NL1003261C2 - Bladluisresistentie in composieten. - Google Patents

Description

BLADLUISRESISTENTIE IN COMPOSIETEN

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op nieuwe planten van de familie Compositae. in het bijzon-5 der slaplanten van het genus Lactuca die resistent zijn tegen de bladluis Nasonovia ribisniari en daarbij agrono-misch wenselijke eigenschappen vertonen.

Bladluizen veroorzaken veel schade in de groenteteelt. Ze voeden zich aan het floëem van de planten en 10 veroorzaken daardoor verminderde of abnormale groei. Levende bladluizen of resten van bladluizen maken het geoogste produkt onverkoopbaar. Daarnaast vormt honingdauw, een suikerachtig vocht dat door de bladluizen wordt afgescheiden, een kleverige laag op de bladeren. Behalve 15 vanwege deze directe schade, zijn bladluizen ook zeer gevreesd omdat zij virusziekten verspreiden.

Nasonovia ribisniari is de soort bladluis, die in Europa het meest gevonden wordt op sla die in de vollegrond groeit. N. ribisniari is in het bijzonder 20 schadelijk omdat ze zich bij voorkeur voedt op de jonge bladeren van de plant. Hierdoor raken de bladluizen gemakkelijk gevangen in de zich sluitende kroppen, waardoor zij moeilijk toegankelijk worden voor pesticiden. Vooral in de sterk kroppende ijssla types veroorzaakt dit 25 grote problemen. Telers beperken de schade door bladluizen door herhaaldelijk pesticiden op het groeiende gewas te spuiten, -in het bijzonder wanneer de weersomstandigheden gunstig zijn voor de voortplanting van bladluizen.

Het gebruik van overmatige hoeveelheden pesticide is uit 30 milieu-oogpunt ongewenst. Bovendien missen pesticiden in bepaalde gevallen, zoals bijvoorbeeld hierboven beschreven voor zich sluitende slakroppen, hun doel.

Resistentie van de planten, waarop bladluizen voorkomen (waardplant-resistentie), is een milieuvriende-35 lijk alternatief voor het gebruik van pesticiden om de ontwikkeling van bladluizen in bijvoorbeeld sla te beheersen. Er is daarom reeds uitgebreid onderzoek gedaan naar resistentie tegen N. ribisniari en naar de overer- i <: o 2 ving van dit type resistentie. Voor een aantal sla-culti-vars werd een partiële resistentie tegen N. ribisniari beschreven (Dunn, J.A. & Kempton, D.P.H. (1980) Tests of Agrochemical and Cultivars, No. l, (Ann, appl. Biol. 94, 5 Supplement): 58-59). Een bijna volledige resistentie tegen N. ribisniari werd gevonden in de wilde Lactuca soort L. virosa L. (Eenink A.H. & F.L. Dieleman (1983) Euphytica 32:691-695). Deze Nasonovia resistentie in L. virosa bleek veroorzaakt te worden door een enkel domi-10 nant gen, dat Nr-gen genoemd wordt.

In 1981 werden door het voormalige Instituut voor de Veredeling van Tuinbouwgewassen (IVT, nu onderdeel van CPRO-DLO) in Wageningen L. sativa planten uitgegeven die in hun genoom een L. virosa chromosoomfragment 15 met het Nr-gen voor resistentie tegen N. ribisnigri bevatten. Deze planten resulteerden uit een kruisingspro-gramma met L.virosa en L.sativa. waarin L.serriola als brugsoort werd gebruikt. Een brugsoort wordt gebruikt wanneer twee soorten slechts in beperkte mate met elkaar 20 gekruist kunnen worden, zoals het geval was met L.virosa en L.sativa.

De uitgegeven planten waren qua fenotype en agronomische eigenschappen van een ongewenst type (niet kroppend, slechte teelteigenschappen).

25 Vanwege de ongewenste agronomische eigenschap pen werden deze planten op veredelingsbedrijven gebruikt als kruisingsouder, met als doel om door genetische recombinatie en selectie planten te verkrijgen die resistentie tegen N.ribisniari combineren met goede agronomi-30 sche eigenschappen.

L. sativa is een eenjarige soort, maar wanneer hij onder kunstlicht gekweekt wordt bij een verhoogde temperatuur kunnen binnen één jaar 2-5 opeenvolgende generaties gekweekt worden. Terugkruisingsprocedures zijn 35 een algemeen bekend en geschikt middel om genen uit een "donorouder", in te kruisen in een genetische achtergrond met een hoge agronomische waarde. In het algemeen kan het inkruisen van een dominant gen in een agronomisch accep-

1 0 0 3 ‘è. 6 I

3 tabel fenotype bereikt worden door 3-5 terugkruisingen, gevolgd door 2-3 zelfbestuivingen. Er zijn derhalve 5-8 generaties in 3-5 jaar nodig om agronomisch acceptabele planten te verkrijgen, die het gewenste gen in hun genoom 5 hebben. Echter, hoewel planten met het Nr-gen reeds in 1981 werden uitgegeven aan zaadbedrijven, is de succesvolle overdracht van het Nr-gen naar agronomisch acceptabele slaplanten tot nu toe nog niet gemeld.

Het is nu het doel van de onderhavige uitvin-10 ding planten van de familie Compositae. en dan met name nieuwe slaplanten, te verschaffen, die resistentie tegen bladluis van de soort Nasonovia ribisniari combineren met agronomische goede eigenschappen.

Dit doel werd volgens de uitvinding bereikt 15 doordat in de loop van een selectieprogramma werd gevonden dat de toepassing van deze resistentie in slaplanten met goede agronomische kenmerken werd verhinderd door negatieve neveneffecten, die het L. virosa chromosoom-fragment, waarop het Nr-gen gelegen was, met zich mee 20 bracht, wanneer het ingebracht werd in een L. sativa genoom. In vergelijking met gekweekte slaplanten zonder de N. ribisniqri resistentie vertoonden planten, die homozygoot waren voor het Nr-gen, namelijk een verminderde groei, een lichter groene kleur, en versnelde afbraak 25 van chlorofyl in de oudere bladeren in de generatieve plant (wanneer de plant schiet). Dit resulteerde in generatieve -planten met geheel of gedeeltelijk witte oudere bladeren en/of verminderde planthoogte. Dit agronomisch ongewenste fenotype zal in deze aanvrage verder 30 worden aangeduid met "CSV-fenotype", hetgeen betekent "Compacte groei en Snelle Veroudering". Figuur 1 geeft een voorbeeld van het verschil tussen normale slaplanten en CSV-planten. De CSV-symptomen zijn in het vegetatieve stadium vooral duidelijk als de planten onder stress 35 groeien (bijvoorbeeld bij lage temperatuur).

De uitvinding verschaft daarom planten met het Nr-resistentiegen in het genoom, waarbij de genetische informatie, die verantwoordelijk is voor het CSV-fenotype 10ö, 4 in tenminste zodanige mate ontbreekt in het genoom van de plant, dat het CSV-fenotype niet tot expressie komt.

De onderhavige uitvinding is gebaseerd op het inzicht dat het CSV-fenotype niet een gevolg is van het 5 Nr-gen zelf, maar veeleer van genetische informatie uit de omgeving van het resistentiegen. Volgens de uitvinding is derhalve gevonden dat er een koppeling bestaat tussen de resistentie en het CSV-fenotype. Door deze koppeling te verbreken kunnen wel resistente, agronomisch accepta-10 bele planten worden gekweekt. Overigens is uit de literatuur en uit eigen onderzoek gebleken dat ook andere eigenschappen uit L·. virosa vaak gepaard gaan met het CSV-fenotype, wanneer zij in andere planten worden ingekruist. Maron Smith en Langton (The Grower, 21/9/1989 15 p 54-55) beschrijven een koppeling tussen compacte groei en een resistentie tegen Bremia lactucea. dat uit L. virosa ingekruist werd in cultuursla. De onderhavige uitvinding verschaft ook hiervoor de oplossing nu is gebleken dat het CSV-fenotype genetisch gekoppeld is aan 20 de gewenste eigenschap. Het CSV-fenotype is een recessie-ve eigenschap, die slechts bij homozygoot resistente planten tot expressie komt.

Eenmaal tot dit inzicht gekomen werd het mogelijk planten te selecteren, waarin de genetische informa-25 tie voor het CSV-fenotype uit de omgeving van het gen in zodanige mate verwijderd of veranderd was dat de resistentie niet -langer in combinatie met het CSV-fenotype tot expressie gebracht werd. Als voorbeeld wordt in deze aanvrage het Nr-resistentiegen beschreven, maar het 30 principe van de uitvinding gaat uiteraard ook op voor andere uit L.virosa afkomstige, aan CSV gekoppelde eigenschappen .

Het verdwijnen of veranderen van de genetische informatie, die leidt tot het CSV-fenotype, wordt ver-35 oorzaakt door recombinatie-gebeurtenis(sen) in de omgeving van het gen. Op dit moment is niet geheel duidelijk of de CSV-informatie links of rechts van het gen ligt of er omheen. Wanneer de genetische informatie voor het CSV- 1 0 0 3 2:1 5 fenotype aan weerszijden van het resistentiegen ligt worden bij voorkeur beide delen van deze genetische informatie veranderd of verwijderd. Volgens de uitvinding zal in dat geval uiteindelijk bij voorkeur geselecteerd 5 worden op planten, waarbij twee of meer recombinatie-gebeurtenissen hebben plaats gevonden. Uiteraard behoeft een dergelijke dubbele recombinatie-gebeurtenis niet bij één generatie te hebben plaats gehad, maar kunnen ook recombinatie-gebeurtenissen uit volgende generaties 10 aanleiding geven tot de uiteindelijke verwijdering of verandering van de genetische informatie aan beide zijden van het resistentiegen. Indien de CSV-informatie slechts aan één zijde van het gen ligt is een enkele recombina-tiegebeurtenis uiteraard voldoende.

15 In deze aanvrage wordt met "recombinatie-ge beurtenis" een meiotische crossing-over bedoeld.

De planten zonder CSV-fenotype kunnen verkregen worden door middel van conventionele kruisingstechnieken. Voorwaarde is echter dat het juiste selectiecriterium 20 gehanteerd wordt. Volgens de uitvinding is nu een geschikt selectiecriterium gedefinieerd, namelijk het geheel of gedeeltelijk ontbreken of inactief zijn van een stuk genetische informatie uit de omgeving van het resistent ie-gen. Volgens de uitvinding is het niet relevant 25 hoeveel van de het resistentie-gen omringende genetische informatie in een recombinant ontbreekt of op welke wijze het CSV-gen -of de CSV-genen geïnactiveerd is, respectievelijk zijn, zolang het CSV-fenotype in de plant en zijn nakomelingen ontbreekt.

30 Om planten waarin recombinatie is opgetreden tussen het Nr-gen en genen die het CSV-fenotype veroorzaken te vinden, worden in de praktijk segregerende populaties, of nakomelingen van dergelijke populaties, gescreend op planten met een recombinant fenotype, dat wil 35 zeggen homozygote resistentie tegen N. ribisniqri in combinatie met een niet-CSV-fenotype. Hoewel het mogelijk is op deze manier geschikte recombinanten te vinden, zoals uit de voorbeelden blijkt, bestaat er echter een 1003261 6 aantal redenen waarom het vinden van agronomisch waarde-volle recombinanten bemoeilijkt kan worden.

In het selectieprogramma om resistentie te combineren met goede agronomische kenmerken is gebleken 5 dat planten die N. ribisniari resistentie combineren met een agronomisch waardevol fenotype vrijwel altijd niet het resultaat zijn van recombinatie in een chromosoom, maar dat ze heterozygoot zijn voor het ingekruiste L. virosa chromosoomfragment. Volgens de uitvinding werd 10 gevonden dat het CSV-fenotype recessief overerft. Omdat het Nr-aen dominant is zal een plant met een enkele kopie van het L. virosa chromosoom resistentie met een normaal (niet-CSV) fenotype combineren. Nakomelingen van dergelijke planten zullen echter op het CSV-fenotype segrege-15 ren en kunnen niet commercieel gebruikt worden, aangezien commericiële slarassen zuivere lijnen zijn, die moeten voldoen aan hoge eisen van genetische uniformiteit om in het verkeer gebracht te mogen worden. Verder werd gevonden dat, omdat de expressie van de resistentie een biolo-20 gisch kenmerk is dat afhankelijk is van verschillende omgevings- en experimentele omstandigheden, vaak een bepaalde fractie van de planten in een N. ribisniari resis-tentietest fout geklassificeerd wordt. Planten met het Nr-gen worden vatbaar geacht en planten zonder het Nr-aen 25 worden resistent genoemd. Hetzelfde geldt voor het scoren van het CSV-fenotype van individuele planten op het veld of in de ka&. Afhankelijk van de experimentele en omgevingsomstandigheden zal een bepaalde fractie planten met het ingebrachte L. virosa chromosoomfragment in homozygo-30 te toestand normaal bevonden worden, terwijl een aantal van de planten, waarbij het ingebrachte chromosoomfragment in heterozygote toestand aanwezig of totaal afwezig is, symptomen zouden kunnen vertonen die tot een foute klassificatie van het CSV-fenotype leiden.

35 Ondanks de bovenbeschreven moeilijkheden, die zich kunnen voordoen, zal uit de voorbeelden blijken dat de selectie van de gewenste planten, waarin de genetische informatie voor het CSV-fenotype ontbreekt, op de con- 1003261 7 ventionele wijze alleszins mogelijk is. Deze wijze van selecteren vergt echter wel een relatief grote splitsenden populatie of een groot aantal kruisingen.

Het kan daarom efficiënter zijn om bij de 5 selectie van geschikte planten gebruik te maken van moleculair-biologische hulpmiddelen. Een bijzonder goed bruikbare techniek is de AFLP-techniek, zoals beschreven door Vos, P. et al., in Nucleic Acids Research, 1995,

Vol. 23, No. 21: 4407-4414. Deze techniek toegepast op de 10 onderhavige uitvinding is gebaseerd op het in kaart brengen van DNA-merkers die genetisch gekoppeld zijn aan het ίίΕ-gen, waarna op betrekkelijk eenvoudige wijze van een nakomeling van een kruisingsexperiment bepaald kan worden of in de omgeving van het Nr-gen een recombinatie-15 gebeurtenis is opgetreden. Wanneer een gekoppelde merker ontbreekt heeft (dus) een overkruisings-gebeurtenis (crossing-over) tussen het Nr-gen en die merker plaats gevonden. Door merkers op verschillende afstanden van het gen te kiezen kan tevens bepaald worden of er veel of 20 weinig van de omgeving van het gen verdwenen is. Nakomelingen, waarbij één of meer gekoppelde merkers ontbreken missen dus tenminste een stuk van de ongewenste omgeving van het gen en hebben daarom een meer dan gemiddelde kans op de aanwezigheid van een chromosoom met het Nr-gen, 25 waarbij de genetische informatie die leidt tot het CSV-fenotype, afwezig is. De efficiëntie van de selectie van planten die homozygotie voor het Nr-gen combineren met afwezigheid van het CSV-fenotype kan met moleculaire merkers aanmerkelijk verhoogd worden.

30 Het in kaart brengen van genetische merkers in de omgeving van een gen is een door de gemiddelde molecu-lair-biologisch deskundige vrij gemakkelijk uitvoerbare procedure, die bijvoorbeeld wordt beschreven in Lefebvre, V. & A. M. Chevre. Tools for marking plant disease and 35 pest resistance genes: a review. Agronomie 15, 1995 (l): 3-19; Michelmore, R.W. Molecular approaches to manipulation of disease resistance genes. Annual Review of Phytopathology 33 (1995): 393-427; Michelmore, R.W., R.V.

1003261 δ

Kesseli & E.J. Ryder. Genetic mapping in lettuce. In: R.L. Phillips & I.K. Vasil (eds.) DNA-based markers in plants, Kluwer Acad. Publishers, Dordrecht, 1994, pp. 223-239; Winter, P. & G. Kahl. Molecular marker technolo-5 gies for plant improvement. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 1995, 11 (4): 438-448. Algemene informatie over de AFLP-technologie is te vinden in Vos, P. et al. (supra). In Voorbeeld 2 zal het gebruik van de AFLP-technologie voor het selecteren van planten volgens de 10 uitvinding verder worden toegelicht.

De onderhavige uitvinding wordt in deze aanvrage geïllustreerd aan de hand van de cultuursla Lactuca sativa. Het zal de deskundige duidelijk zijn dat de principes van de uitvinding eveneens van toepassing zijn 15 op andere soorten van het genus Lactuca. en meer algemeen op planten van de familie Compositae. Verwijzing naar L.sativa dient dus niet als een beperking van de uitvinding te worden geïnterpreteerd.

Volgens de onderhavige uitvinding is het resis-20 tentie-gen bij voorkeur afkomstig uit L.virosa. Uiteraard zijn planten volgens de uitvinding in hoofdzaak volledig fertiel en homozygoot voor het resistentiegen. Door het ontbreken van de genetische basis, die leidt tot het CSV-fenotype vertonen zij in hoofdzaak geen verminderde 25 groei, geen verminderde groenkleuring van de bladeren en geen vroegtijdige chlorofyl-afbraak wanneer de planten zich in de generatieve fase bevinden.

Met "cultuursla" of "gekweekte slaplanten" wordt sla bedoeld, die geschikt is voor consumptie en 30 voldoet aan de eisen voor commerciële teelt. Naast de slaplanten zelf, en de voor consumptie geschikte delen daarvan, zoals de kroppen of bladeren, omvat de uitvinding voor vermeerdering geschikte onderdelen of afgeleiden van de plant. Voorbeelden van voor vermeerdering 35 geschikte onderdelen zijn orgaanweefseis, zoals bladeren, stengels, wortels, scheuten en dergelijke, protoplasten, somatische embryo's, helmknoppen, bladstelen, cellen in kweek en dergelijke. Voor vermeerdering geschikte afge- 1003261 9 leiden zijn bijvoorbeeld zaden. De planten volgens de uitvinding kunnen op de conventionele wijze gekweekt of vermeerderd worden, maar ook door middel van weefsel-kweektechnieken uit plantedelen.

5 Planten volgens de uitvinding, die worden gekenmerkt door het ontbreken van een CSV-fenotype bij aanwezigheid van het Nr-gen in homozygote toestand, kunnen gebruikt worden om N. ribisniari resistentie in verschillende andere agronomisch waardevolle slatypen te 10 brengen. Dit gebeurt bijvoorbeeld door standaardterug-kruisingsprocedures voor een dominant gen (zie Briggs, F.N. & P.F. Knowles. (1967) In: Principles of plant breeding, pp. 162-167), gevolgd door zelfbestuiving van de planten gedurende tenminste twee generaties en het selec-15 teren van lijnen die homozygoot zijn voor het resisten-tiegen.

In bepaalde stappen van het selectieprogramma worden kruisbestuivingen gebruikt. Echter, kruisbestuiving van zelfbestuivende planten vereist dat in de plant 20 die gebruikt wordt als de vrouwelijke ouder zelfbevruch-ting voorkomen wordt. Dit kan bereikt worden door het met de hand verwijderen van de mannelijke delen van de voortplantingsorganen. Dit kan tot stand gebracht worden door fysieke verwijdering daarvan of door middel van chemische 25 middelen en/of het gebruik van water op de bloemen. Al deze methoden van het verwijderen of niet-functioneel maken van de mannelijke delen van de voortplantingsorganen zijn goed bekend in de techniek. Nakomelingen van een kruising kunnen verkregen worden door de vrouwelijke 30 ouder van de kruising zaad te laten produceren, het F1 of terugkruisingszaad te verzamelen en uit te zaaien om nieuwe planten te krijgen. Fl-planten kunnen zelfbestoven worden om de F2-generatie te produceren, of teruggekruist met de recurrente ouder van een terugkruisingsschema.

35 Teruggekruiste planten kunnen verder teruggekruist worden met de recurrente ouder om de agronomische waarde van de planten in een volgende generatie te verbeteren of kunnen 1003261 10 zelfbestoven worden om planten te produceren die homozy-goot zijn voor het Nr-gen.

In een eerste specifieke uitvoeringsvorm verschaft de uitvinding L.sativa L. planten van de lijn RZ 5 96.85123, de verkrijging waarvan in voorbeeld 2 verder uiteengezet wordt. Planten van deze lijn zijn homozygoot voor het Nr-gen en missen de genetische informatie, die het CSV-fenotype veroorzaakt. Dergelijke planten zijn niet klein en/of niet geel, zoals CSV-planten. Wanneer 10 planten niet klein zijn en/of niet geel missen zij voldoende van de genetische informatie, die het CSV-fenotype veroorzaakt, of is deze genetische informatie in voldoende mate geïnactiveerd. Om de uitvinding te illustreren werden zaden van van de RZ 96.85123 planten op 16 mei 15 1996 gedeponeerd bij NCIMB Onder nummer 40804. Het voorbehoud is gemaakt dat afgifte van monsters van de gedeponeerde zaden tot de datum van octrooiverlening alleen kan geschieden aan een deskundige.

In een andere specifieke uitvoeringsvorm ver-20 schaft de uitvinding het resultaat van de conventionele kruisingsmethode en het specifieke selectieschema zoals beschreven in voorbeeld 1 in de vorm van planten van de lijn RZ 96.75906. Deze planten zijn eveneens homozygoot voor het Nr-gen en missen de genetische informatie, die 25 het CSV-fenotype veroorzaakt. Om de uitvinding te illustreren werden zaden van de RZ 96.75906 planten op 16 mei 1996 gedeponeerd bij NCIMB onder nummer 40803.

De uitvinding heeft verder betrekking op een werkwijze voor het verkrijgen van planten volgens de 30 uitvinding, omvattende het selecteren van een ouderplant, die heterozygoot is voor Nr-resistentie. het vervaardigen van een splitsende populatie, het produceren van een nakomelingschap van in hoofdzaak elke plant van de splitsende populatie, en het toetsen van de nakomelingschap op 35 resistentie en CSV-fenotype. Een splitsende populatie kan op verschillende manieren vervaardigd worden, zoals door zelfbestuiving van de heterozygote ouderplant, door kruising van de heterozygote ouderplant met een resis- 1 0 0 3 2 £ 1 11 tente plant en door een verdubbelde haploïdentechniek toe te passen op de heterozygote ouderplant. Bij de verdubbelde haploïdentechniek worden uit verdubbelde gameten van een plant nieuwe planten opgekweekt. De gameten 5 kunnen afkomstig zijn van de mannelijke voortplantingsorganen (androgenese) of van de vrouwelijke voorplantings-organen (gynogenese) . De opkweek van verdubbelde haplo-iden vergt meestal een in-vitro stap. Het voordeel van verdubbelde haploïden bij het zoeken naar recombinanten 10 is dat de gameten, waaruit de planten ontstaan, resulteren uit een meiotische recombinatie in de heterozygote ouderplant, terwijl-de resulterende verdubbelde haploïden volledig homozygoot zijn, zodat maskerende effecten van heterozygotie vermeden worden.

15 In planten verkregen via verdubbelde haploïden techniek kan de gewenste recombinant direct herkend worden: een plant met resistentie en zonder CSV. In de lijnen verkregen door zelfbestuiving van planten uit een splitsende populatie kunnen lijnen met gewenste recombi-20 nante planten herkend worden, doordat de lijn uniform resistent is, maar nog wel splitst voor CSV, of doordat de lijn nog splitst voor resistentie, maar uniform een normaal fenotype heeft, of doordat de lijn uniform resistent is en uniform een normaal fenotype heeft.

25 De efficiëntie van genoemde werkwijze kan belangrijk verhoogd worden, wanneer voor het produceren van een nakomelingschap van in hoofdzaak elke plant een voortoets plaatsvindt op planten, waarin een gewenste recombinatie-gebeurtenis is opgetreden. Een dergelijke 30 voortoets kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd met behulp van moleculair biologische methoden, zoals de AFLP-tech-niek. De selectie volgens de AFLP-techniek is gebaseerd op het opsporen van recombinatiegebeurtenissen in de buurt van het locus van het Nr-gen in het genoom van 35 planten uit de splitsende populatie.

De onderhavige uitvinding zal verder worden verduidelijkt aan de hand van de begeleidende voorbeelden, die slechts gegeven zijn bij wijze van illustratie 1 0 0 3 26 1 12 en niet de bedoeling hebben de uitvinding op enigerlei wijze te beperken.

VOORBEELDEN 5 ALGEMEEN

In het onderstaande worden heel algemeen de technieken beschreven, die gebruikt werden voor het verkrijgen van de planten volgens de uitvinding. In de voorbeelden zal verder worden ingegaan op de specifieke 10 details van de uitgevoerde experimenten.

Materialen en methode 1. Resistentietest

Resistentie tegen N. ribisniari kan aangetoond 15 worden door een populatie planten te kweken en elke plant te inoculeren met een bepaald aantal N. ribisniari bladluizen (bijvoorbeeld 15). Resistentie is bewezen wanneer na een bepaalde testperiode (bijvoorbeeld 7 dagen) het aantal bladluizen op de plant 0 of minder dan het aantal 20 waarmee begonnen werd is, terwijl op gevoelige planten na de testperiode het aantal bladluizen per plant toegenomen is.

Als controle worden er in de test planten meegenomen van een vatbaar ras. Op deze controleplanten 25 moeten de bladluizen zich duidelijk vermeerderen, wil de test als betrouwbaar geaccepteerd worden. De test wordt bij voorkeur- uitgevoerd bij een temperatuur die varieert tussen 18 en 24°C en bij een minimale daglengte van 14 uur. Bij voorkeur worden kleine planten in de vegetatieve 30 fase met ongeveer 1 tot 3 echte bladeren gebruikt om geïnoculeerd te worden met N. ribisniari individuen, maar ook oudere planten kunnen in de resistentietest gebruikt worden. De N. ribisniari resistentie wordt niet slechts waargenomen onder testomstandigheden, maar is eveneens te 35 zien op het veld of in de kas.

De in de resistentietest gebruikte bladluizen waren van een rood biotype aangeduid met WN1 en verkrijgbaar bij de Afdeling Entomologie van de Landbouwuniversi- 1003281 13 teit Wageningen. Voorafgaand aan de test werden ze op slaplanten gekweekt. Uiteraard kunnen ook groene bladluizen worden gebruikt. Resistentietests werden uitgevoerd met zaden, die werden gezaaid in potgrondblokken. Vier 5 weken na uitzaaien werden de bladluizen naar de jonge slaplanten overgebracht.

2. Kruisingen

Voor de eerste kruising wordt één ouder ge-10 bruikt die homozygoot is voor de resistentie tegen N.

ribisniari en de agronomisch ongewenste eigenschappen van verminderde groei, verminderde groenkleuring en/of vroege afbraak van chlorofyl in de generatieve fase vertoont. De andere plant is een plant die niet resistent is tegen N^ 15 ribisniari en de bovengenoemde agronomisch ongewenste eigenschappen niet vertoont.

De door kruising verkregen F1 planten kunnen worden teruggekruist met de recurrente (N. ribisniari-vatbare) ouder (of een ander N. ribisniari-vatbare 20 plant), en/of door zelfbestuiving tot F2 generatie gekweekt. De zo ontstane Tl (terugkruisings-) of F2 planten kunnen eveneens via zelfbestuiving tot een volgende generatie opgekweekt worden, of opnieuw als kruisingsou-der gebruikt worden.

25 Het opsporen van planten met een recombinatie- gebeurtenis nabij het locus van het resistentie verschaffende Nr-gen met behulp van de AFLP-techniek of een andere techniek van moleculaire merkers, kan efficiënt gebeuren in een voor het Nr-gen splitsende populatie. Dit 30 kan zijn een populatie verkregen door zelfbestuiving van een heterozygote plant (zie Voorbeeld 2), of een populatie verkregen door een heterozygote plant terug te kruisen, bij voorkeur met een plant uit de resistente ouderlijn. Fenotypische selectie op recombinatie tussen 35 N. ribisniari-resistentie en CSV-fenotype kan efficiënt gebeuren met een populatie van inteeltlijnen afkomstig van planten uit een voor het Nr-gen splitsende populatie.

1003261 14

Met een lijn wordt hier een groep van zaden of planten, verkregen door zelfbestuiving van een plant, aangeduid.

De verhoging van de selectie-efficiëntie door het gebruik van moleculaire merkers wordt bereikt doordat 5 met merkers een voorselectie kan worden uitgevoerd.

Alleen nakomelingen van planten waarvan met merkers is aangetoond dat er een recombinatie-gebeurtenis in de buurt van het Nr-locus heeft plaatsgevonden worden vervolgens nog op resistentie en de aanwezigheid van het 10 CSV-fenotype getoetst.

Ontkoppeling tussen resistentie en het CSV-fenotype kan in een.(al dan niet met merkers voorgeselecteerde) populatie van lijnen gevonden worden door per lijn een aantal planten (bijvoorbeeld 25) te toetsen op 15 resistentie tegen N. ribisniqri. en dezelfde of andere planten (bijvoorbeeld 25) te toetsen op CSV-fenotype.

Elke lijn kan op grond van deze twee toetsen per eigenschap ingedeeld worden in de volgende klassen: 20 Resistentie: a) uniform resistent b) splitsend in resistente en vatbare planten c) uniform vatbaar 25 CSV fenotype: a) uniform CSV-fenotype b) splitsend in planten met CSV-fenotype en planten met normaal fenotype c) uniform normaal fenotype 30

Recombinante planten, die homozygoot zijn voor het Jlr-gen zonder het CSV-fenotype te vertonen, kunnen gevonden worden: 1) in lijnen die uniform resistent zijn tegen N. ribis-35 niari en waarvan niet alle planten het CSV-fenotype vertonen, en 1003261 15 2) in lijnen die uniform een normaal fenotype vertonen, en waarvan niet alle planten vatbaar zijn voor N. ribis-nigri.

In het eerste geval worden planten zonder het 5 CSV-type geselecteerd voor zaadproductie. Nakomelingen uit zelfbestuiving van deze geselecteerde planten worden opnieuw op resistentie en CSV-fenotype getoetst, en lijnen die uniform resistent zijn en uniform een normaal (niet-CSV) fenotype hebben worden aangehouden.

10 In het tweede geval worden resistente planten geselecteerd voor zaadproductie. Nakomelingen uit zelfbestuiving van deze geselecteerde planten worden opnieuw op resistentie en CSV-fenotype getoetst, en lijnen die uniform resistent zijn en uniform een normaal (niet-CSV) 15 fenotype hebben worden aangehouden.

3. Selectie door middel van de AFLP-techniek

Van elke te testen plant wordt een klein stukje blad (bijvoorbeeld 50 mg) verzameld en wordt DNA geëxtra-20 heerd. Voor een koppelingsstudie tussen AFLP-merkers en het Nr-gen moet elke bemonsterde plant ook op resistentie tegen N. ribisniqri worden getoetst, wat kan geschieden volgens bovenstaande procedure. Het opsporen van AFLP- of andere moleculaire merkers die gekoppeld zijn aan het Nr-25 gen, kan gebeuren door het merkerpatroon van individuele resistente of vatbare planten te vergelijken of door DNA van groepen -van vatbare of resistente planten te mengen (zogenaamde "pools”) en de merkerpatronen van deze pools te vergelijken. Merkers die gekoppeld zijn aan het Nr-gen 30 kunnen vervolgens aan de hand van de merkerpatronen van individuele planten uit een splitsende populatie worden gerangschikt tot een merkerkaart, die de genetische afstand tussen de merkers onderling en tussen de merkers en het Nr-gen weergeeft. Methoden om de mate van geneti-35 sche koppeling tussen merkers onderling en tussen merkers en een monogene eigenschap op te sporen zijn standaard in de techniek en worden in vele handboeken beschreven. Computersoftware om deze koppelingsstudies uit te voeren 1003261 I ' 16 is algemeen beschikbaar (bijvoorbeeld het programma "Joinmap", verspreid door het CPRO-DLO te Wageningen).

Met een set van merkers die nauw-gekoppeld zijn aan het Nr-locus, kunnen planten opgespoord worden met 5 één of meerdere recombinatie-gebeurtenissen in de buurt van het Nr-locus. Planten met een recombinatie-gebeurte-nis worden gekenmerkt doordat een deel van de aan het Nr-gen gekoppelde merkers is vervangen door merkers afkomstig van de vatbare ouder met normaal (niet-CSV) fenoty-10 pe.

De merkerontwikkeling en merkerbepalingen voor dit project werden uitgevoerd door Keygene NV, Agro Business Park 90, Postbus 216, 6700 AE, Wageningen. Er werd uitsluitend gebruik gemaakt van de door Keygene 15 ontwikkelde en gepatenteerde AFLP-techniek. Voor de details van de AFLP-techniek wordt verwezen naar P. Vos et al., AFLP: a new technique for DNA fingerprinting, Nucleic Acids Research, 1995, 23 (21): 4407-4414.

De AFLP-techniek wordt inmiddels door diverse 20 leveranciers aangeboden en is voor de gemiddelde deskundige beschikbaar. Voor de gemiddelde deskundige is daarmee het opsporen van nauw gekoppelde merkers voor een gen een routine-aangelegenheid, voorzover geschikte planten-populaties beschikbaar zijn. Het zal de gemiddelde des-25 kundige duidelijk zijn dat door de keuze van restrictie-enzymen en primers vele verschillende AFLP-merkers gegenereerd kunnen worden die gekoppeld zijn aan een bepaald gen, en dat voor het genereren van een set van nauw-gekoppelde merkers met het doel meiotische recombinatie 30 in de buurt van een locus op te sporen, het niet wezenlijk uitmaakt welke nauw-gekoppelde merkers daarvoor gebruikt worden. Bepalend zijn enkel het aantal merkers dat men gebruikt plus de verspreiding over het chromo-soomfragment waarin men recombinatie wil opsporen.

35 1003261 ή * 17 VOORBEELD 1

Conventionele kruising L. sativa L. planten volgens de uitvinding werden verkregen volgens onderstaand schema: 5

Lijn 793202 x T2(Calona x R18-geniteur) F1 i 10 F2 x T2(Saladin RZ x R18 geniteur) i F1 x Saladin RZ 4

Saladin RZ x F1

15 I

F1 i F2 i

20 F3 x Saladin Quick RZ

i F1 F2 25 i F3 i F4 30 F5, o.a. lijn 96.75906

Een plant uit lijn IVT 793202, één van de lijnen met het Nr-gen, die in 1981 zijn uitgegeven door het voormalige Instituut voor de Veredeling van Tuinbouw-35 gewassen (IVT) te Wageningen, werd gekruist met een plant uit een eigen selectielijn van het ijssla type met volledige resistentie tegen de valse meeldauwziekte veroorzaakt door Bremia lactucae (T2(Calona x R18 geniteur)).

F1 zaad van deze kruising werd gezaaid en vermeerderd tot 40 F2. F2 planten werden gecontroleerd op resistentie tegen N.ribisniqri en op morfologie, en een geselecteerde resistente F2 plant werd gekruist met een plant van het type Saladin met volledige resistentie tegen B.lactucae (T2("Saladin RZ" x R18 geniteur). F1 planten uit deze 45 kruising werden gecontroleerd op resistentie tegen N. ribisniari. en teruggekruist met een plant van het type "Saladin RZ". F1 planten uit deze kruising werden gecon- f003261 l h 18 troleerd op resistentie tegen N. ribisniari en opnieuw gekruist met een plant van het type "Saladin RZ". Fl zaad van deze kruising werd gezaaid en vermeerderd tot F2. F2 planten werden gecontroleerd op resistentie tegen N^.

5 ribisniari en op morfologie, en een op ijssla-type geselecteerde resistente F2-plant werd vermeerderd tot F3-lijn. F3-lijnen werden opnieuw getoetst op resistentie en op fenotype en een op ijssla-type geselecteerde F3-plant werd gekruist met een plant van het type "Saladin Quick 10 RZ". De Fl generatie uit deze kruising werd gecontroleerd op resistentie tegen N. ribisniari en vermeerderd tot F2. Planten uit de F2-,-F3- en F4-generaties afkomstig van één Fl-plant van deze kruising werden getoetst op resistentie tegen N.ribisniari en op fenotype. Geselecteerde 15 F2- en F3-planten die resistentie combineerden met een gewenst niet-CSV fenotype, bleken steeds heterozygoot voor het Nr-gen te zijn. Echter, uiteindelijk werd in de F4-generatie van deze kruising een lijn gevonden die uniform was voor het normale (ijssla) fenotype, dat wil 20 zeggen geen symptomen van CSV liet zien, en daarbij nog wel splitste voor resistentie tegen N.ribisniari. Van een aantal planten van deze F4-lijn werd zaad geteeld. De nakomelingen van enkele van deze F4-planten (o.a. lijn RZ 96.75906) bleken niet meer te splitsen voor resistentie 25 tegen N.ribisniari. en combineren derhalve homozygotie voor het Nr-gen met een agronomisch waardevol fenotype, door afwezigheid van de CSV-symptomen.

Hierbij dient vermeld te worden dat de in dit voorbeeld beschreven voorbeeld de ontstaansgeschiedenis 30 en stamboom geeft van planten van de uitvinding. Het geeft geenszins alle geproduceerde generaties weer die uit deze serie van kruisingen voortgekomen zijn, maar slechts die generaties waarvan de planten van de uitvinding in rechte lijn afstammen. Van bovenstaand kruisings-35 en selectieschema zijn nog meer takken onderzocht, echter alle zonder het gewenste eindresultaat, dat wil zeggen homozygoot, N.ribisniari-resistente planten zonder CSV-symptomen.

1003261 19 VOORBEELD 2

Opsporen van recombinanten na voorselectie met AFLP-merkers L.sativa L. planten volgens de uitvinding 5 werden verkregen uitgaande van een enkelvoudige kruising tussen een plant uit de door het voormalige Instituut voor de Veredeling van Tuinbouwgewassen uitgegeven N. ribisnigri-resistente lijn IVT 793202 en een plant uit het kropsla ras Ultra RZ. Uit deze kruising werd van een 10 Fl-plant zaad geproduceerd. F2-zaden van deze kruising werden uitgezaaid, en van een aantal planten werd F3-zaad geproduceerd.

Vervolgens werden van deze kruising 140 planten van een voor resistentie splitsende F3-lijn (afkomstig 15 van één voor het Nr-gen heterozygote F2-plant) getoetst op resistentie. Van de getoetste planten waren 95 resistent, 32 vatbaar, terwijl voor 3 planten geen duidelijke resistentiescore verkregen werd. Van de F3-planten met een eenduidige resistentiescore werd bladmateriaal voor 20 DNA-analyse verzameld. Voor de detectie van AFLP-merkers die aan het Nr-gen gekoppeld zijn, werd in eerste instantie uitgegaan van een toetsset van DNA van 5 resistente slalijnen (waaronder de resistente geniteur IVT 793202), 3 vatbare lijnen (waaronder Ultra RZ), 2 mengsels 25 ("pools") van DNA van voor N. ribisnigri vatbare rassen en 44 individuen van de hierboven genoemde F3-lijn uit de kruising tussen IVT 793202 en Ultra RZ. In dit vooronderzoek werd één codominante AFLP-merker geïdentificeerd, die in de set van 44 planten volledig gekoppeld was met 30 het resistentiegen. Met deze codominante merker kunnen homozygoot en heterozygoot resistente planten onderscheiden worden.

Vervolgens werden met bovengenoemde codominante AFLP-merker in totaal 121 F3-planten uit de kruising 35 tussen IVT 793202 en Ultra RZ onderzocht. De F3-planten konden zo worden onderscheiden in 35 homozygoot resistent, 60 heterozygoot resistent en 26 vatbaar. DNA van de homozygoot resistente planten en van de homozygoot vatba- 1003281 * 20 re planten werd afzonderlijk gepooled. Van deze "resistente" en "vatbare" pool werden 96 AFLP-fingerprints gemaakt. Dit leverde ongeveer 4300 AFLP-bandjes op, waarvan 110 gekoppeld waren aan het Nr-gen, en 25 aan het 5 vatbare allel op dit locus. Hieruit werden 19 AFLP-mer-kers gekozen voor gebruik om te screenen op recombinatie in de omgeving van het Nr-gen. Van deze 19 merkers waren er 14 gekoppeld aan het resistentie veroorzakende Nr-gen en 5 aan het "vatbare" allel.

10 Op grond van de test met bovengenoemde co-domi- nante AFLP-merker werden twee F3-planten geïdentificeerd die heterozygoot waren voor het Nr-gen. Van F4-zaad dat op deze planten geproduceerd was, werden per F4-lijn 800 planten uitgezaaid. Van deze planten werd bladmateriaal 15 bemonsterd en DNA geïsoleerd. DNA van uiteindelijk in totaal 1575 F4-planten werd gebruikt voor een screening op merker-recombinatie met de 19 gekozen AFLP-merkers.

Het resultaat van de eerste bepaling was dat voor 206 planten indicatie werd verkregen van merker-recombinatie. 20 Deze 206 planten werden opnieuw getoetst op de 19 AFLP-merkers. Uiteindelijk leverde dit voor 162 planten een bevestiging van een recombinatie-gebeurtenis in de buurt van het ^[r-locus op.

Van de 1575 bemonsterde planten werd F5-zaad 25 geteeld. Van de 162 planten, die op grond van de AFLP-analyse als merker-recombinant waren geïdentificeerd, was van 89 planten F5-zaad verkregen. De 89 F5-lijnen die dit opleverde werden getoetst op resistentie tegen N. ribis-niari en op fenotype. In deze toetsen werd een lijn 30 (94.85338) gevonden die niet meer splitste voor resistentie (dus homozygoot resistent was voor het Nr-gen), maar nog wel splitste voor het CSV-fenotype. Van zaadnummer 94.85338 werden 50 planten opnieuw met een aantal AFLP-merkers geanalyseerd. Eén van deze planten bleek na 35 analyse met 22 aan het Nr-gen gekoppelde AFLP-merkers homozygoot recombinant voor 12 van de 22 merkers. Van deze plant werd F6-zaad gewonnen (lijn 95.85051). Deze lijn werd opnieuw getoetst op fenotype en resistentie, en 1003261 21 opnieuw bleken alle planten van deze lijn resistent tegen N« ribisniari en hadden alle planten van deze lijn een normaal, dat wil zeggen niet-CSV fenotype.

Van 11 planten van lijn 95.85051 werd F7-zaad 5 geteeld. Dit leverde o.a. zaadnummer 96.85123 op, welke werd gedeponeerd.

1 0 0 3 2 6 1

Claims (14)

1. Planten van de familie Compositae. welke resistent zijn tegen de bladluis Nasonovia ribisniari 5 door aanwezigheid in het genoom van het Nr-resistentie-gen, waarbij de genetische informatie, die verantwoordelijk is voor het CSV-fenotype in tenminste zodanige mate ontbreekt in het genoom van de plant, dat het CSV-fenotype niet tot expressie komt.

2. Planten volgens conclusie 1, met het ken merk, dat het Nr-resistentiegen homozygoot aanwezig is.

3. Planten volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de planten slaplanten van het genus Lactuca, in het bijzonder L. sativa L.. zijn.

4. Planten volgens conclusie l, 2 of 3, te verkrijgen door de volgende stappen: a) het selecteren van een ouderplant, die heterozygoot is voor Nr-resistentie. b) het vervaardigen van een splitsende popula- 20 tie, c) het produceren van een nakomelingschap van in hoofdzaak elke plant van de splitsende populatie, d) het toetsen van het nakomelingschap op resistentie en CSV-fenotype, 25 e) het uit een geschikte nakomelingschap selec teren van planten, die ofwel resistent zijn ofwel geen CSV-fenotype- vertonen, f) het produceren van zaad van deze planten door zelfbestuiving en het kweken van nakomelingen uit 30 dit zaad ter verkrijging van een lijn, en g) het toetsen van de lijn op resistentie en CSV-fenotype en het selecteren van lijnen, die uniform resistent zijn en uniform een niet-CSV fenotype hebben.

5. Planten volgens conclusie 4, met het ken- 35 merk, dat de splitsende populatie vervaardigd wordt door zelfbestuiving van de ouderplant, door kruising van de ouderplant met een resistente plant of door een verdubbelde haploïdentechniek. 1003261

6. Planten volgens conclusie 4 of 5, inet het kenmerk, dat de geschikte nakomelingschap uit stap e) er één is waarvan de planten ofwel uniform resistent zijn tegen N.ribisniari en niet allemaal het CSV-fenotype 5 vertonen, ofwel uniform niet het CSV-fenotype vertonen en niet allemaal vatbaar zijn voor N.ribisniari.

7. Planten volgens conclusie 4 of 5, met het kenmerk, dat de geschikt nakomelingsschap uit stap e) er één is waarvan de planten zowel uniform resistent zijn 10 tegen N.ribisniari als uniform niet het CSV-fenotype vertonen, in welk geval de stappen f) en g) komen te vervallen.

8. Planten volgens één der conclusies 4-7, met het kenmerk, dat het toetsen in stap d) gebaseerd is op 15 het ontbreken van een met het oog waarneembaar CSV-feno-type.

9. Planten volgens één der conclusies 4-8, met het kenmerk, dat voorafgaand aan stap c) door middel van moleculair biologische technieken een voorselectie ge- 20 maakt wordt van planten, waarbij een recombinatiegebeur-tenis heeft plaatsgehad tussen de genetische informatie voor de resistentie en de genetische informatie voor het CSV-fenotype.

10. Planten volgens conclusie 9, met het ken- 25 merk, dat de moleculair biologische technieken worden gevormd door de AFLP-techniek.

11. Op generatieve of vegetatieve wijze verkregen nakomelingen van planten volgens één der conclusies 1-10.

12. Voor vermeerdering geschikte onderdelen of afgeleiden van planten volgens één der conclusies 1-11, zoals orgaanweefsels, zoals bladeren, stengels, wortels, scheuten en dergelijke, protoplasten, somatische embryo's, helmknoppen, bladstengels, cellen in kweek, zaden en 35 dergelijke.

13. Voor consumptie geschikte onderdelen of afgeleiden van planten volgens één der conclusies 1-11, zoals kroppen of bladeren. 1003261

14. Werkwijze voor het verkrijgen van planten volgens één der conclusies 1-10, omvattende de stappen, zoals omschreven in de conclusies 4 tot 10. 1003261