PL175058B1 - Sposób wytwarzania ekstraktu opartego na zmodyfikowanych białkach bakteryjnych - Google Patents
Sposób wytwarzania ekstraktu opartego na zmodyfikowanych białkach bakteryjnychInfo
- Publication number
- PL175058B1 PL175058B1 PL93301012A PL30101293A PL175058B1 PL 175058 B1 PL175058 B1 PL 175058B1 PL 93301012 A PL93301012 A PL 93301012A PL 30101293 A PL30101293 A PL 30101293A PL 175058 B1 PL175058 B1 PL 175058B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- extract
- bacterial
- extraction
- amino acids
- bacteria
- Prior art date
Links
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 18
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 title description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 42
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 28
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims abstract description 21
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 15
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 4
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims abstract description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 3
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 claims abstract 2
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 7
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 7
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims description 3
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 20
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 4
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000001031 immunopharmacological effect Effects 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000004979 bone marrow derived macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000000713 mesentery Anatomy 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 210000001986 peyer's patch Anatomy 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DIIIISSCIXVANO-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dimethylhydrazine Chemical compound CNNC DIIIISSCIXVANO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N Aspartic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011603 BDIX rat Methods 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 206010061269 Malignant peritoneal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 1
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 150000001510 aspartic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 1
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000003191 femoral vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 1
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 1
- 150000008131 glucosides Chemical class 0.000 description 1
- 150000002307 glutamic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 239000002563 ionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 150000002829 nitrogen Chemical class 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 1
- 201000002524 peritoneal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/848—Escherichia
- Y10S435/849—Escherichia coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/851—Haemophilus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/852—Klebsiella
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/871—Neisseria
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/885—Streptococcus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/886—Streptomyces
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania ekstraktu opartego na zmodyfikowanych bialkach bakteryjnych zawierajacego mieszanine bakteryjnych kwasów polianionowych o masie czasteczkowej w granicach od 10 000 do 1 000 000 i punkcie izoelektrycznym w granicach od 2,5 do 5,5, w którym suma wagowej zawartosci skladowych aminokwasów stanowi co najmniej 50% ekstraktu, zawartosc lipopolisacharydu jest mniejsza od okolo 2 x 10-3 %, który zawiera najwyzej okolo 2% wolnych aminokwasów, najwyzej okolo 8% weglowodanów, najwyzej okolo 4% aminocukrów i najwyzej okolo 15% kwasu dezoksyrybonukleinowego i w którym wsród aminokwasów bialkowych, z których niektóre sa racemizowane, przewazaja reszty kwasu asparaginowego i glutaminowego, znamienny tym, ze obejmuje hodowanie bakterii na plynnym podlozu, zawieszanie tych bakterii w wodnym podlozu, nastepnie przeprowa- dzenie ekstrakcji alkalicznej tej zawiesiny bakteryjnej i oczyszczanie ekstraktu bakteryjnego, przy czym ekstrakcje alkaliczna przeprowadza sie w obecnosci rozcienczonego wodnego zródla jonów OH-, przy stalym pH zawierajacym sie pomiedzy 11 - 13, a spadek wartosci pH podczas ekstrakcji nie przekracza 0,4. PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania ekstraktu opartego na zmodyfikowanych białkach bakteryjnych.
Znane są już produkty bakteryjne, które wykazują działanie lecznicze i które otrzymuje się poprzez hydrolizę alkaliczną. Ze szwajcarskiego patentu nr 633 188 udzielonego zgłaszającemu, znany jest na przykład koncentrat lizatów bakteryjnych o właściwościach przeciwzakaźnych. Lizaty każdego ze szczepów bakteryjnych są otrzymywane poprzez postępującą hydrolizę alkaliczną (pH 9-10), która prowadzi do destrukcji widocznych struktur bakterii.
Obecnie, wynalazcy dowiedli, że można otrzymać ekstrakt bakteryjny posiadający różnorodne immunofarmakologiczne właściwości, takie jak na przykład bardzo ważne działanie immunomodulatorowe, wykorzystując inną obróbkę alkaliczną umożliwiającą utrzymanie nieuszkodzonych widocznych struktur bakterii. Obróbka ta polega na ekstrakcji alkalicznej w warunkach wysokiego, a przede wszystkim stałego pH.
Sposób według wynalazku obejmuje hodowanie bakterii na płynnym podłożu, zawieszanie tych bakterii w wodnym podłożu, następnie przeprowadzenie ekstrakcji alkalicznej tej zawiesiny bakteryjnej i oczyszczanie ekstraktu bakteryjnego, przy czym ekstrakcję alkaliczną przeprowadza się w obecności rozcieńczonego wodnego źródła jonów OH’ przy stałym pH zawierającym się pomiędzy 11 - 13, a spadek wartości pH podczas ekstrakcji nie przekracza 0,4.
Chemiczne traktowanie bakterii, na przykład rozcieńczonym NaOH, powoduje głębokie zmiany pierwszo-, drugo- i trzeciorzędowej struktury białek bakteryjnych. Tak więc obserwuje się częściową deaminację asparaginy i glutaminy, co sprzyja powstawaniu odpowiednio kwasu asparaginowego i glutaminowego. Podczas tego procesu może również zachodzić częściowa
175 058 racemizacja poszczególnych aminokwasów, głównie kwasu asparaginowego, seryny i argininy. Całkowite przekształcenia fizyko-chemiczne struktur białkowych dają polipeptydy, których właściwości amfoteryczne są kwasowe. Wszystkie te polipeptydy mają niskie wartości punktów izoelektrycznych w zakresie od 2,5 do 5,5 z największą koncentracją w pobliżu 4,5. Efektem tych zmian strukturalnych jest ekstrakt proteinowy, który wykazuje właściwości immunomodulatorowe in vitro i in vivo.
W ekstrakcie proteinowym wytworzonym sposobem według wynalazku, suma zawartości składników aminokwasowych stanowi co najmniej 50% (jako procent wagowy produktu liofilizowanego), korzystnie od 55 do 85%, natomiast zawartość lipopolisacharydu (LPS) jest niższa niż około 2 x 10'3<%. Ekstrakt zawiera najwyżej około 2% wolnych aminokwasów, najwyżej około 8% węglowodanów, najwyżej około 4% aminocukrów i najwyżej około 15% kwasu dezoksyrybonukleinowego. Masa cząsteczkowa składowych kwasów polianionowych jest w granicach między 10 000 a 1 000 000. Wytworzony ekstrakt proteinowy zawiera niektóre aminokwasy białkowe w konfiguracji D i L a przeważająca część grup kwasowych pochodzi z kwasu asparaginowego i glutaminowego. Główne aminokwasy, które są racemizowane to seryna, której forma z D-konfiguracją stanowi około 25% - 45%, kwas asparaginowy około 10% - 30% i arginina około 3% - 20%. Termin zmodyfikowane białka wskazuje między innymi, na obecność w ekstrakcie proteinowym aminokwasów w konfiguracji D, bowiem konfiguracja L jest naturalną formą białka.
Jako materiał lub materiały w sposobie według wynalazku mogą być użyte zasadniczo, każde Gram-dodatnie lub Gram-ujemne szczepy bakteryjne, takie jak Escherichia coli lub jeden ze szczepów bakteryjnych opisanych w powyżej wspomnianym szwajcarskim patencie nr 633 188. Korzystnie stosuje się szczep Escherichia coli, dokładnie szczep I-1147 zdeponowany zgodnie z Traktatem Budapesztańskim z 3 października 1991 w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Dr Roux, 75724 Paris Cedex 15 - France, jako źródło jonów OH' stosuje się 0,01 - 1% NaOH, pH· mieści się w granicach od 12,0 do 12,5, temperaturę ekstrakcji utrzymuje się w zakresie między 30 a 45°C, a czas ekstrakcji wynosi od kilku godzin do jednego tygodnia. Ekstrakt proteinowy otrzymany poprzez ekstrakcję alkaliczną oczyszcza się do zawartości lipopolisacharydu poniżej 2 x 10'3%, na drodze jedno- lub kilkuetapowej ultrafiltracji, traktowania niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym, chromatografii i/lub jałowej filtracji, a także liofilizacji.
Ekstrakt bakteryjny wytworzony sposobem według wynalazku nadaje się do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej, która ma własności immunomodulatorowe oraz wykazuje działanie przeciwnowotworowe. Kompozycję taką można sporządzać w formie nadającej się do wstrzyknięcia lub w postaci do podawania doustnego, doodbytniczego lub miejscowego.
Przykład
A. Etapy wstępne
Pierwotne inokulum przygotowane jest z mrożonych bakterii, pobudzonych na nowo do życia poprzez naprzemienny wzrost na płynnym podłożu takim jak tryptonowy bulion sojowy i na pożywce stałej. Zastosowanie standardowego podłoża hodowlanego i inkubacja w temperaturze 37°C ze wstrząsaniem umożliwia stopniowy wzrost objętości podłoża hodowlanego inokulum do 11. W ten sposób przygotowane wtórne inokulum przeniesiono do 20 litrowego naczynia zawierającego 51 odpowiedniej standardowej pożywki, pH = 7,0 uzyskuje się i utrzymuje np. przy pomocy 5% amoniaku, a temperaturę utrzymuje się na poziomie 37°C. Wzrost bakterii prowadzi się w kontrolowanych warunkach napowietrzania i wstrząsania, do osiągnięcia pO2 powyżej 90% nasycenia. Gęstość optyczną mierzy się przy 700 nm. Pod koniec hodowli bakterie są inaktywowane termicznie w autoklawie (30 minut w 120°C) lub przez krótkotrwałą pasteryzację (90 sekund w 105°C). Pobiera się próbkę dla sprawdzenia pod kątem obecności żywotnych bakterii.
Zawiesinę bakterii zagęszcza się oddzielając pozostałe, niewykorzystane podłoże hodowlane poprzez wirowanie lub lepiej przez ultrafiltrację tangencjalną np. przy pomocy systemu ultrafiltracyjnego typu FILTRON z zastosowaniem polisulfonowych kaset. Taką ultrafiltrację przeprowadza się w dwóch etapach: pierwszy polega na 5-, do 10-krotnym zagęszczeniu
175 058 (30 kD do 0,13 pm błon), drugi - na przemyciu poprzez diafiltrację roztworem soli fizjologicznej (3-15 objętości roztworu płuczącego).
Oznacza się suchą masę zawiesiny bakteryjnej, aby można było określić biomasę preparatu przed poddaniem go ekstrakcji alkalicznej. Końcową zawiesinę bakteryjną rozcieńcza się w roztworze soli fizjologicznej doprowadzając końcową suchą masę bakterii do 2 - 20 g/l.
B. Ekstrakcja alkaliczna
Stężenie NaOH stosowanego jako źródło jonów OH wynosiło 0,1%. Ekstrakcja przeprowadzana jest głównie w temperaturze 30 - 45°C ze wstrząsaniem, w tym przykładzie w przybliżeniu w 37°C. Podczas ekstrakcji pobierano próbki dla celów analitycznych. Te analizy obejmowały mierzenie pH, oznaczanie białek i lipopolisacharydów. Bakterie użyte do otrzymywania serii I i II były zagęszczone i przemyte (etap A) w 30 kD kasetach, podczas gdy 1000 kD kasety zastosowano w przypadku serii III. W tym przykładzie ekstrakcja alkaliczna trwała trochę mniej niż dwa dni. Wyniki obejmujące trzy serie (I, II, III) otrzymane z powyżej wspomnianym szczepem Escherichia coli podano w tabeli 1.
Tabela 1
Monitorowanie ekstrakcji alkalicznej
| Seria | Sucha masa (g/l) | Czas | PH | Białka* (mg/l) | LPS** (mg/l) |
| I | 7,4 | 0 min | 7,0 | 220 | > 100 |
| 5 min | 12,3 | 910 | 100 | ||
| 22 godz | 12,3 | 1530 | 8,0 | ||
| 46 godz | 12,3 | 1850 | 1,0 | ||
| II | 7,4 | 0 min | 7,0 | 250 | > 100 |
| 5 min | 12,4 | 870 | 100 | ||
| 22 godz | 12,4 | 1580 | 10 | ||
| 46 godz | 12,3 | 1990 | 3,3 | ||
| III | 7,0 | 0 min | 7,0 | 60 | > 100 |
| 5 min | 12,4 | 710 | 100 | ||
| 22 godz | 12,4 | 1260 | 10 | ||
| 46 godz | 12,4 | 1640 | 1,0 |
* Oznaczania białek według metody Bradforda Odniesienie: albumina z surowicy wołowej (BSA) ** Oznaczanie PS według metody LAL
Odniesienie: LPS z Escherichia coli 0111 :B4
Monitorowanie to daje później możliwość wprawniejszego określenia właściwego czasu trwania procesu ekstrakcji alkalicznej zależnego od końcowego zastosowania, typu traktowanych bakterii, jak również od warunków pH i temperatury. Ten czas jest przeważnie zawarty pomiędzy kilkoma godzinami a jednym tygodniem. Rozpatrując pH, należy podkreślić, że jedną z cech charakterystycznych tego sposobu według wynalazku jest jego stabilność, wartość pH waha się między 11 i 13, np. pomiędzy 12,0 i 12,5 ze spadkiem podczas ekstrakcji nie przekraczającym 0,4. W niniejszym przykładzie pH wynosiło 12,3 - 12,4 z maksymalnym wahnięciem podczas ekstrakcji 0,1. Ważna dodatkowa korzyść sposobu według wynalazku jest widoczna z wyników pokazanych w tabeli 1: można zauważyć, że zawartość lipopolisacharydów w otrzymanym ekstrakcie proteinowym znacząco się zmniejsza. Na końcu ekstrakcji i przed oczyszczeniem ekstraktu proteinowego przeprowadza się kontrolę mikroskopową bakterii wybarwionych metodą Grama dla sprawdzenia czy widoczne struktury bakterii pozostały nienaruszone.
C. Oczyszczanie ekstraktu proteinowego.
Ekstrakt proteinowy, otrzymany w procesie opisanym w punkcie B jest poddany etapowi ultrafiltracji: ulega zagęszczeniu 5- do 10-krotnie poprzez ultrafiltrację (1000 kD) a zasadą działaniajest ekstrakcja poprzez diafiltrację przy użyciu np. wody. Na końcu ekstrakt proteinowy jest zagęszczany poprzez ultrafiltrację (10 kD). Aby wyeliminować większość endotoksyn, w szczególności LPS ekstrakt proteinowy poddaje się procesowi przeniesienia fazowego przy
175 058 użyciu niejonowego środka powierzchniowo czynnego. Np. proces ten może być przeprowadzony w obecności Tritonu X-144 7%, w temperaturze w przybliżeniu 60°C przy wstrząsaniu około 20 min. Po rozdzieleniu się faz, faza niższa (Triton + LPS) jest odrzucana. Wyższa faza wodna zawierająca ekstrakt proteinowy jest zbierana, a pH jest doprowadzane do 7. Fazę wodną poddaje się chromatografii anionowymiennej w celu dalszego zmniejszenia zawartości LPS i usunięcia jonowego środka powierzchniowo czynnego. Można w tym celu zastosować np. chromatografię na żelu DEAE-Sepharose. Faza wodna zawierająca ekstrakt proteinowy jest jako pierwsza absorbowana na żywicy anionowymiennej, po czym makrocząsteczki, które nie zostały zatrzymane, są eliminowane a przemywanie przy niskim pH usuwa zanieczyszczenia. Po zrównoważeniu żelu przy obojętnym pH, wypłukuje się ekstrakt proteinowy przez zwiększenie siły jonowej, eluat zagęszcza się w wyniku ultrafiltracji i przemywa diafiltrując wodą. Ekstrakt proteinowy tak oczyszczony jest poddawany jałowej filtracji i jeśli jest taka konieczność, liofilizowany sposobem ogólnie stosowanym.
Biochemiczne analizy i testy immunofarmakologiczne były przeprowadzane na produkcie liofilizowanym. Oznaczanie aminokwasów racemizowanych podczas ekstrakcji alkalicznej przeprowadzono według Nimura N. i Kinoshita T., J. Chromatography, 352, 169-177, 1986. Różne racematy znalezione w ekstrakcie proteinowym (seria I, II, III) podane są tytułem przykładu w tabeli 2 i są wyrażone jako procenty konfiguracji D.
Tabela 2
Racemizowane aminokwasy
| Parametry | Procent konfiguracji D | ||
| Serie | I | II | III |
| Racemizowane aminokwasy: | |||
| Kwas asparaginowy | 18 | 18 | 20 |
| Seryna | 33 | 35 | 12 |
| Arginina | 10 | 12 |
Nie uległy racemizacji: alanina, tyrozyna, walina, fenyloalanina i leucyna.
Nie wykryto: kwasu glutaminowego, treoniny, proliny, metioniny, izoleucyny, cysteiny, lizyny, histydyny i tryptofanu.
Wyniki analityczne podano w tabeli 3.
Tabela 3
Składniki liofilizowanego produktu
| Parametry | Procent liofilizowanego produktu | ||
| Seria | I | n | III |
| Zawartość białka: | |||
| Białka (Bradford) | 69,2 | 70,14 | 63,1 |
| Aminokwasy białkowe: | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| Asparagina i kwas asparaginowy | 7,3 | 7,6 | 7,1 |
| Glutamina i kwas glutaminowy | 9,6 | 9,5 | 8,9 |
| Seryna | 2,6 | 2,4 | 2,2 |
| Treonina | 2,9 | 3,2 | 2,3 |
| Glicyna | 3,8 | 3,9 | 3,3 |
| Alanina | 5,9 | 5,6 | 5,6 |
| Arginina | 4,8 | 4,6 | 5,3 |
| Prolina | 2,5 | 2,4 | 2,5 |
| Walina | 4,9 | 5,0 | 4,4 |
| Metionina | 3,1 | 4,0 | 3,4 |
| Izoleucyna | 4,1 | 4,0 | 3,5 |
| Leucyna | 6,3 | 6,3 | 5,9 |
| Fenyloalanina | 3,3 | 3,3 | 3,3 |
175 058
| cd tabeli 3 | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| Cystyna | ND | ND | ND |
| Lizyna | 5,0 | 4,9 | 4,7 |
| Histydyna | 1,6 | 1,9 | 1,9 |
| Tyrozyna | 3,9 | 4,0 | 3,9 |
| Ogółem | 71,7 | 72,6 | 68,1 |
| Frakcje powiązane z białkami | |||
| Kwasy tłuszczowe | 0,9 | 0,9 | 1,0 |
| Glukozydy | 3,9 | 3,6 | 4,7 |
| Aminocukry | 1,8 | 1,5 | 2,8 |
| Inne: | |||
| Lipopolisacharydy (LPS) | 6,1 χΙΟ^ | 8,4x10-4 | 2,5x10-4 |
| Kwasy dezoksyrybonukleinowe (DNA) | 9,5 | 6,1 | 4,5 |
| Wolne aminokwasy | ND | ND | ND |
| Woda | 4,8 | 4,9 | 4,8 |
| Analizy elementarne | |||
| Popiół | 6,0 | 7,5 | 7,2 |
| Węgiel | 47,1 | 47,0 | 46,3 |
| Wodór | 6,7 | 6,7 | 6,6 |
| Azot | 13,6 | 14,0 | 13,6 |
| Siarka | 1,3 | 1,4 | 1,8 |
ND = nie wykryto
Właściwości Immunofarmakologiczne
Jasno wykazano, w szczególności przy użyciu testów in vitro i in vivo na modelu zwierzęcym, że ekstrakt proteinowy wytworzony sposobem według wynalazku, ma właściwości immunomodulatorowe i działanie przeciwnowotworowe.
1. Test immunologiczne in vitro
Testy immunologiczne in vitro zostały przeprowadzone na makrofagach otrzymanych ze szpiku kostnego i na limfocytach ze śledziony, kępek Peyera lub gruczołów krezkowych myszy C57BL/6.
Modele makrofagowe: Ekstrakt proteinowy stymuluje zdolność makrofagów do aktywowania oksydacyjnego metabolizmu glukozy w cyklu fosfopentozowym i aktywuje produkcję metabolitów azotowych (test azotynowy). Wydzielania TNF a także produkcja prostaglandyn (PGE2) w makrofagach stymulowane jest przez ekstrakt proteinowy.
Test azotynowy, podany tytułem przykładu, został przeprowadzony według Marietta M. A., Biochemistry, 27, 8706 - 8711,1988. Makrofagi otrzymane ze szpiku kostnego były hodowane na mikropłytkach (70 000 makrofagów na studzienkę) w obecności różnych stężeń ekstraktu proteinowego (0,1 do 50 pg ekstraktu/ml) lub lipopolisacharydów Escherichia coli stosowanych jako pozytywna kontrola (0,0004 do 0,2 pg LPS/ml). Produkcja NO2 w supematantach kultur makrofagowych jest oznaczona przy użyciu odczynnika Griessa według Nauel J. i in., Int. J. Immunopharmac., 11,637 - 645, 1989.
Tabela 4
Wyniki testu azotynowego
| gg ekstraktu/ml | nmoli NOż/mi | gg LPS/ml | nmoli NO2 |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| 0 | <0,02 | 0 | <0,02 |
| 0,1 | 0,9 ±0,1 | 0,0004 | 0,1 ±0,1 |
| 0,39 | 4,1 ±0,1 | 0,0016 | 0,3 ±0,1 |
| 1,56 | 7,7 ± 0,2 | 0,0063 | 4,2 ±0,1 |
| 6,25 | 10,8 ± 0,2 | 0,025 | 6,5 ± 0,4 |
175 058
| cd tabeli 4 | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| 25,0 | 13,1 ±0,8 | 0,1 | 7,1 ± 1,0 |
| 50,0 | 15,1 ±0,3 | 0,2 | 8,3 ±0,2 |
Wyniki dla różnych stężeń testowanego produktu wyrażone są w tabeli 4 liczbą nmoli NO2/ml supernatantu komórkowego jako funkcja stężenia ekstraktu lub LPS. Ekstrakt proteinowy indukuje silną produkcję NO2.
Modele limfocytowe:
Limfocyty ze śledziony, kępek Peyera lub gruczołów krezkowych były hodowane na mikropłytkach (5 x 105 komórek na studzienkę) w standardowych warunkach hodowlanych w różnych stężeniach ekstraktu proteinowego (1 do 100 gg ekstraktu/ml) lub w różnych stężeniach polisacharydu E. coli w kontrolach pozytywnych (1 -100 gg LPS/ml). Proliferacja komórkowa indukowana produktami określonajest poziomem wbudowywania tymidyny znakowanej trytem do DNA komórek, według Louis J. and col., EUR. J. Immunol., 9, 841 - 847, 1979. Amplitudę stymulacji limfocytów proteinowym ekstraktem porównuje się, w tych samych stężeniach, z kontrolą pozytywną dla 3 źródeł limfocytów. Ekstrakt proteinowy działa już w stężeniu 1 gg/ekstraktu/ml i wykazuje maksymalną aktywność pomiędzy 30 i 100 gg ekstraktu/ml.
Test immunologiczny in vivo
Przeciwnowotworowe działanie ekstraktu proteinowego zademonstrowano in vivo na modelu raka otrzewnowego wywołanego u szczurów BDIX.
Stosowane komórki: Komórki Pro b zostały sklonowane z hodowli linii K 12, którą wyizolowano z guza DHD wywołanego dwumetylohydrazyną u pokrewnych szczurów BD IX według Martin F. and col., Int. J. Cancer, 32, 623 - 627, 1983.
Indukcja nowotworów otrzewnowych: Komórki Pro b wprowadzone poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe do syngenicznych szczurów (106 komórek/szczur) dają wzrost po ok. 10 dniach w postaci wielu stałych guzów, które pojawiają się w sieci lub w krezce na plamkach mlecznych, po czym rozprzestrzeniają się w jamie otrzewnowej, jak opisano przez Lagadec P. and col., Invasion and Metastasis, 7,83 - 95,1987.4-5 tygodni później pojawia się wodobrzusze i wszystkie szczury zdychają w ciągu 8-12 tygodni.
Indukcja przerzutów do płuc: Wstrzyknięcie 7 x 106 komórek Pro b do żyły udowej powoduje przerzuty do płatów płucnych i wszystkie szczury zdychają w ciągu 6-10 tygodni.
Leczenie nowotworów płucnego i otrzewnowego: Immunoterapię rozpoczyna się 14 dni po wstrzyknięciu komórek nowotworowych, gdy nowotwór zaczyna być widoczny dla oka. Leczenie polega na wprowadzeniu ekstraktu proteinowego poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe w ilości 10 mg na kg wagi ciała. Całościowo szczury otrzymują 5 zastrzyków w odstępach co 3 - 5 dni. Każdy eksperyment uwzględnia grupę kontrolną i grupę badaną składającą się z 10 (lub 12) szczurów oznaczonych numerami.
Wyniki: Szczury są zabijane w 6 tygodni po wstrzyknięciu komórek, po czym przeprowadza się sekcję zwłok. Masę guza otrzewnowego oszacowano pobieżnie gdy szczury zaatakowane były rozrastającym się nowotworem. Skala zrakowacenia jest ustalona na podstawie liczby i wielkości obserwowanych guzów. Rozmiar wodobrzusza szacowany jest w oparciu o podwójne ważenie. Klasyfikację guzów płuc przeprowadzono po badaniach mikroskopowych płuc szczurów dzieląc je na te, które miały guzy i te, u których ich nie stwierdzono.
Otrzymane wyniki wykazują, że w 8 eksperymentach przeprowadzonych na 82 leczonych szczurach u 41 szczurów sekcja nie wykazała żadnych guzów (40 - 60% szczurów biorących udział w doświadczeniu): u pozostałych szczurów wzrost guzków został znacząco zatrzymany. Ponadto, 78 spośród 82 leczonych szczurów nie miało wodobrzusza. Wszystkie nieleczone szczury miały nowotwory i wodobrzusze. Wyniki te są porównywalne z wynikami otrzymanymi w doświadczeniu na przeżycie: z 10 szczurów leczonych ekstraktem proteinowym, 3 szczury przeżyły 10, 18 i 27 miesięcy po wstrzyknięciu komórek rakowych i w sekcji nie stwierdzono nowotworu. Wszystkie szczury z grupy kontrolnej zginęły z powodu raka 3 miesiące po wstrzyknięciu komórek. Ponadto, wyniki otrzymane w dwóch doświadczeniach na wzrost guzów
175 058 płuc umożliwiły wykazanie, że ekstrakt proteinowy ma efekt ogólnoustrojowy. Z 20 szczurów leczonych przy pomocy wstrzyknięcia dootrzewnowego, 13 wykazało kompletne zahamowanie wzrostu guzów płuc. Przeciwnowotworowe działanie ekstraktu proteinowego stwierdzono na guzach indukowanych komórkami nowotworowymi okrężnicy, a także nowotworów rozsianych. Nie stwierdzono toksyczności w trakcie leczenia.
3. Toksyczność ostra
Toksyczność ekstraktu proteinowego jest niską. Poszczególne dawki sięgają do 300 mg na kg wagi ciała podawane poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe są dobrze tolerowane przez myszy.
4. Podawanie
Ekstrakt proteinowy podaje się przez wstrzyknięcie, najlepiej dootrzewnowe, liofilizowanego produktu rozpuszczone np. w soli fizjologicznej.
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 2,00 zł
Claims (3)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania ekstraktu opartego na zmodyfikowanych białkach bakteryjnych zawierającego mieszaninę bakteryjnych kwasów polianionowych o masie cząsteczkowej w granicach od 10 000 do 1 000 000 i punkcie izoelektrycznym w granicach od 2,5 do 5,5, w którym suma wagowej zawartości składowych aminokwasów stanowi co najmniej 50% ekstraktu, zawartość lipopolisacharydu jest mniejsza od około 2 x 103%, który zawiera najwyżej około 2% wolnych aminokwasów, najwyżej około 8% węglowodanów, najwyżej około 4% aminocukrów i najwyżej około 15% kwasu dezoksyrybonukleinowego i w którym wśród aminokwasów białkowych, z których niektóre są racemizowane, przeważają reszty kwasu asparaginowego i glutaminowego, znamienny tym, że obejmuje hodowanie bakterii na płynnym podłożu, zawieszanie tych bakterii w wodnym podłożu, następnie przeprowadzenie ekstrakcji alkalicznej tej zawiesiny bakteryjnej i oczyszczanie ekstraktu bakteryjnego, przy czym ekstrakcję alkaliczną przeprowadza się w obecności rozcieńczonego wodnego źródła jonów OH’, przy stałym pH zawierającym się pomiędzy 11 -13, a spadek wartości pH podczas ekstrakcji nie przekracza 0,4.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hoduje się bakterie Escherichia coli, zwłaszcza szczep I-1147 zdeponowany w Instytucie Pasteura, a jako źródło jonów OH- stosuje się 0,01 -1% NaOH, pH mieści się w granicach od 12,0 do 12,5, temperaturę ekstrakcji utrzymuje się w zakresie między 30 a 45°C, a czas ekstrakcji wynosi od kilku godzin do jednego tygodnia.
- 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekstrakt białkowy otrzymany poprzez ekstrakcję alkaliczną oczyszcza się do zawartości lipopolisacharydu poniżej 2 x 10'3%, na drodze jedno- lub kilkuetapowej ultrafiltracji, traktowania niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym, chromatografii i/lub jałowej filtracji, a także liofilizacji.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH450/92A CH685498A5 (fr) | 1992-02-14 | 1992-02-14 | Extrait de macromolécules bactériennes, procédé pour sa préparation et composition pharmaceutique contenant cet extrait. |
| PCT/CH1993/000029 WO1993016190A1 (fr) | 1992-02-14 | 1993-02-03 | Extrait de macromolecules bacteriennes, procede pour sa preparation et composition pharmaceutique contenant cet extrait |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL301012A1 PL301012A1 (en) | 1994-04-05 |
| PL175058B1 true PL175058B1 (pl) | 1998-10-30 |
Family
ID=4187312
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL93301012A PL175058B1 (pl) | 1992-02-14 | 1993-02-03 | Sposób wytwarzania ekstraktu opartego na zmodyfikowanych białkach bakteryjnych |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5424287A (pl) |
| EP (1) | EP0580829B1 (pl) |
| JP (1) | JPH06507077A (pl) |
| AT (1) | ATE160588T1 (pl) |
| BR (1) | BR9304205A (pl) |
| CA (1) | CA2106854A1 (pl) |
| CH (1) | CH685498A5 (pl) |
| CZ (1) | CZ282924B6 (pl) |
| DE (1) | DE69315388T2 (pl) |
| DK (1) | DK0580829T3 (pl) |
| ES (1) | ES2111149T3 (pl) |
| GR (1) | GR3025882T3 (pl) |
| HU (1) | HU215262B (pl) |
| PL (1) | PL175058B1 (pl) |
| RO (1) | RO117621B1 (pl) |
| SK (1) | SK279877B6 (pl) |
| WO (1) | WO1993016190A1 (pl) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2703587B1 (fr) | 1993-04-06 | 1995-06-16 | Oreal | Composition cosmetique coloree. |
| US5747663A (en) | 1994-02-07 | 1998-05-05 | Qiagen Gmbh | Process for the depletion or removal of endotoxins |
| DE19710255A1 (de) * | 1997-03-13 | 1998-09-17 | Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg | Verwendung einer Lösung zur Desaktivierung von Endotoxinen |
| FR2842208B1 (fr) * | 2002-07-10 | 2004-10-22 | Lco Sante | Extraits membranaires de klebsiella presentant des proprietes avantageuses, et procede de production de ces extraits |
| EP2059258B1 (en) * | 2006-09-08 | 2019-11-13 | Wyeth LLC | Arginine wash in protein purification using affinity chromatography |
| AU2013200193B2 (en) * | 2007-03-05 | 2015-04-23 | Om Pharma | Bacterial extract for digestive or urinary tract disorders and process for its preparation |
| AU2013202504B2 (en) * | 2007-03-05 | 2014-09-11 | Om Pharma | Bacterial extract for respiratory disorders and process for its preparation |
| PL2114421T3 (pl) * | 2007-03-05 | 2018-07-31 | Om Pharma | Ekstrakt bakteryjny do stosowania względem zaburzeń oddechowych i sposób jego wytwarzania |
| EP3332806A1 (en) * | 2007-03-05 | 2018-06-13 | OM Pharma | Bacterial extract for digestive or urinary tract disorders and process for its preparation |
| US20100055082A1 (en) * | 2008-09-04 | 2010-03-04 | Jacques Alain Bauer | Immunomodulatory extracts from lactobacillus bacteria and methods of manufacturing and use thereof |
| CN102617703A (zh) * | 2012-04-14 | 2012-08-01 | 拜明(苏州)生物技术有限公司 | 一种无需裂解高效提取发酵细菌中外源表达蛋白的方法 |
| JP2014200194A (ja) * | 2013-04-04 | 2014-10-27 | 浜松ホトニクス株式会社 | 細胞から細胞小器官又はタンパク質を回収する方法 |
| KR20210141546A (ko) | 2019-03-14 | 2021-11-23 | 옴 파르마 에스아 | 안정한 박테리아 추출물 제조 공정 및 이의 약제로서의 용도 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2405298A1 (fr) * | 1977-01-27 | 1979-05-04 | Cassenne Lab Sa | Nouvelles glycoproteines isolees d'escherichia coli, procede de preparation et application de medicaments |
| FR2396018A1 (fr) * | 1977-07-01 | 1979-01-26 | Cassenne Lab Sa | Nouveaux glycopeptides acetyles hydrosolubles extraits de corps microbiens lyses d'escherichia coli, procede de preparation et application a titre de medicaments de ces produits |
| CH633188A5 (fr) * | 1978-05-26 | 1982-11-30 | Om Laboratoires Sa | Medicament contre des maladies infectieuses des voies respiratoires. |
-
1992
- 1992-02-14 CH CH450/92A patent/CH685498A5/fr not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-02-03 US US08/119,124 patent/US5424287A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-02-03 RO RO93-01371A patent/RO117621B1/ro unknown
- 1993-02-03 DE DE69315388T patent/DE69315388T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-02-03 PL PL93301012A patent/PL175058B1/pl unknown
- 1993-02-03 WO PCT/CH1993/000029 patent/WO1993016190A1/fr active IP Right Grant
- 1993-02-03 AT AT93902023T patent/ATE160588T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-02-03 HU HU9302893A patent/HU215262B/hu not_active IP Right Cessation
- 1993-02-03 SK SK1111-93A patent/SK279877B6/sk unknown
- 1993-02-03 DK DK93902023T patent/DK0580829T3/da active
- 1993-02-03 JP JP5513639A patent/JPH06507077A/ja active Pending
- 1993-02-03 ES ES93902023T patent/ES2111149T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-02-03 BR BR9304205A patent/BR9304205A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-02-03 CA CA002106854A patent/CA2106854A1/en not_active Abandoned
- 1993-02-03 CZ CZ932064A patent/CZ282924B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1993-02-03 EP EP93902023A patent/EP0580829B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-01-14 GR GR980400055T patent/GR3025882T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5424287A (en) | 1995-06-13 |
| DE69315388D1 (de) | 1998-01-08 |
| PL301012A1 (en) | 1994-04-05 |
| HU9302893D0 (en) | 1994-01-28 |
| SK279877B6 (sk) | 1999-05-07 |
| CZ282924B6 (cs) | 1997-11-12 |
| DE69315388T2 (de) | 1998-05-14 |
| EP0580829A1 (fr) | 1994-02-02 |
| CA2106854A1 (en) | 1993-08-15 |
| HU215262B (hu) | 1998-11-30 |
| GR3025882T3 (en) | 1998-04-30 |
| CH685498A5 (fr) | 1995-07-31 |
| HUT70268A (en) | 1995-09-28 |
| SK111193A3 (en) | 1994-03-09 |
| EP0580829B1 (fr) | 1997-11-26 |
| DK0580829T3 (da) | 1998-08-10 |
| ATE160588T1 (de) | 1997-12-15 |
| CZ206493A3 (en) | 1994-04-13 |
| ES2111149T3 (es) | 1998-03-01 |
| RO117621B1 (ro) | 2002-05-30 |
| BR9304205A (pt) | 1994-08-02 |
| WO1993016190A1 (fr) | 1993-08-19 |
| JPH06507077A (ja) | 1994-08-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL175058B1 (pl) | Sposób wytwarzania ekstraktu opartego na zmodyfikowanych białkach bakteryjnych | |
| Bach et al. | Purification and characterization of bovine tissue factor. | |
| Marchesi | [25] Isolation of spectrin from erythrocyte membranes | |
| AU568265B2 (en) | Process for preparation of a biologically active extract | |
| Kao et al. | The characterization of C-phycocyanin from an extremely halo-tolerant blue–green alga, Coccochloris elabens | |
| Orr et al. | Characteristics of the chemotactic response of neoplastic cells to a factor derived from the fifth component of complement. | |
| Foulds | Purification and partial characterization of a bacteriocin from Serratia marcescens | |
| EP0132125B1 (en) | A protein having antitumor activity | |
| Donta et al. | Chicken pepsinogens and pepsins. Their isolation and properties | |
| Khairallah et al. | A vasopressor lipid in incubated plasma | |
| Gräsbeck et al. | The vitamin B12-binding protein in human saliva isolation, characterization and comparison with the unpurified protein | |
| Gilligan et al. | Nutritional requirements for synthesis of heat-labile enterotoxin by enterotoxigenic strains of Escherichia coli | |
| Inouye et al. | Development-specific protein S of Myxococcus xanthus: purification and characterization | |
| Gotto et al. | The structure and properties of human beta-lipoprotein and beta-apoprotein | |
| He et al. | Changes in the secondary structures and zeta potential of soybean peptide and its calcium complexes in different solution environments | |
| Schubert | Association of Protein Fractions and Lipids from Human Erythrocyte Membranes, II. Studies on a Loosely Bound Protein Fraction | |
| Bas et al. | Purification and properties of staphylocoagulase | |
| Cecchini et al. | Reconstitution of neutral amino acid transport from partially purified membrane components from Ehrlich ascites tumor cells | |
| CA1105863A (en) | Biologically active substance | |
| Gaudreau et al. | The distribution of iron in iron-enriched cells of Saccharomyces cerevisiae | |
| Dive et al. | Use of hemoglobin enzymic hydrolysates, prepared on a pilot-plant scale, as a nitrogen source for the cultivation of three species of Tetrahymena | |
| Takata et al. | Morphogenesis of the tail fibre of bacteriophage T4: isolation and characterization of a component (the gene 34 product) | |
| CN117843718B (zh) | 一种蛋源双功能生物活性肽及其制备方法和应用 | |
| Azuma et al. | Effect of bound phosphate on the calcium-binding ability and calcium-dependent precipitability of human β-casein | |
| US4588685A (en) | Process for the preparation of a new-type active substance selectively inhibiting food intake |