PL182817B1 - Sposób i gotowy zestaw do określania ilości procentowej defektywnych cząsteczek wektora w preparacie wektora używanym w terapii genowej - Google Patents
Sposób i gotowy zestaw do określania ilości procentowej defektywnych cząsteczek wektora w preparacie wektora używanym w terapii genowejInfo
- Publication number
- PL182817B1 PL182817B1 PL96321869A PL32186996A PL182817B1 PL 182817 B1 PL182817 B1 PL 182817B1 PL 96321869 A PL96321869 A PL 96321869A PL 32186996 A PL32186996 A PL 32186996A PL 182817 B1 PL182817 B1 PL 182817B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- vector
- cells
- gene
- tumor
- growth
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 165
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 97
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 75
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 63
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims abstract description 62
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims abstract description 38
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 38
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims abstract description 35
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims abstract description 22
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 20
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims abstract description 15
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims abstract description 15
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims abstract description 8
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims abstract description 7
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims abstract description 7
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 210000003128 head Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 210000003739 neck Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims abstract description 7
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims abstract description 7
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims abstract description 7
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 11
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 6
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 6
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 claims description 6
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 24
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 12
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 abstract 2
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 abstract 1
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 15
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 10
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 8
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 8
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 6
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 4
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 4
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 3
- 108010078814 Tumor Suppressor Protein p53 Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 241000212384 Bifora Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 2
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 2
- 208000008636 Neoplastic Processes Diseases 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 2
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000015098 Tumor Suppressor Protein p53 Human genes 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108700020463 BRCA1 Proteins 0.000 description 1
- 102000036365 BRCA1 Human genes 0.000 description 1
- 101150072950 BRCA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010073148 Multiple endocrine neoplasia type 2A Diseases 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 108700025690 abl Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- -1 antisense constructs Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005880 cancer cell killing Effects 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000035572 chemosensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000026037 malignant tumor of neck Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000006654 negative regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000010309 neoplastic transformation Effects 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000018855 positive regulation of programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
1. Sposób okreslania ilosci procentowej defektywnych czasteczek wektora, wybra- nego z grupy zawierajacej adenowirusy, retrowirusy, wirusy krowianki lub wirusy zwiaza- ne z adenowirusami (adeno-associated virus) w próbce roztworu podstawowego tego wektora, znamienny tym, ze stosuje sie roztwór podstawowy, w którym przynajmniej czesc czasteczek wektora niesie gen efektorowy, wybrany z grupy genów supresorowych nowotworów, konstruktów antysensowych i genów kodujacych toksyny, kodujacy produkt, który hamuje wzrost komórek nowotworowych, indukuje apoptoze komórek nowotworo- wych lub zabija komórki nowotworowe; przy czym najpierw kontaktuje sie komórki no- wotworowe z porcja roztworu podstawowego wektora w warunkach pozwalajacych na wprowadzenie roztworu podstawowego do komórek; nastepnie prowadzi sie inkubacje komórek nowotworowych w warunkach pozwalajacych na ich wzrost; po odpowiednim czasie szacuje sie wzrost komórek nowotworowych, przy czym jako komórki nowotwo- rowe stosuje sie komórki pluc, jelita grubego, sutka, trzustki, prostaty, glowy i szyi, lub skóry; nastepnie porównuje sie oraz okresla procentowo wzrost komórek nowotworowych ze wzrostem komórek, które poddano dzialaniu jednego lub wiecej standardowych testo- wych roztworów podstawowych, zawierajacych wektory bedace kontrola pozytywna, nio- sace funkcjonalny gen efektorowy i wektory bedace kontrola negatywna nie niosace funk- cjonalnego genu efektorowego. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób i gotowy zestaw do określania ilości procentowej defektywnych cząsteczek wektora w preparacie wektora używanym w terapii genowej. Wynalazek obejmuje sposób i zestaw, które mogą być używane do określania ilości procentowej adenowirusa zawierającego niefunkcjonalny gen p53 w roztworze podstawowym zawierającym dziki typ genu p53, który ma być użyty w klinicznej terapii genowej.
Wiadomo, że stosowane metody leczenia raka, obejmujące terapię radiacyjną zabiegi chirurgiczne i chemioterapię, mają ograniczoną skuteczność. Np.: tylko z powodu raka płuc, co roku umiera w USA ponad 140 000 ludzi. Ostatnio, śmiertelność z powodu raka płuc stała się wyższa niż śmiertelność spowodowana rakiem sutka u kobiet. Pomimo, że wprowadzenie programów mających na celu zmniejszenie liczby ludzi palących, obniżyło związaną z wiekiem śmiertelność spowodowaną rakiem płuc; ilość zgonów powodowana przez raka płuc pozostanie wysoka jeszcze przez długi okres XXI wieku. Rozwój nowych sposobów leczenia będzie zależał od zrozumienia na poziomie molekularnym biologii powstawania raka płuc.
Wiadomo już, iż szereg różnych odmian nowotworów spowodowana jest, przynajmniej częściowo, anomaliami genetycznymi, które prowadzą bądź do nadekspresji jednego lub większej liczby genów, bądź do ekspresji uszkodzonego lub zmutowanego genu lub genów. Np.: w wielu wypadkach, ekspresja onkogenów prowadzi do rozwoju nowotworu. Onkogeny są to genetycznie zmienione geny, których ekspresja zmutowanego produktu niszczy normalne funkcje komórkowe lub system kontroli funkcjonowania komórki (Spandidos i in.,1989).
Stwierdzono, że wiele spośród dotychczas zbadanych onkogenów jest uaktywnianych na skutek mutacji, często mutacji punktowej, w obrębie regionu kodującego normalnego genu komórkowego, który to gen określany jest mianem protoonkogenu. Mutacje te prowadzą do substytucji aminokwasowych w powstającym produkcie białkowym danego genu. Powstający w ten sposób produkt cechuje się anormalnymi funkcjami biologicznymi, co przyczynia się do rozwoju procesu nowotworzenia (Travali i in., 1990). Mutacje leżące u podstaw procesu nowotworzenia mogą powstać na skutek działania różnych czynników, jak np. mutagenów chemicznych czy promieniowania jonizującego. Jak dotychczas, zidentyfikowano i w różnym stopniu opisano pewną ilość onkogenów i rodzin onkogenów, np. ras, myc, neu, raf, erb, src, fms,jun i abl (Travali i in., 1990; Bishop,1987).
182 817
Uważa się, że podczas normalnego wzrostu komórki, pewne stymulujące wzrost protoonkogeny są równoważone przez hamujące wzrost geny supresorowe (nowotworów). Szereg czynników może wpłynąć na zachwianie równowagi pomiędzy tymi dwiema grupami czynników, co w konsekwencji prowadzi do stanu nowotworzenia (transformacji nowotworowej). Jednym z takich czynników zaburzających są mutacje w genach supresorowych nowotworów (Weinberg,1991).
Jednym z ważnych supresorów nowotworów jest białko komórkowe p53, będące jądrową fosfoproteiną o masie 53 kDa, która kontroluje podział komórki. Mutacje punktowe w genie p53 i utrata tego allelu, znajdującego się na chromosomie 17p, należą do najczęstszych zaburzeń obserwowanych w wypadku nowotworów złośliwych u człowieka. Białko p53 jest silnie konserwowane w toku ewolucji i ulega ekspresji w większości normalnych tkanek. Wykazano udział dzikiego p53 w kontroli cyklu komórkowego (Mercer, 1992), regulacji transkrypcji (Fields i in., 1991) i indukcji apoptozy (Yonish-Rouach i in., 1991; Shaw i in.,1992).
Znany jest szereg zmutowanych alleli p53, gdzie pojedyncze zmiany reszt aminokwasowych prowadzą do syntezy białek, które mają zachwiane zdolności do regulacji wzrostu, co w końcu prowadzi do procesu nowotworzenia (Hollstein i in., 1991). Stwierdzono, że gen p53 jest najczęściej zmutowanym genem w wypadku raka u ludzi (Hollstein i in., 1991; Weinberg, 1991) i jest szczególnie powiązany z nowotworami, których powstanie związane jest z dymem tytoniowym (Hollstein i in.,1991; Zakut-Houri i in., 1985). Udowodniono istnienie nadekspresji zmutowanego p53 w wypadku raka sutka (Casey i in.,1991).
Jednym z bardziej interesujących aspektów terapii genowej nowotworów jest zastosowanie genów supresorowych (nowotworów), takich jak p53. Istnieją doniesienia, że transfekcja dzikiego genu p53 do komórek pochodzących z pewnych typów nowotworów sutka i płuc może przywrócić supresję kontroli wzrostu komórek tych linii (Casey i in.,1992). Mimo, iż bezpośrednia transfekcja DNA nie jest wydajnym sposobem wprowadzania DNA do komórek pacjenta, uzyskane w wyniku tych badań rezultaty umożliwiają stwierdzenie, że wprowadzenie supresorów nowotworów do komórek nowotworowych może stać się wydajną metodą leczenia, jeżeli uda się opracować sposoby wprowadzania do komórek genów supresorowych.
Obecnie bada się i rozwija systemy wprowadzania genów do komórek, które mogą być zastosowane w terapii genowej nowotworów, do wprowadzania do komórek nowotworowych supresorów nowotworów. Wprowadzenie genów do komórek, w oparciu o wektory wirusowe cieszy się szczególnym zainteresowaniem ze względu na wydajność wirusów w infekowaniu żywych komórek, dodatkowo w procesie infekcji wirusowej cały materiał genetyczny wirusa jest wprowadzany do zainfekowanej komórki. W badaniach tych poczyniono już pewne postępy, nP-: stworzenie wektorów retrowirusowych, które mogą służyć jako wektory do wprowadzania przeróżnych genów do komórek. Ostatnio dowiedziono (w badaniach in vitro na zwierzętach) skuteczności systemów opartych na wektorze adenowirusowym i przy zastosowaniu określonych sposobów transferu genów.
W miarę jak rozwijają się coraz bardziej metody terapii genowej nowotworów, możliwe staje się leczenie kliniczne. Będzie to wymagało rozwinięcia produkcji roztworów podstawowych wektora na dużą skalę. Taka produkcja obejmuje stworzenie dużych ilości roztworu podstawowego wektora z pierwotnego roztworu podstawowego wektora, gdzie jako pierwotny roztwór podstawowy wektora określa się roztwór podstawowy o 100% aktywności. Powstaje problem utraty aktywności następujący w trakcie przeskalowania (na dużą skalę). Oczywiste jest zatem, że przed zastosowaniem uzyskanej porcji roztworu podstawowego wektora w procesie leczenia pacjenta, konieczna będzie kontrola jego jakości. Np.: koniecznym będzie upewnienie się, że porcja roztworu podstawowego wektora zawiera ilość aktywnego wektora, która wystarcza do uzyskania pożądanego efektu terapeutycznego. Ważnym problemem zasygnalizowanym przez Narodowe Instytuty Zdrowia (National Institutes of Health - NIH), Doradczy Komitet ds. Zrekombinowanego DNA (Recombinant DNA Advisory Committee - RAC) oraz Federalny Urząd ds. Leków (Federal Drug Administration - FDA) jest biologiczne znaczenie tych mutacji w końcowym klinicznym roztworze podstawowym. Jednak jest wysoce nieprawdopodobnym, aby zmutowane mogły stanowić jakiekolwiek ryzy
182 817 ko dla pacjenta, urzędy nadzorujące będą wymagały analizy jakości klinicznych preparatów wektora. NIH i RAC oznajmiły, że najważniejszym elementem kontroli jakości jest kontrola funkcji biologicznych. Dlatego też istnieje zapotrzebowanie na test umożliwiający oszacowanie procentowej ilości efektywnych wektorów w roztworach podstawowych wektorów, przeznaczonych do użytku klinicznego.
Istnieje zatem wyraźna potrzeba stworzenia sposobu kontroli jakości, który umożliwiłby oszacowanie ilości defektywnego lub terapeutycznie nieaktywnego wektora znajdującego się w jego roztworze podstawowym oraz idącej za tym utraty aktywności biologicznej roztworu podstawowego wektora.
Sposób według wynalazku jest przeznaczony do określania jakości preparatu wektora, który ma być użyty w celach terapeutycznych. Szczególnie do określania ilości procentowej defekty wnych cząsteczek wektora, wybranego z grupy zawierającej adeno wirusy, retro wirusy, wirusy krowianki lub wirusy związane z adenowirusami w próbce roztworu podstawowego tego wektora, w którym przynajmniej część cząsteczek wektora niesie gen efektorowy, wybrany z grupy genów supresorowych nowotworów, konstruktów antysensownych i genów kodujących toksyny, kodujący produkt, który hamuje wzrost komórek nowotworowych, indukuje apoptozę komórek nowotworowych lub zabija komórki nowotworowe.
W sposobie według wynalazku najpierw kontaktuje się komórki nowotworowe z porcją roztworu podstawowego wektora w warunkach pozwalających na wprowadzenie roztworu podstawowego do komórek; następnie prowadzi się inkubację komórek nowotworowych w warunkach pozwalających na ich wzrost; po czym po odpowiednim czasie, szacuje się wzrost komórek nowotworowych, przy czym jako komórki nowotworowe stosuje się komórki płuc, jelita grubego, sutka, trzustki, prostaty, głowy i szyi, lub skóry; następnie porównuje się wzrost komórek nowotworowych ze wzrostem komórek, które poddano działaniu jednego lub więcej standardowych testowych roztworów podstawowych, zawierających wektory będące kontrolą pozytywną, niosące funkcjonalny gen efektorowy i wektory będące kontrolą negatywną nie niosące funkcjonalnego genu efektorowego.
W sposobie według wynalazku wektory będące kontrolą negatywną kodują gen wskaźnikowy, który korzystnie jest genem lucyferazy.
W sposobie według wynalazku wektory są wektorami adenowirusowymi, korzystnie wektory adenowirusowe znajdują się wewnątrz infekcyjnych cząstek adenowirusa.
W sposobie według wynalazku gen efektorowy jest genem supresorowym nowotworu, przy czym gen ten indukuje apoptozę.
W sposobie według wynalazku gen będący supresorem nowotworów jest dzikim genem p53.
W sposobie według wynalazku ilość procentowa wektora defektywnego jest większa niż 0,05%, korzystnie wynosi pomiędzy 0,05% a 10%.
W sposobie według wynalazku okres czasu wzrostu komórek nowotworowych wynosi od 2 do 10 dni, korzystnie od 3 do 5 dni.
Zestaw według wynalazku do określania ilości procentowej defektywnych cząsteczek wektora wybranego z grupy zawierającej adenowirusy, retrowirusy, wirusy krowianki lub wirusy związane z adenowirusami w próbce roztworu podstawowego tego wektora, przy czym przynajmniej część cząsteczek wektora znajdujących się w tym roztworze podstawowym niesie gen efektorowy, wybrany z grupy genów supresorowych nowotworów, konstruktów antysensownych i genów kodujących toksyny, kodujący produkt, który hamuje wzrost komórek nowotworowych, indukuje apoptozę komórek nowotworowych lub zabija komórki nowotworowe, poprzez kontakt komórek nowotworowych z porcją roztworu podstawowego wektora w warunkach pozwalających na wprowadzenie roztworu podstawowego do komórek; inkubację komórek nowotworowych w warunkach pozwalających na ich wzrost; oszacowanie, po odpowiednim czasie, wzrostu komórek nowotworowych, przy czym jako komórki nowotworowe stosuje się komórki płuc, jelita grubego, sutka, trzustki, prostaty, głowy i szyi lub skóry; porównanie wzrostu komórek nowotworowych ze wzrostem komórek, które poddano działaniu jednego lub więcej standardowych testowych roztworów podstawowych, zawierających wektory będące kontrolą pozytywną niosące funkcjonalny gen efektorowy i wektory będące kontrolą negatywną nie niosące funkcjonalnego genu efektorowego; przy
182 817 czym zestaw zawiera przynajmniej dwa pojemniki, które zawierają standardowe testowe mieszaniny roztworów podstawowych wektorów będących kontrolą pozytywną i wektorów będących kontrolą negatywną o określonej ilości procentowej każdego typu wektora.
W zestawie według wynalazku standardowe testowe mieszaniny roztworów podstawowych zawierają jeden lub więcej procent wektorów kodujących gen wskaźnikowy wybrany spośród grup zawieraj ących:0,l%; 0,5%; 1,0%; 2,0%; 5,0%; 10% i 20%.
W zestawie według wynalazku wektory będące kontrolą negatywną niosą gen wskaźnikowy, przy czym gen wskaźnikowy koduje lucyferazę.
W zestawie według wynalazku wektor jest wektorem adenowirusowym.
Pierwszy etap sposobu według wynalazku obejmuje kontakt komórek nowotworowych z roztworem podstawowym wektora, w warunkach, które umożliwiają wprowadzenie wektora do komórek nowotworowych. Roztwór podstawowy wektora może zawierać wirion lub plazmid, który będzie infekował określone komórki nowotworowe przy zastosowaniu takich warunków środowiska, które umożliwiają infekcję. Wektor może zawierać różne elementy regulatorowe, tj. promotory i/lub enhansery. Roztwór podstawowy będzie zawierał od 0 do 100% funkcjonalnego genu efektorowego. Roztwory podstawowe mogą zawierać wektory wirusowe, choć nie tylko. Spośród wektorów wirusowych używane są adenowirusy, retrowirusy, wirusy krowianki i wirusy związane z adenowirusami (adenoassociated virus). Spośród stosowanych komórek nowotworowych najchętniej używane są komórki nowotworowe pochodzące z płuc, jelita grubego, piersi, trzustki, prostaty, głowy, szyi oraz komórki nowotworowe skóry.
W korzystnej odmianie, niniejszy wynalazek dostarcza wektory wchodzące w skład standardowego roztworu podstawowego, które pozbawione są genu efektorowego, tj. tzw. wektory będące kontrolą negatywną. Wektory te zawierają gen lucyferazy. Gen wskaźnikowy dostarcza dowodu na pomyślne wbudowanie do wektora. Np. w korzystnej odmianie, genem stosowanym jako gen wskaźnikowy jest gen lucyferazy. Zastosowanie tego właśnie genu umożliwia proste, wizualne, stwierdzenie czy został on prawidłowo wbudowany. Warunki środowiska wystarczające do zainfekowania komórek nowotworowych wektorem z roztworu podstawowego różnią się zastosowanym w badaniu rodzajem wektora i rodzajem infekowanej komórki nowotworowej. Stosowane są standardowe warunki umożliwiające infekcję, powszechnie znane specjalistom.
Drugi etap sposobu według wynalazku dotyczy inkubacji komórek nowotworowych w warunkach, które pozwalają na wzrost tych komórek. Odpowiedni czas inkubacji zależy od rodzaju komórek nowotworowych i użytego roztworu podstawowego wektora. Najbardziej dogodny okres inkubacji, wystarczający do wzrostu komórek nowotworowych wynosi od 2 do 10 dni. W najkorzystniejszej odmianie stosuje się roztwór podstawowy adenowirusa i komórki nowotworowe SAOS-LM (American Type Culture Collection, Rockville, MD). Czas wystarczający na zahamowanie wzrostu komórek nowotworowych wynosi 3 do 5 dni.
Trzeci etap sposobu według wynalazku dotyczy oszacowania wzrostu komórek nowotworowych po odpowiednim czasie. Wzrost może być określony standardowymi technikami zliczania komórek, powszechnie znanymi specjalistom.
Wreszcie czwarty etap sposobu według wynalazku dotyczy porównania wzrostu komórek nowotworowych zainfekowanych roztworem podstawowym wektora ze wzrostem komórek nowotworowych zainfekowanych testowymi standardowymi roztworami podstawowymi zawierającymi znaną ilość wektora z funkcjonalnym genem efektorowym tj. wektorami stanowiącymi kontrolę pozytywną i negatywną. Określenie - funkcjonalny gen efektorowy odnosi się do genu mającego określone własności terapeutyczne, który to gen wchodzi w skład części cząsteczek wektora znajdujących się w badanym roztworze podstawowym wektora. Określenie geny efektorowe obejmuje geny supresorowe nowotworów, konstrukty antysensowne i toksyny.
W korzystnej odmianie, gen efektorowy o właściwościach terapeutycznych, który wbudowany jest w wektor to supresor nowotworów. Szczególnie wydajnym genem efektorowym jest dziki gen p53.
182 817
W innej korzystnej odmianie statystycznie znacząca wykrywalna ilość wektorów defektywnych wynosi od 0,5 do 10%. Lecz najlepiej jest, gdy statystycznie znacząca wykrywalna ilość wektorów wynosi powyżej 0,5%.
W korzystnej odmianie, niniejszy wynalazek dostarcza zestaw gotowy do przeprowadzenia badania zawierający przynajmniej jeden pojemnik, zawierający standardowy roztwór podstawowy. Standardowy(e) roztwór(y) podstawowy(e) wchodzący(e) w skład zestawu zawierają) znaczną ilość defektywnego składnika wektorowego. W korzystnej odmianie, kompozycja(e) zawieraj ąca(e) defektywne wektory powstaje przez wstawienie w obręb wektora genu lucyferazy. W innej korzystnej odmianie, gotowy zestaw do badań może również zawierać pojemnik, w skład którego wchodzi funkcjonalny gen efektorowy. Dogodnie jest gdy, funkcjonalnym genem efektorowym jest dzika kopia p53 genu będącego supresorem nowotworów. W korzystnej odmianie, gotowy zestaw obejmuje pojemnik testowych standardowych roztworów podstawowych z wektorami kodującymi gen wskaźnikowy w ilości: 0%; 0,1%; 0,5%; 1,0%; 2,0%; 5,0%; 10%; 20%; 100%.
Terapia genowa znajduje coraz szersze zastosowania kliniczne w leczeniu nowotworów. Ze względu na trudności ze specyficznością oddziaływania z wybranym miejscem, mechanizmy procesów na poziomie transferu i ekspresji genów stają się szeroko stosowanym narzędziem w terapii chorób nowotworowych.
Analiza roztworów podstawowych używanych w terapii genowej będzie wymagana zarówno ze względów bezpieczeństwa, jak i skuteczności terapii. Użycie metod molekularnych do analizy roztworów podstawowych wektorów nie jest obecnie wyjściem praktycznym. Zatem analiza musi być oparta na zbadaniu funkcji biologicznych. Jednym ze sposobów standaryzowania funkcji biologicznej jest stworzenie zestawu standardowych roztworów podstawowych zawierających wektor terapeutyczny, który naśladuje różną ilość wektorów podstawowych wektora, zawierających różną ilość wektorów defektywnych. Potencjalnie niebezpieczne jest stworzenie dla celów standaryzacji wektorów defektywnych zawierających zmutowane wersje genów terapeutycznych. Np. zmutowany gen p53 może być potencjalnie niebezpieczny. Dlatego też, stworzono test służący do określania ilości defektywnego wektora w porcji roztworu podstawowego tego wektora, który to test wykorzystuje surogat wektora defektywnego. ,
Obecny wynalazek dostarcza sposobu, który umożliwia określenie stopnia osłabienia funkcji dzikiego genu w roztworze podstawowym wektora z wykorzystaniem wektora defektywnego. Termin wektor defektywny określa wektor, który utracił swą funkcję podczas przygotowywania roztworu podstawowego wektora. Najczęściej wektor defektywny to wektor, który nie ma wbudowanego genu terapeutycznego, lecz może także zawierać gen terapeutyczny, który jest nieaktywny lub zmutowany. Wektor defektywny nie ma wpływu terapeutycznego na komórki nowotworowe, ponieważ nie zachodzi ekspresja genu terapeutycznego. Aby zasymulować obecność wektora defektywnego można zmniejszać znany wektor defektywny tj. wektor stanowiący kontrolę negatywną, z roztworem podstawowym, zawierającym wektor z wrekombinowaną dziką wersją genu efektorowego, tj. wektorem stanowiącym kontrolę pozytywną. Taki wektor stanowiący kontrolę negatywną może prowadzić ekspresję genu wskaźnikowego takiego jak np. gen lucyferazy (Adluc). Adluc służy jako wskaźnik ilości wektora defektywnego znajdującego się w roztworze podstawowym wektora.
Wektory: Sposobami opisanymi w niniejszym wynalazku mogą być badane różne rodzaje wektorów. Wektorami mogą być standardowe wektory ekspresyjne, które zawierają jeden lub więcej genów efektorowych i elementy regulatorowe wymagane do ekspresji genu efektorowego w komórce. Elementy regulatorowe obejmują promotor oraz mogą również obejmować struktury, które wzmacniają transkrypcję genu efektorowego (tzw. enhancery). Elementy regulatorowe mogą również obejmować struktury, które umożliwiają ekspresję genu efektorowego w ograniczonej grupie komórek (promotory tkankowo specyficzne).
Używając w terapii standardowe wektory ekspresyjne stosuje się różne sposoby wprowadzania ich do komórek. Np. wektory te połączone z mikrocząsteczkami lub zmodyfikowane w inny sposób, umożliwiający ich pobranie lub wprowadzenie do komórki docelowej. Rozważa się również możliwość, gdy nagi DNA może, w niektórych sytuacjach, być trans
182 817 portowany przez błonę komórkową w ilości wystarczającej na prowadzenie terapii genowej. Niezależnie od mechanizmu wprowadzenia do wnętrza komórki i od rodzaju wektora, sposób opracowany do badania aktywności roztworu podstawowego wektora będzie się opierał na tej samej zasadzie.
Inny rodzaj wektora to wektor wirusowy. Wektory wirusowe powstały w oparciu o różne grupy wirusów, m.in. adenowirusy, herpeswirusy, retrowirusy, wirusy krowianki i wirusy związane z adenowirusami (adeno-associated virus). Ten typ wektorów ma dwie ważne cechy, które decydują o jego przewadze nad wektorami standardowymi. Po pierwsze, wektory te można zaprojektować tak, aby replikowały się i pakowały w kapsydy tak, jak infekcyjne wirusowe DNA. To pozwala na wykorzystanie normalnego (stworzonego przez samą naturę) wirusowego systemu rozpoznawania komórki docelowej i wnikania do niej. Dodatkowo, elementy regulatorowe wirusa często są kompatybilne z mechanizmami ekspresji genów w komórkach, które to wirusy atakują. Oczywiście, oba te elementy (zarówno te odpowiedzialne za infekcję określonego typu komórek, jak i elementy regulatorowe) mogą być modyfikowane jeżeli zajdzie taka potrzeba.
Gen efektorowy: Gen efektorowy kodowany przez wektor może być genem, który ma zauważalny wpływ biologiczny na komórki nowotworowe. Najczęściej wpływ biologiczny to zahamowanie wzrostu, stymulacja programowanej śmierci komórki (apoptoza) lub zabicie komórki nowotworowej. Różne geny efektarowe mogą charakteryzować się jedną lub kilkoma z wyżej opisanych aktywności biologicznych. Np.: niektóre geny będące supresorami nowotworów będą jednocześnie hamować wzrost komórek nowotworowych, podczas gdy inne będą przywracać komórkom nowotworowym zdolność; do programowanej śmierci. Białko p53 jest klasycznym przykładem supresora nowotworów. Inne supresory nowotworów to: RB, APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-II, BRCA1, VHL., FCC i MCC. Onkogeny są bardzo dobrym celem działania dla konstruktorów antysensowych. Obejmują one geny: ras, myc, neu, raf, erb, src,fms,jun, trk, ret, gsp, hst, bel i abl. Geny kodujące toksyny lub geny, które blokują podstawowe ftmkcje komórek mogą hamować wzrost komórek nowotworowych lub zabijać te komórki. Toksyny te obejmują toksynę cholery, krztuśca, dyfterytu, tężca, endotoksynę. Geny, takie jak geny antygenów powierzchniowych komórki czy kinazy tymidynowej, które czynią komórkę wrażliwą na działanie czynników zewnętrznych, również będą umożliwiały zabijanie komórek nowotworowych.
Komórki. Teoretycznie każda komórka nowotworowa powinna być podatna na ten rodzaj analizy. Oczywiście, nowotwór musi być podatny na działanie tego genu efektorowego, który został użyty. Przy zastosowaniu jako genów efektorowych, genów toksycznych lub genów, które czynią komórkę podatną na działanie czynników zewnętrznych, należy spodziewać się skuteczności w stosunku do każdego rodzaju komórek. Konstrukty antysensowe i supresory nowotworów wymagają dalszych badań, które pozwolą na określenie ich skuteczności w odniesieniu do poszczególnych rodzajów nowotworów.
Komórki nowotworowe płuc, sutka, jelita grubego, głowy i szyi, trzustki, osteosarcoma i prostaty są przykładem komórek, które będą podatne na leczenie z zastosowaniem supresora nowotworów p53.
Warunki prowadzenia analizy: Warunki przeprowadzenia analizy mogą być bardzo różne i zależą od wielu czynników. Np. warunki i czas inkubacji komórek będą rożne w różnych badaniach. Jeżeli analiza opiera się na badaniu tempa wzrostu komórek, warunki i czas inkubacji będą dobrane tak, aby móc obserwować wzrost badanych komórek. Jeżeli analiza opiera się na badaniu uśmiercania komórek, warunki i czas inkubacji będą zależeć od tego jaki czas i warunki są niezbędne aby gen efektorowy mógł doprowadzić do śmierci komórki. Jeżeli przy zastosowaniu określonego genu efektorowego konieczne jest obserwowanie takich własności, jak wzrost w miękkim agarze czy tworzenie kolonii, należy zastosować standardowe, powszechnie stosowane w takich sytuacjach warunki i czas inkubacji.
Czułość. Porcja pochodząca z roztworu podstawowego wektora będzie zawierała miliony, czasem nawet biliony cząsteczek wektora. Analiza oparta na badaniu aktywności biologicznej ma znacznie ograniczone możliwości wykrycia wektorów defektywnych stanowiących znikomy procent ogółu próby. W zależności od rodzaju użytego wektora, od rodzaju
182 817 komórek nowotworowych, które mają być poddane leczeniu i od danego sposobu leczenia, wartość progowa, która będzie uznawana za wynik statystycznie znaczący, będzie różna. Osoby prowadzące badania mogą określić wartość progową dla poszczególnych metod badania w prosty sposób tworząc serię standardowych roztworów podstawowych.
Na przykład: osoba wykonująca badanie może zmieszać różne procentowo ilości wektora, będącego kontrolą negatywną i wektora, będącego kontrolą pozytywną (np.: próbkę wyjściowego roztworu podstawowego wektora), oznaczając jako 100% aktywność roztworu podstawowego wektora. Oczywiście pojęcie aktywności jest względne i zależy od badanego konstruktu wektor-gen. Na przykład 100% aktywność roztworu podstawowego wektora, będącego kontrolą pozytywną można określić na podstawie stopnia śmierci komórek nowotworowych, zahamowania ich wzrostu, apoptozy czy w oparciu o ekspresję kodowanego genu. Dodając pewną znaną ilość wektora będącego kontrolą negatywną można będzie zaobserwować znaczącą zmianę w zachowaniu (wzrost, śmierć, itp.) pomiędzy komórkami poddanymi działaniu roztworu podstawowego, zawierającego tylko wektor, będący kontrolą pozytywną a komórkami poddanymi działaniu roztworów składających się z różnej (procentowo) mieszaniny wektorą będącego kontrolą pozytywną i wektora, będącego kontrolą negatywną. Minimalna, znacząca statystycznie różnica w zachowaniu, między tymi dwoma grupami komórek określa stopień czułości danego sposobu badania.
Gotowe zestawy do prowadzenia badań. Jest wysoce pożądanym dostarczenie dla poszczególnych rodzajów wektorów gotowych zestawów, zawierających co najmniej wektor, stanowiący kontrolę negatywną. Standardowo, wektory stanowiące kontrolę negatywną będą kodowały geny markerowe jak np. lucyferazę, która umożliwia użytkownikowi zestawu sprawdzenie ilości wektorą będącego kontrolą negatywną w badanym roztworze podstawowym wektora. Te gotowe zestawy mogą zawierać również płytki lub pojemniki do prowadzenia hodowli kultur komórkowych, rozcieńczania buforów, pojemniki oraz komórki do namnażania wektorą będącego kontrolą negatywną a także instrukcje dotyczące prowadzenia badań.
Adenowirus p-53. W korzystnej odmianie, opracowano metodę badania służącą określeniu aktywności supresorowej w stosunku do nowotworów, konstruktu zawierającego adenowirus p-53 (Adp53). Podczas gdy nie znamy tempa mutowania większości wektorów wirusowych, ocenia się że częstość mylenia się adeninowirusowej polimerazy DNA nie jest większa niż częstość błędu ssaczej polimerazy DNA. Zatem jest możliwe, iż w preparacie zawierającym 1010 cząsteczek konstruktu może być aż 104 kopii adenowirusa, zawierających nieaktywny p53 lub prowadzących ekspresję zmutowanego p53.
W tym przypadku identyfikacja wektorów zmutowanych sposobami molekularnymi, takimi jak np. PCR™ nie jest ani praktyczna, ani wystarczająca. Co więcej, ponieważ nie ma sposobu badawczego umożliwiającej badanie transformacji komórek przy użyciu samej tylko zmutowanej formy p53, byłoby niezbędne stworzenie sposobu badania opartego na wykrywaniu jednoczesnej transformacji komórki zarówno zmutowanym p53 jak i innym onkogenem, takim, jak np. ras(2). Z kolei wyniki takich badań są trudne do oszacowania, co więcej w wypadku wielu komórek taka kombinacja genów nie jest skuteczna. Dodatkowo, taki sposób badania wymagałby zastosowania jako kontroli pozytywnej wektora zawierającego zmutowany p53, a tworzenie takich konstruktów jako potencjalnie niebezpiecznych zostało zabronione przez RAC.
W tej sytuacji sposób badania opiera się na porównaniu aktywności wyjściowego, pierwotnego roztworu podstawowego Adp53 z aktywnością nowo przygotowanej próbki roztworu przyjmuje się, że wyjściowy roztwór podstawowy Adp53 powoduje przy wartości MOI 50:1, w 5-tym dniu hodowli śmierć 100% komórek SAOS (ludzka linia komórkowa posiadająca delecję homozygotyczną p53). Takie wyjściowe roztwory podstawowe eliminują in vivo nowotwory w mysim modelu ludzkiego raka płuc (Fujiwara i in.,1994; Zhang i in., 1993). Dodając do wyjściowego roztworu podstawowego coraz większą ilość wektora defektywnego można stworzyć model powstawania kolejnych próbek roztworu, zawierających różną ilość defektywnego Adp53. Następnie tak uzyskaną próbkę Adp53 bada się pod kątem jej zdolności do zabijania komórek SAOS (badanie prowadzi się przez okres 5 dni) a uzyskane krzywe
182 817 wzrostu porównuje się z krzywymi wzrostu uzyskanymi dla wzorcowych roztworów wektora zawierających różny procent defektywnych cząsteczek wektora.
Przykład: Określanie ilości procentowej defektywnego wektora w próbce pobranej z roztworu podstawowego adenowirusa Adp53
Komórki SAOS-LM hodowano na płytkach w ilości 106 komórek na 60 mm płytkę hodowlaną. Płytki inkubowano przez noc w temp. 37°C. Przed zainfekowaniem wirusem komórki na szalkach policzono. Następnie komórki zainfekowano, MOI=50:1. Stworzono następujące grupy: szalki zaszczepione wyjściowym roztworem podstawowym Adp53, szalki zaszczepione roztworem podstawowym zawierającym 0,1%; 0,5%; 1%; 5%, 10% i 20% Adluc (kontrola pozytywna), szalki zaszczepione serią testowanych roztworów Adp53. We wszystkich grupach badania prowadzono w trzech powtórzeniach. Komórki na każdej szalce były liczone codziennie (dwa zliczenia z każdej szalki) przez 5 dni. Eksperyment wykonano niezależnie 3 razy.
Wyniki przedstawiono na rysunku, na którym Fig. 1 przedstawia krzywe wzrostu komórek SAOS-LM po inkubacji w roztworze Adp53 i Adp53, zawierającym różne ilości Ad/wc. Każdy punkt przedstawia średnią ISD uzyskaną z trzech powtórzeń i Fig. 2 przedstawia rozszerzenie krzywych wzrostu z Fig.l. Każdy punkt przedstawia średnią ISD uzyskaną z trzech powtórzeń.
Na Fig. 1 można zauważyć silne zahamowanie wzrostu komórek SAOS w grupie, której podano wyjściowy podstawowy roztwór Adp53, a także mniejszy stopień zahamowania wzrostu w grupach, które zainfekowano roztworami podstawowymi zawierającymi defektywne cząsteczki wektora. Statystycznie znaczące i powtarzalne różnice we wzroście komórek, można zauważyć w trzecim dniu trwania eksperymentu i stają się one coraz wyraźniejsze do piątego dnia trwania eksperymentu. Na Fig. 2, na przykład, w trzecim dniu eksperymentu średnia ilość komórek na szalkach zainfekowanych wyjściowym roztworem pierwotnym Adp53 wynosiła 25± 4 (±odchylenie standardowe), a średnia ilość komórek na szalkach zainfekowanych roztworem pierwotnym Adp53 zawierającym 1% wektora defektywnego wynosiła 36±4. Różnica jest znacząca, p<0,02, przy czułości tego badania wynosi 1%, bowiem różnica między grupami, które zainfekowano roztworem podstawowym odpowiednio zawierającym 0,5% i 1% wektora defektywnego nie jest znacząca. Zatem obecność 1% defektywnego wektora w preparacie; jest biologicznie znacząca i wykrywalna przy pomocy tej sposobu badania.
Podsumowując, stworzenie standardów biologicznych, zawierających konstrukt zastępujący wektor ze zmutowanym genem p53 doprowadziło do stworzenia sposobu biologicznego wykrywania nieaktywnego wektora. Zestawy składników i sposoby tego wynalazku zostały tu przedstawione w przykładowych zastosowaniach, jest jednak oczywiste, że można wprowadzić różnorodne zmiany do składu, metod, poszczególnych etapów, lub kolejności etapów sposobu to opisanego, nie odchodząc od głównej myśli, idei i zakresu wynalazku. Dokładnej, oczywistym jest, że odczynniki opisane tutaj mogą być użyte w miejsce swoich chemicznych i fizjologicznych odpowiedników, z uzyskaniem tych samych lub podobnych rezultatów. Wszystkie te odpowiedniki i modyfikacje, znane wszystkim specjalistom uznaje się za objęte zakresem i ideą wynalazku, jak określono w załączonych zastrzeżeniach patentowych.
Następujące odnośniki literaturowe, w zakresie, w jakim dostarczają przykładowych metod postępowania lub innych szczegółów uzupełniających do opisanych w niniejszym wynalazku zamieszczono poniżej.
Bishop, Science, 235:305-311,1985.
Casey et al., Growth suppression of human breast cancer cells by the introduction of a wild-type p53 gene, Oncogene, 6:1791-1797,1991.
Fields et al., Science, 249:1046-1049,1990.
Fujiwara et al., Induction of chemosensitivity in human lung cancer cells in vivo by adenovirus-mediated transfer of the wild-type p53 gene, Cancer Res., 54:2287-2291,1994.
Hollstein et al., p53 mutations in human cancers, Science, 253:49-53,1991.
Mercer, Celi cycle regulation and the p53 tumor suppressor protein, Critic. Rev. Eukar.
182 817
Gene Express, 2:251-263,1992.
Spandidos et al., J. Pathol. A 57:1-10,1989.
Travali et al., FASEB, 4:3209-3214,1990.
Weinberg, Tumor suppressor gene, Science, 254:11381145,1991.
Yonish-Rouach et al., Naturę, 352:345-347,1991.
Zhang et al., High-efficiency gene transfer and highlevel expression of wild-type p53 in human lung cancer cells mediated by recombinant adenovirus, Comer Gene Therapy, (in press), 1993.
Liczba komórek χ 10 000
120
100
0%Luc
0.1%Luc
0.5%Luc
1%Luc ao
20%Łue
5%Luc
10%Luc
Dni
FIG. 2
182 817
Liczba komórek x 10 000
FIG. 1
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.
Claims (18)
1. Sposób określania ilości procentowej defektywnych cząsteczek wektora, wybranego z grupy zawierającej adenowirusy, retrowirusy, wirusy krowianki lub wirusy związane z adenowirusami (adeno-associated virus) w próbce roztworu podstawowego tego wektora, znamienny tym, że stosuje się roztwór podstawowy, w którym przynajmniej część cząsteczek wektora niesie gen efektorowy, wybrany z grupy genów supresorowych nowotworów, konstruktów antysensowych i genów kodujących toksyny, kodujący produkt, który hamuje wzrost komórek nowotworowych, indukuje apoptozę komórek nowotworowych lub zabija komórki nowotworowe; przy czym najpierw kontaktuje się komórki nowotworowe z porcją roztworu podstawowego wektora w warunkach pozwalających na wprowadzenie roztworu podstawowego do komórek; następnie prowadzi się inkubację komórek nowotworowych w warunkach pozwalających na ich wzrost; po odpowiednim czasie szacuje się wzrost komórek nowotworowych, przy czym jako komórki nowotworowe stosuje się komórki płuc, jelita grubego, sutka, trzustki, prostaty, głowy i szyi, lub skóry; następnie porównuje się oraz określa procentowo wzrost komórek nowotworowych ze wzrostem komórek, które poddano działaniu jednego lub więcej standardowych testowych roztworów podstawowych, zawierających wektory będące kontrolą pozytywną, niosące funkcjonalny gen efektorowy i wektory będące kontrolą negatywną, nie niosące funkcjonalnego genu efektorowego.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wektory będące kontrolą negatywną kodują gen wskaźnikowy.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że gen wskaźnikowy jest genem lucyferazy.
4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że wektory są wektorami adenowirusowymi.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że wektory adenowirusowe znajdują się wewnątrz infekcyjnych cząstek adenowirusa.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że gen efektorowy jest genem supresorowym nowotworu.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że gen efektorowy indukuje apoptozę.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że gen będący supresorem nowotworów jest dzikim genem p53.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ilość procentowa defektywnego wektora jest większa niż 0,05%.
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ilość procentowa defektywnego wektora wynosi pomiędzy 0,05% a 10%.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że okres czasu wzrostu komórek nowotworowych wynosi 2 do 10 dni.
12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że okres czasu wzrostu komórek nowotworowych wynosi 3 do 5 dni.
13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że standardowe testowe roztwory podstawowe zawierają jeden lub więcej procent wektorów defektywnych wybranych spośród grup zawierających: 0%; 0,1%; 0,5%;l,0%; 2,0%; 5,0%;10%; 20%;100%.
14. Gotowy zestaw do określania ilości procentowej defektywnych cząsteczek wektora, wybranego z grupy zawierającej adenowirusy, retrowirusy, wirusy krowianki lub wirusy związane z adenowirusami w próbce roztworu podstawowego tego wektora, znamienny tym, że zawiera przynajmniej dwa pojemniki, które zawierają standardowe testowe mieszaniny roztworów podstawowych wektorów będących kontrolą pozytywną i wektorów będących kontrolą negatywną, o określonej ilości procentowej każdego typu wektora, przy czym przynajmniej część cząsteczek wektora znajdujących się w tym roztworze podstawowym niesie
182 817 gen efektorowy, wybrany z grupy genów supresorowych nowotworów, konstruktów antysensowych i genów kodujących toksyny, kodujący produkt, który hamuje wzrost komórek nowotworowych, indukuje apoptozę komórek nowotworowych lub zabija komórki nowotworowe, poprzez kontakt komórek nowotworowych z porcją roztworu podstawowego wektora w warunkach pozwalających na wprowadzenie roztworu podstawowego do komórek; inkubację komórek nowotworowych w warunkach pozwalających na ich wzrost; oszacowanie, po odpowiednim czasie, wzrostu komórek nowotworowych, przy czym jako komórki nowotworowe stosuje się komórki płuc, jelita grubego, sutka, trzustki, prostaty, głowy i szyi, lub skóry; porównanie wzrostu komórek nowotworowych ze wzrostem komórek, które poddano działaniu jednego lub więcej standardowych testowych roztworów podstawowych, zawierających wektory będące kontrolą pozytywną, niosące funkcjonalny gen efektorowy i wektory będące kontrolą negatywną nie niosące funkcjonalnego genu efektorowego.
15. Zestaw według zastrz. 14, znamienny tym, że standardowe testowe mieszaniny roztworów podstawowych zawierają jeden lub więcej procent wektorów kodujących gen wskaźnikowy wybranych spośród grup zawierających: 0,1%; 0,5%; 1,0%; 2,0%; 5,0%; 10% i 20%.
16. Zestaw według zastrz. 14 albo 15, znamienny tym, że wektory będące kontrolą negatywną niosą gen wskaźnikowy.
17. Zestaw według zastrz. 16, znamienny tym, że gen wskaźnikowy koduje lucyferazę.
18. Zestaw według zastrz. 14, znamienny tym, że wektor jest wektorem adenowirusowym.
* * *
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/390,887 US5637456A (en) | 1995-02-17 | 1995-02-17 | Rapid test for determining the amount of functionally inactive gene in a gene therapy vector preparation |
| PCT/US1996/002042 WO1996025515A1 (en) | 1995-02-17 | 1996-02-14 | A rapid test for determining the amount of functionally inactive gene in a gene therapy vector preparation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL321869A1 PL321869A1 (en) | 1997-12-22 |
| PL182817B1 true PL182817B1 (pl) | 2002-03-29 |
Family
ID=23544364
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL96321869A PL182817B1 (pl) | 1995-02-17 | 1996-02-14 | Sposób i gotowy zestaw do określania ilości procentowej defektywnych cząsteczek wektora w preparacie wektora używanym w terapii genowej |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5637456A (pl) |
| EP (1) | EP0811077B1 (pl) |
| JP (1) | JPH11500012A (pl) |
| KR (1) | KR19980702312A (pl) |
| AT (1) | ATE283371T1 (pl) |
| AU (1) | AU700427B2 (pl) |
| BR (1) | BR9607613A (pl) |
| CA (1) | CA2213116A1 (pl) |
| CZ (1) | CZ257597A3 (pl) |
| DE (1) | DE69633913D1 (pl) |
| HU (1) | HUP9802062A3 (pl) |
| NO (1) | NO973770L (pl) |
| NZ (1) | NZ303040A (pl) |
| PL (1) | PL182817B1 (pl) |
| SK (1) | SK283027B6 (pl) |
| UA (1) | UA45492C2 (pl) |
| WO (1) | WO1996025515A1 (pl) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2760009A1 (fr) * | 1997-02-27 | 1998-08-28 | Atochem Elf Sa | Procede de fabrication d'acide acrylique a partir de l'acroleine par reaction redox et l'utilisation d'une composition solide d'oxydes mixtes comme systeme redox dans ladite reaction |
| US7691370B2 (en) | 1998-10-15 | 2010-04-06 | Canji, Inc. | Selectivity replicating viral vector |
| CA2416408A1 (en) * | 2000-07-19 | 2002-01-31 | Regents Of The University Of California | Methods for therapy of neurodegenerative disease of the brain |
| FR2821624B1 (fr) * | 2001-03-01 | 2004-01-02 | Sod Conseils Rech Applic | Nouveau polynucleotide utilisable pour moduler la proliferation des cellules cancereuses |
| US6908560B2 (en) * | 2003-03-12 | 2005-06-21 | Basin Water, Inc. | Zero brine, zero rinse water process for treatment of contaminated drinking water for removal of arsenic |
| EP2208786B1 (en) * | 2005-12-13 | 2018-08-01 | Kyoto University | Nuclear reprogramming factor |
| US20090227032A1 (en) * | 2005-12-13 | 2009-09-10 | Kyoto University | Nuclear reprogramming factor and induced pluripotent stem cells |
| US8278104B2 (en) * | 2005-12-13 | 2012-10-02 | Kyoto University | Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2 |
| US8129187B2 (en) | 2005-12-13 | 2012-03-06 | Kyoto University | Somatic cell reprogramming by retroviral vectors encoding Oct3/4. Klf4, c-Myc and Sox2 |
| US9213999B2 (en) * | 2007-06-15 | 2015-12-15 | Kyoto University | Providing iPSCs to a customer |
| JP2008307007A (ja) * | 2007-06-15 | 2008-12-25 | Bayer Schering Pharma Ag | 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞 |
| CA2695522C (en) * | 2008-05-02 | 2019-01-15 | Kyoto University | Method of nuclear reprogramming |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4975365A (en) * | 1987-05-12 | 1990-12-04 | The John Hopkins University | Assay for measuring DNA cell repair potential |
| US5212057A (en) * | 1988-10-26 | 1993-05-18 | University Of Florida | Biological system for constructing and testing viral vaccines |
| CA2115742A1 (en) * | 1991-08-20 | 1993-03-04 | Ronald G. Crystal | Adenovirus mediated transfer of genes to the gastrointestinal tract |
| FR2688514A1 (fr) * | 1992-03-16 | 1993-09-17 | Centre Nat Rech Scient | Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant. |
| FR2704234B1 (fr) * | 1993-04-22 | 1995-07-21 | Centre Nat Rech Scient | Virus recombinants, preparation et utilisation en therapie genique. |
| SK282843B6 (sk) * | 1993-07-13 | 2002-12-03 | Rhone-Poulenc Rorer S. A. | Defektný rekombinantný adenovírus a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom |
-
1995
- 1995-02-17 US US08/390,887 patent/US5637456A/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-02-14 JP JP8525132A patent/JPH11500012A/ja active Pending
- 1996-02-14 UA UA97084262A patent/UA45492C2/uk unknown
- 1996-02-14 NZ NZ303040A patent/NZ303040A/en unknown
- 1996-02-14 HU HU9802062A patent/HUP9802062A3/hu unknown
- 1996-02-14 KR KR1019970705709A patent/KR19980702312A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-02-14 CZ CZ972575A patent/CZ257597A3/cs unknown
- 1996-02-14 EP EP96905510A patent/EP0811077B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-14 SK SK1113-97A patent/SK283027B6/sk unknown
- 1996-02-14 AT AT96905510T patent/ATE283371T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-02-14 BR BR9607613-5A patent/BR9607613A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-02-14 AU AU49248/96A patent/AU700427B2/en not_active Ceased
- 1996-02-14 CA CA002213116A patent/CA2213116A1/en not_active Abandoned
- 1996-02-14 PL PL96321869A patent/PL182817B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-02-14 DE DE69633913T patent/DE69633913D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-14 WO PCT/US1996/002042 patent/WO1996025515A1/en active IP Right Grant
-
1997
- 1997-08-15 NO NO973770A patent/NO973770L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE283371T1 (de) | 2004-12-15 |
| US5637456A (en) | 1997-06-10 |
| KR19980702312A (ko) | 1998-07-15 |
| CZ257597A3 (cs) | 1998-04-15 |
| CA2213116A1 (en) | 1996-08-22 |
| NZ303040A (en) | 1998-07-28 |
| DE69633913D1 (de) | 2004-12-30 |
| JPH11500012A (ja) | 1999-01-06 |
| EP0811077A1 (en) | 1997-12-10 |
| WO1996025515A1 (en) | 1996-08-22 |
| EP0811077B1 (en) | 2004-11-24 |
| SK111397A3 (en) | 1998-04-08 |
| SK283027B6 (sk) | 2003-02-04 |
| AU4924896A (en) | 1996-09-04 |
| BR9607613A (pt) | 1999-11-30 |
| NO973770D0 (no) | 1997-08-15 |
| UA45492C2 (uk) | 2002-04-15 |
| HUP9802062A2 (hu) | 1998-12-28 |
| AU700427B2 (en) | 1999-01-07 |
| NO973770L (no) | 1997-10-15 |
| PL321869A1 (en) | 1997-12-22 |
| HUP9802062A3 (en) | 2001-08-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ladenstein et al. | Prognostic significance of DNA di‐tetraploidy in neuroblastoma | |
| Cock et al. | The influence of nuclear background on the biochemical expression of 3460 Leber's hereditary optic neuropathy | |
| CA2315279A1 (en) | 14-3-3.sigma. arrests the cell cycle | |
| PL182817B1 (pl) | Sposób i gotowy zestaw do określania ilości procentowej defektywnych cząsteczek wektora w preparacie wektora używanym w terapii genowej | |
| Shibahara et al. | Targeted disruption of one allele of the Y‐box binding protein‐1 (YB‐1) gene in mouse embryonic stem cells and increased sensitivity to cisplatin and mitomycin C | |
| Nieuwenhuis et al. | BRCA1 and BRCA2 heterozygosity and repair of X-ray-induced DNA damage | |
| Bajpayee et al. | Current status of short-term tests for evaluation of genotoxicity, mutagenicity, and carcinogenicity of environmental chemicals and NCEs | |
| McMillan et al. | Molecular determinants of radiosensitivity in mammalian cells | |
| Shephard et al. | Mutations in liver DNA of lacI transgenic mice (Big Blue) following subchronic exposure to 2-acetylaminofluorene | |
| Landi et al. | Repeated analysis of sister chromatid exchange induction by diepoxybutane in cultured human lymphocytes: effect of glutathione S-transferase T1 and M1 genotype | |
| Wei et al. | Genetic effect of an InDel in the promoter region of the NUDT15 and its effect on myoblast proliferation in chickens | |
| Stringer et al. | Detection of the H-RAS oncogene in human thyroid anaplastic carcinomas | |
| WO2000073420A2 (en) | Creation of human tumorigenic cells and uses therefor | |
| Friedlande et al. | The role of XbaI polymorphism of the apolipoprotein B gene in determining levels and covariability of lipid and lipoprotein variables in a sample of Israeli offspring with family history of myocardial infarction | |
| Thraves et al. | Transformation of human epidermal keratinocytes with fission neutrons | |
| Dulhanty et al. | Complementation of the DNA-repair defect in a CHO mutant by human DNA that lacks highly abundant repetitive sequences | |
| Starita et al. | A multiplexed homology-directed DNA repair assay reveals the impact of~ 1,700 BRCA1 variants on protein function | |
| Sigurdson et al. | Gamma-ray mutagen sensitivity and survival in patients with glioma. | |
| Economidou-Karaoglou et al. | Variations in serum alkaline DNase activity: a new means to assess early detection of relapse in patients treated for acute nonlymphoblastic leukemia | |
| Ewuola et al. | Insilico analysis of myostatin gene in selected poultry species | |
| Raymond | Loci associated with bone strength in laying hens | |
| CN118086385A (zh) | 一种鉴别nf基因突变致病性的方法 | |
| CN1178557A (zh) | 一种在基因治疗载体制剂中测定功能失活基因之数量的快速检验方法 | |
| Krontiris | Challenges: Clinical applications of oncogene research | |
| Broketa et al. | CROATIAN INTERNATIONAL PUBLICATIONS |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20080214 |