PL180271B1 - Nowy mutant szczepu Aspergillus niger i sposób hodowli nowego mutanta szczepe Aspurailias zizer - Google Patents

Abstract

1. Nowy mutant szczepu Aspergillus niger A.n:33/20/K zdeponowany pod numerem KKP/154. 2. Sposób hodowli nowego mutanta szczepuAspergillus niger A.n.33/20/K w warunkach aerobowych, na pożywce płynnej zawierającej źródło węgla, azotu i składniki mineralne, znamienny tym, że stosuje się podłoże zawierające w 1 litrze wody: 1.5-2.5 g KH2PO4, 1.0-2.0 g (NH4)2SO4,0.1-1.0 g CO(NH2)2,0.1-0.5 gMgSO4 x 7 H20,0.1-0.5 g CaCl2,7-15 g sacharozy, 7-15 g karboksymetylocelulozy, 0.01-0.1 ml monooleinianu polioksyetylosorbitanu (Tween 80), 50-100 mg FeSC^ x 7 ^0, 0.5-3.0 mg MnSC>4 x 7 ^0, 0.5-4.0 mg CoCl2, przy czym hodowlę rozpoczyna się przy pH początkowym wynoszącym 5.0-6.0.

Description

Przedmiotem wynalazkujest nowy mutant szczepu Aspergillus niger i sposób jego hodowli, zapewniający podwyższoną zdolność wytwarzania β-glukozydazy.

Grzyby z rodzaju Aspergillus, należące do grzybów strzępkowych, znane są od bardzo dawna jako składnik naszego środowiska. Zostały opisane po raz pierwszy w 1729 r. przez Micheli’ego, badania biochemiczne przeprowadził w 1891 r. Wehner. W1901 r. Wehnerwyodrębnił, w zależności od ich cech morfologicznych, kilka grup rodzaju Aspergillus, m. in. grupę Aspergillus niger, która w 1934 r. została podzielona na 35 gatunków, w tym gatunek o tej samej nazwie - Aspergillus niger. Gatunek ten został opisany przez Van Tieghem’a.

Szczepy gatunku Aspergillus niger posiadajązróżnicowane zdolności do biosyntezy różnych metabolitów, a w szczególności są bogatym źródłem wielu użytecznych przemysłowo enzymów: amylazy, celulazy, pektynazy, proteazy, lipazy. W skład aktywności celulolitycznej Aspergillus niger wchodzą4 podstawowe wzajemnie uzupełniające się składniki: endo-1,4-p~glukanaza, egzocelobiohydrolaza, egzo-1,4-P-glukozydaza i β-glukozddaza. Sldad kompleksu celulolyyczneoo zależy przede wszystkim od mikroorganizmu i od składu pożywki, na której wzrasta.

Opisany w patencie polskim nr 166 006 Aspergillus niger IBT - 90 stanowi źródło kompleksu enzymów yclulolityconych. Wykazuje on aktywność 9-17 J β-gle0ozdZazy, oośród zzyoznych innych aktywności cclulklitzyonzch.

Aspergillus ζϊ-ι^ζ^ potencjalne źródło β- glukoozdazz (hydrolazy β-gluSoozdowej) odkryty został dopiero w końcu lat osiemdziesiątych. Większość wykonanych na ten temat prac miała charakter zdecydowanie poznawczy, dotycząc z reguły badania optymalnego źródła węgla w pożywce i poznaniu własności indukowanego enzymu (Witte K. Wartenberg A. Purtfcation and properties of two β-glycksiZkCk s isolnedd ϊτοολ Aspergillus igger. Acta Bioeccl-mol. 9,1889, 179-190 oraz Shoseyor O. i in., Ezdo-betaglucksidakc from Aspergillus niger grown on a monoterpene glucoside μζΙζϊζϊζ- medium. Phztkchcmistrz, 27, 1988, 1973-1976).

Ze zgłoszenia patentu europejskiego 307071 A2 znany jest Aspergillus niger B1, jako źródło β-glukkzydazy, o aktywności około 20 J wobec PNPG (p-zitrofczyl-β-D-glsSopirazozzdu). Szczep ten jest zdolny do wzrostu na pożywce zawierającej naturalne β-glukozzdy monoterpenowe właściwe jako jedyne źródło węgla. Efektem tego jest produkcja enzymu wysoce specyficznego wobec naturalnych glikozydów roślinnych, odpowiedzialnych m. in. za zapach i aromat.

Celem wynalazku jest nowy mutant szczepu Aspergillus niger o pożądanej aktywności, stabilności i specyficzności działania β-glukkzzdazy oraz opracowanie warunków jego hodowli, umożliwiających uzyskanie pożądanych cech. Szczególnie istotne było otrzymanie szczepu o

180 271 aktywności β-glukozydazy wobec szerokiego spektrum naturalnych substratów, umożliwiającej zastosowanie jej w całym szeregu procesów przetwórczych przemysłu rolno-spożywczego.

Nowy mutant szczepu grzyba strzępkowego będący przedmiotem wynalazku określono jako Aspergillus niger A.n.33/20/K i zdeponowano go w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP/154.

Aspergillus niger A.n.33/20/K otrzymano w wyniku skojarzonego działania dwóch czynników mutagennych: promieni ultrafioletowych i etylenoiminy o stężeniu 0,03%. Przeprowadzona mutagenizacja pozwoliła na wytworzenie nowego mikroorganizmu, posiadającego nowąi pożądaną własność, zgodnie z założonym celem wynalazku.

Sposób hodowli nowego mutanta szczepu Aspergillus niger A.n.33/20/K według wynalazku polega na tym, że stosuje się podłoże zawierające w 1 litrze wody: 1.5-2.5 g KH2PO41.0-2.0 g (NH4)₃S04, 0.1-1.0 g CO(NH₂)₂, 0.1-0.5 g MgS^4 x 7 H₂0, 0.1-0.5 g CaCl₂, 7-15 g sacharozy, 7-15 g karboksymetyloeelulozy, 0.01 -0.1 ml monooleinianu polioksyetylosorbitanu (Tween 80), 50-100 mg FeSO4 x 7 H20, 0.5-3.0 mg MnSO4 x 7 H20, 0.5-4.0 mg CoC^, przy czym hodowlę rozpoczyna się przy pH początkowym, wynoszącym 5.0-6.0.

Opis szczepu Aspergillus niger według wynalazku, przedstawia się następująco:

-mikroskopowy

Szczep wytwarza dwa rodzaje strzępek. Większość z nich, tj. około 70% ogólnej ilości, stanowią strzępki krótkie i szerokie (5-6,5 pm) o dobrze wykształconych septach i jednorodnej protoplazmie. Natomiast około 30% strzępek to komórki długie i wąskie (3,5-4,0 pm). Ich protoplazma zawiera nieliczne ziarnistości i pojedyncze wodniczki, oraz słabo wykształcone ciało szczytowe. Konidiofory są dobrze wykształcone z fialidami na całym pęcherzyku. Ich średnica wynosi od 40 (młode) do 85 pm.

Łańcuszki zarodniczków są długie i rozpadają się stosunkowo trudno. Mutant wytwarza dwa rodzaje czarnych zarodników: zarodniki gładkie i okrągłe o cienkiej ścianie komórkowej oraz okrągłe i chropowate o znacznie grubszej ścianie komórkowej. Stosunek ilości obu rodzajów zarodników wynosi 1:2, a ich średnica jest podobna i wynosi od 4,5 do 5,0 pm.

-kolonii

Podłoże	Powierzchnia	Rewers
1	2	3
podłoże według wynalazku	średnica = 21 mm po 72 godz.	biały, gładki, przezroczysty
kolonia okrągła, płaska, biała, grzybnia bardzo delikatna, przy brzegu widoczne strzępki
brzeczka o gęstości 8°Blg	średnica = 44 mm po 72 godz.	biało-kremowy, gładki
kolonia okrągła, płaska, lekko żółta, strefa brzegowa biała, kolonia (poza strefą brzegową) pokryta czarnymi zarodnikami, przy brzegu widoczne strzępki
brzeczka o gęstości 3°Blg	średnica = 35 m po 72 godz.	biały, gładki
kolonia okrągła, płaska, biała, grzybnia delikatna, wyraźna strefa brzegowa, kolonia (poza strefą brzegową) pokryta czarnymi zarodnikami, przy brzegu widoczne strzępki
Saunders'a	średnica = 12 mm po 72 godz.	biały, gładki, przezroczysty
kolonia okrągła, płaska, biała, grzybnia bardzo delikatna, kolonia pokryta czarnymi zarodnikami układającymi się pierścieniowo, przy brzegu widoczne strzępki

180 271 ciąg dalszy tabeli

1	2	3
YPG	średnica = 32 mm po 72 godz.
kolonia okrągła, płaska, żółta, kolonia (poza strefą brzegową) pokryta czarnymi zarodnikami, grzybnia gęsta, pilśniowata	żółto-kremowy, wyraźne zmarszczenia układające się promieniście

Współczynniki szybkości wzrostu radialnego wynosiły:

-dla pożywki wg wynalazku -dla brzeczki o gęstości 8°Blg -dla brzeczki o gęstości 3°Blg -dla pożywki Saunders'a -dla pożywki YPG

Kr= 191 pm · h’¹ Kr = 480 pm · h'¹ Kr = 350 μη · h'’

Kr= 133 pm · h^u K_r = 300 pm · h’

Właściwa szybkość wzrostu na pożywce wg wynalazku wynosiła:

P24 = 0,0778 h’1

P48 = 0,0269 h-i

P72 = 0,0258 h‘i

Stanowiący przedmiot wynalazku mutant A.n. 33/20/K w połączeniu ze sposobemjego hodowli pozwala na wydajne i proste otrzymywanie preparatu β-glukozydazy co najmniej dwukrotnie tańszego i aktywniejszego od handlowych preparatów emulsyny z migdałów, podobnie specyficznego wobec glukozydów zawierających aglikon, działającego w pH optimum 4.8, termostabilnego i odpornego na kontakt z rozpuszczalnikami organicznymi (etanolem, pentanem).

W porównaniu do znanego szczepu B1, z przytoczonego w stanie techniki zgłoszenia patentu europejskiego nr 307071, mutant A.n. 33/20/K wykazuje co najmniej rząd wielkości większąaktywność sekrecyjnej β-glukozydazy (oznaczoną także wobec PNPG), a enzym charakteryzuje się znacznie szerszym spektrum substratów, wykazując do wielu glikozydów naturalnych powinowactwo (Km) podobne jak endo-β-glukozydaza szczepu B1 do glikozydów monoterpenowych.

Hodowlę mutanta według wynalazku prowadzono na podłożu zawierającym w 1 litrze wody: 2 g KH₂PO₄ 1.4 g (NH₄)₂SO₄,0.3 g COlNH^, 0.3 g MgSO₄ x 7 H₂0,0.3 g CaCl₂,10 g sacharozy, 10 g karboksymetylocelulozy, 0.033 ml Tween 80, 80.5 mg FeSO4 x 7 H20,1.56 mg MnSO4 x 7 H20,2 mg CoCl2 Początkowe pH podłoża wynosiło 5.6. Inokulum: wodna zawiesma zarodników. Hodowlę prowadzono w fermentorze w temperaturze 30°C przez 120 godzin, przy napowietrzaniu 1:1 V/V min lbbrtaach miesaadłal5 Oobr./min, a po 66 godziaach hodowli 300obr./min.

Ciecz pohodpwlaną oczyszczano przez zatężenie około 10-12 razy w temperaturze nie przekraczającej 45°C, wysalanie frakcji aktywnej koncentratu w warunkach 75% nasycenia roztworu siarczanem amonu, a następnie odsalanie meto^ultrafiltracji przez filtr polieulfonowy NMWL10 kD.

Aktywną sekrecję enzymu i efektywny sposób oczyszczania z cieczy pohodowlanej zapewniły skład pożywki i warunki hodowli. Zastosowana pożywka nie zawierała w swoim składzie żadnych białek, a jedynie induktor którym jest karboksymetylocelulps_Ja, dodatkowe źródło węgla w postaci sacharozy.

Z 1 litra cieczy pohodowlanej otrzymuje się za pomocą wysalania i ultrafiltracji minimum 605-805 J. aktywności względem p-nitrofenylo^glukopiranozydu (PNPG). Preparat zawierający ponad 35% białka, wykazywał optymalną aktywność w pH 5 i temperaturze 65°C (połowiczna utrata aktywności po ok. 3 godzinach). W najczęściej stosowanej temperaturze -50°C traci zaledwie 20% po 14-dmowej inkubacji. Przejawia następujące aktywności wobec naturalnych β-glipzyod0w ^J J akypvności / mg baałka*):

7.5 mM celo^oza - 39

2.5 mM p-nitrofenylo-β-gluaopiranρsyO - 22 mm salicyn - 7

2.5 mM amygdalina - 18

2.5 mM arbutyna - 9

180 271 mM florydzyna - 1

0.75 mg/ml glukan z jęczmienia lub piwa - 1 * 1 J aktywności hydrolizuje 1 mM wiązań glikozydowych w czasie 1 min., w temperaturze 50°C, w środowisku 0.05 M buforu cytrynianowego o pH 4 8.

Przykłady zastosowania wynalazku

Przykład 1

Otrzymywanie związanych glikozydowo składników aromatu z owoców wiśni, malin, czarnych porzeczek, truskawek i jabłek.

Obowiązujące za granicą (w krajach Europy Zach. i USA) uregulowania prawne określają, że „naturalny aromat” to kompozycja składników wyizolowanych z surowców naturalnych, lub otrzymanych na drodze mikrobiologicznej. Stąd wiele stosowanych w przemyśle spożywczym naturalnych aromatów zawiera komponenty izolowane z wielu różnych surowców, a także otrzymane na drodze biotechnologicznej. Dla przykładu produkowany w USA aromat wiśniowy (Cherry - Type WONE Fortyfier) zawiera 8 komponentów-półproduktów izolowanych z różnych surowców roślinnych i otrzymywany na drodze fermentacji etanol.

Ciecz pohodowlaną Aspergillus niger A.n. 33/20/K zatężono 20-krotnie na wyparce próżniowej w temperaturze 40°C i wysalano dodając siarczanu amonu do 75% nasycenia. Osad odwirowano 10 mm. x 10 000 g, a następnie ekstrahowano 3-krotnie, każdorazowo 3 objętościami wody. Nierozpuszczalne składniki osadu usuwano wirując każdorazowo j. w. Supematanty łączono i poddawano ultrafiltracji przez filtry polisulfonowe na podłożu polipropylenowym o NMWL = 100 000 D (Sigma Techware, Niemcy). Retentat liofilizowano.

Zatężony ekstrakt alkoholowy wytłoków owocowych rozcieńczony wodą do ok. 10% v/v alkoholu adsorbowano na kolumnie z Amberite XAD-2, przemywano 10 obj. wody, 1 obj. pentanu i eluowano 96% etanolem. Po zatężeniu i otrzymaniu roztworu zawierającego nie więcej niż 20% v/v etanolu dodawano 300 J aktywności (wobec PNPG) β-glukozydazy A. niger w przeliczeniu na 1 kg wytłoków wiśni.

W szklanym, szczelnie zamkniętym szklanym korkiem szlifowym, naczyniu ekstrakcyjnym na fazę wodną nawarstwiano 0.4 obj. pentanu. Inkubowano w temp. 25°C przez 3 dni, mieszając fazę wodną w sposób nie pozwalający na powstawanie nadmiernej ilości emulsji. Po inkubacji fazę pentanową osuszano od zemulgowanej wody niewielkimi porcjami bezwodnego siarczanu sodu. Ekstrakt analizowano metodą chromatografii gazowej na kolumnie CarbowaX 20M (0.2mm x 25m) w gradiencie temperatury: 3 min x 60°C i 5° /min do 220°C. Na podstawie zintegrowanych danych chromatograficznych próbek kontrolnych i poddanych działaniu β-glukozydazy wyliczano ilość substancji uwolnionych z frakcji glikozydowych badanych owoców.

surowiec maliny wiśnie czarne porzeczki truskawki jabłka mg/kg s.m. owoców 14.6 32.3 13.0 52.0 9.0

Oczyszczone frakcje glikozydowe, niezależnie od owoców, były bkzwonne, natomiast działanie β-glukozydazy przywracało im aromat (szczególnie swoisty w przypadku truskawek). Przy pomocy sprzężonego z chromatografem gazowym spektrometru masowego stwierdzono, że u wszystkich badanych owoców w największych ilościach z frakcji glikozydowych pod wpływem β-glukozydazy powstawał: aldehyd benzoesowy, alkohol benzylowy i alkohol fenyloetylowy. Jedynie z frakcji glikozydowej truskawek w największych ilościach uwalniany był furaneol.

Przykład 2

Zmniejszanie lepkości bezciśnieniowych zacierów żytnich przy produkcji spirytusu w gorzelniach rolniczych.

Wysoka lepkość zacierów żytnich otrzymywanych energooszczędną metodą BUS (Bezciśnieniowe Upłynnianie Skrobi) istotnie utrudnia proces technologiczny (tru(diości w przetaczaniu i

180 271 myciu urządzeń), a ponadto niekorzystnie wpływa na efektywność fermentacji (utrudnione usuwanie CO2 może hamować fermentację). Stosowane w tej metodzie zacierania krajowe jak i importowane preparaty amylolityczne nie rozwiązują tego problemu. Na rynku dostępny jest osobny, importowany preparat Viscozyme (Novo Nordisk, Dania) obniżający lepkość.

Ciecz pohodowlaną zatężono 20-krotnie na wyparce próżniowej w temperaturze 40°. Z 1 litra cieczy pohodowlanej otrzymano ok. 50 ml koncentratu zawierającego minimum 1000-1300 J aktywności β-glukozydazy (wobec PNPG).

Koncentrat cieczy pohodowlanej w ilości 0.005 J/ml zacieru dodawano bezpośrednio po schłodzeniu zacieru do 50°C i nie później jak bezpośrednio po dodaniu drożdży. Lepkość względna zacierów wynosząca wyjściowo od 50 do ponad 100 mPa· s już w pierwszych 2-3 godzinach fermentacji spada do poziomu 8-10 mPa-s rzadko uzyskiwanego bez dodatku β-glukozydazy na koniec 3 - dobowej fermentacji. Wyliczono, że uzyskiwany ok. 0.1 % zysk w wydajności spirytusu już pokrywa koszty zastosowania koncentratu cieczy pohodowlanej, otrzymywanej w skali hodowli kilkunastolitrowych.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 2,00 zł.

Claims (2)

Zastrzeżenia patentowe

1. Nowy mutant szczepu Aspergillus niger A.n.33/20/K zdeponowany pod numerem KKP/154.

2. Sposób hodowli nowego mutanta szczepu Aspergillus niger A.n.33/20/K w warunkach aerobowych, na pożywce płynnej zawierającej źródło węgla, azotu i składniki mineralne, znamienny tym, że stosuje się podłoże zawierające w 1 litrze wody: 1.5-2.5 g KH2PO4, 1.0-2.0 g (NH4)₂S04, 0.1-1.0 g CO(NH2)2, 0.1-0.5 g MgSO4 x 7 ^0, 0.1-0.5 g CaCty 7-15 g sacharozy, 7-15 g karboksymetylocelulozy, 0.01 -0.1 ml monooleinianu polioksyetylosorbitanu (Tween 80), 50-100 mg FeSO4 x 7 H,0,0.5-3.0 mg MnSCty x 7 H20,0.5-4.0 mg CoCty przy czym hodowlę rozpoczyna się przy pH początkowym wynoszącym 5.0-6.0.