CZ299713B6 - Rostliny odolné proti mšicím - Google Patents

Abstract

Rostliny, odolné proti mšicím z celedi Compositae, odolné proti mšicím Nasonovia ribisnigri v dusledku prítomnosti genu Nr pro odolnost v genomu se liší od jiných tím zpusobem, že genetická informace, v jejímž dusledku se vytvárí fenotyp CRA v genomu rostliny chybí alespon do takového rozsahu, že nedochází k expresi fenotypu CRA. Popsán je také zpusob selekce techto rostlin.

Description

‘ Oblast techniky ⁵ d

Vynález se týká rostlin, odolných proti mšicím z čeledi Compositae, zvláště salátu zrodu *1

Lactuca. Jde o rostliny, odolné proti mšicím Nasonovia ribisnigri, které mohou být významné ze $ zemědělského hlediska. 'í

Dosavadní stav techniky j

Mšice způsobují značné škody na zelenině. Živí se rostlinnou tkání včetně cévního systému a tím vyvolávají snížení nebo abnormální růst. Přítomnost mšic mimoto činí sklizené produkty nepro15 dejnými. Mimoto vytváří sladký sekret mšic lepivou vrstvu na listech zeleniny. Kromě přímého poškození mohou mšice také šířit virové choroby rostlin a jsou proto krajně nežádoucí.

Nasonovia ribisnigri je čeleď mšic, která je v Evropě na porostech polního salátu nej rozšířenější.

Jde o zvláště škodlivé organismy vzhledem ktomu, že napadají převážně mladé listy rostlin.

Mšice jsou při tom snadno zachyceny v zavíraj ících se hlávkách salátů a tím jsou nesnadno zasažitelné pesticidy. Zvláště u těch typů salátů, které vytvářejí pevné hlávky, je tento problém velmi závažný. Pěstitelé se snaží často omezit poškození, způsobené mšicemi opakovaným postřikem rostoucích rostlin pesticidy, zvláště v případě, že počasí je příznivé pro množení mšic.

Používání vysokého množství pesticidů je však nežádoucí z hlediska životního prostředí. Mimoto není možno zaručit, že pesticidy skutečně zasáhnou mšice, například v případě zavírajících se hlávek salátu.

Odolnost rostlin, na nichž se mohou mšice vyskytovat, to znamená odolnost hostitelských rostlin je alternativou k použití pesticidů, přičemž tato alternativa by byla velmi výhodná z hlediska životního prostředí. Z tohoto důvodu byly prováděny četné pokusy, dokud jde o odolnost proti N. ribisnigri a o dědičnost tohoto typu odolnosti. Byla již popsána částečná odolnost pro řadu kultivarů salátu proti N. ribisnigri podle publikace Dunn J. A. a Kempton D. P. H., 1980, Tests of Agrichemical and Cultivars, č. 1, Ann. appl. Biol. 94, doplněk, str. 58 až 59. Téměř úplná odolnost k N. ribisnigri byla prokázána u divoké variety salátu Lactuca, L. virosa L. podle Eenink

A. H. a Dieleman F. L., 1983, Euphytica32, 691 až 695. Tato odolnost u L. virosa byla způsobena jediným dominantním genem, který byl označen Nr.

V roce 1981 byly vytvořeny v Institute for Horticultural Plant Breeding (IVT, nyní část CPRODLO) ve Wageningen rostliny L. sativa, které ve svém genomu obsahovaly fragment chromo40 somu L. virosa s genem Nr pro odolnost proti N. ribisnigri. Tyto rostliny byly výsledkem programu hybridizace L. virosa a L. sativa, přičemž byla k přemostění použita L. serriola. Taková Čeleď se užívá v případě, že jiné dvě čeledi mohou být spolu jen omezeně zkříženy, tak, jak tomu je v případě L. virosa a L, sativa.

Vytvořené rostliny však měly nežádoucí fenotyp a agronomické vlastnosti, nevytvářely žádoucí hlávky ajejich kultivace byla obtížná.

Vzhledem k uvedeným nežádoucím vlastnostem byly tyto rostliny užity pro účely křížení jako rodičovské rostliny pro hybridizaci k získání dalších rostlin pomocí genetické rekombinace a selekce tak, aby mohlo být dosaženo kombinace odolnosti proti N. ribisnigri s dobiými agronomickými vlastnostmi.

L. sativa je jednoletá rostlina, avšak v případě pěstování za umělého světla při vyšší teplotě je možno v průběhu jednoho roku vyprodukovat 2 až 5 generací. Zpětné křížení je obecně známý a vhodný postup pro křížení genů z “dárce“ do genetického základu za získání cenného agro-1 nomického materiálu. Obecně je možno zajistit uložení dominantního genu do agronomicky přijatelného fenotypu v průběhu 3 až 5 zpětných křížení, následovaných 2 až 3-násobným samoopylením. K získání ní agronomicky přijatelných rostlin s požadovaným genem v jejich genomu je tedy zapotřebí 5 až 8 generací v průběhu 3 až 5 let. Přestože rostliny, obsahující genNr byly připraveny již v roce 1981 s možností dodávky pro osev, úspěšný přenos tohoto genu do agronomicky přijatelných rostlin salátu nebyl až dosud s úspěchem uskutečněn.

Vynález si klade za úkol vytvořit rostliny z čeledi Compositae, zvláště nové rostliny salátu, které by spojovaly odolnost proti mšicím z čeledi Nasonovia ribisnigri s agronomicky vhodnými ío vlastnostmi.

Vynález je založen na zjištění, které bylo prokazováno v průběhu selekčního postupu, že totiž při přenosu genu pro odolnost rostlin salátu chromosomovým fragmentem L. virosa dochází vlivem tohoto chromosomu ke zhoršení agronomických vlastností salátových rostlin. Jde o vedlejší účinek chromosomového fragmentu, v němž je genNr uložen, na genom L. sativa. Ve srovnání s pěstovanými salátovými rostlinami, které nenesou gen pro tuto odolnost jsou homozygotní rostliny s genem Nr menšího vzrůstu, mají světlezelenou barvu a ve starších listech dochází k urychlenému rozkladu chlorofylu u generativních rostlin. V důsledku toho mají generativní rostliny starší listy bělavé nebo zcela bílé a/nebo mají sníženou výšku rostlin. Tento agronomicky nežádoucí fenotyp bude dále v průběhu přihlášky označován jako fenotyp CRA (Compact growth and Rapid Ageing). Na obr. 1 je znázorněn příklad rozdílu mezi normálními rostlinami, salátu a rostlinami fenotypu CRA. Ve vegetativním stadiu jsou příznaky zvláště zjevné v případě, že rostliny rostou za méně výhodných podmínek, například při nižší teplotě.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří rostliny, odolné proti mšicím, obsahující ve svém genomu genNr pro odolnost, přičemž genetická informace pro vznik fenotypu CRA v rostlinách chybí alespoň do takového rozsahu, že nedochází k expresi tohoto fenotypu.

Vynález je založen na poznatku, že fenotyp CRA není důsledkem přítomnosti genu Nr, nýbrž genetickou informací z blízkosti tohoto genu. Z tohoto důvodu bylo pozorováno, že existuje souvislost mezi odolností rostlin a fenotypem CRA. Při přerušení spojení mezi genem Nr a některými složkami v jeho blízkosti je však možno vypěstovat odolné a agronomicky přijatelné rostliny. Z literatury bylo zjištěno, že v průběhu křížení bylo pozorováno, že také jiný materiál z L. virosa bývá často příčinou vzniku fenotypu CRA, například podle publikace Maxon Smith a Langton,. The Grower, 21,9. 1989, str. 54 až 55, kde se popisuje souvislost mezi kompaktním růstem a odolností proti Bremia lactucea, přenesené do pěstovaného salátu z L. virosa. CRA fenotyp je recesi vní vlastnost, k expresi tohoto fenotypu dochází pouze u homozygotně odolných rostlin. Na základě tohoto poznatku je však možno uvedený problém vyřešit.

Na základě svrchu uvedených skutečností je zásadně možno vybírat rostliny, u nichž byla z blízkosti genu Nr odstraněna genetická informace pro fenotyp CRA nebo byla pozměněna natolik, že již nedochází k současné expresi odolnosti a fenotypu CRA. Jako příklad se v průběhu přihlášky uvádí genNr pro odolnost, avšak zásadně je možno vynález aplikovat i na jiné vlastnosti, spojené s fenotypem CRA při použití materiálu z L. virosa.

Odstranění nebo změna genetické informace, v jejímž důsledku dochází ke vzniku fenotypu CRA je možno uskutečnit rekombinací v blízkosti genu. V současné době není zcela prokázáno, zda informace pro fenotyp CRA leží na pravé nebo levé straně genomu nebo zdaje uložena po obou jeho stranách. V případě, že je genetická informace pro fenotyp CRA uložena na obou stranách genu pro odolnost, odstraní se nebo se změní s výhodou obě části této genetické informace. Podle vynálezu se tedy s výhodou vybírají rostliny, u nichž došlo nejméně ke dvěma rekombinačním jevům. Ktéto rekombinací nemusí samozřejmě dojít v průběhu jedné generace, i rekombinaění

-2cz zyy/u bď postupy, probíhající v po sobě následujících generacích, mohou ve svém důsledku vést k odstranění nebo ke změně genetické informace na obou stranách genu pro odolnost. V případě, že informace pro fenotyp CRA je uložena pouze na jedné straně genu, stačí samozřejmě uskutečnit jedinou rekombinaci.

Pod pojmem „rekombinační jev“ se rozumí meiotický crossing-over. |

Rostliny bez fenotypu CRA je možno získat běžnou hybridizací. Je však zapotřebí použít '1 správných kriterií pro selekci. Podle vynálezu byla nyní správná kriteria pro selekci definována, 4 jde zejména o úplnou nebo částečnou nepřítomnost nebo neúčinnost části genetické informace z blízkosti genu pro odolnost. Podle vynálezu je nepodstatné, do jakého rozsahu byla genetická informace v blízkosti genu pro odolnost odstraněna nebo jakým způsobem byl gen nebo byly geny pro CRA deaktivovány, pokud je fenotyp CRA nepřítomen rostlině i jejím potomstvu.

Aby bylo možno vyhledat rostliny, u nichž došlo k rekombinaci mezi genem Nr a geny, které vyvolávají fenotyp CRA se systematicky sledují oddělené populace nebo potomstvo těchto populací k získání rostlin, obsahujících rekombinantní fenotyp, to znamená homozygotní odolnost proti N. ribisnigri v kombinaci s nepřítomností fenotypu CRA. Přesto že je možno získat vhodné rekombinantní rostliny tímto způsobem, jak je také zřejmé z příkladů, existuje přesto řada příčin, v jejichž důsledku může dojít ke komplikacím při nacházení agronom icky cenných rekombinantních rostlin.

Při selekci na spojení odolnosti s dobrými agronomickými vlastnostmi bylo prokázáno, že rostliny, které spojují odolnost proti N. ribisnigri s agronomicky cenným fenotypem téměř vždy nejsou výsledkem rekombinace v chromosomu, ale jsou heterozygotní z důvodu přenesení chromosomového fragmentu L. virosa. Bylo prokázáno, že fenotyp CRA se dělí recesivně. Vzhledem k tomu, že gen Nr je dominantní u rostlin s jedinou kopií chromosomového fragmentu L. virosa, budou tyto rostliny spojovat odolnost s normálním fenotypem, odlišným od CRA. Potomstvo takových rostlin se však bude dělit a budou se v něm objevovat rostliny s fenotypem CRA, takže komerční využití nebude možné vzhledem k tomu, že využitelné variety salátu musí být čisté linie, odpovídající přísným požadavkům na genetickou homogenitu, jinak nemohou být použity.

Bylo dále zjištěno, že exprese odolnosti je biologická vlastnost, která závisí na různých pokusných podmínkách a i na okolních podmínkách, takže při zkoušce na odolnost je určitý podíl rostlin klasifikován nesprávně, takže rostliny s obsahem genu Nr jsou považovány za neodolné a rostliny bez tohoto genu jsou naopak považovány za odolné. Totéž platí o hodnocení fenotypu CRA u jednotlivých rostlin v polních podmínkách nebo ve skleníku. V závislosti na pokusných a okolních podmínkách bude určitý pódii rostlin, obsahujících chromosomový fragment L. virosa hodnocen jako normální rostlina, zatímco řada rostlin, v nichž je chromosomový fragment přítomen za heterozygotních podmínek nebo zcela chybí, může mít vlastnosti, v jejichž důsledku budou rostliny zařazeny do fenotypu CRA.

Přes svrchu popsané potíže, knimž může dojít je zřejmé, že selekce požadovaných rostlin s genetickou informací bez fenotypu CRA je běžným způsobem možná. Tento způsob selekce však vyžaduje poměrně velkou populaci nebo velký počet hybridizací.

Z uvedených důvodů může být účinnější využít pro selekci vhodných rostlin molekulární biologii. Výjimečně vhodným způsobem je způsob AFLP, popsaný v publikaci VosP. a další,

Nucleic Acíds Research, 1995, sv. 23, ě. 21, 4407 až 4414. Tento postup je založen na zjištění polohy markérů DNA, které jsou genericky spojeny s genem Nr, takže je možno poměrně jednoduchým způsobem prokázat, zda došlo k rekombinaci v blízkosti genu Nr v potomstvu při hybridizačním pokusu. V případě, že vázaný markér chybí, došlo ke crossin-over mezi genem Nr a tímto markérem. Volbou markérů v různé vzdálenosti od genu je rovněž možno stanovit, jak velký úsek sekvence byl z blízkosti genu odstraněn. Potomstvo, v němž jeden nebo větší počet markérů chybí, tedy má odstraněnou alespoň část nežádoucí sekvence z blízkosti genu, takže tyto rostliny mají větší než průměrnou naději, že obsahuji chromosom s genem Nr bez genetické informace, v jejímž důsledku dochází ke vzniku fenotypu CRA. Účinnost selekce rostlin s kom-3CZ 299713 B6 bínací homozygosity pro gen Nr a nepřítomnosti fenotypu CRA je tedy možno při použití molekulárních markérů významně zvýšit.

Mapování generických markérů v blízkosti genu je postup, který může snadno provést běžný odborník a který byl popsán například v publikacích Lefebvre V. a Chevre A. M„ Tools for marking plant disease and pěst resistance genes: a review, Agronomie 15, 1995, (1): 3 až 19, Michelmore R. W. Molecular aprroaches to manipulation of diesease resistance genes, Annjual Review of Phytopathology 33, 1995, 393 až 427, Michelmore R. W., Kesseli R. V. a Ryder E. J., Genetic mapping in lettuce, v R. L. Phillips a 1. K. Vasil, eds., DNA-based markers in plants, ío Kluwer Acad. Publishers, Dordrecht, 1994, str. 223 až 239, Winter P. a KahlG., Molecular markér technologies for plant improvement, World Journal of Microbtology and Biotechnology, 1995, (4), 438 až 448. Obecné informace o technologii AFLP je možno nalézt ve svrchu uvedené publikaci Vos P. a další. V příkladu 2 bude dále vysvětleno použití technologie AFLP pro selekci rostlin podle vynálezu.

Vynález je v průběhu přihlášky osvětlen na pěstovaných rostlinách salátu Lactuca sativa. Každému odborníkovi je však zřejmé, že principy vynálezu jsou zcela obecné a aplikovatelné nejen na další čeledi rodu Lactuca, nýbrž obecněji na rostliny Composrtae. Údaje, týkající se L. sativa, by tedy neměly být chápány jako omezení rozsahu vynálezu.

Podle vynálezu se s výhodou užívá genu pro odolnost z L. virosa. Rostliny podle vynálezu jsou samozřejmě zcela fertilní a dokud jde o gen pro odolnost homozygotní. Vzhledem k nepřítomnosti genetické informace pro fenotyp CRA nemají snížený růst ani méně syté zelené zbarvení, listů ani u nich nedochází k předčasnému rozpadu chlorofylu u rostlin v generativní fázi.

Pod pojmem „pěstovaný salát“ nebo „pěstované rostliny salátu“ se rozumí salát, který je vhodný pro spotřebu a může splnit požadavky na komerční využití. Mimoto by měly obsahovat salátové rostliny materiál, vhodný pro další propagaci těchto rostlin. Příkladem materiálu, vhodného pro další propagaci rostlin salátu jsou orgánové tkáně, například listy, stonky, kořeny, výhonky a podobně, protoplasty somatické embrya, prašníky, blizny, burky v kultuře a podobně. Deriváty, vhodné pro další propagaci rostlin jsou například semena. Rostliny podle vynálezu je možno pěstovat nebo množit běžným způsobem, avšak také pomocí tkáňových kultur z některých částí těchto rostlin.

Rostliny podle vynálezu, které jsou charakterizovány nepřítomností fenotypu CRA v přítomnosti genu Nr při homozygotním stavuje možno použít k přenosu odolnosti proti N, ribisntgri na další agronomicky cenné typy salátu. Toho je možno dosáhnout například pomocí standardního zpětného křížení pro dominantní gen, například podle publikace Briggs F. N. a Knowles P. F„ 1967, v Principles Of plant breeding, str. 162 až 167 s následným samoopylením rostlin po nejméně dvě generace s následnou selekcí linií, které jsou homozygotní pro gen pro odolnost.

V určitém stupni selekce je možno užít zkříženého opylení. Zkřížené opylení u rostlin schopných samoopylení však vyžaduje zábranu samoopylení u rostliny, užité jako samičí rostlina. Toho je možno dosáhnout ručním odstraněním samčích části reproduktivních orgánů. Je také možno použít jiného fyzikálního odstranění, chemického odstranění a/nebo použití vody. Všechny tyto postupy pro odstranění nebo vyvolání disfunkce samčích částí reproduktivních orgánů jsou známé. Potomstvo této hybridizace je možno získat odebráním semen z hybridizované samičí rostliny, s následným výsevem semen F1 nebo semen po zpětném křížení k získání nových rostlin. Rostliny F1 mohou být schopné samoopylení za vzniku generace F2 nebo mohou být zpětně zkříženy s rodičovskou rostlinou. Tyto zpětné zkřížené rostliny mohou být znovu zpětně zkříženy s rodičovskou rostlinou ke zlepšení agronomické hodnoty rostlin v následující generaci nebo může dojít k samoopylení k získání rostlin, homozygotních pro gen Nr.

i

Podle prvního specifického provedení vynálezu je možno získat rostliny L. sativa L. linie RZ

96.85123, získání těchto rostlin bude dále podrobněji vysvětleno v příkladu 2. Rostliny této linie

-4CZ 299713 B6 jsou homozygotní vzhledem ke genu Nr a neobsahují genetickou informací, která vede ke vzniku fenotypu CRA. Rostliny nejsou malé a/nebo zažloutlé jako rostliny CRA, V případě, že rostliny nejsou ani malé ani zažloutlé, je zřejmé, že chybí dostatečná část generické informace pro fenotyp CRA nebo byla tato genetická informace dostatečně deaktivována. Semena rostlin linie

RZ 96.85123 byla uložena do sbírky NCIMB pod číslem 40804 dne 16. května 1996 pod pod. mínkou, že vzorky uložených semen mohou být do udělení patentu vydávány pouze odborníkům.

Podle dalšího specifického provedení vynálezu se uvádějí výsledky běžné hybridizace a specifické selekce podle příkladu 1, jejichž výsledkem byly rostliny linie RZ 96.75906. Tyto rostliny jsou rovněž homozygotní pro gen Nr a chybí jim genetická informace pro fenotyp CRA. Semena ío rostlin linie RZ 96.75906 byla rovněž uložena do stírky NCÍMB pod číslem 40803 16. května

1996.

Součást podstaty vynálezu tvoří potom způsob získávání rostlin podle vynálezu, který spočívá v tom, že se vybere rodičovská rostlina, která je heterozygotní pro odolnost typu genu Nr, vytvoří se potomstvo ve formě segregační populace a potomstvo této populace a u tohoto potomstva se prokáže přítomnost odolnosti a přítomnost fenotypu CRA. Segregační populaci je možno vytvořit různým způsobem, například samoopylením heterozygotní rodičovské rostliny, křížením heterozygotní rodičovské rostliny s odolnou rostlinou a použití dvojitého haploidního postupu u heterozygotní rodičovské rostliny. V tomto případě se nové rostliny pěstují z dvojitých gamet rostliny. Gamety mohou pocházet ze samčích reproduktivních orgánů (androgenese) nebo ze samičích reproduktivních orgánů (gynogenese). Kultura zdvojených aploidů obvykle vyžaduje stupeň, provedení in vitro. Výhoda tohoto postupu při vyhledávání rekombinantů spočívá vtom, že gamety, z nichž rostlina pochází, jsou výsledkem meiotické rekombinace v heterozygotní rodičovské rostlině, kdežto výsledné zdvojené haploidy jsou zcela homozygotní, takže nemůže dojít k maskování účinků heterozygotních jedinců.

U rostlin, získaných postupem s použitím zdvojených haploidů může být výsledný rekombinant okamžitě rozpoznán. Jde o rostlinu s odolností a bez CRA. V liniích, získaných samovolným opylením rostlin ze segregačních populačních linií je možno rekombinantní rostliny rozeznat tak, že celá linie je odolná, avšak v linii se stále vyskytují rostliny s CRA, nebo má linie normální fenotyp, avšak objevují se v ní odolné rostliny nebo je linie odolná a všechny rostliny mají normální fenotyp.

Účinnost tohoto postupu je možno podstatně zvýšit tak, ze před získáním potomstva od v podstatě každé rostliny se provádí předběžná zkouška na rostlinách, na nichž se jeví výsledky požadované rekombinance. Taková předběžná zkouška může být provedena pří použití metod molekulární biologie, například pomocí AFLP. Selekce tímto postupem je založena na detekci rekombinace v blízkosti uložení genu Nr v genomu rostliny ve sledované populaci.

Vynález bude dále osvětlen souvislosti s příklady provedení, které jsou určeny pro popis jednotlivých praktických provedení vynálezu, nemají však sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Nejprve budou obecněji popsány jednotlivé postupy a pak budou v jednotlivých příkladech uvedeny specifické podrobnosti jednotlivých pokusů.

Materiály a metody 1, Zkouška na odolnost

Odolnost proti N. ribisnigri je možno prokázat tak, že se populace rostlin pěstuje a každá rostlina se naočkuje určitým počtem mšic N. ribisnigri, například 15. Odolnost je prokázána v případě, že po určité době, například 7 dnů je počet mšic na rostlině O nebo méně než počáteční počet, zatímco u rostlin bez odolnosti dojde po této době ke zvýšení počtu mšic.

-5CZ 299713 B6

Rostliny bez odolnosti jsou pěstovány současně jako rostliny kontrolní. U těchto kontrolních rostlin musí dojít prokazatelně k množení mšic, aby bylo možno test zařadit do pokusu. Zkouška se s výhodou provádí při teplotě 18 až 24 °C při minimální délce dne 14 hodin. Pro naočkování N. ribisnigri se s výhodou užijí malé rostliny ve vegetativní fázi s přibližně 1 až 3 pravými listy, i když je možno použít i starší rostliny. Pokusy na odolnost proti mšicím N. ribisnigri je možno provádět jak za polních podmínek, tak také ve skleníku.

Mšice, použité pro uvedenou zkoušku, byly mšice červeného biotipu, označované WN1, tento biotyp je možno získat z Department of Entomology of the Agricultival Universiry of io Wageningen. Před pokusem se mšice pěstují na rostlinách salátu. Je samozřejmě možno použít také zeleně zbarvené mšice. Při zkoušce na odolnost byla semena vysévána do kompostových bloků a mšice byly přeneseny na mladé rostlinky saláru 2 týdny po vysetí.

2. Hybridizace

Pro první hybridizaci se užije jedna z rodičovských rostlin, která je homozygotní, pokud jde o odolnost proti N. ribisnigri a která má agronomicky nežádoucí vlastnosti, jako snížený růst, méně intenzivní zelenou barvu a/nebo časný rozpad chlorofylu v generativní fázi. Jako druhá rostlina se užije rostlina, která není odolná proti N-ribisnigri a nemá agronomicky nežádoucí vlastnosti.

Rostliny Fl, získané hybridizaci je možno zpětně křížit s původní rodičovskou rostlinou bez odolnosti proti N. ribisnigri nebo jinou rostlinou bez této odolnosti je možno ji pěstovat v generaci F2, získané samoopylením. Takto získané rostliny BC1 po zpětném křížení nebo F2 je také možno pěstovat v další generaci samoopylením nebo je možno je znovu užít jako rodičovské rostliny pro hybridizaci. Zjištění rostlin, u nichž došlo k rekombinaci v blízkosti uložení genuNr pro odolnost při použití AFLP nebo jiného postupu s použitím molekulového značení je možno úspěšně uskutečnit v populaci, která se dělí na rostliny, obsahující nebo neobsahující gen Nr. Může jít o populaci, získanou samoopylením heterozygotní rostliny, jak bude dále uvedeno v příkladu 2, nebo o populaci, získanou zpětným křížením heterozygotní rostliny, s výhodou rostliny z odolné rodičovské linie. Selekce pro rekombinaci mezi odolností proti N. ribisnigri a feno30 typem CRA je možno účinně uskutečnit na populaci inbredních linií rostlin z populace, která se dělí na rostliny, obsahující a neobsahující gen Nr.

Pod pojmem linie se rozumí skupina semen nebo rostlin, získaná samoopylením jediné rostliny.

Účinnost selekce při použití molekulového značení je možno zvýšit při použití předběžné selekce. Pak se dále sledují na odolnost a na přítomnost fenotypu CRA pouze rostliny, u nichž bylo pomocí značení pokázáno, že došlo k rekombinaci v blízkosti místa uložení genu Nr.

Rozrušení spojení odolnosti a fenotypu CRA je možno prokázat u populace linií (po případně předběžné selekci pomocí molekulového značení) tak, že se určitý počet rostlin vjedné linii, například 25 rostlin sleduje na odolnost proti N. ribisnigri a tytéž nebo jiné rostliny, například opět v počtu 25 rostlin se sledují na přítomnost fenotypu CRA. Na bázi těchto dvou zkoušek je možno každou linii klasifikovat podle následujících kriterií;

Odolnost:

a) homogenní odolnost,

b) dělení na odolné a neodolné rostliny,

c) homogenně neodolné rostliny.

Fenotyp CRA:

a) uniformní fenotyp CRA,

b) dělení na rostliny s fenotypem CRA a na rostliny s normálním fenotypem,

c) homogenní normální fenotyp.

-6CZ 299713 B6

Rekombinantní rostliny, které jsou homozygotní pro gen Nr bez fenotypu CRA je možno nalézt:

1) v liniích, které jsou homogenně odolné proti N. ribisnígri a ne všechny rostliny mají fenotyp CRA a

2) v liniích, které uniformně mají normální fenotyp a ne všechny rostliny jsou bez odolnosti proti

N. ribisnígri.

V prvním případě byly pro produkci semen zvoleny rostliny bez fenotypu CRA. Potomstvo, získané samoopylením těchto rostlin bylo znovu podrobeno zkouškám na odolnost a na přítom10 nost fenotypu CRA a linie, které byly homogenně odolné a současně měly normální fenotyp, byly uchovány.

Ve druhém případě, byly pro produkci semen zvoleny odolné rostliny. Potomstvo po samoopylení těchto rostlin bylo opět podrobeno zkouškám na odolnost a na přítomnost fenotypu CRA a linie, které byly homogenně odolné a měly normální fenotyp, byly uchovány.

3. Selekce pomocí AFLP

Z každé rostliny se pro provedení zkoušek odebere malá část listu, například 50 mg a extrahuje se DNA. Aby bylo možno provést zkoušku na vazbu mezi značením AFLP a genem Nr, musí být každá rostlina rovněž podrobena zkouškám na odolnost proti N. ribisnigri. Detekci AFLP nebo jiného molekulového značení, vázaného na genNr je možno uskutečnit srovnáním přítomnosti značení v jednotlivých odolných nebo neodolných rostlinách nebo tak, že se smísí DNA ze skupin neodolných nebo odolných rostlin a sleduje se přítomnost značení v těchto směsích DNA. Na bázi přítomnosti značení v jednotlivých rostlinách dělící se populace je možno zanést značení, spojené s genem Nr do příslušné mapy a určit tak genetickou vzdálenost mezi dvojím značením a mezi značením a genem Nr. Způsoby detekce stupně genetického spojení vzájemně mezi značením a mezi značením a genem pro určitou vlastnost náleží mezi běžné postupy, uvedené v příručkách. Obvykle je k dispozici počítačový software pro provádění těchto studií, jde například o program Joinmap (CPRO-DLO, Wageningen).

Při použití značení, vázaného v blízkosti místa uložení genu Nr je možno zjistit rostliny, u nichž došlo k jedné nebo většímu počtu rekombinací blízkosti místa uložení genuNr. Rostliny s touto řeko mb i nací jsou charakterizovány tím, že část značení, spojená s genem Nr byla nahrazena značením z rostliny bez odolnosti, avšak s normálním fenotypem bez přítomnosti CRA.

Vývoj značení a průkazu značení pro tyto postupy byl uskutečněn v Keygene NV, Agro Business Park 90, Post Box 216, 6700 AE, Wageningen. Byl použit pauze postup AFLP, vyvinutý a patentovaný Keygene. Podrobnosti jsou uvedeny v publikaci P. Vos a další, AFLP: A new technique for DNA fingerprinting, Nucleic Acids Research, 1995, 23, (21), 4407 až 4414.

Technika AFLP je nyní dodávána z různých zdrojů a může ji provést každý odborník. Pro běžné odborníky je tedy nyní detekce značení, spojeného s genem, běžnou záležitostí, pokud jsou k dispozici vhodné populace rostlin. Je zřejmé, že při volbě vhodných restrikčních enzymů a primerů je možno vytvořit velké množství odlišného značení AFLP a toto značení spojit s určitým genem za získání řady blízce spojených značení k průkazu meiotické kombinace v blízkosti určeného místa, rozhodující je pouze počet použitých značení a jejich distribuce v chromosomovém fragmentu, v němž má být rekombinace prokázána.

Příklad l

Běžná hybridizace

Rostliny L. sativa L. podle vynálezu byly získány podle následujícího schématu:

-7CZ 299713 B6

Linie 793202 x BC2 (Calona x donor) ví

'2. x·ΒΓ2(Saladin RZ x Ř18' donor) 4 •Fl x.' Saladin RZ

Saladin RZ. x Fl

Fx .4;

F 2 _; .

F3 x Saladin '.4 ' 'Fl

F2

F3 ' 4...

F4 .

tisk RZ

F5, mimo jiné linie 96.75906.

Rostlina z linie ÍVT 793202, jedna z linií s genem Nr, vyvinutý v roce 1981 z Institute for Hortícultural Plant Breeding (TVT), Wageningen, byla zkřížena s rostlinou naší vlastní selekční linie salátu s plnou odolností proti plísni, vyvolané Bremia lactucae (BC2 (Calana x R18 donor)). Semena Fl tohoto křížence byla vyseta a dále pěstována do stadia F2. Rostliny F2 byly podrobeny zkouškám na odolnost proti N. ribisnigri a na morfologii a vybraná odolná rostlina F2 byla ío zkřížena s rostlinou typu Saladin s plnou odolností proti B. Lactucae, BC2 („Saladin RZ“ x R18 donor). Rostliny Fl z tohoto křížení byly sledovány na odolnost proti N. ribisnigri a zpětně zkříženy s rostlinou „Saladin RZ“. Rostliny Fl z tohoto křížení byly sledovány na odolnost proti N. ribisnigri a znovu kříženy s rostlinou typu „Saladin RZ“. Semena Fl z tohoto křížení byla vyseta a pěstována k získání rostlin F2, které byly sledovány na odolnost proti N. ribisnigri a pro morfologii a odolná rostlina F2 s křehkou hlávkou byla pěstována v linii F3. Linie F3 byly znovu zkoušeny na odolnost a -na fenotyp a rostlina F3, vybraná pro křehkou hlávku byla zkřížena s rostlinou typu „Saladin Quick RZ“. Generace Fl z tohoto křížení byla sledována na odolnost proti N. ribisnigri a pěstována k získání rostlin F2. Rostliny z generací F2, F3 a F4, pocházející z jedné rostliny Fl z této hybridizace byly podrobeny zkouškám na odolnost proti N. ribisnigri a

-8CZ 299713 B6 na fenotyp. Vybrané rostliny F2 a F3, spojující odolnost s požadovaným fenotypem, odlišným od CRA byly vždy heterozygotní, pokud jde o genNr. Avšak v generaci F4 tohoto křížení byla nakonec nalezena linie, která měla normální fenotyp s křehkou hlávkou bez příznaků CRA a mimoto se stále ještě dělila na rostliny neodolné a odolné proti N. ribisnigri. V dalších generacích několika rostlin F4 (mimo jiné šlo o linii RZ 96.75906) již nedocházelo k dělení na rostliny neodolné a odolné proti N. ribisnigri a rostliny byly homozygotní, pokud jde o gen Nr a současně neobsahovaly CRA a měly agronomicky cenný fenotyp.

Je nutno uvést, že tento příklad popisuje historii, vznik a vývoj rostlin podle vynálezu. Nepopíšuio je všechny generace, získané těmito hybridizacemi, ale pouze ty generace, které jsou přímým . potomstvem uvedených rostlin. Byly sledovány ještě další hybridizační větve podle uvedeného schématu selekce, avšak prozatím bez požadovaného výsledku, to znamená bez získání homozygotních rostlin bez příznaků CRA, odolných proti N. ribisnigri.

Příklad 2

Detekce rekombinantních rostlin předchozí selekci pomocí značení AFLP

Rostliny L. sativa L. podle vynálezu byly získány z jediného křížence mezi linií, odolnou proti

N. ribisnigri, IVT 793202 z Institute for Horticultural Pland Breeding a rostlinou salátu s křehkou hlávkou, variety „Ultra RZ“. Z rostliny Fl tohoto křížení byla odebrána semena, semena F2 byla vyseta a z řady rostlin byla získána semena F3.

Z tohoto křížení bylo podrobeno zkouškám na odolnost 140 rostlin linie F3, dělící se podle odol25 nosti a pocházející z jediné rostliny F2, heterozygotní, pokud jde o genNr. Ze zkoumaných rostlin bylo 95 rostlin odolných, 32 neodolných a u tří rostlin nebylo možno odolnost jasně vyhodnotit. Z rostlin F3 s jednoznačnou odolností byl odebrán materiál z listů pro analýzu DNA. Výchozím bodem pro detekci značení AFLP, spojeného s genem Nr byla v první řadě skupina DNA z pěti odolných linií salátu včetně odolné donorové linie IVT 793202, DNA ze tří neodol30 ných linií, včetně Ultra RZ, dvě směsi DNA z neodolných variet a 44 jednotlivých rostlin ze svrchu uvedené linie F3, získané hybridizaci mezi IVT 793202 a Ultra RZ. Při těchto předběžných zkouškách byl identifikován jeden ko-dominantní značící prvek AFLP, který byl plně spojen s genem pro odolnost ve skupině 44 rostlin. Pomocí tohoto prvku je možno od sebe odlišit homozygotně a heterozygotně odolné rostliny,

Pomocí svrchu uvedeného ko-dominantního prvku bylo zkoušeno celkem 121 rostlin F3 z hybridizace mezi.IVT 793202 a Ultra RZ..Bylo tedy.možno rozdělit uvedené rostliny F3 na 35 homozygotně odolných, 60 heterozygotně odolných a 26 neodolných. DNA homozygotně odolných rostlin a homozygotně neodolných rostlin byla odděleně smísena. Z této „odolné“ a „neodolné“ směsi bylo provedeno 96 analýz sekvence. Bylo získáno 4300 pásů AFLP, z nichž 110 bylo spojeno s genem Nr a 25 bylo spojeno sallelou v tomto místě. 19 značících prvků AFLP bylo použito pro rekombinaci v blízkosti místa uložení genuNr. Z těchto 19 prvků bylo 14 spojeno s genem Nr, vyvolávajícím odolnost a 5 bylo spojeno s allelou neodolných rostlin.

Na bází této zkoušky s ko-dominantním značícím prvkem AFLP byly identifikovány dvě rostliny F3, které byly heterozygotní, pokud jde o gen Nr. Ze semen F4 těchto rostlin bylo vyseto v linii F4 800 rostlin. Byl odebrán materiál z listů těchto rostlin a byla izolována DNA. V DNA celkem 1575 rostlin Fl byla sledována rekombinace v případě 19 zvolených značících prvků AFLP. Při prvním stanovení byla nalezena rekombinace u 206 rostlin. Těchto 206 rostlin bylo znovu podrobeno zkoušce na přítomnost 19 značících prvků AFLP. Rekombinace pak byla potvrzena v blízkosti místa uložení genu Nr v případě 162 rostlin.

Byla pěstována semena F5 z 1575 uvedených rostlin. Semena F5 byla získána z 89 ze 162 rostlin, u nichž byla prokázána rekombinace značícího prvku na bázi analýzy AFLP. Získaných 89 linií

-9CZ 299713 B6

F5 bylo podrobeno zkouškám na odolnost proti N. ribisnigri a na fenotyp. V průběhu těchto zkoušek byla nalezena linie 94.85338, která se již nedělila podle odolnosti a byla homozygotně odolná v důsledku přítomnosti genu Nr, která se však stále ještě dělila na základě fenotypu CRA. 50 rostlin linie 94.85338 bylo analyzováno pomocí řady značících prvků AFLP. Po analýze při použití 22 prvků AFLP, spojených s genem Nr byla nalezena jedna rostlina, homozygotně rekombinantní pro 12 z 22 použitých značících prvků.'Ze semen F6 této linie 95.85051 bylo získáno další potomstvo. Linie pak byla znovu podrobena zkouškám na fenotyp i na odolnost a všechny rostliny této linie byly opět odolné proti N. ribisnigri a současně měly normální fenotyp bez příznaků CRA.

Z 11 rostlin linie 95.85051 byla vypěstována semena F7. Mimo jiné byla získána semena 96.85123, která byla uložena do sbírky.

Příklad 3

Uložení genu pro odolnost a určení místa uložení pomocí techniky AFLP

Obě rekombinantní linie RZ 96.85123 a RZ 96.75906 a několik kontrolních linií bylo podrobeno zkouškám při použití 21 značících prvků AFLP, které byly navázány na allely pro odolnost (zna20 cení cis). Značící prvky byly vyvinuty při křížení IVT 793202 x Ultra. Z předchozích zkoušek byla také známa nejpravděpodobnější sekvence různých značících prvků v genomu salátu. Byly sledovány následující genotypy:

1. IVT 793202 (vytvořená linie, Nasonovia-odolnost + CSV,

2. Ultra (BOTERSLARAS bez odolnosti proti Nasonovia, bez CSV,

3. Saladin (varieta salátu Iceberg bez odolnosti proti Nasanovia, bez CSV),

4. RZ 96.85123 (rekombinantní linie z příkladu 2, odolná proti Nasonovia, bez CSV),

5. RZ 96.75906 (rekombinantní linie z příkladu 1, odolná proti Nasonovia, bez CSV).

Výsledky, získané při použití značících prvků jsou uvedeny v následující tabulce.

’

Tabulka 1

Výsledky, získané při použití pěti linií salátu, podrobených zkouškám s použitím 21 značících prvků AFLP, vázaných na allelu pro odolnost (značení cis), prvky byly pravděpodobně uloženy mezi sekvencemi genomu.

Linie/ τ

varieta značení tis“ i i Z ϊ 1 i ί, Ϊ. 1 1 J 2

3 4 .5. 6 7 8 9 0 Ϊ 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1

IVT7S3202- τ ·+ ť >' r + + 4-4 + 4 + ť + + + + +: +

Ultra

Saladin - - <+ - - - + - - - - - - - + - - - - - 96...£5123 ----------, - .+ + ť. +. + + + 4

96.75906.· - - ± - - + +· τ + '+ : značící prvek je přítomen - : značící prvek chybí

Z výsledků, uvedených v tabulce 1 je zřejmé, že při použití trojího značení cis (číslo 3, 7 a 15) bylo dosaženo positivity i u variety salátu „Saladin“ a nejde tedy o polymorfii mezi varietou, neodolnou proti Nasonomia a oblastí z L. virosa v IVT 793202. Z hodnocení zbývajících

-10CZ 299713 B6 značících prvků vyplývá, že rekombinantní linie 96.85123 a 96.75906 odpovídají levé části vložené oblasti. U obou linií došlo k rekombinaci mezi značícími prvky 12 a 13. Vlevo od značícího prvku 13 neobsahuje ani jedna z linií značení cis. Z tohoto důvodu je velmi pravděpodobné, že gen nebo geny, které jsou kódovými geny pro CSV, jsou uloženy vlevo od značícího prvku 13 ve vloženém fragmentu zL. virosa. Linie96.75906 se liší od druhé rekombinantní linie vtom smyslu, že je rozdělena také na pravé straně. Mezi značícími prvky č. 15 a 16 došlo v linii 96.75906 k rekombinaci a tato linie neobsahuje značení cis vpravo od značícího prvku 15. Je tedy možno uzavřít, že gen pro odolnost proti Nasonovia je uložen přibližně mezi značícími prvky 12 a 16.

Claims (16)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Rostliny, odolné proti mšicím z čeledi Compositae, odolné proti mšicím Nasonovia ribisnigri v důsledku přítomnosti genuNr pro odolnost v genomu, ve kterých genetická informace, v jejímž důsledku se vytváří fenotyp CRA v genomu rostliny chybí alespoň do takového rozsahu, že nedochází k expresi fenotypu CRA.
2. 2. Rostliny, odolné proti mšicím podle nároku 1, ve kterých genNr pro odolnost je přítomen homozygotně.
3. 3. Rostliny, odolné proti mšicím podle nároku 1 nebo 2, kterými jsou rostliny salátu rodu 25 Lactuca, zvláště L. sativa L.
4. 4. Rostliny, odolné proti mšicím podle některého z nároků 1,2 nebo 3, získatelné tak, žě se

   a) vybere rodičovská rostlina, která je heterozygotní, pokud jde o odolnost Nr,

   b) vytvoří se dělicí populace,

   30 c) z v podstatě každé rostliny této populace se získá potomstvo,

   d) získané potomstvo se podrobí zkouškám na odolnost a na přítomnost fenotypu CRA,

   e) z potomstva se vybírají rostliny, které jsou odolné nebo které nemají fenotyp CRA,

   f) z těchto rostlin se samoopylením získají semena a ze semen potomstvo, tvořící linii, načež se

   g) linie podrobí zkouškám na odolnost a na·přítomnost fenotypu CRA a vybírají se linie, které 35 jsou uniformně odolné a současně nemají fenotyp CRA.
5. 5. Rostliny, odolné proti mšicím podle nároku 4, u kterých se dělicí populace získá samoopylením rodičovské rostliny, zkřížením rodičovské rostliny s odolnou rostlinou nebo zdvojenou haploidní technikou.
6. 6. Rostliny, odolné proti mšicím podle nároku 4 nebo 5, kde vhodné potomstvo ze stupně e) je potomstvo, v němž rostliny jsou uniformně odolné proti N. ribisnigri, přičemž nemají všechny fenotyp CRA, nebo jde o rostliny, které nemají fenotyp CRA a nejsou všechny neodolné proti N. ribisnigri.
7. 7. Rostliny, odolné proti mšicím podle nároku 4 nebo 5, kde vhodné potomstvo ze stupně e) je potomstvo, v němž rostliny jsou uniformně odolné proti N. ribisnigri a současně uniformně nemají fenotyp CRA, v tomto případě se neprovádějí stupně ť) a g) uvedeného postupu.

   50
8. 8. Rostliny, odolné proti mšicím podle některého z nároků 4 až 7, kde zkouška ve stupni d) je založena na nepřítomnosti fenotypu CRA, sledovaného okem.

   -11 CZ 299713 B6
9. 9. Rostliny, odolné proti mšicím podle některého z nároků 4 až 8, kde před stupněm c) se provádí předběžná selekce rostlin pomocí molekulární biologie tak, že se sleduje případný výskyt rekombinace mezi genetickou informací pro odolnost a genetickou informací pro fenotyp CRA. j

   5
10. 10. Rostliny, odolné proti mšicím podle nároku 9, kde se jako postup molekulární biologie užije technika AFLP.
11. 11. Potomstvo rostlin, odolných proti mšicím podle nároků 1 až 10, získané generativním nebo vegetativním způsobem.

    io
12. 12. Části nebo deriváty rostlin, odolných proti mšicím, podle nároků 1 až 11 vhodné pro množení.
13. 13. Části nebo deriváty rostlin podle nároku 12, kterými jsou tkáně, například listy, stonky,

    15 kořeny, výhonky, protoplasty, somatická embrya, prašníky, blizny, buňky v kultuře nebo semena.
14. 14. Části nebo deriváty rostlin podle nároků 1 až 11, vhodné ke spotřebě.
15. 15. Části nebo deriváty rostlin podle nároku 14, kde částmi, vhodnými ke spotřebě, jsou napří20 klad hlávky nebo listy.
16. 16. Způsob získávání rostlin podle nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že se

    a) vybere rodičovská rostlina, která je heterozygotní, pokud jde o odolnost Nr,

    b) vytvoří se dělicí populace,

    25 c) z v podstatě každé rostliny této populace se získá potomstvo,

    d) získané potomstvo se podrobí zkouškám na odolnost a na přítomnost fenotypu CRA,

    e) z potomstva se vybírají rostliny, které jsou odolné nebo které nemají fenotyp CRA,

    f) z těchto rostlin se samoopylením získají semena a ze semen potomstvo, tvořící linii, načež se

    g) linie podrobí zkouškám na odolnost a na přítomnost fenotypu CRA a vybírají se linie, které 30 jsou uniformně odolné a současně nemají fenotyp CRA.