KR100485686B1 - 참다시마 유래 올리고당의 제조방법 - Google Patents

참다시마 유래 올리고당의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 참다시마 유래 올리고당의 제조방법에 관한 것으로, pLK108S(KFCC-11303)이 삽입된 에스세리시아 콜리이(E. coli) 균주의 배양상등액 또는 이로부터 회수된 엔도-베타-1,3-글루카나제를 참다시마로부터 분리정제한 라미나린 다당류 분획에 첨가하여 효소반응시킴으로써 참다시마로부터 단시간 내에 고효율로 올리고당을 제조하는 방법을 제공할 수 있으므로 식품 및 의약산업상 매우 유용한 것이다.

Description

참다시마 유래 올리고당의 제조방법{Method for production of oligosaccharide from Laminaria japonica}
본 발명은 참다시마 유래 올리고당의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 엔도-베타-1,3-글루카나제 유전자를 함유한 재조합 벡터 pLK108S(KFCC-11303)이 삽입된 에스세리시아 콜리이(E. coli) DH5α 형질전환체에 의해 생산되는 효소를 이용하여 참다시마로부터 올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.
자연계에는 우리가 산업적으로 활용할 수 있는 글리칸(glycan)들이 많이 존재하고 있다. 그 중 베타-1,3-글루칸(β-1,3-glucan)은 해양에 다량 존재하는 갈조류인 라미나리아 자포니카(Laminaria japonica) 등의 주된 구조 및 저장 다당류인 라미나린(laminarin)의 결합 형태로 알려져 있다. 라미나린은 포도당 잔기들로 이루어진 언브랜치드 베타-1,3-글루칸 중합체(unbranched β-1,3-glucan polymer)이다. 그 구조는 대표적인 갈조류인 라미나리아 디지타타(Laminaria digitata)로부터 유래한 것을 분석해 본 결과 두 가지 타입으로 이루어져 있다. M 타입과 G 타입이 있는데 이들은 3 : 1의 비율로 존재한다. M 타입은 만니톨(mannitol) 잔기와 연결된 포도당 잔기가 20 - 30개 정도를 이루고, G 타입은 22 - 28개 정도의 포도당 잔기를 포함하는 것으로 보고된 바 있다(Steve, M. R., Graeme C., Antony, B. 1996. Analysis of the structural heterogeneity of laminarin by electrospray-ionisation-mass spectrometry Carbohydr. Res. 28: 187-201). 또한, 베타-1,3-글루칸은 곰팡이나 효모의 세포벽 성분으로 잘 알려져 있고, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)와 데바료마이세스 한세니(Debaryomyces hansenii), 한세눌라 시페리(Hansenula ciferrii), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 피리쿨라리아 오리재(Pyricularia oryzae), 아스퍼길러스 오리재(Aspergillus oryzae), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 다양한 효모와 곰팡이들의 세포벽 성분으로 보고되어 왔다(Klebl, F. and Tanner, W. 1989. Molecular cloning of a cell wall exo-β-1,3-glucanase from Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 171: 6529, Hilary, J., Donald J. and Patick, A. 1999. Hydrolase and transferase activities of the β-1,3-exoglucanase of Candida albicans Eur. J. Biochem. 263: 889-895, Salazar, O., Molitor J, and Asenjo, J. A. 1999. Cloning and expression of an Oerskovia xanthineolytica β-1,3-glucanase in Escherichia coli Biotechnol. Lett. 21: 797-802).
베타-글루칸은 자연계에 널리 존재하는 BRM(biological response modifier) 으로 잘 알려져 있고 최근 들어 식재 및 의약재로 활용되고 있다 (Naohito Ohno et al. 2000, Antitumor 1,3-b-glucan from cultures fruit body of Sparossis crispa, Biol. Pharm Bull, 23(7) : 866-872). 베타-1,3-글루칸으로 알려져 있는 라미나린은 갈조류의 일종으로 알려진 에이세니아 바이사이클리스(Eisenia bicyclis)로부터 분리, 정제하여 그 구조가 보고된 바 있고(Masaakira Maeda and Kazutosi Nisizawa 1968, Fine structure of Laminaran of Eisenia bicyclis, J. Biochem. 63(2) : 199-206), 또한, 르쥬드밀라 에이(Ljudmila A) 등은 다양한 파-이스턴 브라운 시위드(far-eastern brown seaweeds)로부터 획득한 라미나린의 분자량, 잔기 말단의 구조 등 생화학적 특징을 체계적으로 보고한 바 있다 (Ljudmila A. Elyakova and Tatiana N. Zvyagintseva 1974, A study of the laminarins of some far-eastern, brown seaweeds Carbohydr. Res. 34 : 241-248). 또한, 파-이스턴 브라운 시위드로부터 추출한 수용성 다당류는 항보체 생리활성이 보고된 바 있고 (Zvyagintseva T. N. et al. 2000, Inhibition of complement activation by water-soluble polysaccharides of some far-eastern brown seaweeds, Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol Pharmacol 126(3) : 209-215), 버섯류로부터 분리한 베타-1,3-글루칸은 항암 활성 물질로 보고되었다 (Naohito Ohno et al. 2000, Antitumor 1,3-b-glucan from cultures fruit body of Sparossis crispa, Biol. Pharm Bull, 23(7) : 866-872, Hisami Shinohara et al. 1988, Antitumor activity and structural characterization of a 1,3-b-glucan extracted with cold alkali from sclerotia of Sclerotinia sclerotiorum IFO 9395, Chem. Phrm. Bull. 36(2) : 819-823, Naohito Ohno et al. 1986, Structure and antitumor activity of a b-1,3-glucan isolated from the culture filtrate of Sclerotinia sclerotiorum IFO 9395, Chem. Pharm. Bull., 34(3) : 1362-1365, Hirohide Mimura et al. 1985, Purification, antitumor activity, and structural characterization of b-1,3-glucan from Peziza vesiculosa, Chem. Pharm. Bull. 33(11) : 5096-5099, Naohito Ohno et al. 1984, Antitumor activity and structural characterization of glucans extracted from cultured fruit bodies of Grifola frondosa, Chem. Pharm. Bull. 32(3) : 1142-1151).
현재 국내에서는 다시마로부터 푸코이단(fucoidan)을 분리, 정제한 것이 일부 보고되고 있으나(구재근, 조길석, 도정룡, 우순자. 한국산 다시마 및 미역으로부터 Fucoidan의 추출 및 정제. 한국수산학회지, 1995, 28(2) : 227-236) 라미나린에 대한 연구는 보고된 바 없다.
이에 본 발명자는 에스세리시아 콜리이(E. coli) (pLK108S) 형질전환체의 배양상등액 또는 이로부터 회수된 엔도-베타-1,3-글루카나제를 이용하여 한국산 참다시마로부터 분리, 정제한 라미나린 다당류로부터 새로운 올리고당류 생성법을 제공하고자 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 재조합 pLK108S(KFCC-11303)이 삽입된 에스세리시아 콜리이(E. coli) 균주의 배양상등액 또는 이로부터 회수된 엔도-베타-1,3-글루카나제를 참다시마로부터 분리정제한 라미나린 다당류 분획에 첨가하여 효소반응시킴으로써 단시간 내에 효율적으로 참다시마 유래 올리고당을 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 상기 목적은 재조합 pLK108S(KFCC-11303)이 삽입된 에스세리시아 콜리이(E. coli) 균주의 배양상등액 또는 이로부터 회수된 엔도-베타-1,3-글루카나제를 참다시마로부터 분리정제한 라미나린 다당류 분획에 첨가하여 효소반응시킴으로써 단시간 내에 효율적으로 참다시마 유래 올리고당을 제조할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명의 구성을 설명한다.
본 발명은 참다시마 라미나린 분획을 추출하는 단계; 엔도-베타-1,3-글루카나제 효소액을 제조하고 상기 효소액에 상기 단계에서 얻은 참다시마 유래의 라미나린 분획을 첨가하여 효소반응을 시키는 단계; 상기 단계에서 얻은 가수분해 산물을 TLC와 HPLC를 이용하여 분석하여 올리고당류를 확인하는 단계; 및 상기 단계의 참다시마 유래의 올리고당류의 정장 활성을 검색하는 단계로 구성된다.
상기 목적을 달성하기 위해서 본 발명은 pLK108S(KFCC-11303)이 삽입된 에스세리시아 콜리이(E. coli) 균주의 배양상등액 또는 이로부터 회수된 엔도-베타-1,3-글루카나제를 참다시마로부터 분리정제한 라미나린 다당류 분획에 첨가하여 효소반응시킴으로써 올리고당을 제조하는 것을 특징으로 하는 참다시마 유래 올리고당의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 pLK108S(KFCC-11303)이 삽입된 에스세리시아 콜리이(E. coli) 균주의 배양상등액 또는 이로부터 회수된 엔도-베타-1,3-글루카나제를 참다시마로부터 분리정제한 라미나린 다당류 분획에 첨가하여 효소반응시킴으로써 참다시마 유래 올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 사용된 플라스미드인 pLK108S(KFCC-11303)는 β-1,3-글루카나제 DNA 절편을 서브클로닝하여 제조된 재조합 플라스미드 pLK432와 바실러스 세포에서 발현이 가능하도록 카나마이신 내성을 가지고 있는 pUB110를 각각 분리·정제하여 제한효소로 절단한 후, 두 DNA를 서로 연결하여 제조한다.
상기 기탁된 pLK108S(KFCC-11303)를 통상적인 유전공학적 방법으로 에스세리시아 콜리이(E. coli)에 도입시켜 형질전환한 후 배양하여 배양상등액을 직접 회수하거나 이로부터 엔도-베타-1,3-글루카나제를 추출한다.
상기 엔도-베타-1,3-글루카나제를 참다시마로부터 분리·정제한 라미나린 다당류 분획에 첨가하여 효소반응시켜 참다시마로부터 올리고당을 제조한다. 상기 올리고당은 주로 라미나리비오즈(G2)이고 약간은 라미나리펜타오즈(G5)이다.
이 때 바람직스럽게 상기 참다시마 유래 라미나린은 마른 다시마를 열수 추출하는 단계; 상기 추출액에 4배 용량의 에탄올을 첨가하여 침전이 생기면 5000rpm으로 20분간 원심분리하는 단계(CLP); 상기 단계의 열수 추출한 조추출물을 0.1-m2 멤브레인을 이용하여 초여과를 실시하는 단계(LP); 상기 단계에서 얻은 용액을 100kD 멤브레인을 사용하여 여과하여 고분자를 제거하는 단계; 상기 단계에서 얻은 용액을 1 kD 멤브레인을 사용하여 농축한 후 동결건조하여 참다시마의 염을 제거하는 단계; 열수추출과 미니탄 - II를 이용하여 조다당류를 10배로 농축한 후 겔여과하는 단계(LPI); 및 상기 단계의 CLP, LP 및 LP1 분획의 총 당량을 황산-페놀 에세이를 통하여 측정하고 라미나린 다당류가 포함된 분획을 정제하는 단계를 통해 얻어지는 것이 좋다. 이는 참다시마로부터 라미나린을 효율적으로 추출할 수 있는 조건이다.
상기와 같이 에스세리시아 콜리이(E. coli)로부터 발현된 엔도-베타-1,3-글루카나제는 다른 균주로부터 발현된 엔도-베타-1,3-글루카나제보다 반응시간이 빠르며, 또한 효율성이 높은 뛰어난 효과가 있다.
이하 본 발명을 다음과 같은 실시예 및 실험예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 다음의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이 것들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재조합 셔틀 플라스미드 pLK108S(KFCC-11303)의 제조
바실러스 써큐란스 IJ2001에서 유래한 β-1,3-글루칸네이즈 유전자를 유래한 β-1,3-글루칸네이즈 4.4 kb DNA 절편 중 0.8 kb를 제외하고 다시 서브클로닝(subcloning)을 실시하여, 재조합 플라스미드 pLK432를 제작하였다. Shuttle 플라스미드를 제작하기 위해서 바실러스 서브틸리스 RM125로부터 유래한 pUB110(4.5 kb Kmr)과 대장균으로부터 β-1,3-글루칸네이즈 유전자를 함유한 재조합 플라스미드(recombinant plasmid) pLK432(4.6 kb, Apr)을 각각 분리 정제하여 제한 효소 Xba Ⅰ으로 절단한 다음 두 DNA를 서로 연결(ligation) 시켰다. 연결시킨 재조합 셔틀 플라스미드의 분석 및 확인은 제한효소로 자른 DNA 절편의 아가로스 겔(agarose gel)(0.7~1.5) 전기영동을 통하여 이루어졌다. 이 재조합 셔틀 플라스미드 pLK108S는 2002년 4월 10일 기탁기관 한국미생물보존센터에 기탁번호 KFCC 11303으로 기탁되었다.
실시예 2 : 참다시마 라미나린 분획의 간편추출
마른 다시마 1kg을 고온·가압의 물로 3시간 동안 추출하였다. 추출된 조추출물(crude extract)을 4배 용량의 에탄올로 침전이 생기게 한 후 4℃에서 5000rpm으로 20분간 원심분리하였다(CLP). 이를 멸균 증류수에 녹여 1mL를 건조하여 추출 수율을 측정하였다. 열수추출한 수용성 조추출물(aqueous crude extract)을 0.1-m2 membranes를 이용하여 초여과법(ultrafiltration)을 실시하였다(LP). 고분자를 제거하기 위해서 100 kD 멤브레인(membrane)을 사용하여 여과하였고, 참다시마의 염(salt)을 제거하기 위해서 1 kD 멤브레인(membrane)을 사용하여 농축한 후 동결건조하였다. 열수추출과 Minitan-Ⅱ를 이용하여 얻은 조다당류(crude polysaccharide)를 10배로 농축한 후 XK26 컬럼(column)에 충전된 세파덱스 G-50(sephadex G-50)을 이용하여 겔여과하였다(LP1). 각각의 분획의 총 당량을 황산-페놀 에세이를 통하여 측정하고 라미나린(laminarin) 다당류가 포함된 분획을 정제하였다.
라미나린 다당체 분획은 열수추출법, 한외여과법 및 겔 여과법을 통하여 추출되었고 이를 LP1 분획이라 명명하였다(도 1). 추출된 LP1 분획의 수율은 1-2%로 나타났다. 참다시마로부터 추출한 라미나린 다당체 분획의 분자량은 표준 다당체를 사용하여 교정식을 만들고 이것을 이용하여 분석해 본 결과 평균 분자량의 범위가 5-10 kDa로 확인되었다(도 2 및 도 3).
실시예 3 : 엔도-베타-1,3-글루카나제(Endo-β-1,3-glucananse) 효소반응법
다음과 같이 효소액을 준비하여 반응시켰다.
효소액을 제조하기 위하여 에스세리시아 콜리이(E. coli) DH5a (pLK108S)를 사용하였는데, LB 액체배지를 사용하여 37℃에서 16시간 동안 진탕배양한 후 12,000rpm에서 10분간 원심분리하여 남은 박테리얼 펠렛(bacterial pellet)은 0.05M 시트르산 완충용액(pH 5.4)으로 현탁한 후 20 ㎑에서 3분간 초음파로 파쇄처리한 후 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 얻은 상등액을 효소반응에 사용하였고 기질은 라미나린 다당체 분획(1%)이 첨가된 0.05M 시트르산 완충용액(pH5.4)을 사용하였다. 엔도-베타-1,3-글루카나제(Endo-β-1,3-glucanase) 반응은 효소의 unit를 결정하고 기질 1mL를 혼합하여 55℃에서 시간대별로 반응시켰다. 환원당 측정은 3,5-디니트로살리실산(3,5-dinitrosalicylic acid; DNS)에 의한 방법에 따라 550nm에서 흡광도를 측정, 비색정량하였으며 55℃에서 1분간 1μ㏖의 환원당을 생성하는 효소량을 1 unit로 표시하였다.
엔도-베타-1,3-글루카나제 효소와 참다시마로부터 추출한 라미나린 다당체 분획을 반응시킨 후 분해 생성물을 확인해 본 결과 새로운 가수분해 양상을 나타내었다.
실시예 4. 라미나린 다당체 분획의 가수분해 산물의 분석
라미나린 다당체 분획의 가수분해 산물은 TLC와 HPLC를 이용하여 분석하였다.
먼저, TLC는 엔도-베타-1,3-글루카나제의 시간대별 반응이 끝난 후 실리카 겔 60 TLC 플레이트(silica gel 60 TLC plate)에 5㎕씩 로딩(loading)하여 수행하였다. 이때 이소아밀알코올(isoamylalchohol): 에탄올: 암모니아: 물(50:60:1:30) 혼합액을 전개용매로 사용한 후 공기 중에서 완전히 건조시키고, 5%의 메톡시벤즈알데하이드(methoxybenzaldehyde)와 5% 황산, 소량의 빙(氷)아세테이트(glacial acetate), 90% 에탄올이 혼합된 용액으로 스프레이한 후 120℃에서 15분간 반응시켰다. TLC 분석에서는 약간의 글루코즈(glucose)와 라미나리비오즈(laminaribiose) (G2)가 주요 생성물로 확인되었다(도 4).
추출한 라미나린 다당체 분획의 분자량과 효소반응 후의 가수분해 산물을 확인하기 위하여 HPLC(Agilent 1100 series) 분석을 하였다. 분자량의 확인에는 GPC 컬럼을 40℃로 사용하였다. 이때 이동상은 증류수를 사용하였고, 1mL/min의 유속으로 흘려주며 분석하였다. 분해산물의 확인에는 카보하이드레이트 NH2 컬럼(carbohydrate NH2 column)을 40℃로 사용하였고, 이때 이동상은 70% 아세토니트릴(acetonitrile; CH3CN)을 사용하였고, 0.9mL/min의 유속으로 흘려주며 분석하였다. 그 결과, TLC 분석결과와 유사하게 라미나리비오즈 (G2)를 비롯한 약간의 라미나리펜타오즈(laminaripentaose; G5)와 글루코즈(G1)를 확인하였다(도 5).
실시예 5. 참다시마 올리고당류의 정장 활성 검색
정장 활성을 검색하기 위하여 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) KCCM 11206, 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) KCCM 11027, 락토바실러스 아시도피러스(Lactobacillus acidophilus) KCTC 3179, 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) KCTC 1046, 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) KCCM 40401 및 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri) KCCM 40717을 사용하였다. 비피도박테리움(Bifidobacterium)은 RC(reinforced clostridial) [효모 추출물 3g, 쇠고기 추출물(Beef extract) 10g, 펩톤 10g, 가용성 전분 1g, 글루코즈 5g, 염산시스테인(cysteine hydrochloride) 0.5g, NaCl 5g, 아세트산나트륨 3g/L]배지를 기본으로 사용하였고, 락토바실러스(Lactobacillus)는 MRS [펩톤 10g, 쇠고기 추출물 10g, 효모 추출물 5g, 덱스트로즈 20g, 트윈(Tween) 80 1g, 시트르산 암모늄(ammonium citrate) 5g, 황산마그네슘 0.1g, 황산망간 0.05, 디포타슘 포스페이트(dipotassium phosphate) 2g/1L] 배지를 기본으로 사용하였다. 위의 기본배지에서 글루코즈 성분을 제외한 것을 carbon source free 배지로 하였고, 엔도-베타-1,3-글루카나제 효소반응에 의해 생성된 올리고당류를 첨가시킨 배지를 LOM1이라 명명하였다. 지시균주의 성장도는 혐기적으로 37℃에서 배양한 것을 665nm 흡광도로 측정하였고, 성장도에 따른 산의 생성은 pH 미터기로 측정하였다. 마지막으로 지시균주의 시간대별 올리고당류의 소비정도는 TLC로 분석하였다.
한편, 참다시마 다당체 올리고당류를 이용하여 정장 활성 기능성을 검색해 본 결과, 비피도박테리움(Bifidobacterium)과 락토바실러스(Lactobacillus) 균주 모두에서 올리고당류의 이용능을 나타내었다. 먼저, 성장률를 확인한 결과, 기본 배지에서 성장한 것을 비교해 보면 carbon free 배지에서는 약 10-20%의 성장률을 보인 반면 참다시마 올리고당류가 첨가된 배지(LOM1)에서는 40-50%의 성장률을 나타내었다(표 1). 또한, 산의 생성정도도 마찬가지로 carbon free 배지에서는 거의 생성되지 않았으나, LOM1 배지에서는 성장률에 비례해서 생성됨이 확인되었다(표 2). 마지막으로 올리고당류의 이용능을 TLC로 알아본 결과 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri) KCCM 40717과 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) KCCM 40401의 경우 배양 시간 8시간 이후부터 올리고당류가 급격히 소비됨을 확인하였다(도 6, 도 7 및 도 8). 따라서 참다시마 올리고당류는 정장 활성 기능성에 큰 효과를 나타낼 것으로 예견되며, 정장 기능성 바이오 헬스 소재로서 개발될 가능성을 보여주었다.
글루코스(대조구), 라미나린 올리고당류 혼합물(LOM1)을 포함하거나 또는 탄소원(carbon source)을 포함하지 않는 RC 또는 MRS 배지에서의 비피도박테리움과 락토바실러스의 상대 성장률 비교
균주 상대 성장률(%)
대조구 LOM1 배지 탄소원을 포함하지 않은 배지(Carbon source free medium)
비피도박테리움 인판티스 (B. infantis) KCCM 11207 100 52 8
비피도박테리움 아돌레센티스 (B. adolescentis) KCCM 11206 100 47 11
락토바실러스 퍼멘툼 (L. fermentum) KCCM 40401 100 45 19
락토바실러스 류테리 (L. reuteri) KCCM 40717 100 42 26
글루코스(대조구), 라미나린 올리고당류 혼합물(LOM1)을 포함하거나 또는 탄소원을 포함하지 않는 RC 또는 MRS 배지에서의 비피도박테리움과 락토바실러스의 산 생성 비교
균주 pH
대조구 LOM1 배지 탄소원을 포함하지 않은 배지(Carbon source free medium)
비피도박테리움 인판티스 (B. infantis) KCCM 11207 5.08 5.34 6.13
비피도박테리움 아돌레센티스 (B. adolescentis) KCCM 11206 4.82 5.43 6.07
락토바실러스 퍼멘툼(L. fermentum) KCCM 40401 5.28 6.04 6.54
락토바실러스 류테리 KCCM 40717 5.06 6.17 6.52
이상 상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명은 pLK108S(KFCC-11303)이 삽입된 에스세리시아 콜리이(E. coli) 균주의 배양상등액 또는 이로부터 회수된 엔도-베타-1,3-글루카나제를 참다시마로부터 분리정제한 라미나린 다당류 분획에 첨가하여 효소반응시킴으로써 올리고당을 제조하는 방법으로, 참다시마로부터 단시간 내에 고효율로 올리고당을 제조하는 뛰어난 효과가 있으므로 식품 및 의약산업상 매우 유용한 것이다.
도 1은 라미나린 다당체 분획의 추출과정을 보여준다.
도 2는 라미나린 다당체 분획의 겔여과 크로마토그램이다.
도 3은 라미나린 다당체 분획(LP1)의 분자량을 보여주는 HPLC 크로마토그램이다.
도 4는 에스세리시아 콜리이(E. coli) DH5α로부터 유래한 엔도-베타-1,3-글루카나제에 의해 가수분해된 참다시마 유래 라미나린의 얇은 박 크로마토그램(Thin layer chromatogram: T. L. C)이다.
도 5는 엔도-베타-1,3-글루카나제에 의해 가수분해된 참다시마 유래의 LP1 분획의 HPLC 프로파일이다.
도 6은 대조구로서 락토바실러스 류테리(L. reuteri) KCCM 40717에 의한 올리고당류의 이용능을 보여주는 TLC 결과이다. 레인 1은 대조구로서 표준 물질 글루코스(G1)와 셀로비오즈(G2)를 나타낸다. 레인 2는 1% 글루코스와 배양하기 전이고, 레인 3은 8시간 동안 배양한 후, 레인 4는 12시간 동안 배양한 후, 레인 5는 24시간 동안 배양한 후를 나타낸다.
도 7은 락토바실러스 류테리(L. reuteri) KCCM 40717에 의한 라미나린 올리고당 혼합물 1 (LOM1)의 올리고당 이용능을 보여주는 TLC 결과이다. 레인 1은 대조구로서 표준 물질 글루코스(G1)와 셀로비오즈(G2)를 나타낸다. 레인 2는 1% 글루코스와 배양하기 전이고, 레인 3은 8시간 동안 배양한 후, 레인 4는 12시간 동안 배양한 후, 레인 5는 24시간 동안 배양한 후를 나타낸다.
도 8은 락토바실러스 퍼멘툼(L. fermentum) KCCM 40401에 의한 라미나린 올리고당 혼합물 1 (LOM1)의 올리고당 이용능을 보여주는 TLC 결과이다. 레인 5는 대조구로서 표준 물질 글루코스(G1)와 셀로비오즈(G2)를 나타낸다. 레인 4는 1% 글루코스와 배양하기 전이고, 레인 3은 8시간 동안 배양한 후, 레인 2는 12시간 동안 배양한 후, 레인 1은 24시간 동안 배양한 후를 나타낸다.

Claims (4)

  1. pLK108S(KFCC-11303)이 삽입된 에스세리시아 콜리이(E. coli) 균주의 배양상등액을 참다시마로부터 분리한 라미나린에 첨가하여 효소반응시킴으로써 올리고당을 제조하는 것을 특징으로 하는 참다시마 유래 올리고당의 제조방법.
  2. pLK108S(KFCC-11303)이 삽입된 에스세리시아 콜리이(E. coli) 균주의 배양상등액으로부터 회수된 엔도-베타-1,3-글루카나제을 참다시마로부터 분리한 라미나린에 첨가하여 효소반응시킴으로써 올리고당을 제조하는 것을 특징으로 하는 참다시마 유래 올리고당의 제조방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 참다시마 유래 라미나린은
    마른 다시마를 열수 추출하는 단계;
    상기 추출액에 4배 용량의 에탄올을 첨가하여 침전물을 형성시키고 5000rpm으로 20분간 원심분리하는 단계(CLP);
    상기 단계의 열수 추출한 조추출물인 상등액을 0.1-m2 멤브레인을 이용하여 초여과를 실시하는 단계(LP);
    상기 단계에서 얻은 용액을 100kD 멤브레인을 사용하여 여과하여 고분자를 제거하는 단계;
    상기 단계에서 얻은 용액을 1 kD 멤브레인을 사용하여 농축한 후 동결건조하여 참다시마의 염을 제거하는 단계;
    열수추출과 미니탄 - II를 이용하여 조다당류를 10배로 농축한 후 겔여과하는 단계(LPI); 및
    상기 단계의 CLP, LP 및 LP1 분획의 총 당량을 황산-페놀 에세이를 통하여 측정하고 라미나린 다당류가 포함된 분획을 정제하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 참다시마 유래 올리고당의 제조방법.
  4. 제 1항 또는 제 2에 있어서, 상기 올리고당은 라미나리비오즈 또는 라미나리펜타오즈인 것을 특징으로 하는 참다시마 유래 올리고당의 제조방법.
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