SK283027B6 - Spôsob stanovenia množstva funkčne inaktívneho génu vo vektorovom preparáte na génovú terapiu a kit - Google Patents

Abstract

Je opísané kvalitatívne posúdenie rekombinantných činidiel používaných v génovej terapii tak, že je uvedený spôsob stanovenia percentuálneho zastúpenia defektného alebo terapeuticky inaktívneho vektora nesúceho gén, ktorý kóduje produkt inhibujúci rast nádorových buniek, indukuje ich apoptózu alebo ich usmrcuje, pričom sa porovnáva rast nádorových buniek s rastom buniek, ak sú kontaktované s jednou alebo viacerými štandardnými vzorkami obsahujúcimi pozitívne kontrolné vektory nesúce funkčný efektorový gén a negatívne kontrolné vektory nenesúce funkčný efektorový gén, ale obsahujúce indikátorový gén.ŕ

Description

Oblasť techniky

Prezentovaný vynález sa všeobecne vzťahuje na oblasť kontroly kvality pre rekombinantné činidlá používané v génovej terapii. Presnejšie sa vynález týka skúšky, ktorá môže byť použitá na určenie percentuálneho zastúpenia defektného vektora, kde vektor kóduje terapeutický gén. Presnejšie sa vynález zaoberá spôsobom zistenia percentuálneho zastúpenia adenovirusu obsahujúceho nefunkčný p53 gén vo vzorke adenovirusu obsahujúcej divoký typ p53 na použitie pri klinickej génovej terapii.

Doterajší stav techniky

Obvyklé liečebné metódy nádorového ochorenia vrátane aktinoterapie chirurgického výkonu a chemoterapie majú iba obmedzenú účinnosť. Napríklad samotný karcinóm pľúc usmrtí ročne v Spojených štátoch viac než 140 000 ľudí. V poslednom čase vekovo závislá mortalita spôsobená karcinómom pľúc prevýšila vekovo závislú mortalitu spôsobenú karcinómom prsníka u žien. Aj keď sa pomocou programov redukujúcich fajčenie znížilo množstvo fajčiarov, napriek tomu karcinómom pľúc spôsobená mortalita zostane vysoká aj v 21. storočí. Racionálny vývoj nových terapeutických metód pre karcinóm pľúc závisí od lepšieho porozumenia biologickej podstaty karcinómu pľúc na molekulárnej úrovni.

Je potvrdené, že rôzne druhy rakoviny sú aspoň čiastočne spôsobované genetickými abnormalitami, ktorých výsledkom je vždy expresia jedného alebo viac génov alebo expresia abnormálneho alebo zmutovaného génu, alebo génov. Napríklad je známe, že v mnohých prípadoch expresia onkogénov ústi do vývoja nádoru. Onkogény sú geneticky alterované gény, ktorých mutované exprimované produkty určitým spôsobom narušujú normálne bunkové ľunkcie alebo kontrolu (Spandidos et al., 1989).

Bolo zistené, že mnoho onkogénov študovaných do dnešného obdobia je „aktivovaných“ ako výsledok mutácie, často bodovej mutácie, v kódujúcej oblasti normálneho bunkového génu, známej ako „prolo-onkogén“. Tieto mutácie ústia do aminokyselinových substitúcií v exprimovanom proteínovom produkte.

Tento alterovaný exprimovaný produkt aktivuje abnormálne biologické funkcie, ktoré prispievajú k neoplastickému procesu (Travali et al., 1990). Mutácie, ktoré spôsobujú tento proces, vznikajú rozličnými spôsobmi, ako napr. chemickou mutagenézou alebo ionizujúcim žiarením. Bolo identifikovaných a v rôznej miere charakterizovaných množstvo onkogénov a onkogénnych rodín vrátane ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun a abl (Travali et al., 1990, Bishop, 1987).

Usudzuje sa, že v priebehu normálneho bunkového rastu sú niektoré rastové promótorujúce protoonkogény vyrovnávané rastovo obmedzujúcimi tumorovými supresorovými génmi. K nerovnováhe týchto dvoch síl, ktorá vedie k neoplastickému stavu, môže prispievať mnoho faktorov. Jedným takým faktorom je mutácia v tumor supresorovom géne (Weinberg, 1991).

Jeden dôležitý supresor nádoru je bunkový proteín p53, čo je jadrový fosfoproteín 53 kD, ktorý kontroluje bunkovú proliferáciu. Bodová mutácia v géne p53 a strata alely na chromozóme 17p, kde je gén p53 umiestnený, patrí medzi najčastejšie alterácie identifikované u ľudských malignít. Proteín p53 je z hľadiska evolúcie vysoko konzervatívny a je exprimovaný vo väčšine normálnych tkanív. Štandardný typ p53 hrá rolu pri kontrole bunkového cyklu (Mercer, 1992), regulácii transkripcie (Fields et al., 1991), a indukcii apoptózy (Yonish - Rouach et al., 1991, Shawetal., 1992).

Sú známe rôzne mutácie alely p53, pri ktorých substitúcia jedinej bázy vyústi do syntézy proteínov, ktoré majú zmenenú schopnosť regulácie rastu a v konečnom dôsledku vedie k malígnemu zvratu (Hollstein et al., 1991). Je faktom, že gén p53 je najfrekventovanejším mutovaným génom v bežných ľudských tumoroch (Hollstein et al., 1991, Weinberg, 1991), a výskyt týchto tumorov je spojený predovšetkým s fajčením cigariet (Holstein et al., 1991, ZakutHouri et al., 1985). Hyperexpresia mutovaného génu p53 bola dokumentovaná v tumore prsníka (Caseyetal., 1991).

Jeden z najzaujímavejších aspektov génovej terapie tumorov sa vzťahuje na použitie tumor supresorového génu, napr. p53. Uvádza sa, že transfekcia štandardného typu p53 v určitom type buniek tumoru prsníka a pľúc môže obnoviť kontrolu supresie rastu v bunkových kultúrach (Casey et al., 1992). Aj keď priama transfekcia DNA nepredstavuje účinný spôsob na zavedenie DNA do buniek pacienta, tieto výsledky ukazujú, že dodanie tumorového supresora do nádorových buniek môže byť efektívnou liečebnou metódou, pokiaľ bude vyvinutý účinný spôsob dopravenia tumorsupresorového génu do postihnutých buniek.

V súčasnosti sa skúma a vyvíja systém dodania génu použiteľný v génovej terapii pri supresii a usmrcovaní tumoru. Zvlášť zaujímavé sú transportné vehikulá s génom na vírusovej báze pre účinnosť vírusov pri infikovaní živých buniek, čo je proces, pri ktorom je do cieľovej bunky prenášaný samotný vírusový genetický materiál. V tomto ohľade bol dosiahnutý určitý pokrok, napr. v množení retrovírusových vektorov predurčených na doručenie rôznych génov. Adenovírusový vektorový systém bol nedávno úspešne vyskúšaný in vitro a v rámci štúdií na zvieratách v určitých skúškach transportu génov.

Pretože boli vylepšené metódy a kompozície na génovú terapiu tumorov, stáva sa prístupnou aj klinická liečba. Vyžaduje to však veľkovýrobu vektorov do zásoby. Táto veľkovýroba znamená vytvorenie veľkého množstva vzoriek vektorových súprav z pôvodnej „priekopníckej¹¹ vektorovej vzorky, ktorej sa náhodne priradí 100 %-ná aktivita. Pri tomto „zväčšení meradla” výroby vznikajú obavy ohľadom straty aktivity. Je jasné, že nutným stupňom pred uskutočnením akéhokoľvek liečebného režimu bude kontrolná analýza kvality. Napr. bude nutné zaistiť, aby vzorky obsahovali dostatočné množstvo aktívneho vektora na dosiahnutie predpokladaného liečebného účinku.

National Institutes of Health (NIH) Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) a Federal Drug Administration (FDA) vyjadrili vážnu domnienku, že táto mutácia má biologický význam v konečnom klinickom kmeni. Napriek tomu, že je vysoko nepravdepodobné, že by pacienti alebo osoby, ktoré s nimi prídu do styku, boli vystavené sebemenšiemu riziku, budú regulačné agentúry na prípravu klinických vektorov požadovať kontrolnú analýzu kvality. NIH RAC stanovil ako najdôležitejší aspekt kontroly kvality biologickú funkciu. Preto je treba vytvoriť skúšku, ktorá by vyhodnotila percento defektných vektorov vo vektorovej súprave určenej na účely liečenia.

Zostáva teda jasná potreba vyvinúť skúšku kontroly kvality, ktorá vyhodnotí množstvo defektného alebo terapeuticky inaktívneho vektora v klinickej vektorovej súprave a sprievodný úbytok biologickej aktivity v klinickej vektorovej súprave.

Podstata vynálezu

Vynález rieši uvedenú potrebu zavedením skúšky na meranie kvality vektorových preparátov na liečebné využitie. Konkrétne je opísaný spôsob stanovenia percentuálneho zastúpenia defektného alebo terapeuticky inaktívneho vektora vo vzorke vektorovej súpravy. Predpokladá sa, že spôsob podľa vynálezu môže byť použitý na kvantifikáciu straty biologickej aktivity pri rôznych terapeutických vektorových preparátoch.

Vo všeobecnom uskutočnení je predmetom vynálezu spôsob stanovenia percenta defektných vektorov v súprave, do ktorej je geneticky zabudovaný efektorový gén na inhibíciu rastu nádorových buniek, indukciu apoptózy v nádorových bunkách alebo usmrcovanie týchto buniek. Spôsob zahŕňa tieto kroky:

a) uvedenie nádorových buniek do styku s vektorom v podmienkach umožňujúcich zavedenie vektora do nádorových buniek,

b) inkubáciu nádorových buniek v podmienkach umožňujúcich rast buniek,

c) analýzu rastu nádorových buniek po dostatočnom čase,

d) porovnanie rastu nádorových buniek s rastom buniek, ak sú kontaktované s jednou alebo viac skúšobnými štandardnými vzorkami obsahujúcimi pozitívne kontrolné vektory nesúce funkčný efektorový gén a negatívnymi kontrolnými vektormi nenesúcimi funkčný efektorový gén.

Preto v celkovom pohľade, prvý aspekt tohto vynálezu zahrnuje uvádzanie nádorovej bunky do styku so vzorkou vektora v podmienkach umožňujúcich jeho zavedenie do nádorových buniek vzorky vektora. Vzorka vektora môže byť zložená z viriónu alebo plazmidu, ktorý infikuje príslušné konkrétne nádorové bunky v podmienkach postačujúcich na umožnenie tejto infekcie. Vektor môže obsahovať rôzne regulačné elementy, ako napr. promótory a/alebo zosilňovače transkripcie. Vzorka obsahuje od 0 do 100 % funkčného efektorového génu. Konkrétne prípady takej vektorovej vzorky zahrnujú, ale nie výlučne, vírusové vektory, ako je adenovírus, retrovírus, vírus vakcínie a adenoassociovaný vírus. Kontaktovaná nádorová bunka sa stane cieľom infikácie jednotlivými vektorovými vzorkami použitými pre každú jednotlivú skúšku. Príkladom vhodných nádorových buniek sú bunky pľúc, tračníka, prsníka, pankreasu, prostaty, hlavy a krku a kože.

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu vektory skúšobnej štandardnej vzorky, ktorým chýba funkčný efektorový gén, t. j. negatívne kontrolné vektory, kódujú gén pre luciferázu.

Indikátorový gén je taký gén, ktorého úspešnú inkorporáciu do vektora je možné detegovať. Napríklad vo zvlášť výhodnom uskutočnení vynálezu je používaným indikátorovým génom gén pre luciferázu, ktorý umožňuje vizuálnu detekciu inkorporácie. Podmienky postačujúce na umožnenie infekcie nádorových buniek vektorom sa líšia pre jednotlivé nádorové bunky a vektory zúčastnené v skúške. Také podmienky sú v odbore známe.

Druhým aspektom vynálezu je všeobecne inkubácia nádorových buniek v podmienkach, ktoré umožňujú rast týchto buniek. Dostatočná inkubačná doba súvisí so vzájomnou kombináciou nádorových buniek a vektorov. Čas používaný na dostatočný rast nádorových buniek je medzi 2 až 10 dňami. Vo výhodnom uskutočnení pri použití adenovírusového vektora do SAOS-LM nádorových buniek (American Type Culture Collection, Rockville, MD) dôjde k dostatočnej inhibícii rastu za 3 až 5 dní.

Tretím aspektom vynálezu je všeobecne hodnotenie rastu nádorových buniek po dostatočnom čase. Rast môže byť hodnotený technikami pre počítanie buniek, ktoré sú v odbore známe.

Konečne štvrtý aspekt vynálezu všeobecne zahrnuje porovnanie rastu nádorových buniek infikovaných vektorom so štandardnými skúšobnými vzorkami obsahujúcimi vektory so známym množstvom vektora, ktorý nesie funkčný efektorový gén, t. j. pozitívnymi kontrolnými vektormi, a negatívnymi kontrolnými vektormi. Funkčný efektorový gén sa týka daného terapeutického génu, ktorý je teoreticky obsiahnutý v určitom množstve testovanej vzorky vektora. Takéto efektorové gény zahrnujú tumor supresorové gény, antimediátorové konštrukty a toxinové gény.

V konkrétnom výhodnom uskutočnení vynálezu sú ako vektory použité adenovírusové vektory. Okrem toho tieto adenovírusové vektory môžu byť obsiahnuté vnútri adenovírusových infekčných častíc.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je terapeutickým efektorovým génom, vybraným na zabudovanie do vektora, tumor supresorový gén. Obzvlášť účinný efektorový gén je divoký typ génu p53.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je percento štatisticky významných detegovateľných defektných vektorov medzi 0,05 a 10 %. Najvýhodnejšie uskutočnenie predpisuje hodnotu percenta štatisticky významných detegovateľných defektných vektorov väčšiu než 0,05 %.

Ďalšie výhodné uskutočnenie vynálezu opisuje súpravu obsahujúcu najmenej jednu nádobu, ktorá obsahuje skúšobný štandard. Skúšobný štandard alebo štandardy obsiahnuté v súprave obsahujú známe percento defektnej vektorovej kompozície. Vo výhodnom uskutočnení je alebo sú defektne vektorové kompozície vytvorené z vektora, do ktorého je zabudovaný gén pre luciferázu. V inom uskutočnení môže súprava tiež zahrnovať nádobu, ktorá obsahuje funkčný efektorový gén. Vo výhodnom uskutočnení je funkčným efektorovým génom divoký typ p53 tumor supresorového génu. V najvýhodnejšom uskutočnení zahrnuje súprava nádoby skúšobných štandardných zmesí, ktoré obsahujú vektorové prípravky, kódujúce indikátorové gény, v percentuálnych množstvách 0 %, 0,1 %, 0,5 %, 1,0 %, 2,0 %, 5,0 %, 10 %, 20 % a 100 %.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 zobrazuje rastové krivky pre bunky SAOS-LM po inkubácii v médiu, Adp53 a Adp53 obsahujúcom rôzne množstvá Adluc. Každý bod reprezentuje priemerný IDS pre misky v trojitom uskutočnení.

Obr. 2 zobrazuje expanziu rastových kriviek z obr. 1. Každý bod reprezentuje priemerný 1SD pre misky v trojitom uskutočnení.

Génová terapia sa stáva dostupnou alternatívou pri liečbe nádorov. Spoločne s riešením problémov spojenými so špecificitou, transferom a úrovňou expresie sa stane liečebná génová manipulácia bežným nástrojom pri liečbe neoplastických ochorení.

Z dôvodov bezpečnosti a účinnosti pri využití génovej terapie bude nutné hodnotenie vektorových súprav. Molekulárne prostriedky na analýzu vektorových súprav nie sú v tomto čase praktické; je teda nutné sa spoľahnúť na biologickú funkciu. Jednou cestou ku štandardizácii biologických funkcií jc vytvorenie štandardných skúšobných súprav terapeutického vektora, ktoré simulujú biologickú aktivitu súpravy vektorov s obsahom rôzneho percenta defektných vektorov. Vytváranie defektných vektorov, ktoré obsahujú mutované terapeutické gény na štandardizáciu hodnotiteľských skúšok je potenciálne nebezpečné. Napr. mutovaný p53 gén môže byť potenciálne škodlivý. Z tohto dôvodu bola vyvinutá skúška na stanovenie percentuálneho zastúpenia defektného vektora v súprave, ktorý' používa náhradu pre defektný vektor.

Podľa vynálezu je vyriešený test, pri ktorom je vo vzorke merané zmenšenie funkcie divokého typu vo vzorke vektora s použitím defektného vektora. Tento defektný vektor reprezentuje vektor, ktorý stratil svoju funkciu v priebehu vytvárania tejto vektorovej vzorky. V základnej forme defektného vektora je jednoducho tento bez akéhokoľvek vloženého terapeutického génu, ale môže tiež obsahovať inaktívny alebo mutovaný terapeutický gén. Defektný vektor nemá terapeutický účinok na nádorové bunky, pretože neexprimuje terapeutický gén. Na účely simulácie existencie defektného vektora je možné miešať známy defektný vektor, t. j. negatívny kontrolný vektor, so vzorkami divokého typu vektora a efektora, t. j, pozitívnymi kontrolnými vektormi. Vo výhodnom uskutočnení tento negatívny kontrolný vektor exprimuje indikátorový gén ako napr. gén pre luciferázu (Adluc). Adluc slúži ako indikátor percenta defektného vektora v testovanej vzorke.

Vektory

Vektory, ktoré môžu byť testované podľa opísaných testov, sa môžu značne líšiť. Môžu to byť štandardné expresné vektory, ktoré obsahujú jeden alebo viac eľektorových génov a regulačných elementov potrebných na expresiu efektorového génu v bunke. Regulačné elementy obsahujú prinajmenšom promótor a môžu tiež obsahovať štruktúry, ktoré zosilňujú transkripciu efektorového génu (zosilňovače). Tieto regulačné elementy môžu obsahovať štruktúry, ktoré umožňujú expresiu efektora v obmedzenej skupine buniek (bunkovo špecifické promótory).

Pri použití štandardných expresných vektorov sú pre zavedenie do bunky použité rôzne metódy. Napr. vektory môžu byť zapuzdrené do lipozómov, konjugované do cieľového agens, spojené s mikročasticami alebo inak modifikované na vstup alebo zavedenie do cieľových buniek. Predpokladá sa, že voľná DNA môže byť v niektorých prípadoch dostatočne transportovaná cez bunkové membrány a použitá na génovú terapiu. Pri akomkoľvek vybranom transportnom mechanizme alebo forme vektora môže byť tento mechanizmus použitý pri testovaní vzorky.

Inou formou vektora je vírusový vektor. Tieto vírusové vektory boli vyvinuté z množstva rôznych vírusových systémov zahrnujúcich adenovírus, herpesvírus, retrovírus, vírus vakcínie a adeno-asociované vírusy. Tieto vektory majú oproti štandardným expresným vektorom dve výhody. Prvá je, že vektor môže byť vhodne upravený na replikáciu a vybavený kapsidou ako DNA infekčného vírusu. To umožňuje použitie normálneho systému smerovania a vstupu vírusu. Regulačné elementy vírusu sú navyše často kompatibilné s mechanizmami génovej expresie hostiteľskej bunky. Samozrejme hostiteľské sekvencie aj regulačné elementy vírusu môžu byť modifikované na konkrétny účel.

Efektorový gén

Efektorový gén kódovaný vektorom môže byť akýkoľvek gén, ktorý prepožičia nádorovej bunke určitú detegovateľnú biologickú aktivitu. Typickou aktivitou je zvyšovanie inhibície rastu, stimulácie programovanej smrti (apoptóza) alebo priamo usmrtenie bunky. Rôzne efektorové gény majú jednu alebo viac takých funkcií. Napr. niektoré tumor supresorové gény inhibujú rast nádorovej bunky, zatiaľ čo iné obnovia normálnu programovanú smrť bunky alebo buniek. p53 je klasickým príkladom tumorového supresora. Ďalšie tumorové supresory zahrnujú RB, APC,

DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, VHL, FCC a MCC. Vhodnými cieľmi antimediátorových konštruktov sú onkogény, zahrnujúce rss, myc, neu, raf erb, src, fms, jun, trk, ret, gsp, hst, bel a abl. Toxínové gény alebo gény blokujúce základné bunkové funkcie môžu inhibovať rast nádorovej bunky alebo priamo bunky usmrcovať. Toxíny zahrnujú toxín cholery, toxín čierneho kašľa, toxín diftérie, tetanotoxín, ricín, endotoxin. Gény, ktoré urobia bunku citlivou na vonkajší agens, ako napr. na bunkový povrchový antigén alebo tymidín kinázu, tiež môžu umožniť usmrcovanie buniek.

Bunky

Teoreticky môže byť tomuto druhu analýzy podrobená akákoľvek nádorová bunka. Samozrejme musí byť nádor citlivý proti používanému efektorovému génu. Toxíny alebo gény, ktoré dodávajú bunkám citlivosť na vonkajšie činidlá, sú vhodné pre väčšinu buniek. Antimediátorové konštrukty a tumorový supresor musia byť na zistenie citlivosti testované s konkrétnymi nádormi. Príklady buniek, ktoré sú vhodnými adeptmi na liečbu pomocou tumor supresorového génu p53, sú bunky nádoru pľúc, prsníka, tračníka, hlavy, krku, pankreasu, osteosarkómu a nádoru prostaty.

Podmienky skúšky

Podmienky, v ktorých sa test vykonáva, sa líšia prípad od prípadu. Napr. podmienky, v ktorých sú liečené bunky inkubované a doba inkubácie, sa líšia podľa konkrétneho pokusu. Tam, kde je zistený rast buniek, tam sú podmienky a čas rôzne podľa požiadavky použitých buniek. Tam, kde sa zistí usmrcovanie buniek, sú podmienky a čas závislé od podmienok a času nutného na usmrtenie bunky efektorovým génom. Pre ďalšie aktivity efektora, ako napr. rast v ľahkom agare alebo formovanie kolónií, budú zodpovedajúce podmienky, čas a ďalšia liečba kvalifikovanému odborníkovi zrejmé.

Citlivosť

Vzorka vektora obsahuje milióny a niekedy trilióny vektorov. Pokus založený na biologickej aktivite má limitované možnosti na identifikáciu defektných vektorov, ktoré sa vyskytujú vo veľmi malom množstve. V závislosti od konkrétneho typu vektora, ošetrovaných nádorových buniek a vykonávaného testu sa prah štatistickej významnosti výsledkov rôzni. Prah citlivosti testu môže stanoviť odborník pomocou vytvorenia série štandardných súprav testov.

Napríklad sa zmieša rôzne percento negatívneho kontrolného vektora s pozitívnym kontrolným vektorom (napríklad vzorka priekopníckeho vektora) s náhodne priradenou 100 % aktivitou. Aktivita je samozrejme definovaná vo vzťahu k testovanému konštruktu vektor-gén. Napr. 100 % aktivita pozitívnej kontrolnej vzorky môže byť definovaná rôznym stupňom usmrtenia nádorovej bunky, inhibíciou rastu, apoptózou alebo mierou expresie kódovaného génu. Pri prídavku určitého množstva negatívneho kontrolného vektora bude štatisticky významný rozdiel medzi správaním (rastom, usmrcovaním atď.) buniek ošetrovaných pozitívnou kontrolou a rôznymi zásobnými zmesami pozitívnej a negatívnej kontroly. Tento minimálne štatisticky významný rozdiel určuje stupeň citlivosti tejto skúšky.

Kit

Je žiaduce vytvoriť súpravy pre konkrétne vektorové systémy, ktoré obsahujú minimálne negatívny kontrolný vektor. Tieto negatívne kontrolné vektory obvykle kódujú signálny gén, ako napr. gén pre luciferázu, ktorý používateľovi umožňuje monitorovať množstvo negatívneho kon trolného vektora obsiahnuté v testovanej vzorke vektora. Tieto súpravy môžu ďalej obsahovať misky vhodné na kultiváciu buniek, riediace pufre a komôrky, bunky na propagáciu negatívneho kontrolného vektora, média a návod.

Adenovírus p53

Vo výhodnom uskutočnení je test určený na meranie tumor supresorovej aktivity konštruktu adenovírus-p53 (Adp53). Zatiaľ čo množstvo mutácií vírusových vektorov nie je dokumentované, množstvo chýb adenovírusovej DNA polymerázy sa neočakáva vyššie, než u cicavčej DNA polymerázy. Potom je teda možné, že v preparáte 10 adenovírusových častíc môže vzniknúť až 10⁴ kópií inaktívneho alebo mutovaného p53 exprimujúceho adenovírusu.

Identifikácia mutantných vektorov molekulárnymi metódami, ako napr. PCR^1M, nie je ani praktická ani vhodná na tento účel. Okrem toho, pretože dosiaľ neexistuje žiadna skúška na bunkovú transformáciu mutantným p53, bude nutné vyvinúť nejakú skúšku na zistenie interakcií s inými onkogénmi, ako napr. s ras(2). Takéto skúšky je ťažké kvantifikovať. Okrem toho mnoho buniek na také kombinácie génov nereaguje. Ďalej tento typ skúšky tiež vyžaduje ako pozitívnu kontrolu mutantný p53 vektor. To bolo zakázané RAC pre potenciálne nebezpečenstvo.

Skúška konkrétne porovnáva aktivitu priekopníckej vzorky Adp53 vektora s aktivitou novozískaných vzoriek. Priekopnícka vzorka Adp53 je definovaná ako sprostredkujúca bunkovú smrť v 100 % SAOS buniek (línie buniek ľudského osteosarkómu s homozygotnou p53 deléciou) s MOI 50 : 1 v 5-dennej kultúre. Taká vzorka eliminuje rast nádoru in vivo v ortotopickom modeli karcinómu ľudských pľúc u holej myši (Fujiwara et al., 1994, Zhang et al., 1993). Pridaním rastúceho množstva defektného vektora k priekopníckej vzorke (vzorka pozitívneho kontrolného vektora) je možné imitovať vzorky s rôznym množstvom defektného Adp53. Vzorka Adp53 je potom testovaná na jeho schopnosť zabíjať SAOS bunky po 5 dňoch a rastová krivka je porovnávaná s krivkou vzniknutou pri testovaní vzorky s rôznym percentom defektného vektora.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Stanovenie percenta defektného vektora vo vzorke Adp53 adenovírusovej vektorovej súpravy.

SAOS-LM bunky (pľúcna metastáza variantu buniek SAOS) boli inokulované v množstve 10⁶ buniek na 60 mm kultivačné misky. Misky boli potom inkubované pri 37 °C cez noc. Bunky boli pred vírusovou infekciou spočítané. Boli infikované na MOI v pomere 50 : 1. Skupiny obsahovali Adp53 priekopnícku vzorku, Adp53 vzorku obsahujúcu 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 %, 10 % a 20 % Adluc (rekonštruované pozitívne kontroly) a skúšobnú šaržu Adp53. Všetky skupiny boli vykonané trojmo. Bunky boli denne počítané (dva odpočty na jednu misku) počas päť dní. Experiment bol opakovaný 3x.

Výsledky sú opísané na obr. 1 a obr. 2. Obr. 1 ukazuje hlbokú inhibíciu SAOS buniek priekopníckou vzorkou Adp53 a menšiu inhibíciu po pridaní defektného vektora. Štatisticky významný a reprodukovateľný výsledok môžeme merať už v treťom a jasnejšie v piatom dni pokusu. Obr. 2, napr. v treťom dni pokusu bol stredný odpočet buniek 25 ± 4 (± S. D.) pre priekopnícku vzorku Adp53 a stredný odpočet buniek pre Adp53 s 1 % defektného vektora bol 36 ± 4. Tento rozdiel je považovaný pri p < 0,02 za významný. Limit citlivosti pre skúšku sa zdá byť 1 %, pretože rozdiely pre 0,5 % a 0,1 % defektného vektora nie sú štatisticky významné. Preto prítomnosť 1 % defektného vektora v preparáte je biologicky významná a reprodukovateľné detegovateľná touto skúškou.

Záverom, vývoj biologického štandardu kombinovaný s náhradou p53 mutantným vektorom vyústil do vývoja citlivej bioskúšky na detekciu inaktívneho vektora. Zatiaľ čo kompozície a spôsoby podľa tohto vynálezu boli opísané vo výhodnom uskutočnení vynálezu, je zrejmé, vzhľadom na jestvujúce technické možnosti, že varianty môžu byť použité pri kompozíciách, metódach a v krokoch alebo sekvenciách krokov metód tu opísaných, bez odchýlenia sa od koncepcie, myšlienky a rozsahu vynálezu. Presnejšie, je zrejmé, že určité vzorky, ktoré sú chemicky aj fyziologicky podobné, môžu byť zamenené za tu opísané vzorky, pričom môžu byť dosiahnuté rovnaké alebo podobné výsledky. Všetky tieto podobné zámeny a modifikácie sú v súlade so znalosťami odborníka v uvedenom odbore a sú považované za hlavnú myšlienku a koncept vynálezu, ako je ďalej uvedené v priložených nárokoch.

Claims (16)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob stanovenia percenta defektných vektorov vo vzorke súpravy vírusových vektorov adenovírusu, retrovírusu, vírusu vakcínie alebo adeno-asociovaných vírusových vektorov, kde aspoň niektoré vektory súpravy nesú efektorový gén, ktorý kóduje produkt inhibujúci rast nádorových buniek, indukuje apoptózu nádorových buniek alebo ich usmrcuje, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje tieto kroky:

   a) uvedenie nádorových buniek do styku s uvedenou vzorkou súpravy vektorov v podmienkach umožňujúcich zavedenie vzorky do nádorových buniek,

   b) inkubáciu nádorových buniek v podmienkach umožňujúcich rast buniek,

   c) analýzu rastu nádorových buniek po dostatočnej dobe,

   d) porovnanie rastu nádorových buniek s rastom buniek, ak sú kontaktované s jednou alebo viacerými skúšobnými štandardnými vzorkami obsahujúcimi pozitívne kontrolné vektory nesúce funkčný efektorový gén a negatívne kontrolné vektory nenesúce funkčný efektorový gén, ktoré kódujú indikátorový gén.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedený indikátorový gén je gén pre luciferázu.
3. 3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedenými vektormi sú adenovírusové vektory·
4. 4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že uvedené adenovírusové vektory sú obsiahnuté vnútri infekčných adenovírusových častíc.
5. 5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedený efektorový gén je tumor supresorový gén.
6. 6. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že efektorový gén indukuje apoptózu.
7. 7. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že tumor supresorovým génom je divoký typ génu p53.
8. 8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že uvedené nádorové bunky sú nádorové bunky pľúc, tračníka, prsníka, pankreasu, prostaty, hlavy, krku a kože.
9. 9. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že medza detekcie defektných vektorov jc väčšia než 0,05 %.
10. 10. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedená medza detekcie defektných vektorov je medzi 0,05 % a 10 %.
11. 11. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedená doba je medzi 2 a 10 dňami.
12. 12. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedená doba je medzi 3 a 5 dňami.
13. 13. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedená skúšobná štandardná súprava obsahuje jeden alebo viac percentuálnych podielov negatívnych kontrolných vektorov, vybraných zo skupiny zahrnujúcej 0 %, 0,1 %, 0,5 %, 1,0 %, 2,0 %, 5,0 %, 10 %, 20 % a 100%.
14. 14. Kit na použitie pri spôsobe podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž 13, vyznačujúci sa tým, že obsahuje aspoň dve nádoby, pričom tieto nádoby obsahujú zmesi súprav skúšobných štandardov pozitívnych kontrolných vektorov nesúcich funkčný efektorový gén a negatívnych kontrolných vektorov nenesúcich funkčný efektorový gén a kódujúcich indikátorový gén, kde uvedené súpravy obsahujú jedno alebo viac percentuálnych množstiev negatívnych kontrolných vektorov vybraných zo skupiny zahrnujúcej 0,1 %, 0,5 %, 1,0 %, 2,0 %, 5,0 %, 10 % a 20 %.
15. 15. Kit podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že uvedený indikátorový gén kóduje luciferázu.
16. 16. Kit podľa nároku 14 alebo 15, vyznačujúci sa tým, že uvedené vektory sú adenovírusové vektory.