PL195516B1 - Sposób otrzymywania ludzkich komórek macierzystych z krwi pępowinowej, sposób namnażania i różnicowania komórek macierzystych do neuronów, astrocytów i oligodendrocytów, komórki macierzyste oraz neurony, astrocyty i oligodendrocyty - Google Patents

Abstract

1. Sposób otrzymywania ludzkich komórek macierzystych z krwi pępowinowej różnicujących się do linii neuronów, astrocytów i oligodendrocytów, znamienny tym, że z krwi pępowinowej selekcjonuje się frakcję komórek pozbawionych na powierzchni antygenu CD34 i zakłada ich hodowlę, selekcjonuje się komórki zdolne do przylegania do podłoża, a następnie kolejno poddaje się pasażo- waniu komórki, które uzyskały kofluentność w podłożu bez dodatku czynników wzrostowych, poddaje się pasażowaniu komórki, które uzyskały kofluentność w podłożu z dodatkiem specyficznych czynników wzrostowych, po czym z komórek po pasażowaniu wyodrębnia się powstające klony. 6. Sposób namna ż ania i róż nicowania neuralnych komórek macierzystych do neuronów, astrocytów i oligodendrocytów, znamienny tym, że komórki macierzyste otrzymane z krwi pępowinowej o cechach antygenowych CD34-, CD45- wykazujące klonogenność oraz ekspresjonujące nestynę hoduje się w postaci klonów komórkowych w obecności czynników mitogennych i surowicy płodowej bydlęcej (FBS), po czym otrzymane komórki umieszcza się w rosnącej hodowli pierwotnej komórek mózgu lub w podłożu różnicującym z czynnikami wzrostowymi, następnie po kilku dniach utrwala się i poddaje badaniu immunocytochemicznemu na obecność antygenów charakterystycznych dla zróżnicowanych komórek nerwowych. 13. Neurony, astrocyty i oligodendrocyty określone w zastrz. 10, 11 i 12, znamienne tym, że otrzymane są z krwi pępowinowej o cechach antygenowych CD34-, CD45- wykazujące klonogenność.

Description

Dziedzina techniki

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania ludzkich komórek macierzystych z krwi pępowinowej, sposób namnażania i różnicowania komórek macierzystych do neuronów, astrocytów i oligodendrocytów oraz otrzymane sposobami według wynalazku neurony, astrocyty i oligodendrocyty.

Stan techniki

Istnieje szereg publikacji dotyczących otrzymywania neuralnych komórek macierzystych z embrionów, tkanki nerwowej płodów ludzkich i osobników dorosłych jak również z komórek wyściółkowych szpiku kostnego, a następnie sposobów hodowania z nich in vitro neuronów, astrocytów i oligodendrocytów lub też tylko niektórych typów tych komórek.

W opisie patentowym nr US 5.753.506 opisano wyodrębnianie, namnażanie i ukierunkowane różnicowanie komórek macierzystych z ośrodkowego układu nerwowego embrionów i dorosłych ssaków. Otrzymaną homogenną populację wielopotencjalnych komórek prekursorowych z neuroepitelium embrionów hodowano w podłożu bezsurowiczym. Komórki przylegały do plastyku z gęstością początkową 20.000/cm², w kolejnych pasażach stosowano wyjściową gęstość 10.000/cm². Do podłoża dodawano cytokiny (bFGF, EGF, TGF-α, aFGF). Podłoże hodowlane zmieniano co 2 dni, komórki pasażowano co 4 dni przed osiągnięciem 50% wzrostu zlewnego. Komórki odklejano od plastyku poprzez zeskrobywanie mechaniczne. Przez cały czas doświadczenia komórki zachowywały zdolność do różnicowania w dojrzałe neurony, oligodendrocyty i astrocyty.

W opisie patentowym US nr 5.851.832 opisano sposób wzrostu i proliferacji wielopotencjalnych neuralnych komórek macierzystych i ich potomstwa in vitro. Stosowano populację neuralnych komórek ssaczych pochodzących z neuralnej tkanki ssaczej dobranej spośród tkanki kory mózgowej, tkanki móżdżkowej, tkanki śródmózgowia, tkanki pnia mózgu, tkanki rdzenia kręgowego, tkanki komorowej i ich kombinacji.

W opisie patentowym US nr 5.968.829 opisano neuralne komórki macierzyste, które pobierano z tkanki mózgowej ssaków, w tym człowieka, i hodowano je w podłożach bezsurowiczych z dodatkiem czynników wzrostowych. Komórki barwiły się pozytywnie na obecność nestyny. Czas potrzebny do podwojenia liczby komórek w hodowli był krótszy niż 30 dni. Komórki różnicowały się w dojrzałe neurony, astrocyty i oligodendrocyty.

W opisie patentowym US nr 6.103.530 opisano wyodrębnianie, charakteryzację, proliferację, różnicowanie i transplantację ssaczych neuralnych komórek macierzystych w pożywce standardowej uzupełnionej czynnikami dodatkowymi takimi jak insulina, transferyna, progesteron, selen, putrescyna i ich kombinacje oraz jeden lub więcej czynników wzrostu, a także LIF (czynnik inhibitujący leukocyty) i ewentualnie heparynę.

Ponadto liczne publikacje naukowe podają szereg informacji dotyczących otrzymywania ludzkich neuralnych komórek z różnych źródeł z wyjątkiem krwi pępowinowej.

E.Mezey, K.J.Chandros, G.Harta, R.A.Maki i S.R.McKercher w artykule Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow, Science 290(5497) : 1779-82, 2001 podają, że szpik dorosłych myszy zawiera komórki zdolne po przeszczepieniu migrować do mózgu zwierzęcia i wytwarzać komórki o cechach morfologicznych i immunocytochemicznych neuronów.

D.Woodbury, E.J.Schwarz, D.J.Prokop i I.B.Black w artykule Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons, J.Neurosci.Res. 61(4):364-70, 2000 podają, że komórki zrębu szpiku kostnego dorosłych szczurów lub ludzi hodowane jako frakcja przylegająca do plastyku, po wielokrotnych pasażach zdolne są po odpowiedniej stymulacji cytokinami do wytwarzania komórek o cechach neuronów.

J.Sanchez-Ramos, S.Song, F.Cardozo-Pelaez, C.Hazzi, T.Stedefort, A.Willing, T.B.Freeman, S.Saporta, W.Jansen, N.Patel, D.R.Cooper i P.R.Sanberg w artykule Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. Experimental Neurology 164, 247-256, 2000 podają, że mysie oraz ludzkie komórki zrębu szpiku kostnego można stymulować do częstych podziałów za pomocą mitogenów (EGF), a następnie różnicować w kierunku neuronów lub astrocytów, zaledwie po drugim lub trzecim pasażu w hodowli in vitro dzięki obecności w pożywce kwasu retinowego i czynnika wzrostowego BDNF lub hodowli mieszanej, w obecności komórek z mózgu płodów szczurzych.

Dotychczas znane sposoby pozyskiwania neuralnych komórek macierzystych z embrionów i tkanek płodowych wymagają wyprzedzających uzgodnień prawnych co do akceptacji tych metod.

Natomiast otrzymywanie ich z określonych fragmentów mózgu jest metodą inwazyjną, nie zawsze

PL 195 516 B1 dostępną i obarczoną dużym ryzykiem dla zdrowia i życia dawcy - niemożliwą bez wywoływania czynnościowych i strukturalnych uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego. Pozyskiwanie neuralnych komórek macierzystych ze szpiku kostnego jest metodą mało wydajną i jak na razie niepełnowartościową pod kątem różnicowego rozwoju w kierunku trzech podstawowych linii komórek ośrodkowego układu nerwowego. W konsekwencji wszystkie wymienione metody, przy niekwestionowanej przydatności w aspekcie poznawczym, są trudne lub niemożliwe do wdrożenia praktycznego w klinice.

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania ludzkich macierzystych komórek, różnicujących się we wszystkie komponenty ośrodkowego układu nerwowego, to jest neurony, astrocyty i oligodenrocyty, z komórek krwi pępowinowej, to jest z krwi pozostającej w naczyniach łożyska i łożyskowej części pępowiny bezpośrednio po urodzeniu dziecka. Brak przeciwwskazań zdrowotnych i etycznych odnośnie pobierania krwi pępowinowej oraz istniejące jako praktyczne wdrożenia procedury pobierania, preparatyki i przechowywania w postaci zamrożonej komórek krwi pępowinowej przemawiają za wyborem tej metody otrzymywania komórek neuralnych jako najlepszej dla przyszłych zastosowań klinicznych.

Według wynalazku sposób otrzymywania ludzkich komórek macierzystych różnicujących się do linii neuronów, astrocytów i oligodendrocytów polega na tym, że z krwi pępowinowej selekcjonuje się frakcję komórek pozbawionych na powierzchni antygenu CD34 i zakłada ich hodowlę, selekcjonuje się komórki zdolne do przylegania do podłoża, a następnie kolejno:

- poddaje się pasaż owaniu komórki, które uzyskał y kofluentność w podł oż u bez dodatku czynników wzrostowych,

- poddaje się pasażowaniu komórki, które uzyskały kofluentność w podłożu z dodatkiem specyficznych czynników wzrostowych, po czym z komórek po pasażowaniu wyodrębnia się powstające klony.

Korzystnie, stosuje się świeżą krew pępowinową do izolacji frakcji komórek pozbawionych na powierzchni antygenu CD34.

Korzystnie, do pasażowania wyodrębnia się komórki macierzyste z podłoża plastykowego.

Korzystnie, pasażowanie prowadzi się przez trypsynizację.

Korzystnie, jako specyficzny czynnik wzrostowy stosuje się czynnik wzrostowy naskórka.

Wynalazek obejmuje również sposób namnażania i różnicowania komórek macierzystych do neuronów, astrocytów i oligodendrocytów, charakteryzujący się tym, że komórki macierzyste otrzymane z krwi pępowinowej o cechach antygenowych CD34^-, CD45^- wykazujące klonogenność oraz ekspresjonujące nestynę hoduje się w postaci klonów komórkowych w obecności czynników mitogennych i surowicy pł odowej bydlęcej (FBS), po czym otrzymane komórki umieszcza się w rosnącej hodowli pierwotnej komórek mózgu lub w podłożu różnicującym z czynnikami wzrostowymi, następnie po kilku dniach utrwala się i poddaje badaniu immunocytochemicznemu na obecność antygenów charakterystycznych dla zróżnicowanych komórek nerwowych.

Korzystnie, hodowlę wyselekcjonowanych klonów komórek prowadzi się w podłożu z czynnikiem wzrostowym naskórka (EGF) oraz surowicą płodową bydlęcą.

Korzystnie, hodowlę różnicującą w kierunku neuronów, astrocytów i oligodendrocytów prowadzi się w obecności komórek kory mózgu szczura.

Korzystnie, hodowlę różnicującą w kierunku neuronów, astrocytów i oligodendrocytów prowadzi się w podłożu różnicującym z czynnikiem wzrostowym pochodzącym z mózgu (BDNF) i kwasem retinowym.

Korzystnie, do oznaczenia zróżnicowania w kierunku neuronów stosuje się przeciwciało skierowane przeciwko β-Tubulinie III oraz MAP-2.

Korzystnie, do oznaczenia zróżnicowania w kierunku astrocytów stosuje się przeciwciało Anti-GFAP.

Korzystnie, do oznaczenia zróżnicowania w kierunku oligodendrocytów stosuje się przeciwciało skierowane przeciwko GalC.

Wynalazek obejmuje również neurony, astrocyty i oligodendrocyty otrzymane są z krwi pępowinowej o cechach antygenowych CD34^-, CD45^- i wykazujące klonogenność.

PL 195 516 B1

Szczegółowe omówienie:

(1) Pobieranie krwi pępowinowej.

Materiałem wyjściowym jest krew pępowinowa pobierana do komercyjnie dostępnych, dopuszczonych do stosowania przez Państwową Służbę Krwi, plastykowych worków kolekcyjnych. Pojedynczy worek zawiera sterylny roztwór antykoagulantu dopuszczonego do stosowania dla pobierania krwi. Krew pobiera się przed lub po urodzeniu łożyska (korzystnie przed urodzeniem) po podwiązaniu i przecięciu pępowiny, np. metodą wielokrotnego nakłuwania naczyń pępowiny. Do czasu izolacji komórek krew można przechowywać przez okres nie przekraczający 24 godzin w temperaturze 4 - 37°C (korzystnie w temperaturze 22°C, która zapewnia żywotność komórek >95%) lub dłużej w stanie zamrożenia. Należy przed dalszą procedurą wykonać testy określające jałowość pobranej krwi, oraz ocenić liczbę komórek i ich żywotność.

2) Selekcja komórek nie posiadających na powierzchni antygenu CD34

Selekcję komórek nie posiadających na powierzchni antygenu CD34 prowadzi się korzystnie metodą wychwytu komórek CD34+ na kolumnach magnetycznych, kolumnach systemu awidynabiotyna, lub przystawką sortującą cytometru przepływowego. Po wirowaniu warstwę interfazy zbiera się i zawiesza w PBS z dodatkiem surowicy płodowej cielęcej. Komórki odpłukuje się poprzez wirowanie, można proces ten powtórzyć kilkakrotnie. Komórki zawiesza się w buforze, np. złożonym z PBS z 2mM EDTA i 0,5% albuminy ludzkiej w proporcji 10⁸/300 μ|. Do zawiesiny komórek dodaje się kolejno ludzkie IgG i przeciwciało anty-CD34 i inkubuje się przez kilkanaście minut w temperaturze 6-12°C. Następnie zawiesinę rozcieńcza się buforem, wiruje, powtórnie zawiesza się w buforze, opłaszcza magnetycznymi kulkami skoniugowanymi z przeciwciałem, ewentualnie filtruje i przepuszcza przez kolumnę magnetyczną MS⁺. Proces separacji korzystnie powtarza się aby zwiększyć wydajność oczyszczania.

3) Selekcja komórek przylegających do plastyku w warunkach hodowli in vitro.

Komórki CD34^- zawiesza się w podłożu hodowlanym przystosowanym dla komórek ludzkich z dodatkiem FCS oraz antybiotyku np. penicyliny i streptomycyny i umieszcza w plastykowych butelkach hodowlanych. Po inkubacji podłoże wraz z komórkami nieprzylegającymi usuwa się, a na komórki przylegające do plastyku nawarstwia się podłoże IMDM z FCS. Hodowlę prowadzi się do osiągnięcia fazy zlewnej komórek (do 20 dni), podłoże korzystnie częściowo wymienia się co kilka dni.

4) Pasażowanie hodowanych komórek.

Po osiągnięciu fazy zlewnej (monolayer) przez hodowane komórki przenosi się je do kilku butelek. Proces ten można przeprowadzić w następujący sposób: podłoże znad hodowanych komórek jest usuwane, a na komórki nawarstwia się roztwór trypsyny w PBS i inkubuje do momentu odklejania się komórek (zwykle około 5 minut). Komórki, które nie odkleją się samoczynnie można spłukać silnym strumieniem PBS. Po około 5 minutach do zawiesiny komórek dodaje się FCS w celu inaktywacji trypsyny. Komórki zawiesza się w IMDM z FCS i odpłukuje przez wirowanie. Porcję komórek uzyskanych z 1 butelki zawiesza się w 30 ml IMDM z 10% FCS i umieszcza np. w 3 butelkach hodowlanych w ilości np. 10 ml/butelkę. Dalsze hodowle prowadzi się analogicznie do hodowli pierwotnej.

5) Propagacja hodowli komórek w obecności czynnika wzrostu naskórka (EGF).

Komórki hodowane są w warunkach typowych dla wzrostu komórek ssaczych (korzystnie w atmosferze 100% wilgotności, 5% CO2, 21% O2, 64% N2, w 37°C, w Dulbecco Modified Eagle Medium z 10% surowicą płodową bydlęcą, pod osłoną antybiotykową mieszaniny streptomycyny i penicyliny) w komercyjnie dostępnych plastykowych butelkach hodowlanych. Po osiągnięciu fazy zlewnej (monolayer) komórki odlepiane są od podłoża plastykowego enzymatycznie (korzystnie przy użyciu trypsyny), a następnie po zatrzymaniu procesu trypsynizacji (korzystnie przez surowicę płodową bydlęcą, lub pożywkę hodowlaną, w której FBS jest obecna) zawiesinę komórek wiruje się i umieszcza w pożywce stosowanej do hodowli komórek ludzkich z czynnikiem wzrostowym stymulującym komórki ssacze do podziałów (korzystnie DMEM suplementowany 10% FBS oraz czynnikiem wzrostu naskórka - EGF- w przedziale stężeń 10-20ng/ml), po czym przenosi się komórki do plastykowych butelek hodowlanych (korzystnie w objętości 5 do 10 ml, w gęstości ok. 0,5 x 10⁴ kom/cm²) i inkubuje się w warunkach korzystnych dla komórek ssaczych przez 5 do 7 dni, aż do osiągnięcia fazy zlewnej. Pożywkę można wymieniać co 3 dni.

PL 195 516 B1

6) Otrzymywanie klonów komórkowych z hodowli prowadzonych w obecności EGF.

Po osiągnięciu przez komórki rosnące w obecności EGF fazy zlewnej, komórki nie wykazujące zdolności adhezyjnych (nie przylegając do dna butelki) i pływające w toni są przenoszone do odrębnych naczyń hodowlanych i badane w kierunku zdolności do tworzenia klonów, czyli zespołów komórek będących wynikiem podziałów jednej komórki.

Pozostałe komórki, przylegające do dna butelki są pasażowane jak wyżej opisano, tj. odklejane od dna butelki enzymatycznie (korzystnie przy użyciu trypsyny), a następnie przenoszone do innych butelek hodowlanych korzystnie w proporcji 1:3. Procedurę powinno się powtórzyć aż do 5-tego pasażu. Nie przylegające komórki z 3-ciego, 4-tego i 5-tego pasażu przeniesione do odrębnych naczyń hodowlanych przyczepiają się do dna naczynia hodowlanego i zaczynają się dzielić tworząc klony (fig. 2a, b, c). Klony można również otrzymywać w wyniku pasażu komórek przylegających do podłoża, ale muszą to być komórki rosnące co najmniej dwie generacje w obecności EGF i przenoszone do innych naczyń hodowlanych w gęstości nie przekraczającej 10 kom/cm².

Losy pojedynczych, przylegających do dna naczyń hodowlanych komórek śledzone są w określonych polach przy użyciu świetlnego mikroskopu odwróconego przez 7 dni do 21 dni - jeśli z pojedynczej komórki powstanie powiększająca się grupa komórek - wówczas mówi się o powstaniu klonu.

7) Wykazanie, że w otrzymanych klonach znajdują się komórki o charakterystyce typowej dla neuralnych komórek macierzystych.

W celu wykazania, ż e w otrzymanych z krwi pępowinowej klonach znajdują się neuralne komórki macierzyste, klony komórkowe znakuje się immunocytochemicznie na obecność nestyny, białka typowego dla ludzkich neuralnych komórek macierzystych (Lendahl U. i wsp. (1990) Cell, 60:585-595).

W tym celu utrwalone komórki rosnące poprzednio w klonach w obecnoś ci EGF inkubuje się z przeciwciał em skierowanym przeciwko ludzkiej nestynie, a nast ę pnie z przeciwciał em skoniugowanym z fluorochromem świecącym po wzbudzeniu światłem z lampy UV, a skierowanym przeciwko IgG surowicy zwierzęcia w którym otrzymano przeciwciało przeciwko nestynie. Komórki pozytywne pod względem obecności nestyny uwidacznia się przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.

8) Wykazanie, że komórki macierzyste otrzymane z krwi pępowinowej mogą różnicować się do komórek charakterystycznych dla dojrzałego OUN - neuronów, astrocytów i oligodendrocytów.

W celu wykazania, ż e róż nicowanie komórek macierzystych otrzymanych z krwi pę powinowej do neuronów astrocytów i oligodendrocytów jest możliwe, można zastosować dwa różne układy eksperymentalne stwarzające warunki sprzyjające neuralnym komórkom macierzystym do różnicowania w dojrzał e komórki OUN, a nastę pnie przy uż yciu znakowa ń immunocytochemicznych potwierdzi ć obecność antygenów specyficznych dla określonego typu komórek OUN.

a) Kierunkowe różnicowanie komórek macierzystych, wywodzących się z krwi pępowinowej w obecności rosnących komórek izolowanych z tkanki mózgowej.

Różnicowanie takie można przeprowadzić zakładając hodowlę wspólną komórek wywodzących się z klonów komórkowych ludzkiej krwi pępowinowej oraz komórek otrzymanych z tkanki mózgowej. Komórki rosnące w butelkach hodowlanych w formie klonów komórkowych przez kilka dni w pożywce hodowlanej typowej dla komórek ssaczych z czynnikami wzrostowymi stymulującymi te komórki do proliferacji (korzystnie czynnik wzrostu naskórka i surowica płodowa cielęca) odlepia się od podłoża plastykowego (korzystnie przy użyciu trypsyny), zbiera się w probówce przez wirowanie, a następnie wybarwia się za pomocą substancji, które po przejściu przez błonę komórkową podlegają reakcji chemicznej w wyniku której powstaje nierozpuszczalny produkt barwny (korzystnie są to pochodne chlorometylowe fluorochromów).

W efekcie barwione komórki są widoczne jako ś wiecące na zielono po wzbudzeniu światłem z lampy UV w mikroskopie fluorescencyjnym. Tak przygotowane macierzyste komórki z krwi pępowinowej umieszcza się na rosnącej już od kilku dni hodowli pierwotnej komórek z mózgu ssaka, przygotowanej według protokołu typowego dla hodowli mieszanych neuronalno-astrocytalnych. Po 4 do 7 dniach wspólnej hodowli w pożywce hodowlanej z dodatkiem surowicy cielęcej płodowej komórki utrwala się i bada immunocytochemicznie na obecność antygenów charakterystycznych dla zróżnicowanych komórek OUN. Do uwidocznienia antygenów charakterystycznych dla określonego typu komórek używa się przeciwciał skierowanych przeciwko tym antygenom, korzystnie: przeciwciało skierowane przeciwko β-Tubulinie III, białku specyficznie występującemu w neuronach, Anti-GFAP - przeciwciało rozpoznające kwaśne białko włókienkowe specyficzne dla astrocytów, GalC - przeciwciało wykazujące obecność galaktocerebrozydu specyficznego dla oligodendrocytów.

PL 195 516 B1

Obecność kompleksów antygen-przeciwciało uwidacznia się w komórce przeciwciałami drugorzędowymi, sprzężonymi z fluorochromem i weryfikuje przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Za pomocą znakowania można wykazać, że już po 4 dniach wspólnej hodowli komórek macierzystych wywodzących się z krwi pępowinowej z komórkami uzyskanymi z mózgu szczura, 38% badanych komórek pępowinowych noszących zielony znacznik fluorescencyjny różnicuje się w neurony, 33% różnicuje się w astrocyty (fig. 3), natomiast 11% w oligodendrocyty.

b) Kierunkowe różnicowanie neuralnych komórek macierzystych uzyskanych z krwi pępowinowej przez inkubację w określonych pożywkach różnicujących;

- wyselekcjonowane pod względem ekspresji nestyny klony komórek pępowinowych, rosnące co najmniej przez 7 dni w warunkach standardowych dla fazy namnażania komórek odlepia się od plastykowego podłoża (korzystnie przez trypsynizację). Uzyskane komórki przenosi się na szalki hodowlane lub do 24-dołkowych płytek hodowlanych (korzystnie w gęstości - 5x10⁴ do 1x10⁵ kom/cm²) w określonych różnicujących pożywkach. Są to dostępne komercyjnie pożywki sprzyjające hodowli komórek wywodzących się z układu nerwowego z dodatkiem kwasu retinowego i/lub mózgowego czynnika wzrostu. Po 4 - 5 dniach hodowli komórki utrwala się i charakteryzuje metodą znakowania immunocytochemicznego na obecność antygenów specyficznych dla neuronów, astrocytów i oligodendrocytów (np. według 1. Draberowa E. et al. Histochem Cell Biol (1998) 109: 231-239, Expression of class III b-tubulin in normal and neoplastic human tissues, 2. Dyer C.A. et al. Journal of Neuroscience Research (2000) 60:412-426 GFAP-Positive and Myelin Marker-Positive Glia in Normal and Pathologic Environments, 3. Palm et al. Molecular Brain Researech (2000) 78:192-195 Featal and adult human CNS stem cells have similar molecular characteristics and developmental potential, 4. Carpenter M. K. et al Experimental Neurology (1999) 158, 265-278 In Vitro Expansion of a Multipotent Population of Human Neural Progenitor Cells).

Obecność neuronów weryfikuje się pozytywnym znakowaniem w stosunku do białek neuronalnie specyficznych, np. takich jak wczesny znacznik β-tubulina III oraz MAP-2 (Microtubule Associated Protein 2) pojawiających się później w różnicujących się neuronach. Występowanie jednocześnie dwóch rodzajów białek neuronalnie specyficznych potwierdza się znakowaniem immunocytochemicznym podwójnym, korzystnie wg metody opisanej w M. K. Carpenter i wsp. Experimental Neurology 1998, 158, 265-278, stosowaną przez nas uprzednio, Bużańska i wsp. J.Neuroscie Res., w druku. W wyniku znakowania można potwierdzić, że w po 4 dniach hodowli w pożywce różnicującej część komórek pochodzących z krwi pępowinowej różnicują się w neurony, w których występuje β-tubulina III oraz neurony w których występuje zarówno β-tubulina III jak i MAP2 (fig.4).

Obecność astrocytów weryfikuje się pozytywnym znakowaniem w stosunku do GFAP (Glial Fibryllary Acidic Protein). W wyniku znakowania immunocytochemicznego potwierdzono, że część komórek pochodzących z krwi pępowinowej różnicuje się w astrocyty.

Obecność oligodendrocytów potwierdza się immunocytochemicznie występowaniem w komórkach galaktocerebrozydu (Gal C). W wyniku znakowania immunocytochemicznego można potwierdzić, że część komórek pochodzących z krwi pępowinowej różnicuje się w oligodendrocyty (fig. 5).

Objaśnienie figur rysunku

Wynalazek w przykładach realizacji jest odtworzony na rysunku na którym: figura 1 przedstawia schemat blokowy sposobów według wynalazku, figura 2 przedstawia powstawanie klonu komórek krwi pępowinowej, z komórkami, w których ekspresji podlega białko charakterystyczne dla neuralnych komórek macierzystych: a) pojedyncza komórka krwi pępowinowej, b) grupa komórek będąca wynikiem podziałów pojedynczej komórki (klon) z fig. 2a po 7 dniach wzrostu w hodowli w obecności EGF i płodowej surowicy bydlęcej (FBS), c) ten sam klon komórek pępowinowych po 14 dniach hodowli w obecności EGF i FBS, d) w kolorze czerwonym widoczne komórki z fig. 2c, w których występuje białko charakterystyczne dla neuralnych komórek macierzystych nestyna, figura 3 przedstawia komórki krwi pępowinowej różnicowane do astrocytów w obecności komórek z kory mózgu szczura, w kolorze zielonym widoczne są trzy komórki krwi pępowinowej, przy czym w dwóch (kolor żółty-zielony+czerwony) występuje GFAP - białko charakterystyczne dla astrocytów, w kolorze czerwonym widoczne są włókna GFAP występujące w astrocytach szczurzych, w kolorze niebieskim - jądra wszystkich komórek, figura 4 przedstawia komórki krwi pępowinowej różnicowane w środowisku hodowlanym (preferencyjnie Neurobasal Medium) z dodatkiem kwasu retinowego i czynnika wzrostowego pochodzącego z mózgu (BDNF) do neuronów: w kolorze niebieskim widoczne wszystkie jądra komórek krwi pępowiPL 195 516 B1 nowej, w kolorze czerwonym komórki, w których ekspresji podlega wczesny znacznik neuronów, β-tubulina III, w kolorze zielonym komórki, w których ekspresji podlega MAP-2, stanowiący znacznik neuronów o wyższym stopniu zróżnicowania, figura 5 przedstawia komórki krwi pępowinowej różnicowane w środowisku (korzystnie Neurobasal A-Medium) z kwasem retinowym oraz BDNF do oligodendrocytów: w kolorze niebieskim wszystkie jądra komórek krwi pępowinowej, w kolorze czerwonym komórki, w których ekspresji podlega znacznik oligodendrocytów, galaktocerebrozyd (GalC).

Przykłady realizacji wynalazku

P r z y k ł a d 1

Pobieranie krwi pępowinowej

Krew pępowinową pobrano do komercyjnie dostępnych, dopuszczonych do stosowania przez Państwową Służbę Krwi, plastykowych worków kolekcyjnych z firmy Baxter, nr kat. 4R6109, o pojemności 700 ml, zaopatrzonych w przyspawany jeden lub więcej drenów zakończonych igłą iniekcyjną. Pojedynczy worek zawierał sterylny roztwór CPDA (roztwór 0,73 g dekstrozy, 0,6 g cytrynianu sodowego, 0,07 kwasu cytrynowego, 0,05 g fosforanu jednosodowego i 6,3 mg adeniny w 23 ml wody).

Krew pobrano przed urodzeniem łożyska po podwiązaniu i przecięciu pępowiny, metodą wielokrotnego nakłuwania naczyń pępowiny. Do czasu izolacji komórek krew przechowywano przez 16 godzin w temperaturze 22°C. Poddano ocenie jałowość pobranej krwi - 2 porcje krwi po 1 ml dodano do butelek zawierających odpowiednio podłoże dla bakterii tlenowych i beztlenowych i umieszczono w czytniku testów. Liczbę komórek oceniano w urządzeniu do automatycznej analizy składu komórkowego krwi (Sysmex, Technicon), a ich żywotność rutynowo oznaczono metodą polegającą na barwieniu oranżem akrydyny i bromkiem etydyny i liczeniu odsetka komórek żywych w cytometrze przepływowym.

P r z y k ł a d 2

Selekcja komórek

Przeprowadzono selekcję komórek nie posiadających na powierzchni antygenu CD34 stosując metodę wychwytu komórek CD34+ na kolumnie magnetycznej. Krew rozcieńczono w stosunku 1:2 buforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS GIBCO bez wapnia i magnezu, nr kat. 14200-059) i nawarstwiono na mieszaninę Fikolu (Sigma, nr kat. F-4375) z Uropoliną 75% (Polpharma SA) w probówce 50 ml (Corning, nr kat. 25330-50). Po wirowaniu w 400 g przez 40 minut warstwę interfazy zebrano pipetą pasteurowską, zawieszono w PBS z dodatkiem 10% surowicy płodowej cielęcej (FCS, Pan Biotech, nr kat. P30-1502). Komórki odpłukano poprzez wirowanie (10 minut, 200 g), proces powtórzono dwukrotnie. Komórki zawieszono w buforze złożonym z PBS z 2mM EDTA (Sigma, nr kat. E-1644) i 0,5% albuminy ludzkiej w proporcji 10⁸/300 μ!. Do zawiesiny komórek dodano kolejno: 100 μl części A₁ (ludzkie IgG) i 100 μl części A₂ (przeciwciało anty-CD34 skoniugowane z haptenem) zestawu do izolacji immunomagnetycznej komórek CD34 (Miltenyi Biotec, nr kat. 467-01) i inkubowano przez 15 minut w temperaturze 4°C. Następnie zawiesinę rozcieńczono buforem 20-krotnie, wirowano (22°C, 10 minut, 400 g) i powtórnie zawieszono w buforze w proporcji 10⁸/400 μΚ Dodawano 100 μl odczynnika B (koloidalne kulki paramagnetyczne rozpoznające hapten) i inkubowano tak jak w etapie poprzednim.

Rozcieńczono zawiesinę komórek jak w etapie poprzednim i po odwirowaniu zawieszono komórki w buforze w proporcji 108/500 μΙ Następnie zawiesinę filtrowano przez filtr nylonowy (Miltenyi Biotec, nr kat. 414-07) i przepuszczono przez kolumnę magnetyczną MS⁺ (Miltenyi Biotec, mr kat. 422-01). Proces separacji powtórzono dwukrotnie. Zbierano komórki przepływające przez kolumnę (komórki nie wychwytywane na kolumnie) tj. frakcję komórek nie posiadającą na powierzchni antygenu CD34 (CD34^-).

P r z y k ł a d 3

Selekcja komórek przylegających do plastyku w warunkach hodowli in vitro

Komórki CD34^- zawieszono w podłożu hodowlanym przystosowanym dla komórek ludzkich (Dulbecco w modyfikacji Iscove'a - IMDM) z dodatkiem 10% FCS oraz penicyliny (5000 lU/ml i streptomycyny (5000 UG/ml) w gęstości 5 x 10⁶/ml i umieszczono w plastykowych butelkach hodowlanych (butelki „oddychające z filtrem w korku Falcon Plastics nr kat. 3108) w objętości 10 ml/butelkę. Po 24-godzinnej inkubacji (atmosfera: 5% CO2, 21% O2, 64% N2, 37°C, 100% wilgotności), podłoże wraz z komórkami nieprzylegającymi usunięto, a na komórki przylegające do plastyku nawarstwiono 10 ml podłoża IMDM z 10% FCS. Hodowlę w identycznych jak w pierwszych 24 godzinach warunkach prowadzono do osiągnięcia fazy zlewnej komórek (do 21 dni), podłoże w objętości 5 ml wymieniano co 7 dni.

PL 195 516 B1

P r z y k ł a d 4

Pasażowanie hodowanych komórek

Po osiągnięciu przez hodowane komórki fazy zlewnej (monolayer) podłoże hodowlane usunięto, a na komórki nawarstwiono 0,25% trypsynę (GIBCO nr kat. 17072-026) w PBS i inkubowano w temperaturze 37°C do momentu odklejania się komórek (około 5 minut). Komórki, które nie odkleiły się samoczynnie spłukano silnym strumieniem PBS. Do zawiesiny komórek dodano FCS do końcowego stężenia 30% (inaktywacja trypsyny), a następnie zawiesinę rozcieńczono IMDM z 10% FCS i odpłukano przez wirowanie (15 minut, 400 g, 20°C). Porcję komórek uzyskanych z 1 butelki zawieszono w 30 ml IMDM z 10% FCS i umieszczono w 3 butelkach hodowlanych w iloś ci 10 ml/butelkę . Dalsze hodowle prowadzono analogicznie do hodowli pierwotnej.

P r z y k ł a d 5

Propagacja hodowli komórek w obecności czynnika wzrostowego EGF.

Komórki hodowano w pożywce Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, GibcoBRL, #61965-026) z 10% surowicą pł odową bydlę c ą (FBS GibcoBRL, #10106-169), pod osł oną antybiotykową (Penicilin/Streptomycin Solution liguid, GibcoBRL # 151440-114 w proporcji 1ml/100 ml pożywki) w atmosferze 100% wilgotności, 5% CO2, 21% O2, 64% N2, w 37°C. Po osią gnięciu fazy zlewnej (monolayer) komórki pasażowano przez usunięcie podłoża znad hodowanych komórek, przemycie tych komórek buforowaną solą fizjologiczną, a następnie nawarstwienie na komórki 0,5 ml roztworu trypsyny (Trypsin-EDTA GibcoBRL # 45300-019) i inkubację w temperaturze 37°C do momentu odklejenia komórek, tj. ok. 3 min. Komórki, które po tym czasie wciąż przylegały do podłoża odklejano mechanicznie przez uderzenia ręką w bok butelki. Po zatrzymaniu procesu trypsynizacji przez dodanie do butelki 3ml DMEM z 10% FBS, zawiesinę komórek przenoszono do sterylnej, 15 ml probówki wirówkowej (Bibby Sterilin #2327-015) i wirowano przez 5 min przy przyspieszeniu 400 g. Po wirowaniu odebrano pożywkę znad komórek, a pelet komórkowy zawieszono w 15 ml DMEM z 10% FBS, pod osłoną antybiotykową, z dodatkiem nabłonkowego czynnika wzrostowego Epidermal Growth Factor (EGF), (Sigma # E9644) w stężeniu 10 ng/ml. Zawiesinę komórek rozdzielono miedzy 3 plastykowe butelki hodowlane (Nunc #156340) o powierzchni 25 cm², po 5 ml do każdej. Gęstość wysiewanych komórek wynosiła 5x 10⁴ kom/cm². Komórki hodowano w warunkach typowych dla hodowli komórek ssaczych przez 6 dni aż do osiągnięcia fazy zlewnej.

P r z y k ł a d 6

Otrzymywanie klonów komórkowych z komórek rosnących w obecności EGF.

Po 5 dniach hodowli w pożywce opisanej w przykładzie 5, suplementowanej czynnikiem wzrostu naskórka (EGF) w stężeniu 10 ng/ml, komórki nie wykazujące zdolności adhezyjnych (nie przylegające do dna butelki hodowlanej) i pływające w toni, przeniesiono do odrębnej butelki hodowlanej i pozostawiono inkubatorze hodowlanym, w warunkach sprzyjających wzrostowi komórek ssaczych (w atmosferze 100% wilgotności, 5% CO2, 21% O2, 64% N2, w 37°C), w celu umożliwienia tym komórkom adhezji do plastykowego podłoża. Pozostałe, przylegające do dna butelki hodowlanej komórki pasażowano jak opisano w przykładzie 5, tj. odlepiono od dna butelki przy użyciu trypsyny-EDTA i przeniesiono do innych butelek hodowlanych w proporcji 1:3.

Procedurę powtarzano ponownie aż do 5-tego pasażu. Nie przylegające komórki z 3-ciego, 4-tego i 5-tego pasażu przeniesiono do odrębnych naczyń hodowlanych. Po przyczepieniu się do dna naczynia hodowlanego pojedyncze przylegające do dna butelki hodowlanej komórki zaczęły się dzielić tworząc klony, czyli zespoły komórek będących wynikiem podziałów jednej komórki (fig. 2 a, b, c). Zdolność izolowanych komórek do tworzenia klonów, badano przy użyciu świetlnego mikroskopu odwróconego (Carl Zeiss). Losy pojedynczych, przylegających do dna naczyń hodowlanych komórek śledzono przez 10 dni.

Równolegle, w celu otrzymania klonów, komórki które był hodowane i podlegały ekspansji w obecności EGF (4 pasaże przez trypsynizację), przeniesiono pasażem do odrębnych butelek hodowlanych w gęstości 10 komórek na cm² i obserwowano przez 21 dni.

P r z y k ł a d 7

Wykazanie obecności w klonach nestyny - białka typowego dla neuralnych komórek macierzystych.

Komórki rosnące w klonach badano immunocytochemicznie na obecność nestyny: komórki utrwalono 4% paraformaldehydem przez 20 minut w temperaturze pokojowej, następnie płukano (3x po 5 min) buforem soli fizjologicznej, następnie znakowano przeciwciałem poliklonalnym skierowanym przeciwko ludzkiej nestynie, otrzymanym od prof. Urbana Lendahla z Karolynska Institutet

PL 195 516 B1 (Sztokholm), według metody znakowania immunocytochemicznego (metoda znakowania nestyny - M. Carpenter et al., Experimental Nurology 1999, 158, 265-278).

Ilość komórek w klonach pozytywnych pod względem obecności nestyny wyniosła ok. 50% (fig. 2d).

P r z y k ł a d 8

Różnicowanie neuralnych komórek macierzystych otrzymanych z klonów komórek krwi pępowinowej do neuronów astrocytów i oligodendrocytów.

Obecność białek specyficznych dla określonego typu komórek badano po znakowaniu immunocytochemicznym przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Axioskop2 (Carl Zeiss).

a) Różnicowanie komórek krwi pępowinowej, wywodzących się z klonów netyn-pozytywnych w obecności komórek izolowanych z tkanki mózgu.

Komórki rosnące w butelkach hodowlanych o powierzchni 25 cm², w formie klonów komórkowych przez 14 dni, w pożywce hodowlanej z czynnikiem wzrostu naskórka (EGF) w stężeniu 10 ng/ml i 10% FBS, odklejano od podłoża przy użyciu trypsyny (jak opisano w przykładzie 5). Po sterylnym przeniesieniu komórek do 15 ml probówki zbierano komórki przez wirowanie przy 400 g. Komórki pozostające w probówce wybarwiano za pomocą substancji Cell Tracker™Green CMFDA, Molecular Probes #C7025 według metody proponowanej przez producenta.

W efekcie komórki barwione widoczne były jako świecące na zielono w mikroskopie fluorescencyjnym. Tak przygotowane komórki macierzyste neuralne z krwi pępowinowej umieszczono na rosnącej już od 7 dni hodowli pierwotnej z kory mózgu szczura, przygotowanej według metody opisanej w Pike et al., Journal of Neuroscie Research, 1998, 52, 505-520 w gęstości 1x10⁴ kom/cm². Po 5 dniach wspólnej hodowli w pożywce hodowlanej z dodatkiem 10% FBS komórki utrwalono 4% paraformaldehydem (20 minut w temperaturze pokojowej) i badano immunocytochemicznie na obecność antygenów charakterystycznych dla zróżnicowanych komórek OUN.

Do uwidocznienia antygenów charakterystycznych dla określonego typu komórek użyto przeciwciał skierowanych przeciwko tym antygenom: TUJ (otrzymane od B.Zalca, INSERM, Paryż) przeciwciało skierowane przeciwko β-Tubulinie III, białku specyficznie występującemu w neuronach, AntiGFAP (DAKO #M0761) - przeciwciało rozpoznające kwaśne białko włókienkowe specyficzne dla astrocytów, GalC (otrzymane od B.Zalca, INSERM, Paryż) - przeciwciało wykazujące obecność galaktocerebrozydu specyficznego dla oligodendrocytów. Obecność kompleksów antygen-przeciwciało uwidoczniono w komórce przeciwciałami drugorzędowymi, sprzężonymi z fluorochromem: Anti-Mouse IgG2a - TxR (Southern Biotechnology # 1080-07),rozpoznające TUJ, Cy™3 Anti-Rabbit IgG (Jackson Immunoresearch Lab. Inc. # 11-165-045) oraz Anti-Mouse IgG3TxR (Southern Biotechnology # 1100-07).

Znakowanie przeprowadzono metodą opisaną w M. K. Carpenter i wsp. Experimental Neurology 1998, 158, 265-278, stosowana przez nas uprzednio, Bużańska i wsp. J.Neuroscie Res., w druku. Znakowanie wykazało, że już po 4 dniach wspólnej hodowli neuralnych komórek macierzystych wywodzących się z krwi pępowinowej z komórkami uzyskanymi z mózgu szczura, 38% badanych komórek pępowinowych noszących zielony znacznik fluorescencyjny różnicuje się w neurony, 33% różnicuje się w astrocyty (fig. 3), natomiast 11% w oligodendrocyty, które w badanych preparatach posiadają czerwoną fluorescencję.

b) Kierunkowe różnicowanie neuralnych komórek macierzystych uzyskanych z krwi pępowinowej przez inkubację w określonych pożywkach różnicujących;

- wyselekcjonowane pod względem ekspresji nestyny klony komórek pępowinowych, rosnące przez 7 dni w warunkach standardowych (atmosfera 100% wilgotności, 5% CO2, 21% O2, 64% N2, 37°C, pożywka hodowlana jak wyżej, z 10 ng/ml EGF i 10% FBS) odklejano od podłoża przez trypsynizację (jak opisano w przykładzie 5). Uzyskane komórki przenoszono do 24-dołkowych płytek hodowlanych (Iwaki # 3820-024) w gęstości 5x10⁴ kom/cm² w określonych różnicujących pożywkach:

- w środowisku Neurobasal A-Medium GIBCO #10888-022 z 10% FBS oraz kwasem retinowym (Retinoic Acid SIGMA # R2625) w stężeniu 0,5 μm, zwanym dalej pożywką A,

- w środowisku Neurobasal Medium z 10% FBS, 0,5 μm kwasem retinowym oraz roztworem BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor, SIGMA # B3795) o stężeniu 10 ng/ml, zwanym dalej pożywką B.

Neuralne komórki macierzyste otrzymane z krwi pępowinowej, hodowano w warunkach standartowych (jak opisano w przykładzie 5) w pożywce A i pożywce B przez 4 dni, a następnie charakteryzowano metodą znakowania immunocytochemicznego na obecność białek specyficznych dla neuronów, astrocytów i oligodendrocytów.

PL 195 516 B1

Obecność neuronów weryfikowano pozytywnym znakowaniem w stosunku do białek neuronalnie specyficznych: wczesny znacznik β-tubulina III oraz MAP-2 (Microtubule Associated Protein 2) pojawiający się później w różnicujących się neuronach. Występowanie jednocześnie dwóch rodzajów białek neuronalnie specyficznych potwierdzano znakowaniem immunocytochemicznym podwójnym wg metody opisanej w M. K. Carpenter i wsp. Experimental Neurology 1998, 158, 265-278, stosowanej przez nas uprzednio, Bużańska i wsp. J.Neuroscie Res., w druku.

Do uwidocznienia w komórkach MAP-2 użyto następującej kombinacji przeciwciał: pierwsze przeciwciało Monoclonal Mouse Anti-MAP-2, (Sigma #M4403), oraz drugie przeciwciało Anti-Mouse IgG FITC (SIGMA # F2266), natomiast do uwidocznienia β-tubuliny III użyto odpowiedniej kombinacji przeciwciał. W wyniku znakowania określono, że po 4 dniach hodowli w pożywce A komórki pochodzące z krwi pępowinowej różnicują się w neurony, w których występuje β-tubulina III w 26% oraz neurony w których występuje zarówno β-tubulina III jak i MAP2 w 12% całej populacji badanych komórek. W pożywce B wartości te były następujące: immunoreakcja przeciwko β-tubulinie III wystąpiła w 19,6% komórek, natomiast podwójna reakcja przeciwko β-tubulinie III oraz MAP-2 wystąpiła w 18% komórek (fig. 4).

Obecność astrocytów weryfikowano pozytywnym znakowaniem w stosunku do GFAP (Glial Fibryllary Acidic Protein). Do uwidocznienia GFAP użyto odpowiedniej kombinacji przeciwciał. Zarówno w pożywce A jak i w pożywce B w astrocyty ekspresjonujące GFAP zróżnicowało się około 23% całej populacji badanych komórek, obecność oligodendrocytów potwierdzono występowaniem w komórkach galaktocerebrozydu (Gal C), przy użyciu odpowiedniej kombinacji przeciwciał. W pożywce A w oligodendrocyty ekspresjonujące GalC zróżnicowały się w 5%, natomiast w pożywce B 7,2% całej populacji badanych komórek (fig. 5).

Claims (13)

1. Sposób otrzymywania ludzkich komórek macierzystych z krwi pępowinowej różnicujących się do linii neuronów, astrocytów i oligodendrocytów, znamienny tym, że z krwi pępowinowej selekcjonuje się frakcję komórek pozbawionych na powierzchni antygenu CD34 i zakłada ich hodowlę, selekcjonuje się komórki zdolne do przylegania do podłoża, a następnie kolejno poddaje się pasażowaniu komórki, które uzyskały kofluentność w podłożu bez dodatku czynników wzrostowych, poddaje się pasażowaniu komórki, które uzyskały kofluentność w podłożu z dodatkiem specyficznych czynników wzrostowych, po czym z komórek po pasażowaniu wyodrębnia się powstające klony.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się świeżą krew pępowinową do izolacji frakcji komórek pozbawionych na powierzchni antygenu CD34.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do pasażowania wyodrębnia się komórki macierzyste z podłoża plastykowego.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pasażowanie prowadzi się przez trypsynizację.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako specyficzny czynnik wzrostowy stosuje się czynnik wzrostowy naskórka.

6. Sposób namnażania i różnicowania neuralnych komórek macierzystych do neuronów, astrocytów i oligodendrocytów, znamienny tym, że komórki macierzyste otrzymane z krwi pępowinowej o cechach antygenowych CD34^-, CD45^- wykazujące klonogenność oraz ekspresjonujące nestynę hoduje się w postaci klonów komórkowych w obecności czynników mitogennych i surowicy płodowej bydlęcej (FBS), po czym otrzymane komórki umieszcza się w rosnącej hodowli pierwotnej komórek mózgu lub w podłożu różnicującym z czynnikami wzrostowymi, następnie po kilku dniach utrwala się i poddaje badaniu immunocytochemicznemu na obecność antygenów charakterystycznych dla zróżnicowanych komórek nerwowych.

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że hodowlę wyselekcjonowanych klonów komórek prowadzi się w podłożu z czynnikiem wzrostowym naskórka (EGF) oraz surowica płodową bydlęcą.

8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że hodowlę różnicującą w kierunku neuronów, astrocytów i oligodendrocytów prowadzi się w obecności komórek kory mózgu szczura.

9. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że hodowlę różnicującą w kierunku neuronów, astrocytów i oligodendrocytów prowadzi się w podłożu różnicującym z czynnikiem wzrostowym pochodzącym z mózgu (BDNF) i kwasem retinowym.

PL 195 516 B1

10. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że do oznaczenia zróżnicowania w kierunku neuronów stosuje się przeciwciało skierowane przeciwko β-Tubulinie III oraz MAP-2.

11. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że do oznaczenia zróżnicowania w kierunku astrocytów stosuje się przeciwciało Anti-GFAP.

12. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że do oznaczenia zróżnicowania w kierunku oligodendrocytów stosuje się przeciwciało skierowane przeciwko GalC.

13. Neurony, astrocyty i oligodendrocyty określone w zastrz. 10, 11 i 12, znamienne tym, że otrzymane są z krwi pępowinowej o cechach antygenowych CD34^-, CD45^- wykazujące klonogenność.