CN118086385A

CN118086385A - 一种鉴别nf基因突变致病性的方法

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Publication number: CN118086385A
Application number: CN202410040635.8A
Authority: CN
Inventors: 史远远; 贾小彦; 郭婉蓉; 黄玉梅
Original assignee: Guangdong Hong Kong Macao Dawan District Institute Of Precision Medicine Guangzhou
Current assignee: Guangdong Hong Kong Macao Dawan District Institute Of Precision Medicine Guangzhou
Priority date: 2023-01-12
Filing date: 2024-01-11
Publication date: 2024-05-28

Abstract

本发明涉及生物医学领域，具体涉及肿瘤基因变异致病性的鉴别，所述鉴别方法其步骤如下：S01通过基因工程手段获得含有致病性未明的NF突变细胞系；S02采用基于NF基因功能能够特异性抑制或杀灭细胞的药物对S01的细胞进行处理；S03当细胞在抑制或杀灭细胞的药物处理下，能正常生长，则说明该细胞中携带的NF基因变异具有致病性；当细胞在抑制或杀灭细胞的药物处理下，不能正常生长或死亡，则说明该细胞中携带的NF基因变异是非致病性变异。该方法是一种规模化、精确、有效的筛选方法，简便、快速、费用低，一次可以筛选成百上千种突变体，减少了操作误差的发生，提高了筛选效率和结果的准确性，可从根本上解决基因突变与致病性分析的高效性、时效性和准确性问题。

Description

一种鉴别NF基因突变致病性的方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及肿瘤基因突变致病性的鉴别。

背景技术

神经纤维瘤(neurofibromatosis type,NF)是一种常染色体显性遗传病，主要分为I型神经纤维瘤病(neurofibromatosis type 1，NF1)、NF2相关的神经鞘瘤病(neurofibromatosis type 2,NF2)和极其罕见的神经鞘瘤(Schwannoma，SWN)。其中，NF1是由17q11.2染色体上抑癌基因NF1的2个等位基因中的一个发生突变所致的常染色体显性遗传病，每3000～5000个新生儿可发现1例患儿，然而大约42％～50％的患儿并非由父母遗传所致，而是发生新发突变。NF1基因是一种重要的抑癌基因，编码了含有2818个氨基酸的神经纤维瘤蛋白，广泛表达于中枢神经系统的神经元和星形胶质细胞，以及外周神经系统的施旺细胞，其主要通过促进活化状态的RAS-三磷酸鸟苷(GTP)转化为无活性的RAS-二磷酸鸟苷(GDP)，从而负向调节RAS信号通路，达到抑制细胞增殖的作用。NF2，其致病基因位于染色体22q12.2上，出生发病率约为1/28000，大多数患者在青少年晚期或成年早期可出现耳鸣、耳聋、面部抽搐、吞咽困难、视力下降、眩晕等症状。在90％的患者中发现以前庭神经鞘瘤(vestibular schwannoma,VS)和脑膜瘤最为常见，此外还包括室管膜瘤、脊髓神经鞘瘤、真皮神经鞘瘤等。除了累及神经系统，肿瘤还可造成白内障、后囊下晶状体混浊、牛奶咖啡色素斑(Caféau lait pigmented spots，CALMs)等病变。

NF1最常见的临床表现为牛奶咖啡斑和神经纤维瘤，其他皮肤病变表现包括皱褶部雀斑、贫血痣、幼年黄色肉芽肿、蒙古斑周围“无色素痣”；神经系统表现包括认知障碍、学习困难、癫痫、视神经胶质瘤(optic pathway alioma，OPG)，脑干胶质瘤、眷髓肿瘤、恶性周围神经鞘瘤(malianant peripheral nerve sheath tumor，MPNST)等；骨骼系统病变包括胫骨假关节、蝶骨翼发育不良、脊柱侧弯、身材矮小、巨头畸形、脊椎发育不良、腰椎翻转、漏斗胸等；其他表现如虹膜错构瘤(lisch结节)、高血压、先天性心脏病、胃肠道间质瘤、肺动脉高压、青少年粒单核细胞白血病、嗜铬细胞瘤、乳腺癌等等，该疾病存在较大的临床异质性，即使是同一家族的患者之间临床表现差异也很大。随着年龄的增长会出现完全外显的特征，半数患者在1岁时即可出现典型的临床表现，而其余患者到8岁时才可能出现症状，但几乎所有患者在20余岁时均可达到诊断标准。迄今，已经超过3000多个NF1基因突变被报道，包括无义突变、错义突变、重复突变、剪切突变、小片段插入或缺失、大片段插入或缺失等各种突变类型分布在整个编码区，其主要导致神经纤维瘤蛋白肽链变短。目前尚无针对1型神经纤维瘤的特效治疗药物，NF1的治疗主要是对症治疗及对并发症的监测。现阶段很多治疗NF1的药物进入临床试验阶段，包括针对分子调控的药物如mTOR抑制剂雷帕霉素、RAF/MEK/ERK通路及酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼、法尼基转移酶抑制剂替吡法尼；另外还有针对肿瘤微环境的药物：调节免疫和抑制血管生成的干扰素、酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼、抗炎抗纤维化的吡非尼酮等，但由于以上药物治疗会出现无法耐受的严重不良反应或肿瘤体积的有限缩小，均未获得令人满意的效果；司美替尼(Selumeitinib，商品名：Koselugo)是FDA批准的首个NF1治疗药物，但是仅适用于3岁及3岁以上伴有症状、无法手术的丛状神经纤维瘤(PN)的NF1儿科患者的治疗。综上，NF1是一种基因变异相关的疾病，目前尚无特效的治疗方法可以逆转或预防NF1的发生。

NF2也称为双侧听神经纤维瘤病或中枢神经纤维瘤病，是由22号染色体上抑癌基因NF2突变引起的一种罕见的常染色体显性遗传性肿瘤综合征。NF2以多种非恶性神经系统肿瘤为特征，包括神经鞘瘤、脑膜瘤、室管膜瘤和胶质瘤，其中双侧前庭神经鞘瘤为典型特征，还伴有听力障碍和皮肤异常等症状，严重影响病人健康情况和生活质量，每四万人就有一人发病。NF2是美国ACMG(American College of Medical Genetics and Genomics)认定的可塑性突变遗传病：既有证据表明，通过及早的筛查诊断，可有确定有效的预防和治疗措施。NF2的发病可能晚于生殖年龄，若能及早发现，将有可能借助现代遗传学手段帮助病人进行生殖阻断，以防止该遗传病遗传至下一代。针对NF2型疾病，除了手术和放疗，其治疗药物贝伐珠单抗、依维莫司、维司替布、拉帕替尼等药物都处于临床试验阶段，尚未批准用于NF2的临床治疗。目前已经陆续开发出可以用于NF2的基因治疗研究的动物模型、载体和启动子，并进行了一些体外实验。Mizrak等将可表达尿嘧啶磷酸核糖基转移酶和胞嘧啶脱氨酶的微囊泡注射到小鼠肿瘤灶，并给予小鼠5-氟胞嘧啶治疗，成功抑制了肿瘤细胞的DNA合成；Prabhakar等利用可表达caspase-1的腺病毒相关载体转染肿瘤细胞后，肿瘤细胞启动了细胞焦亡程序；Ahmed等将包含凋亡相关斑点样蛋白(ASC)基因的腺相关病毒载体定向注射到小鼠的神经鞘瘤细胞，成功诱导了肿瘤细胞凋亡，且相邻的神经没有受损，这一治疗方式当前也只是在临床试验，需进一步评估其安全性和有效性。

现阶段NF1和NF2治疗效果不佳，根本原因是由于误诊、漏诊导致错过最佳治疗时机。因此，早期准确诊断可以使患者得到及时、最佳地诊治，这是NF1和NF2治疗的关键。NF1和NF2的临床诊断标准往往都是基于患者出现一定的表征后，再结合相关检测来确定，其临床表征复杂且在不同病人身上表现出极大差异，仅靠临床表征极难明确诊断。基因检测是NF早筛的重要手段，但现阶段NF基因检测在临床应用上有很大的局限性。阻碍基因检测大规模用于NF早筛的一个重要原因是基因检测中的临床意义不明确突变体(VUS，variantsof uncertain significance)。根据基因变异的致病性，临床上一般将其分成5级：致病性、可能致病性、良性、可能良性或VUS。其中，VUS检测结果目前在临床上被视为非确定性结果，不能作为诊断依据，因而对患者和医生双方都造成了极大困扰。传统上变异致病性的鉴定，依赖于表型与基因型的共分离，需要对疾病变异大家庭多个成员的全基因组进行测序，利用测序信息结合临床表型对遗传性疾病做出正确的分子诊断，缺点是诊断周期长，标准高、积累慢，不能满足现代基因检测早筛的要求。特别是对新发的、罕见的变异，无能为力，比如错义突变，ClinVar数据库中约86％的NF1和95％的NF2的错义突变都是VUS。

现有的NF1和NF2检测方法主要依靠专家共识的临床标准、遗传共分离、分子功能分析方法和生物信息学软件等。

1.尽管专家共识的临床诊断标准较为详细且不断更新，但准确诊断新发突变仍然是一项巨大的挑战，因为NF2临床表现是非常多变的，即使在一个家庭中也可以出现多种临床表现。

2.基因功能性分析可为基因变异解析提供关键证据，然而并非所有的功能研究都能有效地预测变异基因或蛋白的功能。目前业界的分型往往使用RNA-seq，Western等通用分子技术手段，没有特异性针对NF变异的分析办法，并且很多功能性研究一般是在患者身上发现变异后才开展，且往往需要数年时间才能获得研究结果。

3.遗传学共分离可为判断变异的致病性提供重要依据，如果一个变异是导致某种单基因病的，那么患者一定是以致病方式携带，而其没有患病的家族成员(比如其父母)则应该是以非致病方式携带。这种在一个家系里，相同表型和基因型的连锁绑定，以及不同表型和基因型的明确区分，被称为遗传学共分离。家系遗传共分离要对全家系成员做检测，至少要对患者及生物学父母同时做二代测序，平行对比三个人的数据，借助遗传学共分离原则筛选致病突变。遗传学共分离是鉴别致病性突变的经典方法，但是满足条件的家系非常不容易找到，而且整个过程周期较长，还需要耗费大量的人力物力用于遗传病家系信息和样本的采集，容易出错或遗漏。

4.分子功能分析方法可为基因变异解析提供关键证据。但是，低通量的传统功能性分析方法单次实验只能研究一个基因变异，严重滞后于疾病基因变异的发现速度。此外，传统的功能性研究一般是在患者身上发现变异后才开展，且往往需要数年时间才能获得研究结果。综上，传统的基因功能性分析方法对于NF的筛查、诊断、治疗以及研究缺乏高效性、时效性。

5.借助生物信息学工具(例如CADD、PolyPhen2、REVEL，EVE)的预测结果也可分析新的错义突变。但是生物信息分析所得到的结果往往不可靠，特别是不同的生物信息算法依赖于相同或相近的数据进行预测，并且大多数生物信息算法未被已知致病变异验证过。此外，不同算法对同一个基因的预测结果可能完全不同。如果不同种类算法的分析预测结果一致，那么生物信息分析结果可以作为支持的证据。如果绝大多数算法的预测结果不一致，则这些预测的结果不能用于对变异进行分类。总之这些工具的准确性通常较差，预测结果通常不一致，目前仅可用作医学诊断的辅助证据。

针对上述存在的问题或不足，为解决NF基因突变与致病性研究的高效性、时效性和准确性问题，本发明提供了一种在细胞系中测定NF变异功能的方法，精确有效，而且高通量。该方法是一种规模化、精确、有效的筛选方法，简便、快速、费用低、一次可以筛选成百上千种突变体，减少了操作误差的发生，提高了筛选效率和结果的准确性，可从根本上解决基因突变与致病性分析的高效性、时效性和准确性问题。

发明内容

第一方面，本发明提供了一种鉴别NF基因突变致病性的方法，其步骤如下：

S01：通过基因工程手段获得含有致病性未明的NF突变细胞系；

S02：采用基于NF基因功能能够特异性抑制或杀灭细胞的药物对S01的细胞进行处理；

S03：当细胞在抑制或杀灭细胞的药物处理下，能正常生长，则说明该细胞中携带的NF基因变异具有致病性；当细胞在抑制或杀灭细胞的药物处理下，不能正常生长或死亡，则说明该细胞中携带的NF基因变异为非致病性变异。

进一步，所述NF基因可能是NF1和/或NF2的致病基因。

进一步的，所述NF基因突变包含所有可能的单氨基酸突变或多氨基酸突变，包括在病人身上检测到和尚未检测到的基因突变等。

进一步的，所述细胞优选为黑色素瘤细胞。

当所述细胞为黑色素瘤细胞时，抑制或杀灭黑色素瘤细胞的药物可以选自BRAFV600E抑制剂、RAF激酶抑制剂、Trametinib、Binimetinib、Cobimetinib、Imatinib、Bevacizumab、Ipilimumab、Tremelimumab、Dacarbazine、替莫唑胺、Nivolumab、Pembrolizumab、Vemurafenib、Tafinlar、Encorafenib中的一种或多种。

进一步的，所述S01优选细胞通过基因工程手段敲除细胞中的NF基因，构建NF-KO细胞系；设计得到NF基因的可能的突变类型；将突变的NF基因通过基因工程的方式导入S01获得的NF-KO细胞，得到含有NF突变基因的重组细胞即NF突变细胞。

更进一步优选，所述基因工程的方式导入包括慢病毒感染导入、CRISPR-Cas9基因编辑方法导入，利用重组酶或其他生物技术手段导入。

第二方面，本发明提供一种检测NF基因突变致病性的系统，所述系统包括如下模块：

S01模块：NF-KO细胞系，通过基因工程手段敲除细胞中的NF基因，构建NF-KO细胞系；

S02模块：NF基因突变体，设计得到NF基因的所有可能的突变类型；

S03模块：重组细胞，将突变的NF基因通过基因工程的方式导入S01模块获得的NF-KO细胞，得到含有NF突变基因的重组细胞；

S04模块：药物处理，采用能够抑制或杀灭细胞的药物对S03模块的重组细胞进行处理；

S05模块：NF基因筛选，当重组细胞在抑制或杀灭细胞的药物处理下，能正常生长，则说明该重组细胞中携带的NF基因变异具有致病性；当重组细胞在抑制或杀灭的药物处理下，不能正常生长或死亡，则说明该重组细胞中携带的NF基因变异是非致病性变异。

进一步，所述NF基因可能是NF1和/或NF2的致病基因。

进一步的，所述细胞优选为黑色素瘤细胞。

进一步的，所述基因工程的方式导入包括慢病毒感染导入、CRISPR-Cas9基因编辑方法导入，利用重组酶或其他生物技术手段导入。

第三方面，本发明提供了神经纤维瘤致病性的NF突变体文库。

进一步的，所述NF基因突变体文库中包括所有的NF单氨基酸突变或多氨基酸突变。

第四方面，本发明提供一种检测NF基因突变体的致病性的试剂盒，所述试剂盒包括能够检测NF基因突变体致病性的试剂及检测标准的说明书，所述试剂盒根据检测携带NF基因突变体的细胞对抑制或杀灭黑色素瘤细胞的药物的敏感性来确定NF基因突变体是否具有致病性。

进一步的，当检测的细胞在抑制或杀灭黑色素瘤细胞的药物处理下，能正常生长，则说明该检测细胞中携带的NF基因变异具有致病性；当检测的细胞在抑制或杀灭黑色素瘤细胞的药物处理下，不能正常生长或死亡，则说明该检测细胞中携带的NF基因变异是非致病性变异。

进一步的，所述抑制或杀灭黑色素瘤细胞的药物选自BRAFV600E抑制剂、RAF激酶抑制剂、Trametinib、Binimetinib、Cobimetinib、Imatinib、Bevacizumab、Ipilimumab、Tremelimumab、Dacarbazine、替莫唑胺、Nivolumab、Pembrolizumab、Vemurafenib、Tafinlar、Encorafenib中的一种或多种。

附图说明

图1总体技术方案流程图

图2构建NF-KO单克隆细胞系流程图

图3sgRNA表达载体PX459的质粒图谱

图4构建NF1-KO单克隆细胞系及在基因组水平和蛋白水平的效果验证

图5构建NF2-KO单克隆细胞系及在基因组水平和蛋白水平的效果验证

图6CRISPR-Cas9敲入已知的NF1致病性突变

图7用于表达NF2突变体的慢病毒载体(PLV-EFs-Puro)的质粒图谱

图8NF2突变体克隆至慢病毒载体的测序结果图

图9通过慢病毒感染的方式在NF2-KO单克隆细胞中导入多种已知的NF2突变体

图10Vemurafenib筛选携带NF1致病性突变的细胞

图11Vemurafenib筛选携带NF2突变体的细胞

具体实施方式

1.NF1的诊断标准

以往NF1的诊断主要依据1987年美国国立卫生研究院(National Institutes ofHealth.NIH)提出的诊断标准。2021年，国际神经纤维瘤病诊断标准共识组对原诊断标准进行了修订：

(1)6个或6个以上的CALMs：青春期前直径>5mm或青春期后>15mm；

(2)2个或2个以上任何类型的神经纤维瘤或1个PNF；

(3)腋窝或腹股沟区雀斑；

(4)OPG；

(5)裂隙灯检查到2个或2个以上Lisch结节，或光学相干层析成像或近红外影像检查到2个或以上脉络膜异常；

(6)特征性骨病变，如蝶骨翼发育不良、胫骨前外侧弯曲或长骨假关节；

(7)正常组织(如白细胞)中具有等位基因变体分数达50％的致病杂合子NF1变体。父母未患病者满足上述2项及以上，父母患病者满足上述1项或以上，可诊断为NF1。

2.NF2的临床诊断标准：

(1)70岁前发生双侧前庭神经鞘瘤；

(2)70岁前发生单侧前庭神经鞘瘤，且有一级亲属(不仅仅是兄弟姐妹)患NF2；

(3)有脑脊膜瘤、非前庭神经鞘瘤、室管膜瘤和白内障中任意2种，且

a.一级亲属患NF2，或者

b.有单侧前庭神经鞘瘤，且LZTR1基因检测阴性(如有2个或以上非皮内神经鞘瘤)；

(4)有多发性脑脊膜瘤，且：

a.有单侧前庭神经鞘瘤，或者

b.有非前庭神经鞘瘤、室管膜瘤和白内障中任意2种；

(5)从患者血液中发现组成性或嵌合NF2基因致病性突变，或在同一个体中确认2个独立的肿瘤有相同的突变。

尽管该诊断标准较为详细且不断更新，但准确诊断新发突变仍然是一项巨大的挑战，因为NF2临床表现是非常多变的，即使在一个家庭中也可以出现多种临床表现。

3.Vemurafenib(PLX4032；RG7204；维罗非尼)是有效的BRAF选择性抑制剂，能有效地抑制BRAFV600E的活性；

4.BRAF是一种人类基因，编码B-Raf蛋白。B-Raf蛋白参与在细胞内部发送信号，从而指导细胞生长。

本发明的总体技术方案主要包括四个部分：NF基因敲除(NF1-KO和NF2-KO)细胞系的建立；通过CRISPR基因编辑技术或慢病毒感染将NF突变体整合细胞的基因组；vemurafenib筛选NF突变体；二代测序及生物信息学分析(图1)。

实施例1构建NF-KO单克隆细胞系

1.1设计靶向NF的sgRNA序列

设计得到如表1所示的6对sgRNA序列(其中，加粗且斜体部分为sgRNA序列，其余部分为克隆所需要的序列)，将上述序列交给引物合成公司(上海生物工程有限公司)合成(PAGE级纯化)。

表1NF-sgRNA引物列表

1.2载体连接

将上述sgRNA序列连接到PX459载体，PLX459载体购于Addgene公司，其质粒图谱如图3所示。磷酸化NF-的sgRNA序列并退火形成双链DNA；BpiI酶切PX459载体使其暴露出与双链sgRNA序列相同的粘性末端；将酶切后的载体与带有粘性末端的双链DNA在T7DNA连接酶作用下连接，本专利中酶切反应和连接反应同时进行，反应体系及程序如下表所示。

表2反应体系

PX459 vector	1μl(100ng/μl)
		phosphorylated and annealed oligo duplex diluted 1:100	2μl
FastDigest Buffer	2μl
		DTT 10mM(final 1mM)	2μl
ATP 10mM(final 1mM)	2μl
		ddH₂O	9.5μl
BpiI	1μl
		T7 DNA ligase(NEB)	0.5μl

表3反应程序

1.3转化

取DH5α感受态置于冰上融化，32μl DH5α中加入1μl连接产物，轻弹管壁混匀，置于冰上静置30min，42℃热激90s，迅速转移至冰上静置3min，加入1000μl LB培养基，置于37℃摇床(200r/min)中培养1h，用涂布珠均匀涂10μl菌液于氨苄抗性的LB平板中，置于37℃的恒温培养箱中过夜培养。

1.4测序鉴定及质粒提取

用2.5μl枪头挑取单个菌落放于1mL氨苄抗性的LB培养基中，置于37℃、200r/min摇床中培养6h，待菌液浑浊，取200μl菌液用于Sanger测序。测序结果正确后，取阳性克隆的菌液扩大培养于6mL含氨苄抗性的LB培养基，过夜培养后采用Magen公司质粒提取试剂盒进行高纯度无内毒素抽提。

1.5转染及编辑效率检测

转染前一天接种1×10⁶个细胞于6孔板中，第二天采用Lipo3000的脂质体转染试剂将2.5μg重组PX459的NF-sgRNA分别转染至A375细胞。转染24h后加入终浓度为1μg/mLpuromycin筛选72h，待细胞长满时，取一半细胞采用GeneStar公司基因组提取试剂盒进行高纯度gDNA提取，设计用于扩增NF2-sgRNA所在区域的引物(扩增长度500-1000bp)，扩增产物采用诺唯赞公司针对Illumina高通量测序平台的专用试剂盒进行Tn5文库构建，并进行二代测序。

1.6挑选单克隆细胞

根据测序结果，将上述编辑效率较高的细胞群扩大培养，继而通过有限稀释的方法从细胞群中筛选出NF敲除的单克隆细胞，并提取细胞裂解液进行二代测序和WesternBlot检测。通过二代测序鉴定细胞的基因型，确保细胞是单克隆；通过Western Blot检测NF蛋白的表达情况，确定NF的敲除效果。

1.7实验结果

(1)通过Sanger测序，验证质粒构建效果。结果表明，靶向NF不同位点的sgRNA质粒的测序结果，完全符合预期，表明这些质粒可用于NF敲除实验(图4A和5A)。

(2)通过Tn5测序，检测sgRNA编辑效率。结果表明，细胞群的NF基因上存在着大量的不同种类缺失/插入，这些缺失/插入会导致NF基因的移码突变，进而导致NF蛋白表达的缺失，上述结果表明编辑成功(图4B和5B)。

(3)通过Tn5测序和Western Blot实验，验证NF-KO单克隆细胞的敲除效果。对单克隆细胞基因组进行Tn5测序，并结合NF基因在A375细胞中的拷贝数，测序结果表明细胞中有少于NF基因拷贝数的缺失/插入类型，这在DNA水平上验证了单克隆细胞的基因型(图4C和5C)。但为了进一步证明NF在蛋白水平的缺失，我们对基因型鉴定成功的单克隆细胞进行Western Blot实验，发现在没有NF敲除的A375细胞系，可以检测到清晰的NF蛋白条带，但在NF-KO单克隆细胞系，均未检测出有效的NF条带(图4D和5D)。以上结果表明成功筛选到NF-KO的单克隆细胞(图4和图5)。

实施例2通过CRISPR-Cas9技术导入已知的NF1致病突变体

由于NF1编码区(8520bp)非常大，很难通过慢病毒感染的方式导入突变体，因此我们计划通过CRISPR-Cas9技术敲入其已知的致病性突变(p.R1276Q)，具体实验步骤如下：

2.1设计引物

表4敲入NF1-p.R1276Q所需的引物列表

2.2载体连接

(1)HDR修复模板与PUC19载体的连接：使用高保真DNA聚合酶扩增含同源臂的DNA片段和线性化PUC19载体，经琼脂糖凝胶电泳、凝胶回收、Qbuit测浓度后，将适量的DNA片段加入到2×MultiF Seamless Assembly Mix中，50℃孵育30min。

(2)sgRNA与PX459载体的连接同1.2所述；

2.3转化(同1.3)

2.4测序鉴定及质粒提取(同1.4)

2.5基因编辑及效率检测

将上述测序成功的PX459-sgRNA质粒((1μg)和PUC19-HDR模板质粒((1.5μg)按照1.5步骤在A375细胞中进行基因编辑，并靶向扩增NF1目标区域，Tn5测序计算编辑效率。

2.6挑选单克隆细胞(同1.6)

2.7实验结果

(1)通过Sanger和Tn5测序，验证质粒构建的效果。Sanger测序结果表明，靶向NF1(p.R1276Q)位点的sgRNA质粒的测序结果正确；Tn5测序结果表明，HDR模板成功克隆至PUC19载体，完全符合预期，表明这些质粒可用于细胞NF1(p.R1276Q)的敲入实验(图6)。

(2)通过Tn5测序，检测编辑效率。Tn5结果显示在编辑位点有约3％的编辑效率，提示细胞群体中有约3％的细胞成功敲入NF1(p.R1276Q)。

(3)在基因和蛋白水平验证NF1(p.R1276Q)单克隆细胞的敲入效果。Tn5测序结果显示A375中NF1的SNP位点发现其在A375细胞中有三个拷贝(图6B)；PAM和NF1(p.R1276Q)位点处碱基突变占比1/3，碱基插入占比1/3，碱基缺失占比1/3，符合单克隆细胞的特征，以上实验在DNA水平上证明了对NF1(p.R1276Q)的成功敲入(图6C)。但为了严格证明NF1蛋白的表达，对基因水平鉴定成功的NF1(p.R1276Q)单克隆细胞进行Western Blot实验。实验结果显示，在没有NF1敲除的A375细胞系，可以检测到清晰的NF1蛋白条带，在NF1(p.R1276Q)敲入的细胞中检测到较弱NF1蛋白条带(图4D)，因占比1/3的碱基突变会正常表达NF1蛋白，而碱基插入/缺失会导致NF1蛋白无法正常表达，上述实验结果表明在A375细胞中成功导入NF1(p.R1276Q)突变。综上表明已成功筛选到携带NF1(p.R1276Q)单克隆细胞(图6和图4D)。

实施例3NF2突变体的构建

3.1设计引物

本发明中NF2突变体的引物列表如下：

表5 NF2突变体的引物列表

3.2以PLV-NF2质粒为模板，逐个点突变构建上述突变体。PCR反应体系和程序如表6和表7所示，DpnI消化PCR产物(37℃,1h)，消化反应体系如表8所示。

表6 PCR反应体系

表7 PCR反应程序

表8 DpnI消化反应体系

DpnI	0.5μl
		Buffer	2.5μl
DNA	500ng
		ddH₂O	up to 50μl

3.3转化

注意：此处使用的是慢病毒载体，故转化时所用的感受态为Stbl3，可有效抑制长片段末端重复区的重组，降低错误重组的概率，其余步骤同1.3。

3.4测序鉴定及质粒提取(同1.4)

3.5实验结果

Tn5测序结果表明，NF2突变体成功克隆至PLV载体，完全符合预期，表明这些质粒可用于细胞过表达实验(图8)。

实施例4慢病毒包装NF2突变体

4.1包装GFP病毒

转染前一天接种1×10⁶个HEK293T细胞于6孔板中，第二天采用Lipo3000的脂质体转染试剂，将慢病毒系统质粒psPAX2(2μg)，pMG2.G(1μg)以及GFP(3μg)共转染至HEK293T细胞，6h后更换为2mL新鲜培养基，培养24h后，将上清液过0.45μm的低吸附无菌过滤器进行过滤，收集于离心管。

4.2确定合适的MOI值

MOI(Multiplicity of Infection)为感染复数，即病毒量与细胞数的比值，MOI值越高，病毒感染的可能性越大，此时单个细胞可能获得一个以上病毒，同时；因此正式实验前需要进行预实验以确定MOI值以达到一个细胞仅获得一个病毒的目标(MOI<0.3)。按照表10将慢病毒进行梯度稀释，共做6个梯度的GFP病毒稀释液，即每孔中含1μl、10μl、100μl、500μl、1000μl和2000μl病毒，再分别加入Polybrene终浓度为8μg/ml，震荡混匀后加至接种好细胞的6孔板中。感染48h后，收集细胞悬液，流式检测每组细胞中含GFP的比例，结果显示100μL病毒量时含GFP的细胞为15.25％(表9)，提示该MOI值下病毒量感染细胞时每个细胞中仅含有一个病毒。

,表9 GFP病毒稀释液的配制表

4.3包装NF2突变体病毒并感染目的细胞

按照4.1步骤包装NF2突变体病毒并分别感染NF2-KO细胞，感染时的病毒量均为100μl。

4.4筛选

慢病毒感染48h后，加入1μg/mL puromycin持续筛选，以去除没有感染成功的细胞。

4.5检测NF2突变体是否成功整合到NF2-KO细胞的基因组

将稳定表达的细胞进行扩大培养，提取gDNA并进行二代测序，确定NF2突变体成功插入到基因组中。

4.6实验结果

通过Tn5测序，发现NF2突变体成功整合至NF2-KO细胞的基因组(图9)。

实施例5 Vemurafenib筛选NF1突变体

将野生型A375细胞与NF1-KO细胞(P0)等数量共培养，通过向培养基中添加终浓度1μM vemurafenib使细胞承受选择压力。待24孔板长满时加入450μl胰酶消化细胞，其中80μl细胞悬液接种至新24孔板中继续给予vemurafenib压力，另外取出50μl细胞(P1)悬液用于粗提gDNA；待新24孔板长满时，重复传代、粗提gDNA步骤，依次取得P2、P3、P4细胞gDNA，PCR靶向扩增NF1目标区域，构建Tn5文库并测序

结果如图10所示，随着细胞传代次数的增加，野生型A375细胞越来越少，而NF1-KO细胞越来越多。同样地，将野生型A375细胞和携带NF1(p.R1276Q)的细胞共培养，并给予1μMvemurafenib持续作用，结果显示随着细胞传代次数的增加，野生型A375细胞越来越少，而携带致病性突变p.R1276Q的细胞越来越多。上述结果表明，通过vemurafenib药物筛选可准确鉴别NF1的致病性突变。

实施例6 Vemurafenib筛选NF2突变体

按照实施例5中所述步骤，vemurafenib筛选下表中NF2相关的混合细胞群。

表10 NF2混合细胞群分类

序列号	混合细胞群种类
		1	KO+lenti-NF2-WT/KO+lenti-NF2-p.(Phe62Ser)
2	KO+lenti-NF2-WT/KO+lenti-NF2-p.(Leu535Pro)
		3	KO+lenti-NF2-WT/KO+lenti-NF2-p.(Tyr481Ile)
4	KO+lenti-NF2-WT/KO+lenti-NF2-p.(Asn36Ser)
		5	KO+lenti-NF2-WT/KO+lenti-NF2-p.(Met514Val)
6	KO+lenti-NF2-WT/KO+lenti-NF2-p.(Met205Val)
		7	KO+lenti-NF2-p.(Met205Val)/KO+lenti-NF2-p.(Leu535Pro)
8	KO+lenti-NF2-p.(Phe62Ser)/KO+lenti-NF2-p.(Leu535Pro)
		9	WT/NF2-KO

结果如图11所示，A：随着细胞传代次数的增加，野生型A375细胞越来越少，而NF2-KO细胞越来越多；BCD：随着细胞传代次数的增加，NF2-WT细胞越来越少，而携带致病性突变p.(Phe62Ser)、p.(Leu535Pro)、p.(Tyr481Ile)细胞越来越多；EFG：随着细胞传代次数的增加，NF2-WT细胞和携带中性突变p.(Asn36Ser)、p.(Met514Val)、p.(Met205Val)的细胞数量没有明显变化；H:，随着细胞传代次数的增加，含中性突变p.(Met205Val)的细胞越来越少，而含致病性突变p.(Leu535Pro)的细胞越来越多；I：随着细胞传代次数的增加，携带致病性突变p.(Phe62Ser)和p.(Leu535Pro)的细胞数量没有明显改变。以上结果显示上述方法可成功鉴别NF2的致病性突变和中性突变(图11)。

实施例7 Tn5测序数据分析

本发明所述二代测序主要是从细胞提取gDNA，并设计特异性靶向的引物，扩增目的片段并制备Tn5文库进行NGS测序。本发明实施例涉及的NGS测序使用覆盖深度超过100万倍的深度测序。

本发明所涉及的生物信息学分析软件包括bwa、samtools和IGV，以及其他用于数据分析的python或R脚本程序。其中bwa主要用于将低差异度的短序列与参考基因组进行比对；samtools用于将bwa比对生成的sam转换为二进制对应的bam格式；IGV可用于bam文件的可视化观察，且能计算出每个突变的变化频率；Python和R脚本程序用于数据的细化分析和可视化作图。

以上所述实施例仅表述了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种鉴别NF基因变异是否具有致病性的方法，其步骤如下：

S01通过基因工程手段获得含有致病性未明的NF突变细胞；

S02采用基于NF基因功能能够特异抑制或杀灭细胞的药物对S01的细胞进行处理；

S03当细胞在抑制或杀灭细胞的药物处理下，能正常生长，则说明该细胞中携带的NF基因变异具有致病性；当细胞在抑制或杀灭细胞的药物处理下，不能正常生长或死亡，则说明该细胞中携带的NF基因变异为非致病性突变。

2.如权利要求1所述一种鉴别NF致病性基因变异的方法，其特征在于所述NF基因可以是I型神经纤维瘤病(NF1)和/或Ⅱ型神经纤维瘤病(NF2)的基因。

3.如权利要求1所述一种鉴别NF致病性基因突变的方法，其特征在于所述NF基因突变包含所有可能的NF1和NF2基因突变，包括在病人身上检测到和尚未检测到的基因突变。

4.如权利要求1所述一种鉴别NF致病性基因变异的方法，其特征在于所述细胞为黑色素瘤细胞，所述能够抑制或杀灭细胞的药物选自BRAFV600E抑制剂、RAF激酶抑制剂、Trametinib、Binimetinib、Cobimetinib、Imatinib、Bevacizumab、Ipilimumab、Tremelimumab、Dacarbazine、替莫唑胺、Nivolumab、Pembrolizumab、Vemurafenib、Tafinlar、Encorafenib中的一种或多种。

5.如权利要求1所述一种鉴别NF致病性基因变异的方法，其特征在于所述通过基因工程手段获得含有致病性未明的NF突变细胞系中，通过基因工程手段敲除细胞中的NF基因，构建NF-KO细胞系；设计得到NF基因的可能的突变类型；重组细胞，将突变的NF基因通过基因工程的方式导入S01模块获得的NF-KO细胞，得到含有NF基因突变的重组细胞；所述基因工程的导入方式包括慢病毒感染导入、CRISPR-Cas9基因编辑方法导入，利用重组酶或其他生物技术手段导入。

6.一种检测NF基因突变致病性的系统，所述系统包括如下模块：

S02模块：NF基因突变体，设计得到NF基因的可能的突变类型；

S03模块：重组细胞，将突变的NF基因通过基因工程的方式导入S01模块获得的NF-KO细胞，得到含有NF变异基因的重组细胞；

S04模块：药物处理，采用能够基于NF基因功能抑制或杀灭细胞的药物对S03模块的重组细胞进行处理；

S05模块：NF基因筛选，当细胞在抑制或杀灭细胞的药物处理下，能正常生长，则说明该细胞中携带的NF基因变异具有致病性；当细胞在抑制或杀灭细胞的药物处理下，不能正常生长或死亡，则说明该细胞中携带的NF基因变异为非致病性变异。

7.一种待筛选的神经纤维瘤病NF基因突变体文库。

8.如权利要求7所述一种待筛选的导致神经纤维瘤病的NF基因突变体文库，其特征在于所述NF基因突变体文库中包含NF基因所有可能排列组合的单氨基酸变异。

9.一种检测NF基因突变体致病性的试剂盒，所述试剂盒包括能够检测含有NF基因突变体的细胞的试剂及检测标准的说明书，所述试剂盒根据检测含有NF基因突变体的细胞对抑制或杀灭黑色素瘤细胞的药物的敏感性来确定NF基因突变体是否具有致病性。

10.如权利要求9所述一种检测NF基因突变体的试剂盒，其特征在于所述试剂盒当检测的细胞在抑制或杀灭黑色素瘤细胞的药物处理下，能正常生长，则说明该检测细胞中含有的NF基因变异具有致病性；当检测的细胞在抑制或杀灭黑色素瘤细胞的药物处理下，不能正常生长或死亡，则说明该检测细胞中含有的NF基因变异不具有致病性。