PL188494B1 - Rośliny z rodziny Compositae oporne na mszyce Nasonovia ribisnigri, ich potomstwo, części lub pochodne, oraz sposób uzyskiwania - Google Patents

Abstract

1. Rosliny z rodziny Compositae, które sa oporne na mszyce Nasonovia ribisnigri dzieki obecnosci w genomie genu opornosci Nr, w których informacja genetyczna odpo- wiedzialna za fenotyp CRA jest nieobecna w genomie rosliny przynajmniej w takim stop- niu, ze fenotyp CRA nie ulega ekspresji. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są rośliny z rodziny Compositae oporne na mszyce Nasonovia ribisnigri, ich potomstwo, części lub pochodne oraz sposób ich uzyskiwania.

Mszyce powodują wiele szkód w uprawach jarzyn. Żywią się łykiem roślin i w ten sposób powodują zmniejszony lub nienormalny wzrost. Żywe mszyce lub resztki mszyc mogą uczynić zebrany produkt niezdatnym do sprzedaży.. W dodatku spadź, słodki płyn wydzielany przez mszyce, tworzy lepką warstwę na liściach. Mszyce wywołują duże obawy nie tylko ze względu na to bezpośrednie zniszczenie ale także ponieważ rozprzestrzeniają choroby wirusowe.

Nasonovia ribisnigri jest gatunkiem mszycy, który w Europie spotykany jest najczęściej na sałacie hodowanej w polu. N. ribisnigri jest szczególnie szkodliwa, ponieważ woli żerować na młodych liściach rośliny. W ten sposób mszyce łatwo są łapane w zamykających się główkach sałaty, co czyni je trudno dostępnymi dla pestycydów.. Szczególnie duże problemy powoduje to w zwartych główkach sałaty, takich jak sałata krucha. Rolnicy ograniczają szkody wyrządzane przez mszyce za pomocą wielokrotnego opryskiwania rosnących roślin pestycydami, szczególnie wówczas gdy warunki sprzyjają rozmnażaniu mszyc. Stosowanie nadmiernych ilości pestycydu jest niepożądane z punktu widzenia środowiska. Co więcej pestycydy nie osiągają swojego celu w poszczególnych przypadkach, jak opisano powyżej, na przykład dla zamykających się główek sałaty.

Oporność roślin, na których występują mszyce (oporność roślin-gospodarzy) jest przyjazną dla środowiska alternatywą dla stosowania pestycydów, aby kontrolować rozwój mszyc, na przykład na sałacie. Dlatego też przeprowadzono już szerokie badania nad opornością N. ribisnigri i nad dziedziczeniem tego typu oporności. Dla pewnej ilości odmian hodowlanych sałaty opisano częściową oporność na N. ribisnigri (Dunn, J. A. i Kempton, D. P. H. (1980) Tests of Agrochemical and Cultivars, No. 1 (Ann. Appl. Biol., 94, Suplement): 58-59). Nieomal całkowitą oporność na N. ribisnigri znaleziono w dzikiej odmianie Lactuca, L. virosa L. (Benink A. H. i F. L. Dieleman (1983) Euphytica 32: 691-695). Stwierdzono, że ta oporność na Nasonovia u L. virosa jest powodowana przez pojedynczy dominujący gen, zwany genem Nr.

188 494

W 1981 były Institute for Horticultural Plant Breeding (IVT, obecnie część CPRO-DLO) w Wageningen wypuścił rośliny, które zawierały w swoim genomie fragment chromosomu L. virosa mający gen Nr oporności na N. ribisnigri. Rośliny te były wynikiem programu hybrydyzacji z L. virosa i L. sativa, w którym stosowano L. serriola jako gatunek pomostowy. Gatunek pomostowy jest stosowany gdy dwa gatunki mogą być krzyżowane ze sobą tylko w stopniu ograniczonym, jak było w przypadku L. virosa i L. sativa.

Uwolnione rośliny były niepożądanego typu jeśli chodzi o fenotyp i cechy agronomiczne (nie tworzyły głów, słabe cechy hodowlane).

Ze względu na niepożądane cechy agronomiczne rośliny te były stosowane przez firmy hodowlane jako rodzice w hybrydyzacji w celu uzyskania za pomocą rekombinacji genetycznej i selekcji, roślin, które łączą oporność na N. ribisnigri z dobrymi cechami agronomicznymi.

L. sativa jest gatunkiem rocznym, ale gdy jest hodowana pod sztucznym światłem w zwiększonej temperaturze, może w ciągu roku wyprodukować 2-5 kolejnych pokoleń. Znane ogólnie są procedury krzyżówek wstecznych i odpowiednie metody wkrzyżowywania genów od „rodzica dawcy” do tła genetycznego o wysokiej wartości. Na ogół introgresja dominującego genu do agronomicznie akceptowalnego fenotypu może być uzyskana w 3-5 krzyżówkach wstecznych i następnie 2-3 samozapyleniach. Wymaganych jest więc 5-8 pokoleń wciągu 3-5 lat, aby uzyskać agronomicznie akceptowalne rośliny mające pożądany gen w swoim genomie. Jednak choć rośliny mające gen Nr były już udostępnione w roku 1981 firmom produkującym nasiona, nie opisano dotychczas udanego przeniesienia genu Nr do agronomicznie akceptowalnych roślin sałaty.

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie roślin rodziny Compositae, a w szczególności nowych roślin sałaty, które łączą oporność na Nasonovia ribisnigri z dobrymi agronomicznie cechami.

Cel ten uzyskano zgodnie z wynalazkiem dzięki temu, że stwierdzono w trakcie programu selekcji, iż stosowanie tej oporności w roślinach sałaty mających dobre cechy agronomiczne było uniemożliwiane przez ujemne efekty uboczne powodowane przez fragment chromosomu L. virosa, na którym znajdował się gen Nr, gdy był wprowadzany do genomu L. sativa. W porównaniu z hodowanymi roślinami sałaty bez oporności na N. ribisnigri, rośliny homozygotyczne na gen Nr wykazywały obniżony wzrost, jaśniejszą zieloną barwę i przyspieszoną degradację chlorofilu w starszych liściach rośliny generatywnej (gdy roślina przedwcześnie wytwarzała kwiaty albo nasiona). To powodowało, że generatywne rośliny miały całkowicie lub częściowo białe liście zewnętrzne i/lub obniżoną wysokość rośliny. Ten agronomicznie niepożądany fenotyp będzie dalej w tym zastosowaniu określany jako fenotyp CRA, co oznacza „zbity wzrost i szybkie starzenie”. Figura 1 podaje przykład różnic między normalnymi roślinami sałaty i roślinami CRA. W stadium wegetatywnym objawy CRA są szczególnie wyraźne, gdy rośliny rosną w warunkach stresu (na przykład w niskiej temperaturze). Wynalazek dostarcza więc roślin mających gen oporności Nr w genomie, w których genetyczna informacja odpowiedzialna za fenotyp CRA jest nieobecna w genomie rośliny przynajmniej w takim stopniu, że nie jest wyrażany fenotyp CRA.

Niniejszy wynalazek jest oparty na stwierdzeniu, że fenotyp CRA nie jest wynikiem samego genu Nr ale raczej informacji genetycznej w pobliżu genu oporności. Według wynalazku stwierdzono więc, że istnieje powiązanie miedzy opornością a fenotypem CRA. Przez złamanie tego powiązania jest możliwe hodowanie opornych, agronomicznie akceptowalnych roślin. Ponadto stwierdzono na podstawie literatury i naszych własnych badań, że inne cechy L. virosa są także często związane z fenotypem CRA gdy są wkrzyżowywane do innych roślin. Maxon Smith i Langton (The Grower 21/9/1989 str. 54-55) opisali związek między zbitym wzrostem i opornością na Bremia lactucea, który był wprowadzony za pomocą introgresji z L. virosa do sałaty hodowlanej.

Niniejszy wynalazek także dostarcza rozwiązania tego problemu, skoro już stwierdzono, że fenotyp cRa jest genetycznie sprzężony z pożądaną cechą. Fenotyp CRA jest cechą recesywną, która jest tylko wyrażana w homozygotycznie opornych roślinach.

Gdy uzyskano już tę wiedzę, stało się możliwe wybieranie roślin, w których informacja genetyczna dla fenotypu CRA została usunięta z sąsiedztwa genu Nr lub zmieniona w takim stopniu, że oporność już nie była wyrażana w kombinacji z fenotypem CRA. Jako przykład

188 494 opisany jest w tym zgłoszeniu gen oporności Nr, ale zasada wynalazku dotyczy także innych cech sprzężonych z CRA, które pochodzą od L. virosa.

Usunięcie lub zmiana informacji genetycznej powodującej fenotyp CRA jest efektem zjawiska (zjawisk) rekombinacji w pobliżu genu. W tym momencie nie jest całkowicie jasne czy informacja dla fenotypu CRA leży na lewo czy na prawo od genu czy wokół genu. Jeśli informacja genetyczna dla fenotypu CRA leży po obu stronach genu oporności, obie części tej informacji genetycznej powinny korzystnie być zmienione lub usunięte. Według wynalazku, korzystnie w końcu zostaną wybrane rośliny, w których zaszły dwa lub więcej przypadki rekombinacji. Taki podwójny przypadek rekombinacji nie musi oczywiście zachodzić w czasie jednej generacji, ale zdarzenia rekombinacji z kolejnych pokoleń mogą także powodować ewentualne usunięcie lub zmianę informacji genetycznej z obu stron genu oporności. Jeśli informacja CRA leży tylko z jednej strony genu, wystarcza oczywiście pojedyncze zdarzenie rekombinacji.

W tym zgłoszeniu „zdarzenie rekombinacji” rozumiane jest jako mejotyczny crossing-over.

Rośliny bez fenotypu CRA mogą być uzyskane za pomocą konwencjonalnych metod hybrydyzacji. Warunkiem jest jednak stosowanie prawidłowego kryterium selekcji. Według wynalazku zostało obecnie zdefiniowane odpowiednie kryterium selekcji, a mianowicie całkowity lub częściowy brak lub nieaktywność części informacji genetycznej z otoczenia genu oporności. Według wynalazku nie jest istotne, jak wiele informacji genetycznej otaczającej gen oporności jest nieobecnej u rekombinanta lub w jaki sposób gen CRA lub geny CRA jest lub są inaktywowane, o ile fenotyp CRA jest nieobecny u rośliny i jej potomstwa.

Aby znaleźć rośliny, w których zaszła rekombinacja między genem Nr i genami powodującymi fenotyp CRA, segregujące populacje albo potomstwo takich populacji są w praktyce badane przesiewowo pod kątem szukania roślin o fenotypie zrekombinowanym, tzn. homozygotyczną opornością na N. ribisnigri w połączeniu z fenotypem nie-CRA. Choć w ten sposób jest możliwe znalezienie odpowiednich rekombinantów, jak widać z przykładów, istnieje jednak szereg przyczyn, dla których znajdowanie agronomicznie cennych rekombinantów może być skomplikowane.

W programie selekcji dla łączenia oporności z dobrymi cechami rolniczymi stwierdzono, że rośliny, które łączą oporność na N. ribisnigri z agronomicznie cennym fenotypem nieomal zawsze nie są wynikiem rekombinacji w chromosomie, ale są heterozygotyczne dla wprowadzonego drogą introgresji fragmentu chromosomu L. virosa. Według wynalazku stwierdzono, że fenotyp CRA jest dziedziczony recesywnie. Ponieważ gen Nr jest dominujący, roślina z pojedynczą kopią fragmentu chromosomu L. virosa będzie łączyła oporność z normalnym fenotypem (nie-CRA). Potomstwo takich roślin będzie jednak segregować pod kątem fenotypu CRA i nie może być stosowane handlowo, ponieważ handlowe odmiany sałaty są liniami czystymi, które muszą spełniać ścisłe wymagania jednorodności genetycznej, aby mogły być wprowadzane do obrotu. Stwierdzono także, że ze względu na ekspresję oporności, która jest cechą biologiczną zależną od warunków otoczenia i dóświadczalnych, pewna część roślin w teście oporności na N. ribisnigri jest często błędnie klasyfikowana. Rośliny z genem Nr są uznawane za wrażliwe, a rośliny bez genu Nr są zapisywane jako oporne. To samo dotyczy oznaczania fenotypu CRA poszczególnych roślin w polu lub w szklarni. W zależności od warunków doświadczalnych i warunków otoczenia pewna frakcja roślin z wprowadzonym fragmentem chromosomu L. virosa będzie uznana za rośliny normalne w . stanie homozygotycznym, podczas gdy pewna ilość roślin, u których wstawiony fragment chromosomu jest obecny w stanie heterozygotycznym lub całkowicie nieobecny, może przejawiać objawy powodujące błędną klasyfikację fenotypu CRA.

Mimo możliwości wystąpienia powyżej opisanych trudności będzie widoczne z przykładów, że selekcja pożądanych roślin, w których nie jest obecna informacja genetyczna o fenotypie CRA, jest wysoce możliwa w sposób konwencjonalny. Ten sposób selekcji wymaga jednak stosunkowo dużej segregującej populacji lub dużej ilości hybrydyzacji.

Może więc być bardziej wydajne wykorzystanie narzędzi biologii molekularnej w selekcji odpowiednich roślin. Wyjątkowo przydatną metodą jest technika AFLP, jaką opisali Vos, P. i wsp. w Nucleic Acids Research, 1995, t. 23, Nr 21:4407-4414. Przy zastosowaniu do niniej6

188 494 szego wynalazku ta technika jest oparta na mapowaniu markerów DNA, które są genetycznie sprzężone z genem Nr, a następnie w stosunkowo prosty sposób można określić czy zaszło zjawisko rekombinacji w pobliżu genu Nr w potomstwie doświadczenia z hybrydyzacją. Gdy sprzężony marker nie jest obecny, zaszedł crossing-over między genem Nr i tym markerem. Przez dobór markerów w różnych odległościach od genu można także określić czy wiele, czy mało zniknęło z sąsiedztwa genu. Potomstwo, w którym brakuje jednego lub więcej ze sprzężonych markerów, a więc pozbawione przynajmniej kawałka niepożądanego otoczenia genu, ma więc więcej niż średnią szansę, że jest obecny chromosom z genem Nr, w którym genetyczna informacja powodująca fenotyp CRA nie jest obecna. Wydajność selekcji roślin łączących homozygotyczność dla genu Nr z nieobecnością fenotypu CRA może być znacząco zwiększona za pomocą markerów molekularnych.

Mapowanie markerów genetycznych w pobliżu genu jest procedurą, która może być przeprowadzona całkiem łatwo przez osobę o przeciętnych umiejętnościach w biologii molekularnej i która jest na przykład opisana w Lefebvre, V. i A. M. Chevre. Tools for marking plant disease and pest resistance genes: a review Agronomie 15, 1995 (1):3-19; Michelmore, R. W. Molecular approaches to manipulation of disease resistance genes. Annual Review of Phytopathology 33 (1995): 393-427; Michelmore, R. W., R. V. Kesseli i E. J. Ryder. Genetic mapping in lettuce. W: R. L. Phillips i I. K. Vasil (red) DNA based markers in plants, Kluwer Acad. Publishers, Dordrecht, 1994, str. 223-239; Winter, P. i G Kahl. Molecular marker technologies for plant improvement. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 1995, 11 (4): 436-448. Ogólną informację dotyczącą technologii AFLP można znaleźć w Vos, P. i wsp. (p. wyżej). W przykładzie 2 zostanie dalej wyjaśnione zastosowanie technologii AFLP do selekcji roślin według wynalazku.

Niniejszy wynalazek jest zilustrowany w tym zgłoszeniu w odniesieniu do hodowlanej sałaty Lactuca sativa. Oczywiste jest dla specjalisty w tej dziedzinie, że zasady wynalazku mogą być także stosowane do innych gatunków rodzaju Lactuca i bardziej ogólnie do roślin z rodziny Compositae. Odniesienie do Lactuca nie powinno być więc interpretowane jako ograniczenie wynalazku.

Według niniejszego wynalazku gen oporności korzystnie pochodzi od L. virosa. Rośliny według wynalazku są oczywiście zasadniczo całkowicie płodne i homozygotyczne pod względem genu oporności. Że względu na brak genetycznych podstaw powodujących fenotyp CRA wykazują zasadniczo brak zmniejszonego wzrostu, nie wykazują obniżenia zielonego zabarwienia ani przedwczesnej degradacji chlorofilu, gdy rośliny są w fazie generatywnej.

„Sałata hodowlana” lub „rośliny sałaty hodowlanej” rozumiane są jako sałata, która jest odpowiednia do konsumpcji i spełnia wymagania dla hodowli handlowej. Oprócz samych roślin sałaty i ich części odpowiednich do konsumpcji, takich jak liście, łodygi, korzenie, pędy i tym podobne, wynalazek obejmuje części lub pochodne roślin odpowiednich do propagacji. Przykłady części odpowiednich do namnażania obejmują tkanki narządów, takie jak liście, łodygi, korzenie, pędy i tym podobne, protoplasty, zarodki somatyczne, pylniki, ogonki liściowe, komórki w hodowli i tym podobne. Pochodne odpowiednie do namnażania to na przykład nasiona. Rośliny według wynalazku mogą być hodowane lub namnażane w sposób konwencjonalny ale także za pomocą technik hodowli komórkowych z części roślin.

Rośliny według wynalazku, które charakteryżują się brakiem fenotypu CRA w obecności genu Nr w stanie homozygotycznym mogą być wykorzystane do przeniesienia oporności na N. ribisnigri do innych agronomicznie ważnych typów sałaty. Odbywa się to na przykład za pomocą standardowych procedur krzyżówek wstecznych dla genu dominującego (p. Briggs, F. N. i P. F. Knowles (1967) w: Principles of Plant Breeding, str. 162-167), a następnie przez samozapylenie roślin przez przynajmniej dwa pokolenia i wybór linii, które są homozygotyczne pod względem genu oporności.

W poszczególnych etapach programu selekcji stosuje się zapylenia krzyżowe. Jednak zapylenie krzyżowe roślin samozapylających wymaga zapobiegania samozapyleniu u rośliny stosowanej jaiko rodzic płci żeńskiej. Może to być uzyskane przez manualne usuwanie męskich części narządów rozrodczych. Może to być uzyskane przez ich fizyczne usunięcie albo za pomocą czynników chemicznych i/lub stosowania wody na kwiaty. Te wszystkie sposoby usuwania lub unieczynniania męskich części narządów rozrodczych są dobrze znane w tech188 494 nice. Potomstwo hybrydyzacji może być uzyskane przez spowodowanie, by żeński rodzic hybrydyzacji produkował nasiona, zebranie Fl lub nasion z krzyżówki wstecznej i zasianie ich w celu wyprodukowania nowych roślin. Rośliny FI można poddać samozapylaniu, aby uzyskać pokolenie F2 lub krzyżowane wstecznie z rekurencyjnym rodzicem schematu krzyżówek wstecznych. Skrzyżowane wstecznie rośliny mogą być dalej krzyżowane wstecznie z rekurencyjnym rodzicem, aby poprawić wartość agronomiczną roślin w kolejnej generacji lub mogą być samozapylane, aby wyprodukować rośliny, które są homozygotyczne pod względem genu Nr. Przedmiotem wynalazku są rośliny z rodziny Compositae oporne na mszycę Nasonovia ribisnigri dzięki obecności w genomie genu oporności Nr, w których informacja genetyczna odpowiedzialna za fenotyp CRA jest nieobecna w genomie rośliny przynajmniej w takim stopniu, że fenotyp CRA nie ulega ekspresji, korzystnie gen oporności Nr jest obecny w roślinach homozygotycznie. W innym korzystnym wykonaniu rośliny są roślinami sałaty z rodzaju Lactuca, w szczególności L. sativa L.

W kolejnym korzystnym wykonaniu wynalazek obejmuje rośliny, które mogą być wytworzone przez przeprowadzenie następujących etapów:

a) wybór rośliny rodzicielskiej, która jest heterozygotyczna dla oporności na Nr,

b) wytworzenie populacji segregującej,

c) wyprodukowanie potomstwa zasadniczo każdej rośliny populacji segregującej,

d) testowanie potomstwa na oporność i fenotyp GRA,

e) wybranie z odpowiedniego potomstwa roślin, które są albo oporne, albo nie mają żadnego fenotypu CRA,

f) wyprodukowanie nasion z tych roślin za pomocą samozapylenia i hodowania potomstwa z tych nasion aby uzyskać linię, i

g) testowanie linii na oporność i fenotyp CRA i wybranie linii, które są jednorodnie oporne i jednorodnie mają fenotyp nie-CRA.

W korzystnym wykonaniu segregująca populacja jest produkowana za pomocą samozapylenia rośliny rodzicielskiej, przez krzyżowanie rośliny rodzicielskiej z rośliną oporną lub za pomocą techniki podwójnych haploidów.

W innym korzystnym wykonaniu odpowiednim potomstwem z powyżej opisanego etapu e) jest takie, którego rośliny albo są jednorodnie oporne na N. ribisnigri i nie wszystkie mają fenotyp CRA lub jednorodnie nie mają fenotypu CRA i nie są wszystkie wrażliwe na N. ribisnigri, korzystniej odpowiednim potomstwem z etapu e) jest takie, którego rośliny są zarówno jednorodnie oporne na N. ribisnigri i jednorodnie nie mają fenotypu CRA, w tym przypadku omija się etapy f) i g).

W kolejnym korzystnym wykonaniu wynalazku testowanie potomstwa na oporność i fenotyp CRA w etapie d) jest oparte na braku fenotypu CRA widzialnego okiem.

W dalszym korzystnym wykonaniu wynalazku przed opisanym powyżej etapem c) za pomocą technik biologii molekularnej dokonuje się preselekcji roślin, w których zaszło zjawisko rekombinacji między informacją genetyczną dla oporności i informacją genetyczną dla fenotypu CRA, korzystniej techniki biologii molekularnej są oparte na technice AFLP.

Przedmiotem wynalazku jest również potomstwo roślin według wynalazku uzyskane w sposób generatywny lub wegetatywny.

Wynalazek dostarcza również części lub pochodne roślin według wynalazku, które są odpowiednie do namnażania, takie jak tkanki organów, takie jak liście, łodygi, korzenie, pędy, protoplasty, zarodki somatyczne, pręciki, ogonki liściowe, komórki w hodowli i nasiona, korzystnie te, które są odpowiednie do konsumpcji, takie jak główki lub liście.

W jednym z wykonań wynalazek dostarcza roślin L. sativa L. linii RZ 96.85123, których wytwarzanie jest dalej wyjaśnione w przykładzie 2. Rośliny tej linii są homozygotyczne dla genu Nr i brak im informacji genetycznej, która powoduje fenotyp CRA. Takie rośliny nie są małe i/lub nie są żółte, jak rośliny CRA. Gdy rośliny nie są małe i/lub nie są żółte, brak jest dostatecznej informacji genetycznej powodującej fenotyp CRA lub ta informacja genetyczna jest dostatecznie zinaktywowana. Aby zilustrować wynalazek nasiona roślin RZ 96.85123 zdeponowano w NCIMB pod numerem 40804 16 maja 1996. Został postawiony warunek, że do daty wydania patentu, próbki zdeponowanych nasion mogą być tylko wydane specjaliście.

188 494

W innym konkretnym wykonaniu wynalazek dostarcza wyniku konwencjonalnej metody hybrydyzacji i specyficznego schematu selekcji, jak opisano w przykładzie 1, w postaci roślin z linii RZ 96.75906. Te rośliny są także homozygotyczne dla genu Nr i brak im informacji genetycznej powodującej fenotyp cRa. Aby zilustrować wynalazek nasiona roślin RZ 96.75906 zdeponowano w NCIMB pod numerem 40803 16 maja 1996.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób uzyskiwania roślin według wynalazku obejmujący etapy:

a) wybór rośliny rodzicielskiej, która jest heterozygotyczna dla oporności na Nr,

b) wytworzenie populacji segregującej,

c) wyprodukowanie potomstwa zasadniczo każdej rośliny populacji segregującej,

d) testowanie potomstwa na oporność i fenotyp CRA,

e) wybranie z odpowiedniego potomstwa roślin, które są albo oporne, albo nie mają żadnego fenotypu CRA,

f) wyprodukowanie nasion z tych roślin za pomocą samozapylenia i hodowania potomstwa z tych nasion aby uzyskać linię, i

g) testowanie linii na oporność i fenotyp CRA i wybranie linii, które są jednorodnie oporne i jednorodnie mają fenotyp nie-CRA, przy czym przed etapem c) przeprowadza się wstępną selekcję u roślin, u których rekombinacja zaszła pomiędzy informacją, genetyczną warunkującą oporność a informacją genetyczną warunkującą fenotyp CRA, wykorzystując techniki biologii molekularnej.

W korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku segregującą populację produkuje się za pomocą samozapylenia rośliny rodzicielskiej, przez krzyżowanie rośliny rodzicielskiej z rośliną oporną lub za pomocą techniki podwójnych haploidów.

W innym korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku odpowiednim potomstwem w etapie e) jest takie, którego rośliny albo są jednorodnie oporne na N. ribisnigri i nie wszystkie mają fenotyp CRA, lub jednorodnie nie mają fenotypu CRA i nie są wszystkie wrażliwe na N. ribisnigri lub korzystnie odpowiednim potomstwem w etapie e) jest takie, którego rośliny są zarówno jednorodnie oporne na N. ribisnigri i jednorodnie nie mają fenotypu CRA, przy czym w tym przypadku omija się etapy f) i g).

W następnym korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku testowanie w etapie d) jest oparte na braku fenotypu CRA widzialnego okiem.

W kolejnym korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku techniki biologii molekularnej są oparte na technice AFLP.

Segregująca populacja opisana w wynalazku może być wyprodukowana różnymi sposobami, jak na przykład przez samozapylenie heterozygotycznej rośliny rodzicielskiej, przez skrzyżowanie heterozygotycznej rośliny rodzicielskiej z rośliną oporną i przez zastosowanie techniki podwojonego diploidu do heterozygotycznej rośliny rodzicielskiej. W technice podwojenia haploidu, nowe rośliny są kultywowane z podwojonych gamet rośliny. Gamety mogą pochodzić od męskich narządów rozrodczych (androgeneza) lub żeńskich narządów rozrodczych (gynogeneza). Kultura podwojonych haploidów na ogół wymaga etapu in vitro. Zaletą podwojonych haploidów w poszukiwaniu rekombinantów jest to, że gamety, z których pochodzą rośliny są wynikiem rekombinacji mejotycznej w heterozygotycznej roślinie rodzicielskiej, podczas gdy powstające podwojone haploidy są całkowicie homozygotyczne, tak że unika się maskujących efektów heterozygotyczności.

W roślinach uzyskiwanych przez technikę podwojonych haploidów pożądany rekombinant może być natychmiast rozpoznany: roślina z opornością i bez CRA. W liniach uzyskanych w wyniku samozapylenia roślin z segregującej populacji linie mające pożądane właściwości zrekombinowane mogą być rozpoznane przez to, że linia jest jednorodnie oporna, ale nadal segreguje CRA lub przez to, że linia nadal segreguje oporność, ale jednorodnie ma normalny fenotyp lub że linia jest jednorodnie oporna i jednorodnie ma normalny fenotyp.

Wydajność tej metody może być znacznie zwiększona gdy, przed produkcją potomstwa zasadniczo każdej rośliny, przeprowadza się wstępny test na roślinach, w których zaszło pożądane zjawisko rekombinacji. Taki wstępny test może na przykład być przeprowadzony z użyciem metod biologii molekularnej, takich jak technika AFLP. Selekcja według

188 494 techniki AFLP jest oparta na wykrywaniu zjawisk rekombinacji w pobliżu locus genu Nr w genomie roślin z segregującej populacji.

Niniejszy wynalazek zostanie dalej zilustrowany w odniesieniu do towarzyszących przykładów, które są tylko przedstawiane w formie ilustracji i nie mają na celu ograniczania wynalazku w jakikolwiek sposób.

Przykłady

Ogólnie

Techniki stosowane w celu uzyskania roślin według wynalazku są opisane bardzo ogólnie poniżej. Szczegóły przeprowadzonych doświadczeń będą dalej analizowane w przykładach.

Materiały i metoda

1. Test oporności

Oporność na N. ribisnigri może być wykazana przez hodowanie populacji roślin i inokulację każdej rośliny pewną ilością mszyc N. ribisnigri (na przykład 15). Oporność jest udowodniona po pewnym okresie badawczym (na przykład 7 dni), gdy ilość mszyc na roślinie wynosi 0 lub mniej niż liczba początkowa, podczas gdy na wrażliwych roślinach ilość mszyc na roślinę wzrosła po okresie testowym.

Rośliny wrażliwej odmiany są włączone w teście jako kontrola. Mszyce muszą wyraźnie rozmnażać się na tych roślinach kontrolnych, aby test był przyjęty jako wiarygodny. Test jest korzystnie przeprowadzany w temperaturze między 18 i 24°C i w minimalnym czasie 14 godzin dnia. Korzystnie do inokulacji osobnikami N. ribisnigri stosuje się małe rośliny w fazie wegetatywnej z około 1 do 3 liśćmi, choć mogą być też stosowane starsze rośliny w teście oporności. Oporność na N. ribisnigri jest nie tylko obserwowana w warunkach testowych, ale można ją też zauważyć na polu lub w szkłami.

Mszyce stosowane w teście oporności były czerwonego biotypu określanego jako WN1 i można je uzyskać w Department of Entomology z Agricultural University w Wageningen. Przed testem były hodowane na roślinach sałaty. Mogą oczywiście też być stosowane zielone mszyce. Testy oporności przeprowadzano z nasionami, które sadzono w blokach kompostu doniczkowego. Mszyce przenoszono na młode rośliny sałaty w cztery tygodnie po zasianiu.

2. Hybrydyzacje

Dla pierwszej hybrydyzacji stosowany jest jeden rodzic, który jest homozygotyczny pod względem oporności na N. ribisnigri i który wykazuje agronomicznie niepożądane cechy zmniejszonego wzrostu, zmniejszonego zielonego zabarwienia i/lub wczesnej degradacji chlorofilu w fazie generatywnej. Druga roślina jest rośliną, która nie jest oporna na N. ribisnigri i która nie wykazuje powyżej wymienionych agronomicznie niepożądanych cech.

Rośliny FI uzyskane za pomocą hybrydyzacji mogą być krzyżowane wstecznie z rekurencyjnym (wrażliwym na N. ribisnigri) rodzicem (lub inną rośliną wrażliwą na N. ribisnigri) i/lub mogą być hodowane do generacji F2 za pomocą samozapylenia. Powstałe rośliny BC1 (z krzyżówki testowej) lub F2 mogą być także hodowane do następnego pokolenia poprzez samozapylenie lub mogą być znowu stosowane jako rodzic do hybrydyzacji. Wykrywanie roślin ze zdarzeniem rekombinacyjnym w pobliżu locus genu Nr dostarczającego oporności może być przeprowadzone wydajnie z zastosowaniem techniki AFLP lub innej techniki markerów molekularnych w populacji segregującej pod względem genu Nr. Może to być populacja uzyskana w wyniku samozapylania heterozygotycznej rośliny (patrz Przykład 2) lub populacja uzyskana przez krzyżówkę wsteczną rośliny heterozygotycznej, korzystnie z rośliną z opornej linii rodzicielskiej. Fenotypowa selekcja dla rekombinacji między opornością na N. ribisnigri i fenotypem CRA może wydajnie zachodzić w populacji linii wsobnych z roślin z populacji segregującej pod względem genu Nr.

Przez linię jest tu rozumiana grupa nasion lub roślin uzyskanych za pomocą samozapylenia pojedynczej rośliny.

Wzrost wydajności selekcji przez stosowanie markerów molekularnych uzyskuje się w ten sposób, że preselekcja może się odbywać z markerami. Tylko potomstwo roślin, w których stosując markery wykazano, że zaszło zjawisko rekombinacji w pobliżu locus Nr jest następnie dalej badane pod kątem oporności i obecności fenotypu CRA.

Zerwanie sprzężenia między opornością i fenotypem CRA można znaleźć w populacji linii (preselekcjonowanych za pomocą markerów lub nie) przez testowanie pewnej ilości ro10

188 494 ślin na linię (na przykład 25) pod kątem oporności na N. srbrsnrgsr i przez testowanie tych samych lub innych roślin (przykład 25) na fenotyp CRA. Na podstawie tych dwóch testów każda linia może być klasyfikowana pod względem cech w następujących kategoriach.

Oporność:

a) jednorodnie oporne;

b) segregujące w oporne i wrażliwe rośliny;

c) jednorodnie wrażliwe.

Fenotyp CRA:

a) jednorodny fenotyp CRA;

b) segregujące na rośliny z fenotypem CRA i rośliny z normalnym fenotypem;

c) jednorodnie normalny fenotyp.

Rośliny zrekombinnwane, które są homozygntyczna dla genu Nr nie mając fenotypu CRA mogą być znalezione:

1) w liniach, które są jednorodnie oporne na N. srbisnrgsr i z których nie wszystkie rośliny mają fenotyp CRA; i

2) w liniach jednorodnie mających normalny fenotyp i z których nie wszystkie rośliny są wrażliwe na N. srbrsnrgsr.

W pierwszym przypadku do produkcji nasion wybierane są rośliny bez typu CRA. Potomstwo z camnzapylenia tych wybranych roślin jest ponownie testowane na oporność i linie, które sąjadnorodnie oporne i jednorodnie mają normalny fenotyp (nie-CRA) są zatrzymywane.

W drugim przypadku do produkcji nasion wybrane są oporne rośliny. Potomstwo z samozapylenia tych wybranych roślin jest ponownie badane na oporność i fenotyp CRA i linie, które sąja’dnnrndnle oporne i jednorodnie mają normalny fenotyp (nie-CRA) są zatrzymywane.

3. Selekcja za pomocą techniki AFLP

Z każdej rośliny pobiera się mały kawałek liścia (na przykład 50 mg) do testowania i ekstrahuje się DNA. Aby przeprowadzić badania sprzężenia między markerami AFLP i genem Nr każda badana roślina musi być testowana pod kątem oporności na N. srbrsnrgsr, co może być zrobione według powyższej procedury'. Wykrycie AFLP lub innych markerów molekularnych sprzężonych z genem Nr może odbyć się przez porównanie wzoru markerów poszczególnych opornych lub wrażliwych roślin lub przez mieszanie DNA grup wrażliwych lub opornych roślin (tak zwanych „puli”) i porównanie wzorów markerów takich puli. Na podstawie wzorów markerów poszczególnych roślin z segregującej populacji, markery sprzężone z genem Nr mogą być następnie ułożone na mapie markerów, ze wskazaniem genetycznej odległości pomiędzy markerami i genem Nr. Metody wykrywania stopnia sprzężenia genetycznego między markerami i cechą monogeniczną są standardowe dla tej dziedziny i są opisane w wielu podręcznikach. Ogólnie dostępne jest oprogramowanie komputerowe do przeprowadzania tych badań sprzężenia (na przykład program „Joinmap” rozprowadzany przez CPRO-DLO w Wageningen).

Z zestawem markerów blisko sprzężonych z locus Nr mogą być wykryte rośliny z jednym lub więcej zdarzeniami w pobliżu locus Nr. Rośliny ze zdarzeniem rekombinacyjnym charakteryzują się tym, że część markerów sprzężonych z genem Nr jest zastąpiona przez markery od wrażliwego rodzica z fenotypem normalnym (nie-CRA).

Opracowanie markerów i oznaczeń markerów dla tego projektu było przeprowadzone przez Keygene NV, Agro Business Park 90, Post Box 216, 6700 AE, Wageningen. Stosowano wyłącznie technikę AFLP opracowaną i opatentowaną przez ^ygene. Szczegóły tej techniki AFLP opisane są w P. Vos i wsp., AFLP: a new technique for DNA fingerprinting, Nucleic Acids Research. 1995, 23 (21): 4407-4414.

Technika AFLP jest obecnie dostarczana przez różnych dostawców i jest dostępna dla osoby o przeciętnych umiejętnościach w tej dziadzlnia. Dla osoby o przeciętnych umiejętnościach w tej dziedzinie wykrycie blisko sprzężonych markerów dla genu stało się więc sprawą rutynową, o ile są dostępne odpowiednie populacje roślin. Oczywiste jest dla osoby o przeciętnych umiejętnościach, że przez wybranie enzymów restrykcyjnych i starterów może być generowanych wiele różnych markerów AFLP, które są sprzężone z pewnym genem i dla wygenerowania zestawu blisko sprzężonych markerów w celu wykrywania rekombinacji mejotycznej w pobliżu locus nie ma istotnego znaczenia, które blisko sprzężone markery są stoso188 494 wane w tym celu. Istotna jest tylko ilość markerów stosowanych plus rozkład na fragmencie chromosomu, w którym ma być wykryta rekombinacja.

Przykład 1. Konwencjonalna hybrydyzacja

Rośliny L. sativa według wynalazku uzyskano według schematu poniżej:

Linia 793202 x BC2(Calona x R18 dawca) *

Fl *

F2 x BC2 (Saladin RZ x dawca R18') *

F1 x Saladin RZ ł

Saladin RZ x F1 *

F1 *

F2 *

F3 x Saladin Quick RZ *

F1 *

F2 *

F3 *

F4 *

F5, między innymi linia 96.75906

Roślina z linii IVT 793202, jedna z linii z genem Nr udostępnionych w 1981 przez były Instytut for Horticultural Plant Breeding (IVT) w Wageningen była skrzyżowana z rośliną z naszej własnej linii selekcyjnej sałaty kruchej z pełną opornością na mączniaka rzekomego (chorobę powodowaną przez Bremia lactucae (BC2 (Calona x R18 dawca)). Nasiona F1 tej krzyżówki zasiano i rozmnożono do F2. Rośliny F2 badano pod kątem oporności na N. ribisnigri i morfologii i wybraną oporną roślinę f2 krzyżowano z rośliną typu Saladin z pełną opornością na B. lactucae (BC2 („Saladin RZ” x R18 dawca). Rośliny F1 z tej krzyżówki sprawdzono pod kątem oporności na N. ribisnigri i ponownie krzyżowano z rośliną typu „Saladin RZ”. Rośliny F1 tej krzyżówki sprawdzono pod kątem oporności na N. ribisnigri i krzyżowano ponownie z rośliną typu „Saladin RZ”. Nasiona F1 tej krzyżówki wysiewano i namnażano do F2. Rośliny F2 sprawdzano pod kątem oporności na N. ribisnigri i morfologii i oporne rośliny F2 wybrane na typ sałaty kruchej namnażano do linii F3. Linie F3 ponownie testowano na oporność i na fenotyp i rośliny F3 wybrane na typ sałaty kruchej krzyżowano z rośliną typu „Saladin Quick RZ”. Generację F1 z tej krzyżówki sprawdzano pod kątem oporności na N. ribisnigri i namnażano do F2. Rośliny z generacji F2, F3 i F4 pochodzące z jednej rośliny F1 tej hybrydyzacji testowano pod kątem oporności na N. ribisnigri i na fenotyp. Stwierdzono, że wybrane rośliny F2 i F3 łączące oporność z pożądanym fenotypem nie12

188 494

-CRA zawsze są heterozygotyczne dla genów Nr. Jednak w generacji F4 tej krzyżówki w końcu znaleziono linię, która była jednorodna dla normalnego fenotypu (sałata krucha), tzn. nie wykazywała objawów CRA i w dodatku nadal segregowała oporność na N. ribisnigri. Z pewnej ilości roślin tej linii F4 wyprodukowano nasiona. U potomstwa kilku z tych roślin F4 (m. in. linia RZ 96.75906) stwierdzono brak segregacji oporności na N. ribisnigri, tak więc łączą one homozygotyczność na gen Nr z agronomicznie cennym fenotypem, ze względu na brak objawów CRA.

Należy zauważyć, że opisany tu przykład podaje historię rozwoju i genealogii roślin według wynalazku. To bynajmniej nie pokazuje wszystkich wyprodukowanych generacji pochodzących z tej serii hybrydyzacji ale tylko te generacje, których rośliny według wynalazku są liniowym potomstwem. Badane były dalsze gałęzie schematu powyższej hybrydyzacji i selekcji ale wszystkie bez pożądanego efektu końcowego, tzn. homozygotycznych roślin opornych na N. ribisnigri bez objawów CRA.

Przykład 2. Wykrywanie rekombinantów po preselekcji z markerami AFLP

Rośliny L. sativa według wynalazku uzyskano startując od pojedynczej krzyżówki między rośliną opornej na N. ribisnigri linii IVT 793202 wydanej przez były Institute for Horticultural Plant Breeding i rośliną odmiany sałaty „butterhead” „Ultra R2”. Nasiona wyprodukowano z rośliny FI z tej krzyżówki. Nasiona F2 tej krzyżówki zasiano i wyprodukowano nasiona F3 z pewnej ilości roślin.

Z tej krzyżówki 140 roślin linii F3 segregujących oporność (pochodzących z jednej rośliny F2 heterozygotycznej dla genu Nr) badano następnie pod kątem oporności. Z testowanych roślin 95 było opornych, 32 wrażliwych, podczas gdy dla 3 roślin nie uzyskano jasnego wyniku dla oporności. Z roślin F3 z jednoznacznie określoną opornością zebrano liście do analizy DNA. Punktem wyjścia do detekcji markerów AFLP sprzężonych z genem Nr był, po pierwsze, zestaw testowych DNA 5 opornych linii sałaty (w tym opornej linii dawcy IVT 793202), 3 wrażliwe linie (w tym Ultra RZ), 2 mieszaniny („pule”) DNA z odmian wrażliwych na N. ribisnigri i 44 osobniki z wymienionej powyżej linii F3 z hybrydyzacji i między IVT 793202 i Ultra RZ. W tych wstępnych badaniach zidentyfikowano jeden kodominujący marker AFLP, który był w pełni sprzężony z genem oporności w zestawie 44 roślin. Z pomocą tego kodominującego markera można odróżnić rośliny oporne homozygotyczne i heterozygotyczne.

Stosując powyższy kodominujący marker AFLP zbadano łącznie 121 roślin F3 z hybrydyzacji między IVT 793202 i Ultra RZ. Było więc możliwe rozróżnienie roślin F3 na 35 homozygotycznie opornych, 60 heterozygotycznie opornych i 26 wrażliwych. DNA homozygotycznie opornych roślin i homozygotycznie wrażliwych roślin łączono oddzielnie. Z tych puli „opornych” i „wrażliwych” robiono 96 odcisków palca AFLP To wygenerowało około 4300 prążków AFLP, z których 110 było sprzężonych z genem Nr i 25 z wrażliwym allelem w tym locus. 19 markerów AFLP wybrano do użycia w badaniach przesiewowych na rekombinację w pobliżu genu Nr. Z tych 19 markerów 14 było sprzężonych z genem Nr dającym oporność a 5 z allelem „wrażliwym”.

Na podstawie testu z powyżej podanym kodominującym markerem AFLP zidentyfikowano dwie rośliny F3, które były heterozygotyczne dla genu Nr. Z nasion F4 wyprodukowanych na tych roślinach wysiano 800 roślin na linię F4. Pobrano materiał liści tych roślin i wyizolowano DNA. Użyto DNA w sumie 1575 roślin F4 do badań przesiewowych pod kątem rekombinacji markerów z wybranymi 19 markerami AFLP. W wyniku pierwszego oznaczenia wskaźnik rekombinacji uzyskano dla 206 roślin, które przebadano jeszcze raz pod kątem 19 markerów AFLP. To ostatecznie potwierdziło zdarzenie rekombinacji w pobliżu locus Nr dla 162 roślin.

Hodowano nasiona F5 1575 przebadanych roślin. Uzyskano nasiona F5 z 89 ze 162 roślin zidentyfikowanych jako rekombinanty markerów na podstawie analizy AFLP. Powstałe z tego 89 linii F5 przebadano pod kątem oporności na N. ribisnigri i fenotypu. W tych testach znaleziono linię (94.85338), która już nie segregowała oporności (była więc homozygotycznie oporna z genem Nr), ale która nadal segregowała fenotyp CRA. 50 roślin z nasion numer 94.85338 analizowano ponownie za pomocą pewnej ilości markerów AFLP. Po analizie z 22 markerami AFLP sprzężonymi z genem Nr stwierdzono, że jedna z tych roślin była homozygotycznie zrekombinowana dla 12 z 22 markerów. Z tych roślin odzyskano nasiona F6 (linia

188 494

95.85051). Tę linię testowano ponownie pod kątem fenotypu i oporności i ponownie stwierdzono, że wszystkie rośliny tej linii były oporne na N. ribisnigri i wszystkie miały normalny fenotyp, nie-CRA.

Hodowano nasiona F7 z 11 roślin z linii 95.85051. Dało to między innymi nasiona numer 96.85123, które zdeponowano.

Przykład 3. Lokalizacja genu oporności z pomocą badań AFLP

Dwie zrekombinowane linie RZ 96.85123 i RZ 96.75906 i pewne linie kontrolne badano pod kątem 21 markerów AFLP, które według poprzednich badań AFLP, są sprzężone z allelem oporności (markery cis). Markery opracowano na krzyżówce IVT 79202 x Ultra. Najbardziej prawdopodobna sekwencja różnych markerów na genomie sałaty była też znana z poprzednich badań. Badane genotypy to:

1. IVT 793202 (linia udostępniona, oporność na Nasonovia + CSV);

2. Ultra (wrażliwa na Nasonovia BOTERSLARAS, bez CSV);

3. Saladin (wrażliwa na Nasonovia sałata typu kruchego, bez CSV);

4. RZ96.85123 (rekombinowana linia oporna na Nasonovia z przykładu 2, bez CSV);

5. RZ 96.75906 (rekombinowana linia oporna na Nasonovia z przykładu 1, bez CSV). Wyniki markerów są przedstawione w następującej tabeli.

Tabela 1

Wyniki markerów AFLP w 5 liniach sałaty testowanych z 21 markerami AFLP sprzężonych z allelem oporności (markery cis) przedstawione w najbardziej prawdopodobnej pośredniej sekwencji genomu

Linia/odmiana

Markery cis1

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1 0

1 1

1 2

1 3

1 4

1 5

1 6

1 7

1 8

1 9

2 0

2 1

1VT793202

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Ultra

Saladin

+

+

+

96.85123

+'

+

+

+

+

+

+

+

+

96.75906

+

+

+

+

+

+: marker obecny; marker nieobecny

Z tabeli 1 wynika, że trzy markery cis (Numery 3, 7 i 150) są także dodatnie w sałacie lodowej odmiany Saladin i nie są więc polimorficzne między tą odmianą wrażliwą na Nasonovia i obszarem introgresji L. virosa w IVT 793202. Z wyników uzyskanych dla pozostałych markerów widać, że zrekombinowane linie 96.85123 i 96.75906 odpowiadają lewej części obszaru introgresji. W obu liniach nastąpiła rekombinacja między markerami 12 i 13, na lewo od markera 13 u obu linii brak markerów cis. Tak więc jest bardzo prawdopodobne, że gen lub geny kodujące CSV są położone na lewo od markera 13 na fragmencie introgresyjnym L. virosa. Linia 96.75096 różni się od drugiej linii zrekombinowanej tym, że 96.75906 jest też oddzielony z prawej strony: między markerami nr nr 15 i 16 nastąpiła rekombinacja w linii 96.750906 i brak markerów na prawo od markera 15. Z tego można wywnioskować, że gen oporności na Nasonovia jest położony gdzieś między markerami nr nr 12 i 16.

188 494

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims (18)

1. Zastrzeżenia patentowe

   I. Rośliny z rodziny Compositae, które są oporne na mszycę Nasonovia ribisnigri dzięki obecności w genomie genu oporności Nr, w których informacja genetyczna odpowiedzialna za fenotyp CRA jest nieobecna w genomie rośliny przynajmniej w takim stopniu, że fenotyp CRA nie ulega ekspresji.
2. 2. Rośliny według zastrz. 1, znamienne tym, że gen oporności Nr jest obecny homozygotycznie.
3. 3. Rośliny według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że rośliny są roślinami sałaty z rodzaju Lactuca, w szczególności L. sativa L.
4. 4. Rośliny według zastrz. 1 albo 2, które mogą być wytworzone przez przeprowadzenie następujących etapów:

   a) wybór rośliny rodzicielskiej, która jest heterozygotyczna dla oporności na Nr,

   b) wytworzenie populacji segregującej,

   c) wyprodukowanie potomstwa zasadniczo każdej rośliny populacji segregującej,

   d) testowanie potomstwa na oporność i fenotyp CRA,

   e) wybranie z odpowiedniego potomstwa roślin, które są albo oporne, albo nie mają żadnego fenotypu CRA,

   f) wyprodukowanie nasion z tych roślin za pomocą samozapylenia i hodowania potomstwa z tych nasion aby uzyskać linię, i

   g) testowanie linii na oporność i fenotyp CRA i wybranie linii, które są jednorodnie oporne i jednorodnie mają fenotyp nie-CRA.
5. 5. Rośliny według zastrz. 4, znamienne tym, że segregująca populacja jest produkowana za pomocą samozapylenia rośliny rodzicielskiej, przez krzyżowanie rośliny rodzicielskiej z rośliną oporną lub za pomocą techniki podwójnych haploidów.
6. 6. Rośliny według zastrz. 4 albo 5, znamienne tym, że odpowiednim potomstwem z etapu e) jest takie, którego rośliny albo są jednorodnie oporne na N. ribisnigri i nie wszystkie mają fenotyp CRA, lub jednorodnie nie mają fenotypu CRA i nie są wszystkie wrażliwe na N. ribisnigri.
7. 7. Rośliny według zastrz. 4 albo 5, znamienne tym, że odpowiednim potomstwem z etapu e) jest takie, którego rośliny są zarówno jednorodnie oporne na N. ribisnigri i jednorodnie nie mają fenotypu CRA, w tym przypadku omija się etapy f) i g).
8. 8. Rośliny według zastrz. 4, znamienne tym, że testowanie w etapie d) jest oparte na braku fenotypu CRA widzialnego okiem.
9. 9. Rośliny według zastrz. 4 znamienne tym, że przed etapem c) za pomocą technik biologii molekularnej dokonuje się preselekcji roślin, w których zaszło zjawisko rekombinacji między informacją genetyczną dla oporności i informacją genetyczną dla fenotypu CRA.
10. 10. Rośliny według zastrz. 9, znamienne tym, że techniki biologii molekularnej są oparte na technice AFLP.

    II. Potomstwo roślin określonych w zastrz. 1, uzyskane w sposób generatywny lub wegetatywny.
11. 12. Części lub pochodne roślin określonych w zastrz. 1, które są odpowiednie do namnażania, takie jak tkanki organów, takie jak liście, łodygi, korzenie, pędy, protoplasty, zarodki somatyczne, pręciki, ogonki liściowe, komórki w hodowli i nasiona.
12. 13. Części lub pochodne roślin określonych w zastrz. 1, które są odpowiednie do konsumpcji, takie jak główki lub liście.
13. 14. Sposób uzyskiwania roślin określonych w zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje etapy:

    a) wybór rośliny rodzicielskiej, która jest heterozygotyczna dla oporności na Nr,

    b) wytworzenie populacji segregującej,

    188 494

    c) wyprodukowanie potomstwa zasadniczo każdej rośliny populacji segregującej,

    d) testowanie potomstwa na oporność i fenotyp CRA,

    e) wybranie z odpowiedniego potomstwa roślin, które są albo oporne, albo nie mają żadnego fenotypu CRA,

    f) wyprodukowanie nasion z tych roślin za pomocą samozapylenia i hodowania potomstwa z tych nasion aby uzyskać linię, i

    g) testowanie linii na oporność i fenotyp CRA i wybranie linii, które są jednorodnie oporne i jednorodnie mają fenotyp nie-CRA, przy czym przed etapem c) przeprowadza się wstępną selekcję u roślin, u których rekombinacja zaszła pomiędzy informacją genetyczną warunkującą oporność a informacją genetyczną warunkującą fenotyp CRA, wykorzystując techniki biologii molekularnej.
14. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że segregującą populację produkuje się za pomocą samozapylenia rośliny rodzicielskiej, przez krzyżowanie rośliny rodzicielskiej z rośliną oporną lub za pomocą techniki podwójnych haploidów.
15. 16. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że odpowiednim potomstwem w etapie e) jest takie, którego rośliny albo są jednorodnie oporne na N. ribisnigri i nie wszystkie mają fenotyp CRA, lub jednorodnie nie mają fenotypu CRA i nie są wszystkie wrażliwe na N. ribisnigri.
16. 17. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że odpowiednim potomstwem w etapie e) jest takie, którego rośliny są zarówno jednorodnie oporne na N. ribisnigri i jednorodnie nie mają fenotypu CRA przy czym, w tym przypadku omija się etapy f) i g).
17. 18. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że testowanie w etapie d) jest oparte na braku fenotypu CRA widzialnego okiem.
18. 19. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że techniki biologii molekularnej są oparte na technice AFL-P.