościowe przenoszenia się z miejsca na miejsce w porównaniu z grupą kontrolną, której podawano roztwór soli.

Figura 4 przedstawia wykres, ilustrujący skutki działania GVG na pozakomórkową dopaminę, indukowaną nikotyną.

Figury 5A i 5B przedstawiają wykresy, ilustrujące skutki działania nikotyny i GVG na poziomy pozakomórkowej dopaminy w jądrach półleżących swobodnie poruszających się szczurów.

Figura 6 przedstawia wykres, ilustrujący skutki działania metamfetaminy na poziomy pozakomórkowej dopaminy w jądrach półleżących swobodnie poruszających się szczurów.

Figura 7 przedstawia wykres, ilustrujący skutki działania GVG na wywołane metamfetaminą zmiany w poziomach pozakomórkowej dopaminy w jądrach półleżących u swobodnie poruszających się szczurów.

Figura 8 przedstawia wykres, ilustrujący skutki działania GVG na wywołane alkoholem zmiany w poziomach pozakomórkowej dopaminy w jądrach półleżących u swobodnie poruszających się szczurów.

Figura 9 przedstawia wykres, ilustrujący skutki działania GVG na wywołane kokainą, heroiną oraz mieszaniną kokainy i heroiny poziomy pozakomórkowej dopaminy w jądrach półleżących u swobodnie poruszających się szczurów.

Wynalazek ustanawia zastosowanie gamma-winyloGABA (GVG), jego farmaceutycznie tolerowanej soli albo jego enancjomeru lub mieszaniny racemicznej enancjomerów do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zmieniania zachowań związanych z uzależnieniami u ssaków, np. naczelnych, cierpiących na uzależnienie od substancji chemicznych.

Używane tutaj pojęcie „zachowania związane z uzależnieniami” oznacza zachowania, wynikające z przymuszającego zażywania substancji chemicznych i charakteryzujące się widocznym całkowitym uzależnieniem od tych substancji. Objawami tych zachowań są (1) nieprzeparte wciągnięcie w zażywanie narkotyku, (2) chęć zapewniania sobie jego dostarczania i (3) wysokie prawdopodobieństwo nawrotu po odstawieniu.

Na przykład osoba zażywająca kokainę doznaje trzech etapów skutków działania narkotyku. Pierwszy z nich, etap ostrego odurzenia narkotykiem („pohulanka”), jest euforyczny, zaznaczony obniżonym niepokojem, podwyższoną pewnością siebie i żądzą seksualną oraz może być zaznaczony seksualną niedyskrecją, nieodpowiedzialną rozrzutnością oraz wypadkami mogącymi cechować nierozważne zachowanie. Drugi etap, „klęska”, zastępuje euforię niepokojem, zmęczeniem, drażliwością i depresją. Niektórzy zażywający w tym okresie popełniają samobójstwo. Wreszcie trzeci etap, „brak odczuwania przyjemności” jest okresem ograniczonej zdolności do odczuwania przyjemności z normalnych działań oraz głodu euforycznych skutków działania kokainy, co prowadzi do zażycia tego narkotyku. Patrz Gawin i Kleber, Medical Management of Cocaine Withdrawal (Medyczne postępowanie przy odstawianiu kokainy), 6-8 (APT Foundation). W przypadku osób zażywających kokainę zachowania związane z uzależnieniem obejmują zachowania, towarzyszące wszystkim trzem etapom skutków działania narkotyku.

Stosowane pojęcie „nadużywane leki” obejmuje (ale nie ogranicza się do nich) środki pobudzające psychikę, narkotyczne środki przeciwbólowe, alkohole i uzależniające alkaloidy, takie jak nikotyna, albo ich mieszaniny. Niektóre przykłady środków pobudzających psychikę obejmują (ale nie ograniPL 198 789 B1 czają się do nich) amfetaminę, dekstroamfetaminę, metamfetaminę, fenmetrazynę, dietylpropion, metylofenidan, kokainę i ich farmaceutycznie tolerowane sole.

Szczególne przykłady narkotycznych środków przeciwbólowych obejmują alfentanyl, alfaprodynę, anilerydynę, bezytramid, kodeinę, dwuwodorokodeinę, difenoksylan, etylomorfinę, fentanyl, heroinę, hydrokodon, hydromorfon, izometadon, lewometorfan, leworfanol, metazocynę, metadon, metopon, morfinę, ekstrakty opium, płynne ekstrakty opium, sproszkowane opium, granulowane opium, surowe opium, nalewkę z opium, oksykodon, oksymorfon, petydynę, fenazocynę, piminodynę, racemetorfan, racemorfan, tebainę i ich farmaceutycznie tolerowane sole.

Pojęcie „nadużywane leki” obejmuje także leki tłumiące CNS, takie jak barbiturany, chlorodiazopoksyd oraz alkohole, takie jak etanol, metanol i alkohol izopropylowy.

Ssaki mogą być uzależnione od mieszanin nadużywanych leków, na przykład od etanolu i kokainy i w tym przypadku zastosowanie według niniejszego wynalazku, przez podawanie skutecznie działających ilości GVG jest szczególnie odpowiednie do zmieniania zachowań związanych z uzależnieniem od takich mieszanin u ssaków.

Silnie nadużywaną mieszaniną jest mieszanina kokainy i heroiny.

Przy zażywaniu mieszanin nadużywanych leków obserwuje się występowanie synergii. Jeśli np. gryzoniom podaje się heroinę, środek pośrednio uwalniający dopaminę, oraz kokainę, inhibitor ponownego wychwytu dopaminy, to obserwuje się synergiczny wzrost poziomów dopaminy w mózgowym NAc. Synergię można wykazać, np. przez większe podwyższenia poziomów dopaminy w mózgu, niż można byłoby oczekiwać w przypadku stosowania obydwu narkotyków oddzielnie. Korzystnie synergia wynosi od około 500% do około 1000% wzrostu poziomów dopaminy w mózgowym NAc w przypadku mieszaniny kokainy i heroiny w porównaniu z podawaniem obydwu narkotyków oddzielnie.

Zażywanie leków uzależniających obejmuje niezależnie takie składniki jak: tolerancję, uzależnienie psychologiczne i uzależnienie psychiczne. Tolerancja wywołuje potrzebę podwyższania dawek leku po kilkakrotnym podawaniu w celu osiągnięcia skutku tej samej wielkości. Uzależnienie psychiczne jest stanem adaptacyjnym, wytwarzanym przez powtarzające się podawanie leku i przejawia się ono silnymi zakłóceniami psychicznymi, gdy wstrzyma się podawanie leku. Uzależnienie psychologiczne jest stanem, charakteryzującym się silnym popędem, żądzą lub zażyciem leku, którego skutki działania zażywająca osoba odczuwa jako niezbędne dla jej dobrego samopoczucia. Patrz Feldman, R.S. i Quenzer, L.F. „Fundamentals of Neuropsychopharmacology” (Podstawy neuropsychofarmakologii) 418-422 (Sinaur Associates, Inc.) 1984, źródło literaturowe włączone tutaj przez powołanie się na nie, jak gdyby było przytoczone w całości. Bazując na wyżej wymienionych określeniach używane tutaj pojęcie „charakterystyki uzależnienia” obejmuje wszystkie charakterystyki, związane z przymuszającym zażywaniem leków. Są to charakterystyki, na które mogą wpływać biochemiczny układ pacjenta oraz psychiczne i psychologiczne cechy pacjenta.

Wyjaśniono wyżej, że przymuszające zażywanie nadużywanych leków albo mieszanin nadużywanych leków powoduje etapy euforii, po których następują etapy żądzy euforycznych skutków działania tych leków, prowadzące do zażywania tych leków lub mieszanin leków. Używane tutaj pojęcie nagradzających/pobudzających skutków działania nadużywanych leków odnosi się do wszelkich bodźców (w tym przypadku leków), które powodują brak odczuwania przyjemności lub podwyższają prawdopodobieństwo wyuczonych reakcji. Jest to synonim nasilenia (wzmocnienia). W odniesieniu do zwierząt doświadczalnych bodźce uważa się za nagradzające przez zastosowanie wzorców, które uważa się za mierniki nagrody. Można tego dokonać przez mierzenie, czy bodźce wywołują reakcje przystąpienia, zwane też reakcjami głodu lub reakcjami odstawienia, a gdy zwierzęta unikają bodźców, zwane również reakcjami niechęci.

Wzorcem, który mierzy reakcje przystąpienia (głodu) lub odstawienia (niechęci) jest warunkowa preferencja miejsca (CPP). Można wywnioskować, że nagradzające bodźce powodują zachowania przystąpienia. W istocie jedna z definicji nagrody określają jako dowolny bodziec, który wywołuje zachowania przystąpienia. Ponadto skutkami nagrody byłoby podwyższanie pobudzających własności bodźców, związanych z tą nagrodą.

Nagrodę można też mierzyć przez określenie, czy dostarczenie nagrody jest uwarunkowane szczególnymi reakcjami, podwyższającymi prawdopodobieństwo, że te reakcje pojawią się ponownie w podobnych sytuacjach, tj. wzorcem nasilenia. Przykładem nasilenia jest np. zachowanie szczura naciskającego pręt określoną liczbę razy w celu wstrzyknięcia kokainy. Jeszcze innym sposobem mierzenia nagrody jest określanie, czy jakiś bodziec (np. lek) przez wielokrotne łączenie w pary z obojętnymi bodźcami środowiskowymi może spowodować, że obojętne poprzednio bodźce środowiskowe

PL 198 789 B1 wywołują skutki zachowań, początkowo związane tylko z lekiem - jest to nasilenie uwarunkowane. CPP uważa się za postać uwarunkowanego nasilenia.

Pobudzające wartości motywacyjne leków (lub innych bodźców) można oceniać z wykorzystaniem warunkowej preferencji miejsca (CPP). W odniesieniu do kokainy, nikotyny, heroiny, morfiny, metamfetaminy, etanolu lub innych leków nadużywanych albo ich mieszanin zwierzęta bada się w stanie wolnym od leków w celu określenia, czy wolą one środowisko, w którym uprzednio otrzymywały nadużywane leki, w porównaniu ze środowiskiem, w którym uprzednio otrzymywały roztwór soli. Stosując wzorzec CPP zwierzętom podaje się leki w jednym oddzielnym środowisku oraz podaje odpowiedni rozczynnik w alternatywnym środowisku. Wzorzec CPP szeroko stosuje się do oceny pobudzających motywacyjnych skutków działania leków u zwierząt doświadczalnych (Van Der Kooy, 1995). Następuje potem uwarunkowanie lub łączenie w pary z lekiem i jeśli zwierzęta w stanie wolnym od leku konsekwentnie wybierają środowisko uprzednio związane z nadużywanym lekiem, to wyciąga się wniosek, że wartość wzbudzająca głód nadużywanego leku została zakodowana w mózgu i jest dostępna w stanie wolnym od leku. CPP odzwierciedla wzrost czasu, spędzonego w obecności bodźców związanych z lekiem, w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi, którym wstrzykiwano rozczynnik. Można go stosować również do oceny uzależnienia od mieszanin nadużywanych leków.

Głód na poziomie człowieka jest często wywoływany czuciowymi bodźcami, związanymi uprzednio z zażywaniem leku, toteż zakłada się, że wzorce uwarunkowania podobne do CPP można stosować do modelowania głodu u zwierząt doświadczalnych.

Używane tu pojęcie głodu nadużywanych leków lub mieszanin nadużywanych leków oznacza silne pożądanie samodzielnego stosowania leku lub leków, zażywanych uprzednio przez ssaki. Ssaki nie potrzebują nadużywanych leków do zapobiegania objawom odstawienia.

Ryzyko uzależnienia od nadużywanych leków, takich jak np. kokaina, nikotyna, metamfetamina, morfina, heroina, etanol lub inne nadużywane leki, jest związane z ich farmakologicznymi działaniami na drogi wzmacniania/nagradzania środkowokresomózgowej dopaminy (DA) w ośrodkowym układzie nerwowym (CNS). Dopaminoergiczne przenoszenie tymi drogami jest modulowane kwasem gamma-aminomasłowym (GABA).

Na przykład kokaina, nikotyna, matamfetamina, morfina, heroina i etanol powstrzymują presynaptyczny ponowny wychwyt jednoamin. Okazuje się, że dopaminoergiczne neurony środkowokorowego układu limbicznego DA, których komórkowe ciałka znajdują się wewnątrz pokrywkowej powierzchni brzusznej (VTA) i pierwotnie wysuwają się do jąder półleżących (NACC), są związane ze wzmocnieniem działania kokainy, nikotyny, metamfetaminy, morfiny, heroiny lub etanolu. Elektryczne pobudzanie ośrodków nagradzania wewnątrz VTA podwyższa poziomy pozakomórkowej DA w NACC, podczas gdy uszkodzenia 6-hydroksydopaminy w NACC usuwają samodzielne zażywanie kokainy, nikotyny, metamfetaminy, morfiny lub etanolu. Badania mikrodializy in vivo potwierdzają zdolność kokainy, nikotyny, metamfetaminy, morfiny, heroiny i etanolu do podwyższania poziomów pozakomórkowej DA w NACC.

Neurony (GABA)ergiczne (kwasu gamma-aminomasłowego) w NACC i brzusznej gałce bladej wysuwają się na neurony DA w VTA. Badania farmakologiczne i elektrofizjologiczne wykazują, że te wysunięcia działają hamująco. Hamowanie neuronów VTA-DA jest prawdopodobnie wynikiem pobudzania receptora GABAB. Ponadto mikrowstrzykiwanie baklofenu do VTA, działającego przez podtypy tego receptora, może obniżać stężenia DA w NACC. W sumie zostało dowiedzione, że farmakologiczne działanie GABA może wpływać na poziomy DA w NACC przez modulowanie neuronów VTA-DA.

Gamma-winylo GABA (GVG) jest selektywnym i nieodwracalnym inhibitorem transaminazy GABA (GABA-T), znanym jako aktywujący hamujące receptory GABAergiczne. Wiadomo również, iż GVG zmienia biochemiczne skutki działania kokainy przez powodowanie zależnego od dawki i przedłużonego podwyższania poziomów pozakomórkowego endogennego GABA w mózgu.

GVG odpowiada wzorowi C₆H₁₁NO₂ i jest to kwas 4-amino-5-heksanowy, dostępny jako Vigabatrin® z firmy Hoechst Marion Roussel i może być otrzymywany z firmy Marion Merell Dow z Cincinnati, Ohio, USA. GVG nie wiąże się z żadnym receptorem ani kompleksem wtórnie wychwytywanym, ale podwyższa poziomy pozakomórkowego endogennego GABA przez selektywne i nieodwracalne powstrzymywanie transaminazy GABA (GABA-T), enzymu, który normalnie katabolizuje GABA.

Używane tutaj pojęcie GVG oznacza racemiczny związek lub mieszaninę, które zawierają równe ilości S(+)-gamma-winyloGABA i R(-)-gamma-winyloGABA. Ten racemiczny związek GVG jest dostępny jako Vigabatrin® z firmy Hoechst Marion Roussel i może być otrzymywany z firmy Marion Merell Dow z Cincinnati, Ohio, USA.

PL 198 789 B1

GVG zawiera asymetryczne atomy węgla i dzięki temu jest zdolny do występowania w postaci enancjomerów. Niniejszy wynalazek obejmuje wszystkie enancjomeryczne postacie GVG, w tym racematy i mieszaniny racemiczne GVG. W niektórych przypadkach może być korzystne, tj. może dawać większą skuteczność, stosowanie konkretnego enancjomeru, w porównaniu z drugim enancjomerem lub racematem albo mieszaniną racemiczną, w sposobach według niniejszego wynalazku i takie korzyści mogą łatwo określić specjaliści w branży.

Na przykład enancjomer S(+)-gamma-winyloGABA jest bardziej skuteczny w podwyższaniu poziomów pozakomórkowego endogennego GABA, niż enancjomer R(-)-gamma-winyloGABA.

Różne enancjomery można syntezować z chiralnych materiałów wyjściowych, albo można rozdzielać racematy powszechnie stosowanymi sposobami postępowania, które są znane w branży chemicznej, takie jak chromatografia chiralna, frakcjonowana krystalizacja soli diastereoizomerycznych itp.

Podawanie gamma-winyloGABA

Żywym ssakom można podawać (in vivo) GVG lub jego farmaceutycznie tolerowane sole układowo sposobami pozajelitowymi lub dojelitowymi, które obejmują również układy kontrolowanego dostarczania przez uwalnianie. Na przykład GVG można łatwo podawać dożylnie lub wewnątrzotrzewnowo (i.p.), co jest korzystnym sposobem dostarczania. Podawanie dożylne lub wewnątrzotrzewnowe można wykonywać przez wymieszanie GVG z odpowiednim farmaceutycznym nośnikiem (rozczynnikiem) lub środkiem pomocniczym, zgodnie ze znaną w tym zakresie praktyką.

Przewiduje się również stosowanie doustne lub dojelitowe i można stosować takie kompozycje, jak tabletki, kapsułki, pigułki, eliksiry, zawiesiny, syropy, opłatki do leków, gumy do żucia itp., w celu dostarczania GVG lub jego farmaceutycznie tolerowanych soli.

Używane tutaj pojęcie farmaceutycznie tolerowanych soli obejmuje takie kwasy i zasady tworzące sole, które nie podwyższają znacznie toksyczności związków. Niektóre przykłady odpowiednich soli obejmują sole kwasów mineralnych, takich jak kwas solny, jodowodorowy, bromowodorowy, fosforowy, metafosforowy, azotowy i siarkowy, a także sole kwasów organicznych, takich jak kwas winowy, octowy, cytrynowy, jabłkowy, benzoesowy, glikolowy, glukonowy, gulonowy, bursztynowy, kwasy arylosulfonowe, np. kwas toluenosulfonowy itp.

Używane tutaj pojęcie skutecznie działających ilości oznacza, że ta ilość jest skuteczna dla osiągnięcia określonych wyników w zmienianiu zachowań związanych z uzależnieniem u ssaków. Jest to ilość, która obniża poziom lub uwalnia od jednego lub większej liczby objawów lub stanów, wynikających z zaprzestania zażywania lub odstawienia środków pobudzających psychikę, narkotycznych leków przeciwbólowych, alkoholu, nikotyny lub ich kombinacji. Należy jednak podkreślić, że niniejszy wynalazek nie jest ograniczony do jakiejkolwiek konkretnej dawki.

Korzystnie GVG podaje się w dawkach, które nie dają żadnych ujemnych skutków lub znikome. Podawane ilości mogą np. wynosić od około 15 mg/kg do około 2 g/kg lub od około 15 mg/kg do około 600 mg/kg.

Na przykład w leczeniu uzależnienia kokainowego GVG podaje się w ilościach od około 15 mg/kg do około 2 g/kg, korzystnie od około 100 mg/kg do około 300 mg/kg, albo od około 15 g/kg do około 600 mg/kg, a najkorzystniej od około 150 mg/kg do około 300 mg/kg albo od około 75 mg/kg do około 150 mg/kg.

W leczeniu uzależnienia nikotynowego GVG podaje się np. w ilościach od około 15 mg/kg do około 2 g/kg lub od około 15 mg/kg do około 600 mg/kg, korzystnie od około 100 mg/kg do około 300 mg/kg, albo od około 150 mg/kg do około 300 mg/kg, a najkorzystniej od około 18 mg/kg do około 20 mg/kg, albo od około 75 mg/kg do około 150 mg/kg.

W leczeniu uzależnienia od metamfetaminy GVG podaje się ssakom np. w ilościach od około 15 mg/kg do około 2 g/kg, korzystnie od około 100 mg/kg do około 300 mg/kg lub od około 15 mg/kg do około 600 mg/kg, a najkorzystniej od około 150 mg/kg do około 300 mg/kg, albo od około 75 mg/kg do około 150 mg/kg.

Jeśli ssaki są uzależnione od mieszanin nadużywanych leków, ta kich jak np. mieszaniny kokainy i heroiny, to GVG podaje się tym ssakom w ilościach od około 15 mg/kg do około 2 g/kg, korzystnie od około 100 mg/kg do około 300 mg/kg, albo od około 15 mg/kg do około 600 mg/kg, a najkorzystniej od około 150 mg/kg do około 300 mg/kg, albo od około 75 mg/kg do około 150 mg/kg.

Ssaki obejmują np. ludzi, pawiany i inne naczelne, a także zwierzęta domowe, takie jak psy i koty, zwierzęta doświadczalne, takie jak szczury i myszy, oraz zwierzęta gospodarcze, takie jak konie, owce i krowy.

PL 198 789 B1

Bazując na wiedzy, że kokaina, a także inne nadużywane leki podwyższają pozakomórkową NACC DA, oraz fakcie, ze GABA powstrzymuje DA w tych samych jądrach, wykazaliśmy, że GVG może osłabiać zmiany, wywoływane przez kokainę, nikotynę, metamfetaminę i etanol w pozakomórkowej DA. W jednym z przykładów zastosowano in vivo technikę mikrodializy u swobodnie poruszających się zwierząt, aby wykazać skutki działania ostrego (pojedyncze wstrzyknięcie) lub długotrwałego (11 dni) podawania GVG na wywołane kokainą podwyższenia stężenia pozakomórkowej DA w NACC. Patrz zwłaszcza Morgan, A.E. i in. „Effects of Pharmacologic Increases in Brain ABA Levels on Cocaine - Induced Changes in Extracellular Dopamine” (Skutki działania farmakologicznych podwyższeń poziomów ABA w mózgu na wywołane kokainą zmiany pozakomórkowej dopaminy), Synapse 28: 60-65 (1998), przy czym treść tego źródła literaturowego włącza się tutaj, jak gdyby było przytoczone w całości.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że zażywanie GVG zmienia zachowania, zwłaszcza zachowania związane z uzależnieniem, towarzyszące biochemicznym zmianom, wynikającym z przyjmowania nadużywanych leków. Na przykład GVG znacznie osłabia wywoływane przez kokainę podwyższenie synaptycznej DA w nowym prążkowiu w mózgu naczelnych (pawianów), co określono przez emisyjną tomografię pozytronową (PET), oraz usuwa wyrażanie i nabywanie wywołanej kokainą warunkowej preferencji miejsca, czyli CPP. Nie było jednak żadnego widocznego wpływu na CPP dla nagrody w formie pożywienia, ani dla czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce. Te uzyskane dane sugerują możliwości terapeutycznego wykorzystania w uzależnieniu kokainowym farmakologicznej strategii, nakierowanej na układ GABAergicznych przekaźników nerwowych, układ oddzielny, ale czynnościowo związany z środkowokresomózgowiowym układem DA nagradzania/wzmacniania. W porównaniu z bezpośrednim działaniem na kompleks receptora GABA agonistą GABA to nowe podejście z GVG wykazuje jednak tę zaletę, że przedłużone są skutki działania nieodwracalnego inhibitora enzymu, co podwyższa poziomy endogennego GABA bez ryzyka uzależnienia, związanego z agonistą GABA, działającym bezpośrednio na sam receptor.

P r z y k ł a d y

Niżej przedstawiono przykłady w celu zilustrowania i opisania niniejszego wynalazku.

Materiały i sposoby

1. Badania PET naczelnych

Dwadzieścia dorosłych żeńskich osobników pawianów (Papio anubis, 13-18 kg) używano do wszystkich badań i zsyntezowano znakowany węglem-11 rakloprid po uprzednim wykazaniu, że jest on wrażliwy na zmiany synaptycznej DA, wykorzystując wcześniej opisany sposób (Volkow i in., 1994). Podczas badań pobierano próbki krwi tętniczej i wydzielone próbki plazmy analizowano na obecność nie zmienionego promieniotwórczego znacznika, węgla-11. Między wstrzykiwaniami izotopu zwierząt nie usuwano z pomostu. Interesujące obszary (ROI) zakreślano bezpośrednio na obrazach PET. Krótko mówiąc, prążkowie przedstawiono dwustronnie na każdej transosiowej warstwie, na której się pojawiło. Wykonywano przekroje móżdżkowych ROI przez środkowe linie na poziomie robaka móżdżku. ROI z pierwszych badań kopiowano potem bezpośrednio na odpowiednich warstwach z drugich badań. Badając umiejscowienie ROI na drugich obrazach skaningowych można było w razie potrzeby dokonywać zmian jedynie w położeniach ROI. Metoda wielopłaszczyznowej analizy zmniejszała różnice, które mogły powstawać w wyniku poruszania się zwierząt w obszarze pomostu w okresach skaningu.

Uprzednio opracowano graficzny sposób oznaczania objętości rozkładu (DV) dla kinetycznej analizy danych dla raklopridu znakowanego węglem ¹¹C. Stosunek DV był najbardziej odtwarzalnym miernikiem wychwytu raklopridu. Jest to stosunek DV z obszaru bogatego w receptor (prążkowie) do DV z obszaru niereceptorowego (móżdżku). Stężenie wolnego receptora było wprost proporcjonalne do stosunku DV, wynoszącego 1. Przygotowanie zwierząt przeprowadzano tak, jak to szczegółowo opisano wcześniej (Dewey i in., 1992).

Analizę statystyczną zaplanowano do zbadania hipotezy, mówiącej, że (1) prowokacja kokainowa różni się od zmienności testu i powtórnego testu z użyciem promieniotwórczego znacznika węgla-11 (wykonywanych u tych samych zwierząt w takich samych warunkach doświadczalnych) oraz (2) warunki prowokacji różnią się między sobą. Fakt, że uzyskano istotne wyniki dla prążkowia oraz stosunku prążkowia do móżdżku, ale nie dla móżdżku, wskazuje, iż skutki interwencji są ograniczone do specyficznych, a nie obejmują niespecyficznych składników wiązania. GVG nie zmienia regionalnego rozkładu, ani prędkości metabolizmu znacznika promieniotwórczego.

PL 198 789 B1

2. Wywołana kokainą warunkowa preferencja miejsca u gryzoni

We wszystkich badaniach na gryzoniach wykorzystywano męskie osobniki szczurów szczepu Sprague-Dawley (200-225 g, z farmy Taconic, Germantown, USA). Zwierzętom tym umożliwiano aklimatyzację do urządzeń w pomieszczeniach dla zwierząt przez okres przynajmniej 5 dni przed rozpoczęciem doświadczeń. Stosowaliśmy komory warunkowej preferencji miejsca (CPP) uprzednio opisane (Lepore i in., 1995) z tym wyjątkiem, że zamiast tego, aby jedna komora była całkowicie biała, a druga czarna, u nas jedna komora była w całości jasnoniebieska, z podłogą ze stali nierdzewnej, a druga komora była w całości jasnoniebieska, z poziomymi czarnymi paskami (o szerokości 2,5 cm) oddalonymi od siebie o 3,8 cm, i z gładką podłogą z pleksiglasu. We wszystkich badaniach CPP z użyciem GVG objętość roztworu soli wynosiła 1 cm³/kg, a dawki kokainy wynosiły 20 mg/kg. Roztwór soli, kokainę i GVG wstrzykiwano wewnątrzotrzewnowo (i.p.). Procedura uwarunkowywania dla fazy nabywania obejmowała 12 sesji, przeprowadzanych przez kolejne 12 dni.

W badaniach CPP stosowano następujące pary badanych substancji: 1) roztwór soli/roztwór soli, 2) roztwór soli/kokaina, 3) GVG/roztwór soli, 4) roztwór soli/kokaina i GVG. Zwierzęta w każdej grupie losowo przypisywano do planowania czynnikowego 2 x 2, przy czym jeden czynnik stanowił komorę par, a drugi czynnik kolejność uwarunkowania. Zwierzęta, którym podawano albo sól, albo kokainę, otrzymywały je przez wstrzykiwanie i zamykano je w odpowiednim pomieszczeniu na 30 minut. Wstrzykiwania GVG dokonywano 3 godziny przed wstrzykiwaniem roztworu soli lub kokainy, a następnie umieszczano zwierzęta w odpowiedniej komorze. Postępowano w ten sposób, gdyż wykazano, że poziomy GABA osiągają najwyższe wartości po upływie od 3 do 4 godzin od podania GVG.

W dniu badań (dzień 12.) nie podawano ani leku, ani roztworu soli i umożliwiono zwierzętom swobodne poruszanie się między obydwiema komorami przez piętnaście minut. Długości czasu, spędzonego w każdej z komór rejestrowano z zastosowaniem automatycznego strumienia podczerwieni, połączonego elektronicznie z sekundomierzem. Do fazy wyrażenia CPP na kokainę zwierzęta przyzwyczajano i warunkowano do kokainy, jak to opisano w badaniach nabywania, ale żadnemu ze zwierząt w badaniach wyrażania (ekspresji) nie podawano GVG w dniach warunkowania. W dniu badań (dzień 12.) zwierzęta badane w fazie wyrażenia, w przeciwieństwie do zwierząt będących w fazie nabywania, otrzymywały albo roztwór soli, albo GVG na 2,5 godziny przed ich umieszczeniem w urządzeniu i miały one swobodny dostęp do obydwu komór przez 15 minut.

3. Wywołana pożywieniem warunkowa preferencja miejsca u gryzoni

W celu zbadania wywołanego pożywieniem CPP u gryzoni umożliwiano czterem grupom szczurów dostęp do pożywienia dowoli przez okres całych 12 sesji procedury CPP. Te sesje CPP w liczbie 12 były dokładnie takie same, jak w procedurze stosowanej w badaniach CPP wywołanego kokainą, z tym wyjątkiem, że substancją wzbudzającą głód było pożywienie, a nie kokaina. Grupie pierwszej podawano roztwór soli, grupie drugiej podawano wewnątrzotrzewnowo 150 mg/kg GVG, grupie trzeciej podawano roztwór soli, a grupie czwartej podawano wewnątrzotrzewnowo 300 mg/kg GVG przed udostępnieniem żywności oraz par CPP z komór CPP. Zwierzęta z wszystkich czterech grup przyzwyczajono do śniadaniowej potrawy zbożowej o smaku owocowym, o nazwie „Froot Loops”, która jest bardzo pociągająca dla szczurów doświadczalnych. Badanie przeprowadzano w odpowiednich komorach w pomieszczeniu badawczym przez cztery sesje przyzwyczajające. Po upływie dwudziestu czterech godzin po ostatnim kontakcie z parami substancji stosowanych w badaniu CPP zwierzęta umieszczano w komorze i nie podawano im ani leku, ani roztworu soli (ani też pożywienia) (nie udostępniano) i umożliwiano tym zwierzętom swobodne poruszanie się w granicach urządzenia CPP przez 15 minut. Długości czasu, spędzonego przez zwierzę w komorach, po jego kontakcie z parą CPP i bez tego kontaktu rejestrowano z zastosowaniem automatycznego urządzenia.

4. Pomiary czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce u gryzoni

Zwierzęta wstępnie przemieszczano przez 5 minut każdego dnia przez tydzień przed doświadczeniem w celu zmniejszenia stresu powodowanego przemieszczeniem. W dniu badań 2,5 godziny przed rozpoczęciem doświadczeń podawano wewnątrzotrzewnowo GVG (150 mg/kg lub 300 mg/kg) albo roztwór soli (1 cm³/kg lub 0,5 cm³/kg). Zwierzęta przenoszono na teren badań na godzinę przed każdym doświadczeniem. Po upływie 2,5 godziny od podania GVG lub roztworu soli zwierzęta umieszczono w klatkach zachowań i mierzono czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce w 10-minutowych przedziałach przez 90 minut na komputerze PC-AT, wykorzystując program dla układu działania strumieni świetlnych. Same klatki do badań przenoszenia się z miejsca na miejsce są przezroczystymi klatkami akrylowymi o wymiarach 41,3 x 41,3 x 30,5 cm. Układ elektroniczny (układ Photobeam Activity, San Diego Instruments, San Diego, USA), wykorzystywany do monitorowania czynno12

PL 198 789 B1 ści przenoszenia się z miejsca na miejsce, zawiera 16 strumieni podczerwieni, przechodzących przez klatki z lewa na prawo, oraz 16 strumieni, przechodzących od przodu do tyłu. Wszystkie strumienie podczerwieni znajdują się około 0,39 cm nad podłogą.

5. Badania katalepsji u gryzoni

Stopień katalepsji, występujący po podaniu wewnątrzotrzewnowym 150 mg/kg GVG, 300 mg/kg GVG lub roztworu soli (1 cm³/kg, i.p., 0,9% roztwór soli), oznaczano z zastosowaniem testu Bara. Krótko mówiąc, męskie osobniki szczurów szczepu Sprague-Dawley przenoszono do pomieszczenia badawczego trzy dni przed doświadczeniami w celu umożliwienia im aklimatyzacji. W dniu badań podawano zwierzętom (n = 10 w badanej grupie) albo roztwór soli, albo GVG i mierzono stopień katalepsji 60, 120 i 240 minut po wstrzyknięciu. Prowadzący doświadczenie nie wiedział, co podano każdemu zwierzęciu. Z drewna wykonywano pręty o średnicy 1,2 cm, a wysokość od podłogi do końca pręta wynosiła 10 cm. Dla każdego oznaczenia umieszczano delikatnie przednie łapy zwierząt na szczycie pręta i mierzono czas, zużywany przez zwierzęta na przemieszczenie obydwu przednich łap na podłogę.

6. Badania kokainy znakowanej węglem ¹¹C u gryzoni i naczelnych

Zwierzęta (n = 10) rozmieszczono w dwóch grupach. W grupie 1 podawano przez wewnątrzotrzewnowe (i.p.) wstrzykiwanie roztwór soli (1 cm³/kg) 3 godziny przed i.p. podaniem kokainy znakowanej węglem ¹¹C. W grupie 2 podawano przez wstrzykiwanie i.p. GVG (300 mg/kg) 3 godziny przed i.p. podaniem kokainy znakowanej węglem ¹¹C. Po upływie 10 minut od wstrzyknięcia kokainy znakowanej węglem ¹¹C zwierzęta uśmiercano. Usuwano mózgi i mierzono ich promieniowanie. W dwóch dodatkowych badaniach PET u naczelnych podawano GVG (300 mg/kg) niezwłocznie po uzyskaniu podstawowego obrazu skaningowego ze znakowaną kokainą. Około 3 godzin później ponownie podawano znakowaną kokainę i wykonywano obraz skaningowy u tych zwierząt przez 60 minut.

7. Badania mikrodializy u gryzoni

Wszystkie zwierzęta wykorzystywano według procedury zatwierdzonej przez IACUC, ściśle stosując się do wytycznych NIH (Państwowego Instytutu Zdrowia). Dorosłe męskie osobniki szczurów szczepu Sprague-Dawley (200-300 g, z farm Taconic), mające pomieszczenie w urządzeniach do opieki nad zwierzętami w warunkach 12:12 światło/ciemność, rozmieszczano w 6 grupach (n = 5-9), znieczulono i wszczepiano im stereotaktycznie silikonowane kaniule z prowadnicami do prawego NACC (2,0 mm z przodu i 1,0 mm z boku bregmy oraz 7,0 mm brzusznie do powierzchni korowej) przynajmniej 4 dni przed badaniami. Sondy do mikrodializy (2,0 mm, Bioanalytical Systems, BAS, West Lafayette, USA) umieszczano w kaniulach z prowadnicami i przez te sondy podawano sztuczny płyn mózgowordzeniowy (ACSF, 155,0 mM Na, 1,1 mM Ca^2-, 2,9 mM K”, 132,76 mM Cl^- i 0,83 mM Mg^2-) z zastosowaniem mikrowlewowej pompy CMA/100 (BAS) z prędkością przepływu 2,0 ąl/min. Zwierzęta umieszczano w misach, wkładano sondy i przepłukiwano przez noc płynem ACSF. W dniu badań wstrzykiwano przynajmniej trzy próbki w celu określenia trwałości podstawy odniesienia. Próbki zbierano przez 20 min i wstrzykiwano w sposób ciągły (CMA/160, BAS). Średnie stężenie dopaminy w tych trzech trwałych próbkach określano się jako kontrolne (100%) i wszystkie następne wartości z badań przekształcano w procenty tego stężenia kontrolnego. Po ustaleniu trwałej podstawy odniesienia podawano nikotynę przez wstrzykiwanie wewnątrzotrzewnowe. Układ wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) obejmuje kolumnę BAS z odwróconymi fazami (3,0 μ, C-18), elektrochemiczny przetwornik BAS LC-4C z podwójnie szklistą elektrodą węglową nastawioną na 650 mV, komputer, który analizuje dane w sposób ciągły wykorzystując przemysłowy zestaw oprogramowania (Chromograph Bioanalytical Systems), oraz dwupisakowy rejestrator wykresowy. Ruchoma faza (prędkość przepływu 1,0 cm³/min) zawierała 7,0% metanolu, 50 mM jednozasadowy fosforan sodowy, 1,0 mM oktylosiarczan sodowy i 0,1 mM EDNA, pH 4,0. DA ulegała elucji w ciągu 7,5 min. Po zakończeniu badań zwierzęta pozbawiano głów i sporządzano z nich zamrożone wycinki w celu weryfikacji miejsc umieszczania sond.

Równolegle z ilościowym oznaczaniem stężenia dopaminy równocześnie ilościowo określano reakcję przenoszenia się z miejsca na miejsce (lokomotoryczną) tych zwierząt na podawanie środka pobudzającego, stosując czujnik pomiarowy ruchu na podczerwień. Ten optyczny czujnik zbliżeniowy na podczerwień monitorował ruch ramienia z przegubem, integralny składnik swobodnie poruszającego się układu. Cyfrowy sygnał wyjściowy z tego czujnika sprzęgano z komputerem osobistym IBM i programowano do zliczania zarówno dodatnich, jak i ujemnych odchyleń ramion. Dane te zbierano i sumowano, wykorzystując tę samą procedurę czasowego próbkowania, którą stosowano dla próbek dializowanych. Czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce wyrażano następnie w postaci liczby ugięć w przedziale czasu próby.

PL 198 789 B1

P r z y k ł a d 1

Badania naczelnych nie będących ludźmi (pawianów)

W tym przykładzie dwudziestu naczelnym nie będącym ludźmi dwukrotnie wstrzyknięto rakloprid znakowany węglem ¹¹C według sposobu postępowania, przedstawionego w części 1 rozdziału p.t. Materiały i sposoby. Pierwsze wstrzykiwanie służyło jako podstawa odniesienia, a drugie następowało po podaniu kokainy lub placebo. Testowane/testowane ponownie naczelne (n = 7), przedstawione jako grupa 1 w tabeli 1, otrzymały placebo (0,9% roztwór soli, 1 cm³/kg) przed drugim wstrzykiwaniem znacznika promieniotwórczego w celu określenia zmienności test/ponowny test w tym sposobie obrazowania.

T a b e l a I

Grupy i warunki doświadczeń

Grupa	Warunki farmakologiczne
1	Kontrolna (test/test ponowny)
2	Grupa, której podano kokainę
3	Grupa, której podano GVG i kokainę

Wszystkim pozostałym naczelnym (n=13) wstrzykiwano układowo chlorowodorek kokainy (0,5, 1,0 lub 2,0 mg/kg) albo 5, albo 30 minut przed drugim wstrzykiwaniem raklopridu znakowanego węglem ¹¹C. Wśród tych 13 zwierząt pięciu podano GVG (300 mg/kg, dożylnie) 3 godziny przed podaniem kokainy.

Zgodnie z przewidywaniami różne dawki kokainy oraz odstępy czasu od wstępnego podawania przed podaniem kokainy nie wywołują poważnych zmian wpływu kokainy na objętość rozkładu (DV). W związku z tym na fig. 1 przedstawiono średnie procentowe zmiany stosunku DV odpowiednio dla zwierząt, którym podano samą kokainę (n = 8), jako grupy 2, w porównaniu z tymi, którym podano GVG i kokainę (n = 5), jako grupy 3.

Wiązanie raklopridu znakowanego węglem ¹¹C jako konkurującego antagonisty zależy od stężenia DA w rozszczepię synaptycznym. Oznacza to, że gdy maleją stężenia synaptycznej DA, to wzrasta wiązanie raklopridu znakowanego węglem ¹¹C. l odwrotnie, gdy stężenia synaptycznej DA wzrastają, to obniża się wiązanie raklopridu znakowanego węglem ¹¹C. Na fig. 1 widać, że zmienność test/ponowny test w tym sposobie obrazowania wynosił mniej niż 7% dla grupy 1. Zmienność tych pomiarów PET jest zgodna z wartościami poprzednio uzyskanymi u naczelnych z użyciem raklopridu ¹¹C. W grupie 2 kokaina powodowała większe niż 30% obniżenie średniego stosunku DV (p < 0,0002, dwukońcowy test t Studenta, fig. 1). Dane te są zgodne z równoczesnymi badaniami PET i mikrodializy, w których prowokacja amfetaminowa podwyższała poziomy pozakomórkowej DA i obniżała wiązanie raklopridu znakowanego węglem ¹¹C w mózgu naczelnych. Ponadto odkrycia te są podobne do niedawnych doniesień, w których badano skutki prowokacji kokainowej na wiązanie znakowanego raklopridu u ludzi. Dane te są wreszcie zgodne z naszymi własnymi badaniami mikrodializy (Morgan i Dewey, 1998), a także naszymi badaniami PET u naczelnych i u ludzi z użyciem amfetaminy, GBR 12909, tetrabenazyny, metylofenidatu oraz raklopridu znakowanego węglem ¹¹C (Dewey i in., 1993; Volkow i in., 1994). Wstępne podanie GVG silnie blokuje jednak wywołane kokainą obniżenie stosunku DV, pokazane w grupie 2 na fig. 1 (grupa 2, p < 0,002, dwukońcowy test t Studenta). Te różnice są łatwo widoczne w parametrycznych obrazach stosunku DV, przedstawionych na fig. 2. Wartości dla grup 1 i 3 nie są statystycznie różne (p > 0,1, dwukońcowy test t Studenta).

P r z y k ł a d 2

Badania wywołanego kokainą warunkowej preferencji miejsca u gryzoni

W tym przykładzie stosowano sposób postępowania, przedstawiony w części 2 rozdziału p.t. Materiały i sposoby. Kokaina wywoływała zależne od dawki reakcje CPP, przy czym najbardziej wiarygodne i silne reakcje występowały przy 20 mg/kg, jak to wykazano niżej w tabeli II.

PL 198 789 B1

T a b e l a II

Warunkowa preferencja miejsca na kokainę

Kokaina (mg/kg)	Czas spędzony w komorach (min)
Łączone w pary	Nie łączone w pary¹
0	7,4 ± 0,3	7,6 ± 0,3
5,0	8,2 ± 0,4	6,8 ± 0,5
10,0	9,6 ± 0,5²	5,4 ± 0,3
20,0	11,8 ± 0,4³	3,2 ± 0,4⁴

¹Monitorowanym zwierzętom wstrzykiwano tylko roztwór soli.

²Znacznie większe dawki kokainy niż 0 i 5 mg/kg, p < 0,05, analiza wariancji (ANOVA) i test Studenta-Newmana-Keulsa. ³Znacznie większe dawki kokainy niż 0,5 i 10 mg/kg, p < 0,05, ANOVA i test Studenta-Newmana-Keulsa.

⁴Znacznie mniejsze dawki kokainy niż 0,5 i 10 mg/kg, p < 0,01, ANOVA i test Studenta-Newmana-Kreulsa.

Wybraliśmy więc dawkę kokainy 20 mg/kg, aby dla niej badać wpływ podawania GVG na fazy nabywania i wyrażania wywołanego kokainą CPP. Wyniki wyraźnie wykazały, że 112, 150 i 300 mg/kg, ale nie 75 mg/kg, GVG blokowały nabywanie i wyrażanie wywołanego kokainą CPP. Patrz szczegóły niżej w tabelach III-X.

T a b e l a III

Wpływ GVG i roztworu soli na nabywanie wywołanego kokainą warunkowej preferencji miejsca

Podawane pary¹	Czas spędzony w komorach (min)
Łączone w pary	Nie łączone w pary²
Solanka/solanka	7,3 ± 0,5	7,7 ± 0,6
Solanka/kokaina	11,1 ± 0,3⁴	3,9 ± 0,4
75 mg/kg GVG³/solanka	7,3 ± 0,5	7,7 + 0,6
75 mg/kg GVG³/kokaina	9,1 ± 1,1	5,9 ± 1,2

¹Każda wartość przedstawia średnią liczbę minut spędzonych w każdej komorze ± S.E.M. (n = 8-10). ²Monitorowanym zwierzętom wstrzykiwano tylko roztwór soli.

³Zwierzęta otrzymywały GVG lub solankę 2,5 godziny przed otrzymaniem solanki lub kokainy (20 mg/kg). ⁴Znacznie większy niż u wszystkich pozostałych grup, p < 0,05, ANOVA i test Newmana-Keulsa. ⁵Znacznie mniejszy niż u wszystkich pozostałych grup, p < 0,01, ANOVA i test Newmana-Keulsa.

T a b e l a IV

	Czas spędzony w komorach (min)
Podawane pary¹	Łączone w pary	Nie łączone w pary²
Solanka/solanka	7,2 ± 0,5	7,8 ± 0,4
Solanka/kokaina	11,8 ± 0,5⁴	3,2 ± 0,5
112 mg/kg GVG³/solanka	7,6 ± 0,6	7,4 ± 0,6
1 12 mg/kg GVG³/kokaina	8,2 ± 0,5	6,8 ± 0,5

³Zwierzęta otrzymywały GVG lub solankę 2,5 godziny przed otrzymaniem solanki lub kokainy (20 mg/kg). ⁴Znacznie większy niż u wszystkich pozostałych grup, p < 0,05, ANOVA i test Newmana-Keulsa. ⁵Znacznie mniejszy niż u wszystkich pozostałych grup, p < 0,01, ANGVA i test Newmana-Keulsa.

T a b e l a V

Podawane pary¹	Czas spędzony w komorach (min)
Łączone w pary	Nie łączone w pary²
1	2	3
Solanka/solanka	7,4 ± 0,3	7,6 ± 0,4
Solanka/kokaina	11,6 ± 0,5⁴	3,4 ± 0,4⁵

PL 198 789 B1 cd. tabela V

1	2	3
150 mg/kg GVG³/solanka	7,8 ± 0,6	7,2 ± 0,6
1 50 mg/kg GVG³/kokaina	7,9 ± 0,8	7,1 ± 0,8

T a b e l a VI

Podawane pary¹	Czas spędzony w komorach (min)
Łączone w pary	Nie łączone w pary²
Solanka/solanka	7,7 + 0,3	7,3 ± 0,3
Solanka/kokaina	11,2±0,6⁴	3,8 ± 0,5⁵
300 mg/kg GVG3/solanka	7,2 ± 0,4	7,8 ± 0,4
300 mg/kg GVG3/kokaina	7,6 + 0,7	7,2 ± 0,7

T a b e l a VII

Wpływ GVG i roztworu soli na wyrażanie wywołanego kokainą warunkowej preferencji miejsca

Podawane pary¹	Czas spędzony w komorach
Lek podawany w dniu badania	Łączenie w pary	Brak łączenia pary²
Solanka/solanka	solanka	7,5 ± 0,4¹	7,5 ± 0,4
Solanka/solanka	GVC, 75 mg/kg	7,5 ± 0,3	7,5 ± 0,3
Solanka/kokaina	solanka	11,8 ± 0,5³	3,2 ± 0,5
Solanka/kokaina	GVC, 75 mg/kg	10,6 ± 0,6³	4,4 ± 0,9
Solanka/solanka	solanka	7,8 ± 0,51	7,2 ± 0,6

¹Każda wartość przedstawia średnią liczbę minut spędzonych w każdej komorze ± S.E.M. (n = 10).

²Monitorowanym zwierzętom wstrzykiwano tylko roztwór soli.

³Znacznie większy niż dla wszystkich pozostałych podawanych par, p < 0,01, ANOVA i test Studenta Newmana-Keulsa.

T a b e l a VIII

Podawane pary¹	Czas spędzony w komorach
Lek podawany w dniu badania	Łączenie w pary	Brak łączenia pary²
Solanka/solanka	solanka	7,1 ± 0,5	7,9 ± 0,5
Solanka/solanka	GVC, 112 mg/kg	7,2 ± 0,3	7,8 ± 0,3
Solanka/kokaina	solanka	12,2 ± 0,6³	2,8 ± 0,5
Solanka/kokaina	GVC, 112 mg/kg	8,1 ± 0,7	6,9 ± 0,6

²Monitorowanym zwierzętom wstrzykiwano tylko roztwór soli.

PL 198 789 B1

T a b e l a IX

Podawane pary¹	Czas spędzony w komorach
Lek podawany w dniu badania	Łączenie w pary	Brak łączenia pary²
Solanka/solanka	solanka	7,2 ± 0,2¹	7,8 ± 0,2
Solanka/solanka	GVC, 150 mg/kg	7,7 ± 0,2	7,3 ± 1,1
Solanka/kokaina	solanka	11,1 ± 0,5³	3,9 ± 0,4⁴
Solanka/kokaina	GVC, 150 mg/kg	7,9 ± 0,3	7,1 ± 0,3

²Monitorowane zwierzęta, którym wstrzykiwano tylko solankę.

³Znacznie większy niż dla wszystkich pozostałych podawanych par, p < 0,01, ANOVA i test Studenta Newmana-Keulsa. ⁴Znacznie mniejszy niż dla wszystkich pozostałych podawanych par, p < 0,01, ANOVA i test Studenta Newmana-Keulsa.

T a b e l a X

Podawane pary¹	Czas spędzony w komorach
Lek podawany w dniu badania	Łączenie w pary	Brak łączenia pary²
Solanka/solanka	solanka	7,8 ± 0,5¹	7,2 ± 0,6
Solanka/solanka	GVC, 300 mg/kg	7,3 ± 0,4	7,7 ± 0,3
Solanka/kokaina	solanka	12,5 ± 0,8³	2,5 ± 0,6⁴
Solanka/kokaina	GVC, 300 mg/kg	7,9 ± 0,5	7,1 ± 0,6

²Monitorowanym zwierzętom wstrzykiwano tylko roztwór soli.

³Znacznie większy niż dla wszystkich pozostałych podawanych par, p < 0,05, ANOVA i test Studenta Newmana-Keulsa. ⁴Znacznie mniejszy niż dla wszystkich pozostałych podawanych par, p < 0,05, ANOVA i test Studenta Newmana-Keulsa

Sam GVG nie powoduje ani CPP, ani uwarunkowanej reakcji niechęci. Patrz również tabele III-X.

P r z y k ł a d 3

Badania wywołanego pożywieniem warunkowej preferencji miejsca u gryzoni W tym przykładzie stosowano sposób postępowania, przedstawiony w części 3 rozdziału

p.t. Materiały i sposoby. Wyniki, przedstawione niżej w tabeli XI, wskazują, że pożywienie wywoływało skutki pobudzające lub nagradzające. Na przykład wszystkie wartości dla par wykazują, że gryzonie spędzały więcej czasu w komorze, w której znajdowało się pożywienie.

T a b e l a XI

Wpływ GVG (150, 300 mg/kg, i.p.) na warunkową preferencję miejsca na pożywienie

Podawane pary	Czas spędzony w komorach (min)
Łączone w pary	Nie łączone w pary²
Solanka/solanka	7,3 ± 0,6	7,7 ± 0,6
GVG/solanka	7,5 ± 0,7	7,5 ± 0,7
Solanka/pożywienie	9,3 ± 0,7	5,7 ± 0,7
GVG (150mg/kg)/pożywienie	9,4 ± 0,4	5,6 ± 0,5
GVG (300 mg/kg)/pożywienie	9,0 ± 0,5	6,0 ± 0,5

¹Każda wartość przedstawia średnią liczbę minut spędzonych w każdej komorze ± S.E.M. ²Monitorowanym zwierzętom wstrzykiwano tylko roztwór soli.

Podawanie 150 lub 300 mg/kg GVG nie zmieniało reakcji CPP na pożywienie, jak to wykazano w tabeli XI, mimo osłabiania pobudzających motywacyjnych skutków działania kokainy w wyżej przedstawionych doświadczeniach CPP, wykazanych wyżej w tabelach III-X.

Dyskusja wyników doświadczeń, uzyskanych w przykładach 1,2 i 3

W poprzednich badaniach PET wykazaliśmy, że sam GVG obniża stężenia pozakomórkowej DA, powodując wzrost wiązania raklopridu znakowanego węglem ¹¹C w mózgu naczelnych (Dewey i in., 1992). W badaniach PET według niniejszego wynalazku wywołane przez GVG obniżenia

PL 198 789 B1 poziomów pozakomórkowej DA przed podaniem kokainy wyraź nie stanowią podstawę osłabienia skutków działania kokainy, obserwowanego w grupie 3 w tabeli I. Jednakże pozornie identyczne wartości, znalezione dla grup 1 i 3, połączone z naszymi wcześniejszymi odkryciami z użyciem samego GVG (Dewey i in., 1992), wskazują, że kokaina podwyższała poziomy pozakomórkowej DA w niniejszym wynalazku mimo podawania GVG, ale tylko do wartości podstawowych.

Ten wywołany kokainą powrót do wartości podstawowych, wynikający z przedstawionych tu danych CPP, był jednak wyraźnie niewystarczający do wywołania pobudzających motywacyjnych skutków jej działania.

Nasze wyniki wskazują, że kokaina wywołuje reakcje CPP. Natomiast pary rozczynników nie wywoływały reakcji CPP, wskazując, że zwierzęta nie okazywały jakichkolwiek wyróżnień komór, tj. urządzenie było traktowane bez tendencji. Ponadto reakcje CPP na kokainę były zależne od dawki, przy czym najbardziej wiarygodne i silne reakcje występowały w przypadku dawki kokainy, wynoszącej 20 mg/kg.

Podawanie 112, 150, 300 mg/kg, ale nie 75 mg/kg, GVG blokowało nabywanie i wyrażanie reakcji CPP, wywołanych kokainą. Natomiast GVG w parze z roztworem soli nie wywoływał reakcji CPP lub reakcji niechęci. Wskazuje to, że blokada powodowanego kokainą CPP przez GVG nie była związana z wywoływaniem przez sam GVG reakcji niechęci lub reakcji wzbudzającej głód. Nasze wyniki, przedstawione w przykładzie 2, wykazały, że pożywienie wywołuje skutki pobudzające lub nagradzające. Podawanie 150 lub 300 mg/kg GVG nie zmieniało reakcji CPP na pożywienie mimo osłabiania pobudzających skutków działania kokainy. To odkrycie sugeruje, że GVG specyficznie osłabia nagradzające/pobudzające skutki działania kokainy.

P r z y k ł a d 4

Badania czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce i katalepsji u gryzoni doświadczalnych

W tym przykładzie stosowano sposoby postępowania, przedstawione w częściach 4 i 5 rozdziału p.t. Materiały i sposoby. Wprawdzie powszechnie przyjmuje się, że wzorzec CPP odróżnia pobudzające motywacyjne skutki działania od ruchowych skutków działania, niemniej jednak my ocenialiśmy skutki działania GVG na czynności ruchowe i katalepsję u szczurów. Stwierdziliśmy, że uprzednie podawanie GVG w dawkach 150 mg/kg lub 300 mg/kg nie zmieniało działań przenoszenia się z miejsca na miejsce w porównaniu z grupą kontrolną, której uprzednio podawano roztwór soli, jak to wykazano na fig. 3a i fig. 3b. Ponadto uprzednie podawanie GVG w dawkach 150 mg/kg lub 300 mg/kg nie wywoływało katalepsji u szczurów. Czas trwania katalepsji po podaniu 300 mg/kg GVG wynosił 1,1+0,4 sekund (n = 10), niewiele różniąc się od tego czasu, wynoszącego 0,7+0,3 sekund (n=10), u szczurów, którym podawano roztwór soli. Liczba n oznacza liczbę badanych gryzoni.

P r z y k ł a d 5

Poziomy kokainy znakowanej węglem ¹¹C u gryzoni i naczelnych

W tym przykładzie stosowano sposób postępowania, przedstawiony w części 6 rozdziału p.t. Materiały i sposoby. W celu oceny możliwości, czy GVG mógłby osłabiać działania kokainy przez zmienianie jej wnikania do mózgu, badaliśmy wpływ roztworu soli oraz GVG na poziomy kokainy znakowanej węglem ¹¹C w całych mózgach szczurów i naczelnych. U gryzoni poziomy kokainy znakowanej węglem ¹¹C w mózgu po wewnątrzotrzewnowym podaniu roztworu soli oraz 300 mg/kg GVG wynosiły odpowiednio 0,110±0,03 oraz 0,091±0,02, co nie stanowiło statystycznej różnicy. U naczelnych farmakokinetyczny profil wiązania znakowanej kokainy w nowym prążkowi nie różnił się znacznie od podstawowego profilu skaningowego zarówno w odniesieniu do absolutnego wychwytu, jak i klirensu.

P r z y k ł a d 6

W tym przykładzie mierzono skutki działania GVG na wywołane nikotyną zmiany stężeń pozakomórkowej dopaminy, u swobodnie poruszających się szczurów. Stosowano sposób postępowania, przedstawiony w części 7 rozdziału p.t. Materiały i sposoby.

Ogółem badano 8 szczurów dla przypadku każdej podawanej pary. Zwierzętom podawano 4 pary przez okres 8 dni, jedną parę na dzień. Zwierzętom podawano 75 mg/kg GVG 2,5 godziny przed podaniem 0,4 mg/kg nikotyny. Zwierzętom podawano GVG, potem nikotynę i umieszczano je w odpowiedniej komorze w dniu 1. W dniu 2 zwierzętom podawano GVG, następnie roztwór soli i umieszczano je w odpowiedniej komorze. Procedurę dni 1 i 2 powtarzano jeszcze trzykrotnie. Dwadzieścia cztery godziny później po ostatnim podaniu pary zwierzętom umożliwiano wolny dostęp do całego urządzenia do badania zachowań na 15 minut i rejestrowano długości czasów, spędzonych w komorach łączących pary i nie łączących par, wykorzystując automatyczne urządzenia. Skutki działania

PL 198 789 B1 mg/kg wewnątrzotrzewnowo podawanego GVG na nabywanie CPP na nikotynę przez szczury, badane w tym przykładzie, przedstawiono niżej w tabeli XII.

T a b e l a XII

Skutki działania wewnątrzotrzewnowego podawania 75 mg/kg GVG na nabywanie warunkowej preferencji miejsca na (-)-nikotynę

Podawane pary	Czas spędzony w komorach (min)¹
Łączenie w pary	Brak łączenia w pary²
Nikotyna 0,4 mg/kg podawana podskórnie/rozczynnik³	9,4 ± 0,5	5,6 ± 0,5
75 mg/kg GVG/nikotyna 0,4 mg/kg podawana podskórnie	6,4 ± 0,3⁴	8,6 ± 0,3⁵

¹Każda wartość oznacza średnią liczbę minut, spędzonych w każdej komorze ± S.E.M. (standardowy błąd średniej). ²Monitorowanym zwierzętom wstrzykiwano tylko roztwór soli.

³Rozczynnik oznaczał 1 cm³/kg 0,9% NaCI, czyli roztwór soli.

⁴Znacznie krótszy niż w przypadku pary nikotyna/rozczynnik, p < 0,01, ANOVA i test Studenta-Newmana-Keulsa.

⁵Znacznie dłuższy niż w przypadku pary nikotyna/rozczynnik, p < 0,01, ANOVA i test Studenta-Newmana-Keulsa.

Wyniki doświadczeń podobnych do przedstawionych w tabeli XII przedstawiono na fig. 4. Fig. 4 wykazuje, że GVG (150 mg/kg) blokuje wywoływane nikotyną podwyższenia stężeń dopaminy u swobodnie poruszających się szczurów. Puste kółka oznaczają kontrolne zwierzęta. Zaczernione kółka pochodzą od zwierząt, którym podawano GVG 2,5 godziny przed podaniem nikotyny.

P r z y k ł a d p o r ó w n a w c z y

Skutki działania baklofenu na zażywanie kokainy

Nasze wyniki, uzyskane w przykładach 1, 2 i 3, były zgodne z wcześniejszymi badaniami, sugerującymi, że rozszerzenie czynności GABAergicznych może osłabiać nagradzające/wzmacniające działania kokainy i innych nadużywanych leków. Wykazano np., stosując wzorzec postępującego stosunku, że baklofen, selektywny agonista GABAB, po wodował zależne od dawki obniżenie punktów załamania w przypadku dożylnego (i.v.) podawania kokainy męskim osobnikom szczurów rasy Wistar, chociaż nie wpływał na stopień pobierania leku. Wyniki te sugerowały, że baklofen osłabia wzmacniające skutki działania kokainy, gdyż obniżenie punktów załamania oznacza obniżenie motywacji do samodzielnego zażywania kokainy.

Wysuwano również hipotezę, że rozszerzenie czynności receptora GABAA powoduje osłabienie samodzielnego zażywania kokainy, ponieważ chlorodiazopoksyd i alprazolam, dodatnie alosteryczne modulatory kompleksu receptora GABAA, obniżały częstość samodzielnego zażywania kokainy. Ten skutek działania jest jednak związany prawdopodobnie ze wzrostem wartości wzmacniającej każdej jednostkowej dawki kokainy, gdyż chlorodiazopoksyd będzie podwyższał punkt załamania dla samodzielnego zażywania kokainy w schemacie postępującego stosunku.

Te dane uzyskane z użyciem baklofenu zostały poparte ostatnimi badaniami z tego samego laboratorium, wskazującymi, że ostre uprzednie podawanie szczurom baklofenu (1,25-5 mg/kg wewnątrzotrzewnowo) będzie hamowało samodzielne zażywanie kokainy we wzorcu prób dyskretnych przez okres przynajmniej czterech godzin bez znacznych zmian w reagowaniu na wzmocnienie pożywienia. Mikrowstrzykiwanie baklofenu do brzusznego obszaru pokrywkowego po tej samej stronie bocznej, gdzie umieszczono pobudzającą elektrodę w bocznym podwzgórzu u szczurów, powodowało przesunięcie w prawo krzywej zależności stopnia reakcji od natężenia prądu, wykazując, że baklofen osłabiał wartości nagradzające pobudzania elektrycznego. Baklofen nie wpływał jednak na maksymalny stopień reagowania na nagrodę elektrycznego pobudzania mózgu, ani na poziomy niewzmacnianych czynności, co sugeruje, że działanie baklofenu nie było związane ze zmianami czynności i sprawności ruchowych.

Niedawne badania wykazały, że GVG powoduje zależne od dawki podwyższanie progów nagrody pobudzania mózgu u męskich osobników szczurów F344 (Kushner i in., 1997b) bez znacznych skutków działania na czynności ruchowe. Obniżenie progów nagrody pobudzania mózgu, powodowane przez 2,5 oraz 5 mg/kg kokainy podawanej wewnątrzotrzewnowo, było silne antagonizowane dawką 400 mg/kg GVG.

Wreszcie reakcję CPP, wywołaną morfiną (8 mg/kg), znacznie osłabiało mikrowstrzykiwanie baklofenu (0,1-1 nmol) do brzusznego obszaru pokrywkowego i ten skutek był antagonizowany przez 2-hydroksysaklofen, będący antagonistą GABAB. Mimo stosowania różnych wzorców do oceny nagraPL 198 789 B1 dzania/wzmacniania badania te wykazują więc, że aktywacja receptorów GABAB osłabia wzbudzające głód wartości kokainy, morfiny oraz nagród elektrycznego pobudzania mózgu.

Uprzednio doniesiono, że wstępne podanie progabidu, związku GABA-mimetycznego (który podwyższa poziomy GABA w mózgu przez swój metabolizm do GABA), który sam nie wywołuje warunkowej preferencji miejsca ani niechęci, nie zmienia reakcji CPP na 1,5 mg/kg podawanej śródotrzewnowo amfetaminy. Trudno jest jednak porównywać to odkrycie z niniejszym wynalazkiem, ponieważ występowały różnice szczepów szczurów, związków GABAergicznych i leków stosowanych do wywoływania CPP. Należy też wziąć pod uwagę, że progabid był obecny tylko przez 35 minut. Wykazano, że maksymalny wzrost poziomów GABA w mózgu po układowym podaniu progabidu występuje po upływie czterech-sześciu godzin od wstrzyknięcia, toteż poziomy GABA nie znajdowały się w maksimum podczas oznaczania CPP wywołanego amfetaminą.

Biorąc pod uwagę dowody, sugerujące, że powiększanie czynności dopaminoergicznych w układzie środkowolimbicznym odgrywa rolę w pośredniczeniu w nagradzających/wzmacniających skutkach działania kokainy, zniesienie reakcji CPP na kokainę przez GVG można związać ze zmianą aktywności/czynności dopaminoergicznej. Tę hipotezę podtrzymują nasze badania mikrodializy in vivo, wykazujące, że ostre (300 i 500 mg/kg wewnątrzotrzewnowo) lub powtarzalne podawanie (100, 300 i 500 mg/kg wewnątrzotrzewnowo) GVG powoduje znaczne, zależne od dawki, obniżenie podwyższania poziomów pozakomórkowej DA w NACC oraz prążkowiu, wywołanego przez 20 mg/kg podawanej wewnątrzotrzewnowo kokainy (Dewey i in., 1998). Równocześnie jest niemożliwe, aby zmiany wrażliwości receptorów DA po podaniu GVG były odpowiedzialne za jego osłabianie działania kokainy, ponieważ wiadomo, że powtarzalne podawanie GVG nie zmienia wrażliwości receptorów D1 lub D2 w prążkowiu szczurów. Nie ma jednak dowodów, dotyczących skutków działania GVG na inne receptory DA (D3, D4 oraz D5). Alternatywnie jest możliwe, że kokaina mogłaby zmieniać czynności receptorów GABAB, zmieniając potencjalnie uwalnianie przekaźników nerwowych, takich jak DA, i to mogłoby być antagonizowane przez GVG za pośrednictwem podnoszenia poziomów GABA i w konsekwencji pobudzaniem recepto rów GABAB.

Wykazano, również, iż powtarzalne podawanie kokainy obniża skuteczność działania presynaptycznych autoreceptorów i heteroreceptorów GABAB na bocznych przegrodowych neuronach jąder w płatach mózgu szczurów. Może to prowadzić do niepowstrzymywanego działania i podwyższonego uwalniania przekaźników nerwowych. Jest również możliwe, że baklofen mógłby osłabiać działanie DA i to osłabiałoby działanie kokainy. Pośrednio potwierdzają to dane uzyskane przez Laceya i in. (1998), wykazujące, że w pozakomórkowych zapisach z neuronów strefy zwartej istoty szarej pnia mózgu szczurów zewnętrzne prądy, wywoływane przez DA, były zwierane przez maksymalne prądy, wytwarzane przez baklofen.

Możliwych jest kilka interpretacji obecnych wyników. Po pierwsze jest możliwe, że GVG mógłby podwyższać metabolizm kokainy, obniżając w ten sposób jej ilości, które dostają się do mózgu, oraz w następstwie tego obniżając skutki jej neurochemicznego działania, i w końcu jej działania, odnoszące się do zachowań. Jest jednak niemożliwe, aby poziomy kokainy znakowanej węglem ¹¹C w mózgu nie były w znacznym stopniu zmieniane u szczurów lub naczelnych, którym uprzednio podano GVG (300 mg/kg). Ponadto kokaina jest głównie metabolizowana przez cholinesterazy plazmy, podczas gdy GVG jest wydalany w moczu głównie w niezmienionej postaci, co czyni niepodobnym farmakologiczne wzajemne oddziaływanie.

Istnieją doniesienia, że leki, które powiększają czynności GABAergiczne, mogą powodować upojenie polekowe i ataksję. W konsekwencji uzasadnione jest zakładanie, że GVG przez wywoływanie takich niepomyślnych skutków działania, odnoszących się do zachowań, może niespecyficznie antagonizować działanie kokainy. Wyniki obecnych badań wykazują jednak, że GVG nie wywołuje katalepsji lub znacznych zmian czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce, czyniąc taką hipotezę nie do utrzymania. Ponadto omówione wyżej przykłady wykazują, że GVG nie wywołuje niechęci do miejsca preferowanego, co wskazuje, że antagonizm względem działania kokainy nie wynika z wzbudzającego niechęć działania przeciwważnego. W dodatku sam GVG nie wywołuje preferencji miejsca u zwierząt doświadczalnych, ponieważ nie przesuwa wyróżnień zwierząt ze środowiska par z kokainą do środowiska par z GVG.

Wykazano, że podawanie GVG może zmieniać spożycie pożywienia u szczurów. W związku z tym jest możliwe, że GVG może obniżać lub osłabiać hedonistyczne wartości naturalnych nagród, również tych, które wywołuje kokaina. Obecne badania wykazały jednak, że ani dawka 150, ani 300 mg/kg GVG nie wpływają na zmianę nagradzająco/pobudzających skutków działania pożywienia.

PL 198 789 B1

Istnieją dowody wskazujące, że zachowania we wzorcu warunkowej preferencji miejsca (CPP) zależą od badanych czynników wzmacniających, w tym własności poprawiających pamięć. Można więc wnioskować, że dokonywana przez GVG blokada wyrażania i nabywania wywołanego kokainą CPP jest wynikiem przeszkadzania ze strony GVG w wiązaniu dodatniej wartości pobudzającej kokainy z odpowiednimi bodźcami. Wiadomo istotnie, że niektóre leki, które potęgują działanie GABAergiczne, mogą upośledzać pamięć. GVG nie wpływa jednak na warunkowanie miejsca pożywienia, co sugeruje, że ta hipoteza nie może wyjaśniać antagonizmu GVG na działanie kokainy we wzorcu CPP.

Stwierdzono, że dawki 112, 150 i 300 mg/kg GVG antagonizują nabywanie i wyrażanie wywołanego kokainą CPP. Natomiast GVG nie wywoływał CPP ani reakcji niechęci do miejsca preferowanego, wskazując, że GVG nie antagonizuje działania kokainy przez to, że sam wywołuje reakcję CPP albo osłabia CPP przez wywołanie skutku niechęci. Ponadto GVG nie wywoływał katalepsji i nie zmieniał pobudzającej wartości pożywienia. Istnieją dowody, że bodźce lub sygnały związane z kokainą będą przywracały zachowania poszukujące narkotyku oraz jego głód u odtruwanych narkomanów kokainowych, prowadząc w ten sposób do nawrotu nałogu. Wyrażanie CPP na kokainę, oznaczone w nieobecności kokainy, jest antagonizowane przez GVG. Wyniki te wskazują, że głód doświadczany przez narkomanów kokainowych może być osłabiany przez GVG.

Dopaminoergiczne przenoszenie w NACC jest odpowiedzialne za wzmacniające własności kokainy. W omówionych wyżej badaniach PET wykonywano jednak pomiary w prążkowiu, a nie w NACC. Wprawdzie przekaźnictwo nerwowe DA w prążkowi nie było odpowiedzialne za kokainowe nagradzanie i wzmacnianie, ale skutki działania kokainy na poziomy pozakomórkowej DA były jakościowo podobne w obydwóch tych obszarach. Ponadto nasze badania mikrodializy in vivo wykazały, że zdolność GVG do osłabiania wywoływanych kokainą wzrostów poziomów pozakomórkowej DA jest podobnego stopnia w obydwóch tych obszarach (Dewey i in., 1997; Morgan i Dewey, 1998).

W przeprowadzonych doświadczeniach wykorzystano dwa różne gatunki gryzoni i naczelnych. Mezokortykolimbiczny układ DA jest neuroanatomicznie i neurofizjologicznie homologiczny w obydwu gatunkach. Ponadto biochemiczne skutki działania kokainy na pozakomórkową DA, mierzone techniką mikrodializy in vivo, są podobne w obydwu gatunkach i obydwa gatunki, gryzonie i naczelne, łatwo samodzielnie zażywają kokainę (Morgan i in., 1998).

Na podstawie otrzymanych wyników doświadczalnych zakłada się, że blokada zachowań we wzorcu CPP była spowodowana osłabieniem skutków działania kokainy na DA w mózgu wtórnie po wywołanych przez GVG podwyższeniach GABAergicznego powstrzymywania mezokortykolimbicznego układu DA.

GVG dostarcza korzyści z blokowania pobudzających, motywacyjnych i biochemicznych skutków działania kokainy na DA w mózgu przez nieodwracalne powstrzymywanie GABA-T, czyniąc stosunkowo powolną syntezę od nowa tego enzymu, etap określający prędkość odwracania powstrzymywania skutków działania kokainy. Niedawne doniesienie o przypadkach osób nadużywających kokainę sugeruje, że gabapentyna, środek przeciwdrgawkowy, który także wzmaga GABAergiczne przenoszenie według nieznanego mechanizmu, osłabia skutki odstawienia i głód kokainy. Razem wziąwszy, dane te wskazują, że leki, selektywnie nacelowane na układ GABAergiczny, mogą być korzystne w leczeniu uzależnienia kokainowego. Ściślej biorąc, wywoływane przez GVG powstrzymywanie GABA-T, które powoduje podwyższenie poziomów pozakomórkowego GABA w mózgu, oznacza skuteczny lek i nową strategię w leczeniu uzależnienia kokainowego.

P r z y k ł a d 7

Zjawisko uczulenia obserwuje się właściwie w przypadku wszystkich uzależniających leków. Uważa się, że uczulenie odgrywa rolę w etiologii uzależnień. W tym przykładzie mierzono u dziesięciu swobodnie poruszających się szczurów skutek działania roztworu soli oraz 150 mg/kg podawanych wewnątrzotrzewnowo GVG na wyrażanie wywołanych kokainą stereotypowych zachowań w następstwie uczulającego trybu podawania kokainy.

Zwierzętom podawano wewnątrzotrzewnowo 15 mg/kg kokainy i oznaczano stereotypię w standardowych klatkach umożliwiających przenoszenie się z miejsca na miejsce. Przez 6 kolejnych dni podawano zwierzętom wewnątrzotrzewnowo 15 mg/kg kokainy raz na dzień w ich mieszkalnych klatkach. Osiem dni później zwierzęta te ponownie prowokowano przez wewnątrzotrzewnowe podanie 15 mg/kg kokainy i oznaczano stereotypię. Do oceny stereotypii stosowano pięciopunktową skalę ocen i oceniający nie wiedział, co podawano każdemu zwierzęciu. Zaobserwowano, że GVG usuwał wyrażanie wywołanego kokainą uczulenia przy dawce 150 mg/kg podawanej wewnątrzotrzewnowo 2,5 godziny przed prowokacją kokainową. Wyniki przedstawiono niżej w tabeli XIII.

PL 198 789 B1

T a b e l a XIII

Skutek działania roztworu soli oraz 150 mg/kg podawanego wewnątrzotrzewnowo GVG na wyrażanie wywołanych kokainą stereotypii po uczulającym trybie podawania kokainy

Punktacja stereotypii w dniu 1	Podawanie 2 godz. przed pomiarem punktacji stereotypii	Stereotypie w dniu 15
2,5 ± 0,4	1 cm³/kg wewnątrzotrzewnowo 0,9% NaCI	4,1 ± 0,5*
2,9 ± 0,4	150 mg/kg wewnątrzotrzewnowo GVG	2,3 ± 0,6

Znacznie większe niż w dniu 1., p<0,05, test Studenta

Następne doświadczenia zaplanowano w celu określenia skutków działania GVG na wywołane nikotyną podwyższenia poziomów DA w NACC, a także na zachowania, związane z tym skutkami biochemicznymi. W szczególności dokonywano tego przez: 1) stosowanie mikrodializy in vivo u swobodnie poruszających się zwierząt, nie stykających się dotąd z tym bodźcem oraz tych, którym przez dłuższy czas podawano nikotynę, do mierzenia skutków działania GVG oraz nikotyny na poziomy pozakomórkowej DA w NACC; 2) stosowanie emisyjnej tomografii pozytronowej (PET) do mierzenia skutków działania GVG na wywołane nikotyną obniżenia wiązania raklopridu znakowanego węglem ¹¹C w prążkowiu znieczulonych żeńskich osobników pawianów oraz 3) badanie skutków działania GVG na wywoływane nikotyną CPP.

P r z y k ł a d 8

Skutki działania GVG na wywołane nikotyną podwyższenia poziomów DA w NACC

1. Badania mikrodializy u gryzoni

W tym przykładzie zastosowano nikotynę jak lek uzależniający. Zwierzętom z grupy 1 podawano nikotynę (0,4 mg/kg, podskórnie) 2,5 godziny po podaniu GVG (75, 90, 100 lub 150 mg/kg, wewnątrzotrzewnowo). W osobnej serii doświadczeń (grupa 2) zwierzętom podawano przez 21 dni nikotynę (0,4 mg/kg, podskórnie, dwa razy dziennie). W dniu badań podawano GVG (100 mg/kg) albo 2,5, albo 12, albo 24 godziny przed prowokacją nikotynynową (0,4 mg/kg, podskórnie). We wszystkich badaniach zwierzęta umieszczano w misach do mikrodializy na noc przed doświadczeniami i perfundowano sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) przez sondy do mikrodializy z prędkością przepływu, wynoszącą 2,0 ąl/min. Po zakończeniu każdego badania zwierzęta uśmiercano, wydobywano ich mózgi i dzielono na wycinki do weryfikacji umiejscowienia sondy.

W grupie 1 zwierząt nikotyna podwyższała stężenia pozakomórkowej DA w NACC o około 100% po 80 minutach od podania (fig. 5A). Oznacza to, że poziomy DA wzrosły do około 200% poziomów podstawowych. DA wracała do poziomów podstawowych po upływie około 160 minut od podawania. GVG w sposób zależny od dawki powstrzymywał ten wzrost, jak to przedstawiono na fig. 5A. W przypadku dawki 75 mg/kg GVG nie wpływał na wywołane nikotyną podwyższenia poziomów DA, podczas gdy w dawce 90 mg/kg GVG powstrzymywał podwyższenia poziomów DA o około 50%, zaś w dawce 100 mg/kg całkowicie usuwał jakiekolwiek podwyższenie poziomu DA. Najwyższa dawka, 150 mg/kg, również całkowicie usuwała te skutki działania (danych nie przedstawiono). Na szczególną uwagę zasługuje odkrycie, że w przypadku tych trzech wyższych dawek (90, 100 lub 150 mg/kg) GVG obniżał podstawowe poziomy DA przed podaniem nikotyny. Najniższa dawka (75 mg/kg) nie wpływała na podstawowe poziomy DA i w następstwie tego nie wpływała na zdolność nikotyny do podwyższania pozakomórkowej DA w NACC.

W grupie 2 zwierząt nikotyna podwyższała poziomy pozakomórkowej DA w NACC w tym samym okresie czasu i w tym samym stopniu, jak to zmierzono w grupie 1 zwierząt (około 100% powyżej poziomu podstawowego, fig. 5B). Podobnie do naszych danych, uzyskanych w grupie 1, gdy podawanie następowało 2,5 godziny przed podaniem nikotyny, dawka GVG, wynosząca 100 mg/kg, całkowicie usuwała wywołane nikotyną podwyższenia poziomów pozakomórkowej DA. Jeśli jednak podanie następowało 12 godzin przed prowokacją, to nikotyna podwyższała poziomy pozakomórkowej DA o około 25% powyżej wartości poziomów podstawowych (fig. 5B). W grupie 2 zwierząt, którym podawano GVG 24 godziny przed prowokacją nikotynową, poziomy pozakomórkowej DA wzrastały do wartości podobnych do zmierzonych u zwierząt kontrolnych (fig. 5B). Zgodnie z naszymi wcześniej uzyskanymi danymi (Dewey i in., 1997) GVG nie zmieniał ogólnych czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce podczas 2,5-godzinnego okresu czasu od jego wstępnego podania. Jednakże nikotyna podwyższała ogólne czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce u wszystkich zwierząt, niezależnie od podanej im dawki GVG.

PL 198 789 B1

P r z y k ł a d 9

2. Wywołane nikotyną CPP u gryzoni

Opis urządzenia CPP

Urządzenie CPP wykonano całkowicie z pleksiglasu z wyjątkiem podłogi w jednej z komór łączenia par, którą wykonano z płyty ze stali nierdzewnej z otworami (o średnicy 0,5 mm) w odstępach 0,5 mm od krawędzi do krawędzi. Dwie komory łączenia par różniły się sygnałami wizualnymi i dotykowymi. Jedna z komór była w całości jasnoniebieska z podłogą ze stali nierdzewnej, a druga komora była jasnoniebieska z poziomymi czarnymi pasami (o szerokości 2,5 cm) oddalonymi od siebie w odstępach 3,8 cm, z gładką podłogą z pleksiglasu. Te dwie komory łączenia par były oddzielone trzecim, obojętnym tunelem łączącym (10 x 14 x 36 cm) z przezroczystymi ścianami z pleksiglasu i podłogą z pleksiglasu. Wizualne i dotykowe sygnały były tak wyważone, że przed uwarunkowaniem zwierzęta nie przejawiały żadnego istotnego wyróżnienia ubocznego.

Wpływ GVG na wyrażane CPP u gryzoni

Sposób postępowania podczas warunkowania obejmował 20 sesji, prowadzonych przez 20 kolejnych dni. Pierwsze trzy sesje były sesjami przyzwyczajania, podczas których zwierzęta przetrzymywano przez 5 minut na dzień i wystawiano na działanie widoków i dźwięków pomieszczeń badawczych. Potem następowało 16 sesji 8 łączeń par z wykorzystaniem grupy 1) rozczynnik/rozczynnik (1 cm³/kg wewnątrzotrzewnowo 0,9% roztworu soli, n = 10 zwierząt) lub 7 dla grupy roztwór soli - nikotyna (0,4 mg/kg podskórnie), przy czym w każdej grupie było 10 zwierząt. Połowie zwierząt w każdej badanej grupie podawano nikotynę przed poddaniem działaniu widoku niebieskiej komory, a drugiej połowie podawano roztwór soli przed poddaniem działaniu widoku niebieskiej komory z czarnymi pasami. Zwierzętom, którym, wstrzykiwano rozczynnik lub nikotynę, zamykano w odpowiednich komorach na 30 minut za odcinającymi drzwiami z pleksiglasu w celu zablokowania dostępu do pozostałych części komór. Końcowa sesja (dzień 20.) była sesją badawczą, w której zwierzętom podawano jedną z następujących substancji 30 minut przed doświadczeniem: 1) roztwór soli lub 2) GVG (18,75, 37,5, 75 lub 150 mg/kg wewnątrzotrzewnowo). Wejścia do obydwu komór łączenia par były otwarte i zwierzęta mogły swobodnie poruszać się między 3 komorami przez 15 minut. Rejestrowano długości czasu, spędzonego w każdej komorze, z zastosowaniem automatycznych strumieni podczerwieni, sprzęgniętych elektronicznie z sekundomierzem.

Wpływ GVG na nabywanie CPP

Zwierzęta przyzwyczajano tak, jak to opisano wyżej. Zwierzętom tym podawano albo roztwór soli, albo GVG (37,5 i 75 mg/kg wewnątrzotrzewnowo) 2,5 godziny przed podaniem nikotyny. Następnie zwierzęta te umieszczano w odpowiedniej komorze na 30 minut. Powtarzano to dla 8 łączeń w pary przez okres 16 dni. W dniu badań zwierzęta umieszczano w urządzeniu CPP i umożliwiano im swobodny dostęp do wszystkich komór CPP i rejestrowano długości czasu, spędzonego w komorze.

Podawanie soli nie wywoływało wyróżnienia jakiejś komory. Natomiast nikotyna (0,4 mg/kg podskórnie) wywoływała statystycznie istotną i wiarygodną reakcję CPP, gdy zwierzęta spędzały 9,6 ± 0,6 min po stronie łączenia par (nikotyny) w porównaniu z 5,4±0,6 min po stronie bez łączenia par (roztworu soli) (tabele XIV i XV). Statystyczna analiza danych wyrażania wykazywała wpływ podawania (F(5, 50) = 21,6, p <0,001). Dalsza analiza ujawniała, że GVG w dawkach 18,75, 37,5, 75,0 lub 150 mg/kg, ale nie roztwór soli, usuwał fazę wyrażania wywołanego nikotyną CPP (tabela XIV).

Analiza danych o nabywaniu wykazała skutek podawania (F(3,32) = 11,8, p <0,05. Dalsza analiza wykazała, że GVG (37,5 mg/kg) nie blokuje istotnie nabywania wywołanego nikotyną CPP (tabela XV). Natomiast w dawce 75 mg/kg GVG w znacznym stopniu blokuje fazę nabywania wywołanego nikotyną CPP (tabela XV).

T a b e l a XIV

Wpływ roztworu soli oraz GVG na wyrażanie reakcji warunkowej preferencji miejsca na 0,4 mg/kg podawanej podskórnie (-)-nikotyny

Podawane pary¹	Lek podawany w dniu badania	Czas spędzony w komorach (min)
Łączenie w pary	Brak łączenia pary²
1	2	2	4
Solanka/solanka	solanka²	7,4 ± 0,3¹	7,6 ± 0,3
Solanka/nikotyna	solanka	9,6 ± 0,6	5,4 ± 0,6
Solanka/nikotyna	GVG, 18,75 mg/kg³	7,5 ± 0,7*	7,5 ± 0,7

PL 198 789 B1 cd. tabeli XIV

1	2	3	4
Solanka/nikotyna	GVG, 37,5 mg/kg	6,8 ± 1,0**	8,2 ±1,0
Solanka/nikotyna	GVG, 75 mg/kg	6,4 ± 0,3**	8,6 ± 0,3
Solanka/nikotyna	GVG, 150 mg/kg	5,0 ± 0,9**	10,0 ± 0,9

¹Każda wartość oznacza średnią liczbę minut, spędzonych w każdej komorze ± S.E.M. (standardowy błąd średniej). Ogółem dla każdej podawanej pary badano 8-10 szczurów. Wszystkim zwierzętom podawano 8 par z nikotyną i roztworem soli przed dniem badań. W dniu badań zwierzętom podawano albo roztwór soli, albo GVG 2,5 godziny przed umieszczeniem w urządzeniu CPP. ²Solanka oznacza 1 cm³/kg podawanej podskórnie 0,9% solanki.

*Znacznie krótszy niż w przypadku pary roztwór soli/nikotyna z podawaniem roztworu soli w dniu badań, P <0,05, ANOVA i test Studenta-Newmana-Keulsa.

**Znacznie krótszy niż w przypadku pary roztwór soli/nikotyna z podawaniem roztworu soli w dniu badań, P<0,01, ANOVA i test Studenta-Newmana-Keulsa.

T a b ela XV

Wpływ roztworu soli oraz GVG na nabywanie reakcji warunkowej preferencji miejsca na 0,4 mg/kg podawanej podskórnie (-)-nikotyny

Podawane pary	Czas spędzony w komorach (min)
Łączone w pary	Nie łączone w pary
Solanka/solanka²	7,2 ± 0,3¹	7,7 ± 0,3
Solanka/nikotyna	9,6 ± 0,61	5,4 ± 0,6
Nikotyna/GVG, 37,5 mg/kg i.p.	8,8 ± 0,5	6,2 ± 0,5
Nikotyna/GVG, 75 mg/kg i.p.	6,9 ± 0,9*	8,1 ± 0,9

¹Każda wartość oznacza średnią liczbę minut, spędzonych w każdej komorze ± S.E.M. (standardowy błąd średniej). Ogółem dla każdej podawanej pary badano 8-10 szczurów. Zwierzętom wstępnie zarówno solankę jak i 37,5 lub 75 mg/kg GVG i.p., a w 2,5 godziny później każde ze zwierząt otrzymało 0,4 mg/kg nikotyny s.c., z wyjątkiem jednej grupy, w której podano solankę, a następnie parę z roztworem soli (para solanka/solanka).

²Solanka oznacza 1 cm³/kg podawanej podskórnie 0,9% solanki.

Badania PET naczelnych

Do wszystkich badań obrazowania wykorzystano dorosłe żeńskie osobniki pawianów (n = 16) (Papio anubis, 13-18 kg) oraz rakloprid znakowany węglem-11 (¹¹C-rakloprid). Zwierzęta rozmieszczono w 5 grupach, przedstawionych szczegółowo w tabeli XVI. Zwierzętom kontrolnym (grupa 1) dwukrotnie wstrzykiwano ¹¹C-rakloprid bez jakiejkolwiek interwencji leku w celu określenia zmienności test/ponowny test w pomiarach. Dane te przedstawiono uprzednio (Dewey i in., 1998). Grupie 2 zwierząt podawano sam GVG (300 mg/kg) 2,5 godziny przed drugim wstrzykiwaniem ¹¹C-raklopridu. Podobnie jak dla grupy 1 zwierząt, te dane również przedstawiono uprzednio (Dewey i in., 1992). Grupie 3 zwierząt podawano samą nikotynę (w sumie 0,3 mg, około 0,02 mg/kg) 30 minut przed drugim wstrzykiwaniem ¹¹C-raklopridu. W kombinowanych badaniach GVG/nikotyna GVG podawano dożylnie (i.v.) w dawkach, wynoszących 100 (grupa 4) lub 300 mg/kg (grupa 5) 2,5 godziny przed podaniem nikotyny. Nikotynę (w sumie 0,3 mg, dożylnie) podawano 30 minut przed drugim wstrzykiwaniem ¹¹C-raklopridu. Przez okres badań pobierano próbki krwi tętniczej i wydzielone próbki plazmy analizowano na obecność niezmienionego ¹¹C-raklopridu. Między wstrzykiwaniami izotopu nie usuwano zwierząt z pomostu. Analizę danych przeprowadzano z zastosowaniem metody Logana, opisanej wcześniej szczegółowo (Logan i in., 1990).

Każdemu naczelnemu (n=16) dwukrotnie wstrzykiwano ¹¹C-rakloprid. Pierwsze wstrzykiwanie służyło jako podstawa odniesienia dla drugiego, które następowało po podaniu GVG, nikotyny lub obydwu tych substancji. Testowanym/ponownie testowanym naczelnym (n=7, grupa 1, tabela XVI) podawano placebo (0,9% roztwór soli, 1 cm³/kg) 30 min przed drugim wstrzyknięciem znacznika promieniotwórczego w celu określenia zmienności test/ponowny test tej metody. Wszystkim pozostałym naczelnym (n=9) podawano przez wstrzykiwanie układowe GVG, nikotynę lub obydwie te substancje przed drugim wstrzykiwaniem ¹¹C-raklopridu.

Doniesiono wcześniej (Dewey i in. 1998), że zmienność stosunku średniej objętości rozkładu (DV) test/ponowny test znakowanego raklopridu w prążkowiu naczelnych była niewiele większa od 7%

PL 198 789 B1 (tabela XVII). Podawanie GVG (300 mg/kg, grupa 2) znacznie podwyższało średni stosunek DV o 18% (tabela XVII). Dane te są zgodne z badaniami mikrodializy, dowodzącymi, że GVG w zależności od dawki obniża poziomy pozakomórkowej DA u swobodnie poruszających się zwierząt. Podawanie nikotyny (grupa 3) wywołało jednak przeciwny skutek GVG i znacznie obniżyło średni stosunek DV o 12% (tabela XVII). Jest to znów zgodne z naszymi danymi z mikrodializy, dowodzącymi, że nikotyna podwyższa poziomy pozakomórkowej DA u swobodnie poruszających się zwierząt. Po następczym podaniu GVG (100 mg/kg, grupa 4) usuwał obniżenie średniego stosunku DV, wywołane samą nikotyną (grupa 3). Przy tej dawce GVG średni stosunek DV był podobny do wartości test/ponowny test, uzyskanej w grupie 1 zwierząt (9%, tabela XVII). Jeśli jednak podawanego w dawce 300 mg/kg (grupa 5), to średni stosunek DV dla znakowanego raklopridu był znacznie wyższy (15%) od wartości test/ponowny test i w rzeczywistości był podobny do wartości, uzyskiwanych w grupie 2 zwierząt, którym podawano sam GVG (tabela XVII).

Stwierdzono, że GVG, nikotyna, lub obydwie te substancje nie zmieniają prędkości układowego metabolizmu znakowanego raklopridu, ani regionalnego rozkładu znacznika promieniotwórczego. Nawrót z każdego badania był niezauważalny.

T a b e l a XVI

Grupy do badań PET naczelnych

Grupa	Warunki
1	Test/ponowny test (bez prowokacji)
2	GVG (300 mg/kg)
3	Nikotyna (0,3 mg)
4	GVG (100 mg/kg), nikotyna (0,3 mg)
5	GVG (300 mg/kg, nikotyna (0,3 mg)

T a b e l a XVI

Wpływ prowokacji lekiem na średni stosunek DV

Grupa	% zmiany średniego stosunku DV
1	7,16 ± 1,2
2	18,8 ± 3,2
3	-12,3 ± 2,6
4	9,45 ± 2,1
5	15,1 ± 2,8

Dyskusja wyników doświadczalnych, uzyskanych w przykładzie 9

W tym przykładzie udowodniliśmy, że nikotyna (0,4 mg/kg podskórnie) podwyższa DA w NACC o około 100% (albo do 200% powyżej poziomu podstawowego) u swobodnie poruszających się zwierząt około 80 minut po jej podaniu. Poprzednie badania mikrodializy donosiły, że podawanie nikotyny w dawkach 0,6 lub 0,8 mg/kg (podskórnie) powodują odpowiednio 220% i 179% wzrost poziomów pozakomórkowej DA w NACC (Di Chiara i Imperato, 1988; Imperato i in., 1986; Brazell i in., 1990). Chociaż bezpośrednio nieporównywalne, nasze wyniki są wyraźnie w jednym szeregu z tymi wcześniej uzyskanymi danymi. Ponadto u naszych zwierząt, długotrwale poddawanych działaniu nikotyny, prowokacja nikotynowa wywoływała 90% wzrost poziomów pozakomórkowej DA w NACC. To odkrycie jest zgodne z uprzednimi danymi, wskazującymi, że długotrwałe podawanie nikotyny nie wywołuje tolerancji ani uczulenia na ostrą prowokację nikotynową (Damsma i in., 1989).

W odniesieniu do danych uzyskanych przez nas z użyciem GVG wykazaliśmy, że zależnie od dawki powstrzymuje on wywołane nikotyną podwyższenia DA w DACC zarówno u zwierząt nie stykających się dotąd z tym bodźcem, jak i u tych, którym dłuższy czas podawano nikotynę. Są to pierwsze badania, donoszące o takich działaniach GVG. GVG podany w dawce 75 mg/kg nie skutkuje, gdy nikotyna podwyższa pozakomórkową DA o prawie 200%, ale w dawce 90 mg/kg powoduje powstrzymywanie prawie 50%. Podawany w dwóch najwyższych dawkach (100 i 150 mg/kg) GVG całkowicie usuwa wywołane nikotyną podwyższenia poziomów DA w NACC. Uprzednio wykazaliśmy, że ostre

PL 198 789 B1 wstrzykiwanie GVG (300 mg/kg wewnątrzotrzewnowo) wywołuje 25% obniżenie wywołanych kokainą podwyższeń DA w NACC (Dewey i in., 1998). Jednakże długotrwałe podawanie GVG w podobnych dawkach powoduje większe powstrzymywanie (Morgan i Dewey, 1998). Dane te razem wykazują, że dawki GVG, potrzebne do znacznego osłabienia wywołanych lekami podwyższeń poziomów DA w NACC zależą nie tylko od leku użytego do prowokacji (np. kokainy, nikotyny), ale również od dawek, w których podaje się ten prowokujący lek.

Niniejsze dane wykazują dalej, że skuteczność działania GVG jest związana z jego zależną od dawki zdolnością do obniżania podstawowych stężeń DA przed prowokacją lekami. Na przykład dawka 75 mg/kg nie wpływała na podstawowe stężenia DA oraz na wywołane nikotyną podwyższenia DA. Natomiast w dawkach 90 lub 100 mg/kg GVG obniżał podstawowe poziomy DA i odpowiednio zmniejszał o 50% albo usuwał skutki działania nikotyny. Wydaje się, że zależne od dawki osłabianie wywołanych nikotyną lub kokainą podwyższeń DA w NACC jest powodowane wstępnym obniżaniem podstawowych stężeń DA, wynikającym ze wzrostu endogennego GABA, wytwarzanego przez GVG. Jest to zgodne z danymi, wskazującymi, że powiększenie czynności GABAergicznych obniża DA w NACC.

Rozszerzając nasze poprzednie prace nad GVG i kokainą badaliśmy przebieg w czasie skutków działania GVG na wywołane nikotyną podwyższenia DA w NACC u zwierząt, którym długotrwale podawano nikotynę przez 21 dni. GVG podawany 2,5 godz. przed nikotyną w dawce 100 mg/kg całkowicie usuwał wywołany lekiem wzrost DA w NACC. Jeśli jednak podawano go 12 godzin przed prowokacją, to nikotyna podwyższała pozakomórkową DA o około 25%.

GVG nie wpływał na wywoływane nikotyną podwyższenia DA w NACC, gdy podawano go w tej samej dawce 24 godziny przed prowokacją nikotynową. Nasze dane z badań mikrodializy oraz odnoszących się do zachowań wyraźnie wykazują, że nawet małe zmiany w powstrzymywaniu GABA-T, wywołane przez podwyższenie dawek GVG, mają głęboki wpływ na powstrzymywanie wywołanych nikotyną podwyższeń odpowiednio DA w NACC oraz CPP.

Dane te są szczególnie interesujące w świetle prędkości syntezy GABA-T, okresu półtrwania GVG w mózgu gryzoni, czasu trwania wpływu na GABA oraz podanej tu krzywej odpowiedzi na ostrą dawkę. Uprzednio uzyskane dane wykazują, że biologiczny okres półtrwania GAB-T w mózgu gryzoni wynosi 3,4 dnia, podczas gdy okres półtrwania GVG w tym mózgu wynosi około 16 godzin. Ponadto ogólne poziomy GABA w tym mózgu nie zaczynają obniżać się aż do 24 godzin, upływających po ostrym podaniu GVG (Jung i in., 1977). Niewspółmierność między długotrwałymi poziomami GABA w mózgu, mierzonymi po upływie 24 godzin od podania pojedynczej dawki GVG, i normalną reakcją na prowokację nikotynową, obserwowanymi w tym samym punkcie czasowym, sugeruje, że GABAergiczne powstrzymywanie dróg nagradzania w środkowokresomózgowiu może nie stanowić prostego odzwierciedlenia ogólnych poziomów GABA w mózgu. Oznacza to, że chociaż ogólne poziomy GABA w mózgu są nadal znacznie podwyższone po 24 godzinach od podania ostrej dawki GVG, to małe różnice czynnościowe w poszczególnych drogach mogą być maskowane tymi ogólnymi pomiarami. Jest możliwe, że receptory GABA stały się niewrażliwe na GABA w okresie czasu, wynoszącym 24 godziny.

W niniejszych badaniach udowodniliśmy, że 8 połączeń w pary roztworu soli i nikotyny wywoływało wiarygodne reakcje CPP. Nasze wyniki są zgodne z poprzednimi badaniami, wykazującymi, że nikotyna (0,1-1,12 mg/kg podskórnie) wywołuje zależne od dawki reakcje CPP męskich osobników zwierząt ze szczepu Sprague-Dawley (Fudala i in., 1985; Fudala i Iwamoto, 1986). Wykazaliśmy również, że zwierzęta rasy Lewis, ale nie zwierzęta odmiany F344, wykazują reakcje CPP na nikotynę po 10 łączeniach w pary (Horan i in., 1977). Poprzednie doniesienia wykazały jednak, ze 4 łączenia w pary nikotyna-rozczynnik nie wywoływały reakcji CPP u męskich osobników szczurów kapturowych (Clarke i Fibiger, 1987). Wydaje się więc, że wywoływane nikotyną CPP mogą być zależne od gatunku, choć może to być podważone faktem, że w przytoczonych badaniach stosowano różne liczby łączeń w pary. Wywołane nikotyną reakcje CPP, przedstawione w niniejszych badaniach, są zgodne z wyobrażeniem, że nikotyna wywiera dodatni wpływ na pobudzające motywacyjne zachowania.

Dane te po raz pierwszy dowodzą, że GVG może blokować biochemiczne i odnoszące się do zachowań skutki działania nikotyny, z zastosowaniem wzorca CPP. Dane CPP wyraźnie wykazują, że GVG w dawce tak niskiej, jak 18,75 mg/kg usuwa wyrażanie reakcji CPP, wywołanej przez nikotynę. Nasze dane wykazują również, iż dawka 75 mg/kg, chociaż nie dawka 37,5 mg/kg, blokuje nabywanie reakcji CPP na nikotynę. Na podstawie tych uzyskanych danych dawka GVG, niezbędna do leczenia zaprzestania palenia może wynosić ogółem 250-500 mg/dzień (w porównaniu z dawką 2-4 g/dzień w przypadku padaczki), czyli w zakresie znacznie niższym od podawanego epileptykom.

PL 198 789 B1

Skutków działania GVG na wywołane nikotyną CPP nie można wiązać z powodowaniem działania nagradzającego lub zniechęcającego, ponieważ uprzednio wykazaliśmy, że GVG sam (75-300 mg/kg wewnątrzotrzewnowo) nie powoduje CPP lub niechęci (Dewey i in., 1998). Ponadto jest nieprawdopodobnie, aby GVG usuwał wywołane nikotyną czynności odnoszące się do zachowań przez ingerowanie w pamięć lub czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce, ponieważ GVG nie blokuje czynności nagradzania żywnością ani czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce nawet w tak wysokich dawkach, jak 300 mg/kg (Dewey i in., 1998).

Wykazano wreszcie, że GVG nie jest samodzielnie zażywany przez małpy rezusy i odstawienie zwierząt od długotrwałego podawania GVG nie przejawia się sygnałami lub objawami odstawienia (Takada i Yanagita, 1997). Tak więc GVG, w odróżnieniu od innych leków stosowanych w farmakoterapii niektórych uzależnień (np. metadonu, antabuse), sam nie jest uzależniający i nie wywołuje istotnych wzbudzających niechęć skutków działania.

Osłabianie nabywania reakcji-CPP na nikotynę przez GVG można interpretować jako obniżenie dodatnich pobudzających wartości nikotyny. Dane te wykazują, że GVG obniża prawdopodobieństwo, że zwierzęta będą nabywały skojarzeń dodatniego skutku pobudzającego po podaniu nikotyny. Ciekawe jest, że nasze wyniki wskazują, iż dawka GVG, wymagana do zablokowania fazy wyrażania reakcji CPP powodowanej przez nikotynę wynosiła 1/4 dawki, niezbędnej do zablokowania nabywania tej reakcji CPP. To odkrycie jest zgodne z naszymi wcześniejszym danymi, wykazującymi, że wyższe dawki są wymagane do zablokowania nabywania niż do wyrażania CPP powodowanego kokainą (Dewey i in. 1998). Wyjaśnienie tej różnicy nie jest znane. GVG osłabia wyrażanie reakcji CPP na nikotynę, co dowodzi, że GVG obniża zachowania poszukujące leku u zwierząt, ponieważ zwierzęta te już przyswoiły sobie dodatnie pobudzające wartości tego leku.

Nasze dane wykazują więc, że GVG może być bardziej skuteczny w blokowaniu głodu nikotyny, niż ma to miejsce w blokowaniu dodatnich pobudzających wartości lub nagradzającego działania nikotyny. Wreszcie w najwyższej badanej dawce, 150 mg/kg, GVG wywoływał znaczną reakcję niechęci w dniu badań (tabela XV), gdy zwierzęta opędzały 5,0+0,9 minut, po stronie łączenia par (nikotyny) i 10,0+0,9 minut po stronie bez łączenia par (roztwór soli). Dane te sugerują, że może występować pułapowy (maksymalny) skutek, przy którym GVG w wysokich dawkach staje się wzbudzającym niechęć u zwierząt, którym podawano nikotynę i które badano w stanie wolnym od leku. Dane te mogą nasuwać myśl o przesunięciu w górę granicznych dawek do badań w klinicznych próbach u ludzi.

Na podstawie naszej znajomości wzorca CPP można stwierdzić, że nasze dane potwierdzają następujące wyniki. We wzorcu CPP zwierzęta są badane w stanie wolnym od leku w celu określenia, czy wyróżniają one środowisko, w którym uprzednio podawano im nikotynę, w porównaniu ze środowiskiem, w którym uprzednio podawano im roztwór soli. Jeśli te zwierzęta w stanie wolnym od leku zgodnie wybierają środowisko, związane uprzednio z nikotyną, to wyciąga się wniosek, że wzbudzające głód wartości nikotyny zostały zakodowane w mózgu i są dostępne w stanie wolnym od leku (Gardner, 1997). W rzeczywistości w dniu badań zbliżenie i powiązanie zwierząt ze stroną łączenia par z lekiem można uważać za zachowanie poszukujące leku. W sumie bodźce środowiskowe i inne sygnały, które poprzednio były obojętne lub wykazywały brak wydatności, stawały się wydatne przez powtarzanie łączenia w pary z nikotyną. Jeśli następnie zwierzęta te ponownie wystawiono na działanie tych sygnałów, wytwarzały się reakcje CPP, tj. sygnały te mogły wywoływać skutek działania leku. Sygnały związane z lekami wywołują więc uwarunkowane reakcje (odruchy warunkowe) Pawłowa.

Jest to decydujące, ponieważ wiadomo, że czynniki niefarmakologiczne oprócz czynników farmakologicznych odgrywają rolę w pośredniczeniu w pobudzających wartościach uzależniających leków (Jarvik i Henningfield, 1988). W istocie udowodniono klinicznie, że u odtrutych narkomanów wystawienie ich na bodźce, które poprzednio były związane z zażywaniem narkotyków, może wywołać nawrót do nałogu (Childress i in., 1986 a,b; Childress i in., 1988; Ehrman i in., 1992; O'Brien i in., 1992; Wikler, 1965). Dane te wykazują więc, że w związku z tym, iż GVG blokuje wyrażanie wywołanych nikotyną reakcji CPP, to blokuje on zatem głód lub poszukiwanie nikotyny. GVG jest wiec skuteczny w leczeniu osób, które pragną przestać palić papierosy. Dane te wykazują dalej, że GVG skutecznie działa w usuwaniu wyrażania reakcji CPP na nikotynę i może osłabiać głód w obecności sygnałów środowiskowych, związanych uprzednio z paleniem.

Nasze dane PET dla naczelnych są zgodne z wcześniej uzyskanymi danymi z zastosowaniem wielokrotnych farmakologicznych prowokacji, które wykazały, że wiązanie ¹¹C-raklopridu jest wrażliwe zarówno na podwyższenia, jak i obniżenia synaptycznej DA (Dewey i in., 1993; Seeman i in., 1989).

W grupie 3 zwierząt (tabela XVII) dowiedziono, że średni stosunek DV konsekwentnie obniżał się

PL 198 789 B1 w odniesieniu do wartości podstawowych w następstwie podawania nikotyny. To obniżenie przekraczało zmienność test/ponowny test znakowanego raklopridu i było mniejsze od obniżenia, zmierzonego przy użyciu GBR-12909 (Dewey i in., 1993) lub skopolaminy (Dewey i in., 1993). Uprzednie podanie GVG w dawce 100 mg/kg 2,5 godziny przed nikotyną powodowało, że średni stosunek DV był podobny, jak w grupie 1 zwierząt (tabela XVII). Jeśli jednak dawkę GVG podwyższano do 300 mg/kg, to średni stosunek DV wzrastał do wartości zgodnej z grupą 2 zwierząt. Dane te wykazują, że niższa dawka GVG powodowała obniżenie synaptycznej DA z grubsza równoważnie do podwyższenia, wywołanego nikotyną, natomiast wyższa dawka GVG powodowała obniżenie, które mocno przekraczało zdolność nikotyny do podwyższania DA. Nasze badania mikrodializy potwierdzają te dane, że wyższe dawki GVG wywołują większe obniżenie pozakomórkowej DA u swobodnie poruszających się zwierząt.

Dane uzyskane z dializy i PET, połączone z danymi CPP, wykazują, że same podwyższenia DA w NACC są podstawą ryzyka uzależnienia od nadużywanych leków. Po pierwsze, dane te, połączone z wyżej przedstawionymi danymi dla kokainy, wykazują, że badania mikrodializy in vivo lub pomiary PET samej endogennej DA niekoniecznie orzekają o skuteczności działania leków, stosowanych do leczenia chorób, mimo, że mają one charakter specyficznie związany z przekaźnikami nerwowymi. Po drugie, obydwa rodzaje danych, dane z mikrodializy i PET, wyraźnie dowodzą, że GVG w dawce 100 mg/kg całkowicie blokował wywoływane nikotyną podwyższenia poziomów DA w NACC, podczas gdy dawka 75 mg/kg nie wywierała żadnego wpływu. Natomiast GVG w niskiej dawce, wynoszącej 18,75 mg/kg, całkowicie usuwał fazę wyrażania wywołanego nikotyną CPP, podczas gdy do usunięcia fazy nabywania potrzebna była dawka 75 mg/kg.

Na podstawie krzywej odpowiedzi na dawkę, uzyskanej z danych z mikroanalizy, nie można byłoby oczekiwać, że GVG w dawce 18,75 mg/kg będzie miał jakikolwiek wpływ na wywołane nikotyną podwyższenia DA w NACC. Ponadto podobny skutek stwierdzono z użyciem kokainy, gdzie GVG w dawce 300 mg/kg obniżał wywołane kokainą podwyższenia poziomów DA w NACC o 25%, podczas gdy w dawce 150 mg/kg całkowicie usuwał fazy wyrażania i nabywania wywołanego kokainą CPP (Dewey i in., 1997; 1998).

W sumie dane te sugerują przynajmniej dwa możliwe do przyjęcia i być może połączone objaśnienia. Po pierwsze, różnicowe zmiany DA w następstwie farmakologicznej prowokacji w obszarach innych niż same NACC mogą być odpowiedzialne za ryzyko uzależnienia od danego leku. Istotnie były doniesienia, że różne uzależniające leki mogą zmieniać poziomy DA w obszarach mózgu innych niż NACC, w tym w jądrze migdałowatym, prążkowiu i czołowej korze (Hurd i in., 1997; Dewey i in., 1997; Di Chiara i Imperato, 1998; Marshall i in., 1997). Po drugie, przekaźniki nerwowe inne niż DA mogą odgrywać ważną rolę w ryzyku uzależnienia od nadużywanych leków. Na przykład reakcje CPP na kokainę nadal utrzymują się u myszy, którym brakuje przenośników DA i 5-HT (Sora i in., 1998; Rocha i in.; 1998). Wiadomo ponadto, że przekaźniki nerwowe, takie jak 5-MT, acetylocholina, enkefaliny i glutaminiany, odgrywają rolę w pośrednictwie skutków działania uzależniających leków, w tym nikotyny (Bardo, 1998; Gardner, 1997). Razem wziąwszy dane te wykazują, że GVG powstrzymuje skutki działania kokainy i nikotyny przez zmiany DA w obszarach innych niż NACC. Równocześnie GVG może powstrzymywać inne przekaźniki nerwowe, które albo modulują DA bezpośrednio, albo same są związane z pośredniczeniem skutków działania uzależniających leków. Prowadzi się dalsze badania, zaplanowane dla oceny wielorakich skutków działania GVG na inne przekaźniki nerwowe.

Wcześniej dowodziliśmy, że zdolność GVG do osłabiania wywołanych kokainą podwyższeń DA w NACC jest całkowicie usuwana przez uprzednie podawanie zwierzętom selektywnego antagonisty receptora GABAB, SCH 50911 (Bolser i in., 1995), leku, który podawany sam nie zmienia znacznie poziomów DA. Można wiec wykazać, że GVG usuwa działanie nikotyny przez podwyższenie poziomów GABA, które następnie pobudzają receptory GABAB. Jest to zgodne z danymi, wykazującymi, że podawanie baklofenu, selektywnego agonisty GABAB (Bovery i Pratt, 1992; Kerr i in., 1990) do VTA znacznie obniża reakcje CPP u zwierząt, wywołane układową morfiną (Tsuji i in., 1995). Ponadto układowe podawanie baklofenu obniża samodzielne zażywanie kokainy w stosunku postępującym i dyskretnym schemacie prób (Roberts i in., 1996, 1997).

Można wnioskować, że GVG osłabia farmakologiczne i odnoszące się do zachowań działania nikotyny po prostu przez zmienianie ilości, która efektywnie dostaje się do mózgu, albo przez zmianę przepuszczalności bariery krew-mózg, albo przez podwyższanie układowej prędkości metabolizmu nikotyny. Takie ewentualności są nieprawdopodobne z wielu powodów. Po pierwsze, GVG nie wpływał na transport przez barierę krew-mózg ¹¹C-kokainy, alkaloidu, który - jak wcześniej wykazano - podwyższa DA w NACC, zarówno w mózgu gryzoni, jak i w mózgu naczelnych. Po drugie, GVG jest wydalany

PL 198 789 B1 głównie w niezmienionej postaci przez nerki (Grant i Heel, 1991; Porter i Meldrum, 1998), podczas gdy nikotynę metabolizują enzymy w wątrobie. Wreszcie GVG nie oddziaływuje wzajemnie z mikrosomowymi enzymami wątrobowymi (Grant i Heel, 1991; Porter i Meldrum, 1998), a więc nie mógłby pobudzać lub powstrzymywać tych enzymów.

Rozmiary NACC leżą znacznie poniżej zdolności rozdzielczej naszego tomografu, stawiając ich specyficzną analizę poza możliwościami tej techniki. Dlatego też nasze analizy obejmowały prążkowie dwustronnie oraz móżdżek. Marshall i in. (1995) dowodzili, że nikotyna podwyższa DA jednakowo w NACC i w prążkowiu, podczas gdy nasze własne dane z mikrodializy udowadniały, że GVG obniża stężenia DA również jednakowo w obydwóch tych obszarach (Dewey i in., 1997). Te dane dla naczelnych dalej podtrzymują stosowanie tej techniki obrazowania do oceny czynnościowych skutków farmakologicznych prowokacji w nietkniętym żywym mózgu.

Ponadto ta medyczna technika obrazowania zapewnia unikalny wgląd w oddziaływania, istniejące - jak to wykazano - między czynnościowo powiązanymi przekaźnikami nerwowymi zarówno w mózgu naczelnych, jak i w mózgu ludzkim.

W połączeniu z wyczerpującą literaturą, potwierdzającą podstawowe zasady wzajemnego oddziaływania przekaźników nerwowych w obydwu ogniskach neuroanatomicznych, specyficznym czynnościowo i specyficznym obszarowo, staje się coraz bardziej jasne, że nowe strategie leczenia zaburzeń mózgowych (w tym uzależnień od kokainy, nikotyny, heroiny, metamfetaminy i alkoholu) mogą być uzupełnione szerszą świadomością tych dobrze udokumentowanych podstawowych zasad. O ile zmiany stężeń poszczególnych przekaźników nerwowych mogą być rzeczywiście podstawą etiologii specyficznych zaburzeń, to jest prawdopodobne, że postępy chorób i rozwój objawów są związane z wyrównawczymi lub wywołującymi choroby zmianami w innych przekaźnikach nerwowych, czynnościowo związanych z początkowymi obiektami. Mając tę wiedzę rozwinęliśmy nowe strategie leczenia, w szczególności zaplanowane w celu zmieniania jednego lub większej liczby przekaźników nerwowych przez atakowanie innych. Uzyskane przez nas dane z użyciem nikotyny, kokainy, metamfetaminy, alkoholu i GVG reprezentują dużą przydatność do leczenia ssaków, uzależnionych od nadużywanych leków.

P r z y k ł a d 10

Skutki działania GVG na wywołane metamfetaminą podwyższenia DA w NACC

W tym przykładzie badano skutki działania GVG na wywołane przez metamfetaminę zmiany stężeń dopaminy w NACC u 6-8 swobodnie poruszających się szczurów. Zwierzętom podawano metamfeteminę w dawkach 1,25 mg/kg wewnątrzotrzewnowo i 2,5 mg/kg wewnątrzotrzewnowo. Stwierdzono, że metamfetamina podwyższała stężenia pozakomórkowej DA w NACC o około 2500% ponad poziomy podstawowe po upływie 100 minut od podania 2,5 mg/kg i o około 1500% ponad poziomy podstawowe po podaniu 1,25 mg/kg (fig. 6). DA wracała do poziomów podstawowych po upływie około 200 minut od podania.

Jeśli GVG podawano przed podawaniem metamfetaminy, to GVG zależnie od dawki powstrzymywał wzrost DA, jak to przedstawiono na fig. 7. W dawce 300 mg/kg GVG powstrzymywał podwyższenia DA o około 38%, a w dawce 600 mg/kg powstrzymywał podwyższenia DA o około 58%. Dane te dowodzą, że GVG powstrzymuje powodowane metamfetaminą podwyższenia stężeń pozakomórkowej dopaminy w NACC.

Na podstawie powyższych danych stwierdza się więc, że kolejność klasyfikacji nikotyny, kokainy i metamfetaminy w odniesieniu do podwyższania DA w NACC jest następująca: metamfetamina (2500%) > kokaina (450%) > nikotyna (90%), co odpowiada kolejności klasyfikacji wielkości ostrej dawki GVG, potrzebnej do znacznego obniżenia wywołanego tymi lekami podwyższeń DA w NACC.

P r z y k ł a d 11

Skutki działania GVG na wywołane etanolem podwyższenia DA w NACC

W tym przykładzie badano skutki działania GVG na wywołane przez etanol zmiany stężeń dopaminy w NACC u 6-8 swobodnie poruszających się szczurów. Zwierzętom podawano etanol w dawce 1,0 g/kg wewnątrzotrzewnowo. Etanol podwyższał stężenia pozakomórkowej DA w NACC o około 200% ponad poziomy podstawowe po upływie około 125 minut od podania etanolu.

Jeśli GVG podawano w dawce 300 mg/kg, to powstrzymywał on wzrost DA o około 50% (fig. 8).

Również w dawce 100 mg/kg GVG znacznie obniża (o około 40%) zdolność alkoholu do podwyższania poziomów dopaminy w jądrach półleżących u swobodnie poruszających się szczurów (danych nie przedstawiono). Dane te dowodzą, że GVG po wstrzymuje powodowane etanolem podwyższenia stężeń pozakomórkowej dopaminy w NACC.

PL 198 789 B1

P r z y k ł a d 12

Skutki działania GVG na wywołane mieszaniną kokainy i heroiny podwyższenia DA w NACC

W tym przykładzie badaliśmy skutki działania GVG na synergiczne podwyższenia DA w NAc po prowokacji mieszaniną kokainy i heroiny (szybka pohulanka). Przeprowadzono badania mikrodializy in vivo z wykorzystaniem dorosłych męskich osobników szczurów szczepu Sprague-Dawley (farmy Taconic), jak to uprzednio przedstawiono (Morgan i Dewey, 1998). Kokainę, inhibitor ponownego wychwytu dopaminy, podawano (wewnątrzotrzewnowo, i.p.) (n=6-8) w dawkach 20 mg/kg, natomiast heroinę, środek bezpośrednio uwalniający dopaminę, podawano (wewnątrzotrzewnowo, i.p.) (n=6-8) w dawkach 0,5 mg/kg. W badaniach zaplanowanych dla zbadania synergicznych skutków działania mieszanin kokainy i heroiny (n=6-8) oba leki podawano w takich samych dawkach, jakie stosowano w badaniach pojedynczych leków. Sama kokaina powodowała znaczne podwyższenie poziomów pozakomórkowej DA o około 380% ponad wartości poziomów podstawowych po upływie 60 minut od podania. DA wracała do poziomu podstawowego w ciągu 120 minut. Natomiast heroina podwyższała DA w NAc tylko o 70% po upływie 60 minut od podania. Powrót do poziomu podstawowego następował w ciągu 140 minut. Jeśli jednak obydwa leki zmieszano, to powodowały one podwyższenie DA w NAc o około 1000% po upływie 180 minut od podania. Powrót do wartości poziomów podstawowych nie następował jeszcze po upływie 200 minut od osiągnięcia wartości maksymalnej (fig. 9). Takie podwyższenie różniło się znacznie (P>0,001) od powodowanego przez samą kokainę lub heroinę.

Neurochemiczna synergia w porównaniu ze skutkami addytywnymi została dowiedziona nie tylko na podstawie wielkości wzrostu DA w NAc, ale również na podstawie czasu, zużytego na osiągnięcie maksymalnego podwyższenia oraz na powrót do wartości poziomów podstawowych. Każdy lek indywidualnie powodował maksymalne podwyższenie w ciągu 60 minut po prowokacji. Natomiast w przypadku ich mieszaniny osiągnięcie tego maksymalnego podwyższenia wymagało prawie trzykrotnie dłuższego czasu, niż dla każdego leku osobno. Ponadto znacznie dłużej trwał powrót do wartości poziomu podstawowego w porównaniu z każdym lekiem osobno. Te uzyskane dane wskazują, że czas trwania euforii jest znacznie dłuższy wówczas, gdy obydwa narkotyki stosuje się w mieszaninie, niż wówczas, gdy stosuje się je osobno.

W odniesieniu do bezwzględnej wielkości reakcji GVG całkowicie usuwa synergiczne efekty, będące następstwem prowokacji mieszaniną tych leków. U zwierząt, którym podawano GVG (300 mg/kg wewnątrzotrzewnowo) 2,5 godziny przed prowokacją, DA w NAc wzrastała o około 500% po upływie 180 minut od prowokacji (fig. 9). To podwyższenie znacznie różniło się między obydwu podwyższeniami powodowanymi samą kokainą i heroiną (odpowiednio P>0,05 i 0,001) oraz mieszaniną kokainy i heroiny (P>0,001). Dane uzyskane po wstępnym podaniu GVG są podobne do addytywnego skutku działania kokainy (380%) i heroiny (70%) w porównaniu z efektem synergicznym.

Usuwając synergiczny efekt działania obydwu leków na bezwzględną wielkość podwyższenia GVG nie wpływał na czasowe aspekty reakcji. Po podaniu GVG i następującej po nim prowokacji mieszaniną kokainy i heroiny DA w NAc osiągała maksymalne stężenie w czasie 180 minut, który jest taki sam, jak czas reakcji, zmierzony u zwierząt, którym nie podawano GVG przed prowokacją.

Wyniki z tego przykładu wykazują, że GVG skutecznie osłabia synergiczne podwyższenia DA w NAc, wywołane przez prowokacje mieszaniną kokainy i heroiny. W połączeniu z naszymi wcześniejszymi badaniami to odkrycie wykazuje skuteczność działania GVG w leczeniu uzależnień wielolekowych.

Powyższe przykłady dowodzą, że leki, które są selektywne nakierowane na układ GABAergiczny, mogą być korzystne w leczeniu nadużywania leków, takich jak środki pobudzające psychikę, narkotyczne leki przeciwbólowe, alkohole i nikotyna lub ich kombinacji. Ściślej biorąc powodowane przez GVG powstrzymywanie GABA-T, które wywołuje podwyższanie poziomów pozakomórkowego GABA w mózgu, przedstawia skutecznie działający lek i nową strategię leczenia uzależnień od kokainy, nikotyny, heroiny, metamfetaminy i etanolu.

O ile więc przedstawiono tutaj to, co obecnie uważa się za korzystne rozwiązania niniejszego wynalazku, to specjaliści w branży będą zdawać sobie sprawę, że można opracować inne i dalsze rozwiązania, nie odchodząc od ducha niniejszego wynalazku, i zamierza się włączyć tu wszystkie takie dalsze modyfikacje i zmiany, jakie wchodzą w dokładny zakres przedstawionych tu zastrzeżeń.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie gamma-winyloGABA (GVG), jego farmaceutycznie tolerowanej soli albo jego enancjomeru, albo jego mieszaniny racemicznej do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierającej jako jedyną substancję aktywną GVG oraz ewentualnie zawierającej ponadto środki wspomagające, rozpuszczalniki lub nośniki, która to kompozycja jest podawana w skutecznie działającej ilości, wystarczającej do zmiany uzależnienia odnoszącego się do zachowań ssaków związanych z głodem co najmniej jednego nadużywanego leku, wybranego z grupy obejmującej kokainę, heroinę, metamfetaminę, nikotynę i alkohol etylowy.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kompozycja jest podawana w ilości wystarczającej do osłabienia, powstrzymania lub usunięcia zachowań, związanych z głodem kokainy, heroiny i metamfetaminy.

3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że kompozycję stosuje się bez reakcji wzbudzających niechęć do GVG lub głód GVG.

4. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że dawka dzienna GVG wynosi od 100 do 300 mg na kg masy ciała ssaka.

5. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że dawka dzienna GVG wynosi od 150 do 300 mg na kg masy ciała ssaka.

6. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że kompozycję stosuje się do zmiany uzależnienia odnoszącego się do warunkowej preferencji miejsca.

7. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że kompozycję stosuje się bez zmiany nagradzających/pobudzających skutków działania pożywienia u naczelnych.

8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że kompozycję stosuje się bez zmiany czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce u naczelnych.

9. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że kompozycję stosuje się do osłabienia, powstrzymania lub usunięcia zachowań związanych z głodem heroiny i metamfetaminy.

10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że ssak jest z rzędu naczelnych.

11. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że kompozycję stosuje się do obniżenia charakterystyk uzależnień od heroiny i metamfetaminy.

12. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że kompozycję stosuje się bez reakcji wzbudzających niechęć do GVG lub głód GVG.

13. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że charakterystyki uzależnień obniża się bez zmiany czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce u naczelnych

14. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że nadużywanym lekiem jest nikotyna.

15. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że kompozycję stosuje się bez reakcji wzbudzających niechęć do GVG lub głód GVG.

16. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że dawka dzienna GVG wynosi od 15 mg do 2 g na kg masy ciała ssaka.

17. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że dawka dzienna GVG wynosi od 15 do 600 mg na kg masy ciała ssaka.

18. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że dawka dzienna GVG wynosi od 100 do 300 mg na kg masy ciała ssaka.

19. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że dawka dzienna GVG wynosi od 75 do 150 mg na kg masy ciała ssaka.

20. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że ssak jest z rzędu naczelnych.

21. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że kompozycję stosuje się do zmiany uzależnienia odnoszącego się do warunkowej preferencji miejsca.

22. Zastosowanie według zastrz. 14 albo 20, znamienne tym, że kompozycję stosuje się do osłabienia, powstrzymania lub usunięcia nagradzająco/pobudzających zachowań związanych z używaniem nikotyny.

23. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że kompozycję stosuje się bez zmiany czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce u naczelnych.

24. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że kompozycję stosuje się bez zmiany nagradzających/pobudzających skutków działania pożywienia u naczelnych.

25. Zastosowanie według zastrz. 14 albo 20, znamienne tym, że kompozycję stosuje się do osłabienia, zahamowania lub usunięcia charakterystyk uzależnienia nikotynowego.

PL 198 789 B1

26. Zastosowanie według zastrz. 25, znamienne tym, że kompozycję stosuje się bez reakcji wzbudzających niechęć do GVG lub głód GVG.

27. Zastosowanie według zastrz. 25, znamienne tym, że kompozycję stosuje się bez zmiany czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce.

28. Zastosowanie według zastrz. 14 albo 20, znamienne tym, że kompozycję stosuje się do osłabienia, zahamowania lub usunięcia symptomów będących rezultatem przerwy lub odstawienia nikotyny.

29. Zastosowanie według zastrz. 28, znamienne tym, że kompozycję stosuje się bez reakcji wzbudzających niechęć do GVG lub głód GVG.

30. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kompozycję stosuje się do osłabienia, powstrzymania lub usunięcia zachowań, związanych z głodem lub stosowaniem co najmniej jednego nadużywanego leku, który stanowi dowolną kombinację nadużywanych leków, wybranych z grupy obejmującej kokainę, heroinę, metamfetaminę, nikotynę .i alkohol etylowy.

31. Zastosowanie według zastrz. 30, znamienne tym, że kompozycję stosuje się bez reakcji wzbudzających niechęć do GVG lub głód GVG.

32. Zastosowanie według zastrz. 30, znamienne tym, że kombinacją nadużywanych leków jest kokaina i heroina.

33. Zastosowanie według zastrz. 30, znamienne tym, że dawka dzienna GVG wynosi od 15 mg do 600 mg na kg masy ciała ssaka.

34. Zastosowanie według zastrz. 30, znamienne tym, że kompozycję stosuje się do zmiany uzależnienia odnoszącego się do warunkowej preferencji miejsca.

35. Zastosowanie według zastrz. 30 albo 32, znamienne tym, że kompozycję stosuje się bez zmiany nagradzających/pobudzających skutków działania pożywienia u ssaków.

36. Zastosowanie według zastrz. 35, znamienne tym, że nagradzająco/pobudzające skutki działania kombinacji nadużywanych leków, osłabia się bez zmiany czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce u ssaków.

37. Zastosowanie według zastrz. 30 albo 32, znamienne tym, że kompozycję stosuje się do obniżenia charakterystyk uzależnień od co najmniej jednego nadużywanego leku.

38. Zastosowanie według, zastrz. 37, znamienne tym, że kompozycję stosuje się bez reakcji wzbudzających niechęć do GVG lub głód GVG.

39. Zastosowanie według, zastrz. 37, znamienne tym, że kompozycję stosuje się bez zmiany czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce u ssaków.

40. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że do osłabienia, powstrzymania lub usunięcia zachowań, związanych z głodem lub stosowaniem nadużywanych leków wybranych z grupy obejmującej kokainę, heroinę, metamfetaminę, nikotynę i alkohol etylowy stosuje się kompozycję zawierającą racemiczną mieszaninę GVG lub enancjomer GVG.

41. Zastosowanie według zastrz. 40, znamienne tym, że kompozycję stosuje się bez reakcji wzbudzających niechęć do GVG lub głód GVG.

42. Zastosowanie według zastrz. 40, znamienne tym, że dawka dzienna GVG wynosi od 15 do 600 mg na kg masy ciała ssaka.

43. Zastosowanie według zastrz. 40, znamienne tym, że kompozycję stosuje się do zmiany uzależnienia odnoszącego się do warunkowej preferencji miejsca.

44. Zastosowanie według zastrz. 40, znamienne tym, że kompozycję stosuje się bez zmiany nagradzających/pobudzających skutków działania pożywienia u ssaków.

45. Zastosowanie według zastrz. 40, znamienne tym, że kompozycję stosuje się bez zmiany czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce u ssaków.

46. Zastosowanie według zastrz; 40, znamienne tym, że kompozycję stosuje się do obniżenia charakterystyk uzależnień od środków wybranych z grupy obejmującej kokainę, heroinę, metamfetaminę, nikotynę i alkohol etylowy.

47. Zastosowanie według zastrz. 46, znamienne tym, że dawka dzienna GVG wynosi od 15 do 600 mg na kg masy ciała ssaka.

48 Zastosowanie według zastrz. 46, znamienne tym, że charakterystyki uzależnień obniża się bez reakcji wzbudzających niechęć do GVG lub głód GVG.

49. Zastosowanie według zastrz. 46, znamienne tym, że charakterystyki uzależnień obniża się bez zmiany czynności przenoszenia się z miejsca na miejsce u ssaków.

PL 198 789 B1

50. Zastosowanie według zastrz. 40, znamienne tym, że stosuje się kompozycję zawierającą enancjomer S(+)-gamma-winyloGABA lub jego farmaceutycznie tolerowaną sól.

51. Zastosowanie według zastrz. 40, znamienne tym, że stosuje się kompozycję zawierającą enancjomer R(-)-gamma-winyloGABA lub jego farmaceutycznie tolerowaną sól.