PL171704B1

PL171704B1 - Sposób wytwarzania srodka farmaceutycznego do leczenia lub profilaktyki zacmy PL

Info

Publication number: PL171704B1
Application number: PL93306093A
Authority: PL
Inventors: Mitsuyoshi Azuma; Yoshimasa Abe; Shunji Sogo
Original assignee: Senju Pharma Co; Senju Pharmaceutical Coltd
Priority date: 1992-05-20
Filing date: 1993-05-17
Publication date: 1997-06-30
Also published as: WO1993023032A1; EP0641563A4; RU94046058A; HUT71250A; HU9403321D0; BG99197A; CN1084061A; CA2135302A1; PL306093A1; BR9306387A; EP0641563A1; MX9302924A

Abstract

1. Sposób wytwarzania srodka farmaceutycznego do leczenia lub profilaktyki zacmy, znamienny tym, ze miesza sie co najmniej jeden zwiazek wybrany z grupy obejmujacej kwas (+ )-(2S,3S)-3-[(S)-3-metylo-1-(3-metylobutylokarbamoilo)buty- lokarbamoilo]-2-oksiranokarboksylowy, jego sól i jego ester etylowy z wodnym rozpuszczalnikiem i przed lub po wymieszaniu zwiazku nastawia sie tak pH wodnego roztworu, ze pH ostatecznego preparatu wynosi od 3 do 7. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania środka farmaceutycznego stanowiącego kwas (+)-(2S,3S)-3-[(S)-3-metylo-1-(3-metylo-butylokarbamoilo)butylokarbamoilo]-2-oksiranokarboksylowy (poniżej określana jako E-64c), jego sól (poniżej określana jako sól E-64c) lub jego ester etylowy (poniżej określany jako E-64d), przydatnego w leczeniu lub profilaktyce zaćmy.

Zaćma jest chorobą, w której soczewka staje się mętna na skutek różnych czynników, objawiająca się zaburzeniami wzroku spowodowanego rozproszeniem światła wywołanym przez zmętnienie soczewki, gdyż na skutek rozproszenia nie mogą powstać normalne obrazy na siatkówce.

W zależności od przyczyn zaćmy dzieli się na zaćmę wrodzoną, zaćmę starczą, zaćmę powikłaną, zaćmę urazową, zaćmę cukrzycową itp.; znana jest również zaćma popromienna, zaćma hutników szkła itp., przy czym wszystkie zaćmy stanowią poważne choroby oczu, którym towarzyszy pogorszenie wzroku na skutek zmętnienia soczewki. Dotychczas zaćmę leczono podając różne środki farmaceutyczne takie jak antychinoidy (np. pirenoksynę), środki odgrywające rolę w syntezie glutationu (np. cysteinę), środki zawierające grupy SH (np. tioproninę), inhibitory reduktazy aldozowej (np. tolrestan) itp. Jednakże podawanie takich środków nie daje w pełni zadawalających wyników, częściowo na skutek wyraźnie powolnego metabolizmu soczewki. W efekcie leczenie zaćmy ogranicza się obecnie do zabiegów chirurgicznych. Leczenie chirurgiczne polega na przemieszczeniu zmętnienia wewnątrz gałki ocznej lub na wyłuszczeniu całej soczewki z gałki ocznej. Obydwie metody są uciążliwe dla pacjentów, gdyz nieodwracalnie związane są z nimi nacięcia i szycia rogówki oraz rany cięte soczewki, nawet jeśli przeprowadza się operację zgodnie z uznaną techniką chirurgiczną.

Czynnik powodujący zaćmę jest w dalszym ciągu nieznany, z tym że uważa się, że z chorobą tą związane jest utlenianie, rozkład i aglutynacja krystalicznego białka, a ponadto w soczewkach, w których rozwija się zmętnienie, zaobserwowano wzrost ilości wapnia [Invest. Ophthalmol., 13, 204-209 (1974)].

Doniesiono, że trans-epoksysukcynylo-leucyloamido-(4-guanidyno)butan (poniżej określany jako E-64), będący inhibitorem kalpainy, proteazy cysteinowej występującej w soczewce uaktywnionej przez wapń, może zapobiegać zmętnieniu soczewki w przypadku modeli zaćmy starczej i modeli zaćmy cukrzycowej w postaci hodowanych soczewek szczura [Atarashii Ganka, 6, 1573-1576 (1989)]. Niestety E-64 wywiera tak słabe działanie w leczeniu zaćmy, że nie ma praktycznego znaczenia. Stwierdzono również, ze E-64c, inhibitor syntezy proteazy cy steinowej, jego sól i E-64d są skutecznymi lekami przy ostrym uszkodzeniu ośrodkowym układu nerwowego spowodowanego przez ostre uszkodzenie i/lub przy zaburzeniach krążeniowych mózgu i rdzenia kręgowego, co związane jest z ich działaniem inhibitującym na proteazę cysteinową (publikacja niebadanego patentu japońskiego nr 255 423 (1987).

W świetle powyższych danych przeprowadzono szeroko zakrojone poszukiwania ulepszonego środka do leczenia lub profilaktyki zaćmy, oraz sposobu jego wytwarzania, stwierdzając, że E-64c, sól E-64c i E-64d nieoczekiwanie wykazują doskonałą skuteczność w leczeniu i profilaktyce zaćmy, oraz ustalono sposób wytwarzania środka do leczenia lub profilaktyki zaćmy, zawierający taki związek jako składnik aktywny. Stwierdzono również, że E-64c, sól E-64c i E-64d mogą łatwo przenikać przez rogówkę i wykazują działanie farmakologiczne przy pH w zakresie od 3 do 7, a ponadto że E-64d jest wyjątkowo trwały w takim zakresie pH; doprowadziło to do opracowania wynalazku.

Sposób wytwarzania środka farmaceutycznego do leczenia lub profilaktyki zaćmy, polega na tym, że miesza się co najmniej jeden związek wybrany z grupy obejmującej kwas (+)- (2S,3S)-3-[(S)-3-metylo-1-(3-metylobutylokarbamoilo)butylokarbamoilo]-2oksiranokarboksylowy, jego sól i jego ester etylowy z wodnym rozpuszczalnikiem i przed lub po wymieszaniu związku nastawia się tak pH wodnego roztworu, że pH ostatecznego preparatu wynosi od 3 do 7.

E-64c i E-64d określone są wzorem

Spośród związków o powyższym wzorze związkiem, w którym R oznacza atom wodoru, jest E-64c, a związkiem, w którym R oznacza etyl, jest E-64d.

Rodzaj soli w przypadku soli E-64c nie jest specjalnie ograniczony, o ile jest to sól farmaceutycznie dopuszczalna; przykładowo wymienić można sól z metalem alkalicznym taką jak sól sodowa lub potasowa, sól z metalem ziem alkalicznych taką jak sól wapniowa lub barowa, sól z zasadowym aminokwasem takim jak lizyna lub arginina albo sól z aminą taką jak dimetyloamina lub trietyloamina.

E-64c, sól E-64c i E-64d można łatwo wytworzyć np. sposobem ujawnionym w publikacji niebadanego patentu japońskiego nr 115 878/1980 (patent USA nr 4 382 889).

E-64c, sól E-64-c i E-64d, wykazują doskonałe działanie hamujące zmętnienie soczewki, o czym świadczą podane niżej przykłady doświadczalne, tak że można je stosować jako skuteczne środki farmaceutyczne w leczeniu lub profilaktyce zaćmy. Środki takie można podawać doustnie lub pozajelitowo.

Do przykładowych podłoży kropli do oczu należą rozpuszczalniki wodne takie jak sterylna oczyszczona woda, sól fizjologiczna i bufor.

W przypadku kropli do oczu jako składnik aktywny korzystnie stosuje się E-64d, gdyż związek ten łatwo przenika przez rogówkę i jest szybko hydrolizowany w oku przez enzymy do E-64c, związku aktywnego, wykazując pożądane działanie lecznicze i profilaktyczne.

pH kropli do oczu wynosi zazwyczaj od 3 do 7, korzystnie od 4 do 6, a jeszcze korzystniej od 4,5 do 5,5. Gdy pH jest niższe od 3, pojawiają się skutki uboczne takie jak zaburzenia w

171 704 tkance ocznej, a związek staje się nietrwały, podczas gdy przy pH powyżej 7 trwałość związku spada w sposób niepożądany.

E-64c, sól E-64c i E-64d można rozpuścić w wodnym rozpuszczalniku jako podłożu.

Poniżej podano przykładowe dodatki wprowadzane do kropli do oczu.

Do buforów należy, np. bufor fosforanowy, bufor boranowy, bufor cytrynianowy, bufor winianowy, bufor octowy i aminokwas. Korzystnie bufor wykazuje zdolność buforowania w zakresie pH 2-9.

Do środków zapewniających izotoniczność należą np. cukry takie jak sorbitol, glukoza i mannitol, alkohole wielowodorotlenowe takie jak gliceryna, glikol polietylenowy i glikol propylenowy, oraz sole takie jak chlorek sodowy.

Do środków konserwujących należy np. chlorek benzalkoniowy, chlorek benzetoniowy, p-hydroksybenzoesany takie jak p-hydroksybenzoesan metylu i p-hydroksybenzoesan etylu, alkohol benzylowy, alkohol fenyloetylowy, kwas sorbinowy i jego sól, timerozal i chlorobutanol.

Do środków zagęszczających należy np. hydroksyetyloceluloza, hydroksypropyloceluloza, metyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza oraz karboksymetyloceluloza i jej sole.

Do solubilizatorów (stabilizatorów) należą np. rozpuszczalne w wodzie polimery takie jak cyklodekstryny i poliwinylopirolidon oraz środki powierzchniowo czynne takie jak Polysorbate 80 (monooleanian sorbitanu polioksyetylenowany 20 cząsteczkami tlenku etylenu).

Do środków chelatujących należy np. sól disodowa EDTA, cytrynian sodowy i skondensowany fosforan sodowy (ΧΝΑ2Ο yPzOs).

Do środków zawieszających należą np. środki powierzchniowo czynne takie jak Polysorbate 80 i rozpuszczalne w wodzie polimery takie jak metyloceluloza sodowa, hydroksypropylometyloceluloza oraz metyloceluloza.

Krople do oczu wytwarzać można w wyniku zmieszania podłoża takiego jak rozpuszczalnik wodny, dodatków wymienionych powyżej i co najmniej jednego związku wybranego z grupy obejmującej E-64c, sól E-64c i E-64d, w odpowiedniej kolejności, oraz doprowadzenia pH mieszaniny do 3 - 7, a następnie sterylizacji.

Stosuje się konwencjonalne sposoby sterylizacji, takie jak sterylizacja na drodze filtracji, sterylizacja wysokociśnieniową parą wodną i sterylizacja przepływającą parą wodną. Korzystny sposób sterylizacji stanowi filtracja przez filtr membranowy 0,22 μm.

Krople do oczu, w których związek został rozpuszczony, korzystnie wytwarza się wprowadzając do podłoża dodatki i co najmniej jeden związek aktywny wybrany z grupy obejmującej E-64c, sól E-64c i E-64d w odpowiedniej kolejności i doprowadzając pH do 3 - 7. Przy stosowaniu buforu pH korzystnie doprowadza się do 4 - 6 po dodaniu buforu wykazującego zdolność buforowania przy pH w zakresie 2-9.

Krople do oczu, w których związek został zawieszony, korzystnie wytwarza się wprowadzając dodatki do podłoża, doprowadzając pH do 3 - 7, sterylizując uzyskany roztwór i dodając odrębnie sterylizowany związek. Przy stosowaniu buforu pH korzystnie doprowadza się do 4 - 6 po dodaniu buforu wykazującego zdolność buforowania przy pH w zakresie 2 - 9.

Stosować można zwykłe środki do nastawiania pH, takie jak np. kwas solny, kwas octowy, kwas fosforowy, wodorotlenek sodowy i wodorotlenek amonowy, a korzystnie IN kwas solny i IN wodorotlenek sodowy.

Jakkolwiek ilość związku wybranego z grupy obejmującej E-64c, sól E-64c i E-64d, obecnego w środku do leczenia zaćmy zmienia się w zależności od rodzaju wybranego związku, postaci leku itp. to korzystnie ilość ta wynosi około 0,001 - 10% wag./objęt., ajeszcze korzystniej 0,01 - 1% wag./objęt. W przypadku kropli do oczu i 0,001 - 10% wag., ajeszcze korzystniej 0,01 - 1% wagowych w przypadku maści do oczu.

Gdy E-64c, sól E-64c lub E-64d stosuje się jako środek do leczenia zaćmy, dawka zmienia się w zależności od rodzaju stosowanego związku, wieku pacjenta, wagi ciała, objawów, postaci leku itp. Gdy środek podaje się dorosłej osobie chorej na zaćmę, związek może być w postaci roztworu lub zawiesiny do oczu o stężeniu około 0,001 - 10% wag./objęt., korzystnie około

171 704

0,01 - 1% wag./objęt., podawanego 3-5 razy dziennie w dawce jednej lub kilku kropli na raz.

Środek do leczenia zaćmy otrzymany sposobem według wynalazku może zawierać jeden lub więcej innych środków do leczenia zaćmy takich jak antyutleniacze (np. pirenoksyna), środki odgrywające rolę w syntezie glutationu (np. cysteinę), środki zawierające grupy SH (np. tioproninę), inhibitory reduktazy aldozowej (np. tolrestan) itp. w odpowiednich kombinacjach, w takich ilościach, aby nie naruszyć przedmiotu wynalazku.

Środek do leczenia zaćmy wytwarzany sposobem według wynalazku zapewnia doskonałe wyniki w leczeniu i profilaktyce różnych rodzajów.

Na figurach 1A i 1B przedstawiono wykres ilustrujący wpływ E-64c przy podawaniu dootrzewnowym szczurom oraz wprowadzania E-64d na zaćmę galaktozową u szczurów.

Na figurze 2 przedstawiono wykres ilustrujący działanie hamujące E-64 i E-64d na wywołanąjonoforem wapniowym zaćmę w hodowanych soczewkach szczurów w porównaniu z działaniem hamującym na zmętnienie soczewek w grupie kontrolnej.

Wynalazek szczegółowo opisują podane poniżej przykłady i przykłady doświadczalne, które jednak nie ograniczają zakresu wynalazku.

Przykład I. Lek do oczu w postaci zawiesiny.

Wytworzono lek do oczu w postaci zawiesiny zgodnie z następującą recepturą:

E-64d	1 g
Polialkohol winylowy	0,5 g
12-hydrat monowodorofosforanu sodowego	0,5 g
Dihydrat diwodorofosforanu sodowego	0,2 g
Sól disodowa EDTA	0,02 g
Chlorek sodowy	0,7 g
Chlorek benzalkoniowy	0,007 g
Sterylna oczyszczona woda	odpowiednia ilość
Łącznie	100 ml

Sposób wytwarzania. Polialkohol winylowy (0,5 g), 12-hydrat monowodorofosforanu sodowego (0,5 g), dihydrat diwodorofosforanu sodowego (0,2 g), sól disodową EDTA (0,02 g), chlorek sodowy (0,7 g) i chlorek benzalkoniowy (0,007 g) rozpuszczono w 80 ml sterylnej oczyszczonej wody, uzupełniono sterylną oczyszczoną wodą do objętości 100 ml i przesączono w celu wysterylizowania przez filtr membranowy (0,22 gm) uzyskując roztwór (pH 6). W roztworze zawieszono uprzednio wysterylizowany E-64d (1 g) uzyskując lek do oczu w postaci zawiesiny.

Przykład II. Lek do oczu w postaci roztworu.

Wytworzono lek do oczu w postaci roztworu zgodnie z następującą recepturą:

E-64c	0,1 g
Kwas borowy	1.7 g
Tetraboran sodowy	0,4 g
Sól disodowa EDTA	0,02 g
Chlorek benzalkoniowy	0,005 g
Sterylna oczyszczona woda	odpowiednia ilość
Łącznie	100 ml

171 704

Sposób wytwarzania. Kwas borowy (1,7 g), tetraboran sodowy (0,4 g), sól disodową EDTA (0,02 g), chlorek benzalkoniowy (0,005 g) i E-64c (0,1 g) rozpuszczono w sterylnej oczyszczonej wodzie, uzupełniono sterylną oczyszczoną wodą do objętości 100 ml i przesączono w celu wysterylizowania przez filtr membranowy (0,22 pm) uzyskując lek do oczu w postaci roztworu (pH 7).

Przykład III. Lek ao oczu w postaci roztworu.

Wytworzono lek do oczu w postaci roztworu zgodnie z następującą recepturą:

E-64c	1g
Octan sodowy	0,05 g
Chlorek sodowy	0,9 g
p-hydroksybenzoesan metylu	0,026 g
p-hydroksybenzoesan propylu	0,014 g
1N kwas solny	odpowiednia ilość
Sterylna oczyszczona woda	odpowiednia ilość
Łącznie	100 ml

Sposób wytwarzania.

Sterylną oczyszczoną wodę (80 ml) ogrzano do około 80°C i rozpuszczono w niej p-hydroksybenzoesan metylu (0,026 g) i p-hydroksybenzoesan propylu (0,014 g). Po schłodzeniu roztworu do temperatury pokojowej rozpuszczono w nim octan sodowy (0,05 g), chlorek sodowy (0,9 g) i E-64c (1 g), po czym pH roztworu nastawiono na 5 1N kwasem solnym. Roztwór uzupełniono sterylną oczyszczoną wodą do objętości 100 ml i przesączono w celu wysterylizowania przez filtr membranowy (0,22 pm) uzyskując lek do oczu w postaci roztworu.

Przykład IV. Lek do oczu w postaci roztworu.

Wytworzono lek do oczu w postaci roztworu zgodnie z następującą recepturą:

E-64c	1g
Diwodorofosforan sodowy	0,1 g
Gliceryna	2,6 g
Sól disodową EDTA	0,01 g
Chlorek benzalkoniowy	0,005 g
1N kwas solny	odpowiednia ilość
Sterylna oczyszczona woda	odpowiednia ilość
Łącznie	100 ml

Sposób wytwarzania. Diwodorofosforan sodowy (0,1 g), glicerynę (2,6 g), sól disodową EDTA (0,01 g), chlorek benzalkoniowy (0,005 g) i E-64c (1 g) rozpuszczono w sterylnej oczyszczonej wodzie (80 ml) i pH roztworu nastawiono na 6 IN kwasem solnym. Roztwór uzupełniono sterylną oczyszczoną wodą do objętości 100 ml i przesączono w celu wysterylizowania przez filtr membranowy (0,22 pm) uzyskując lek do oczu w postaci roztworu.

Przykład V. Lek do oczu w postaci zawiesiny.

Wytworzono lek do oczu w postaci zawiesiny zgodnie z następującą recepturą:

E-64d	1g
Kwas ε-aminokapronowy	0,1 g
Chlorek sodowy	0,9g
Polysorbate 80	0,1 g
Chlorek benzalkoniowy	0,005 g
IN kwas solny	odpowiednia ilość
Sterylna oczyszczona woda	odpowiednia ilość
Łącznie	100 ml

Sposób wytwarzania. Kwas ε-aminokapronowy (0,1 g), chlorek sodowy (0,9 g), Polysorbate 80 (0,1 g) i chlorek benzalkoniowy (0,05 g) rozpuszczono w 80 ml sterylnej oczyszczonej wody i pH roztworu nastawiono na pH 5 IN kwasem solnym. Roztwór uzupełniono sterylną oczyszczoną wodą do objętości 100 ml i przesączono w celu wysterylizowania przez filtr membranowy (0,22 gm). W roztworze zawieszono uprzednio wysterylizowany E-64d (1 g) uzyskując lek do oczu w postaci zawiesiny.

Przykład VI. Lek do oczu w postaci zawiesiny.

Wytworzono lek do oczu w postaci zawiesiny zgodnie z następującą recepturą:

E-64d	1g
Octan sodowy	0,05 g
Chlorek sodowy	0,9g
p-hydroksybenzoesan metylu	0,026 g
p-hydroksybenzoesan propylu	0,014 g
IN kwas solny	odpowiednia ilość
Sterylna oczyszczona woda	odpowiednia ilość
Łącznie	100 ml

Sposób wytwarzania. Sterylną oczyszczoną wodę (80 ml) ogrzano do około 80°C i rozpuszczono w niej p-hydroksybenzoesan metylu (0,026 g) i p-hydroksybenzoesan propylu (0,014 g). Po schłodzeniu roztworu do temperatury pokojowej rozpuszczono w mm octan sodowy (0,05 g) i chlorek sodowy (0,9), po czym pH roztworu nastawiono na 4 IN kwasem solnym. Roztwór uzupełniono sterylną oczyszczoną wodą do objętości 100 ml i przesączono w celu wysterylizowania przez filtr membranowy (0,22 gm). W roztworze zawieszono uprzednio wysterylizowany E-64d (1 g) uzyskując lek do oczu w postaci zawiesiny.

Poniżej opisano testy farmakologiczne i wyniki wykazujące skuteczność środka do leczenia zaćmy otrzymanego sposobem według wynalazku.

Przykład doświadczalny 1. Wpływ dootrzewnowego podawania E-64c i wprowadzania E-64d na zaćmę galaktozową u szczurów.

3-tygodniowe samce szczurów SD (n = 30) hodowano w pomieszczeniu do hodowli w temperaturze 24 ± 4°C przy wilgotności 55 ±15%, na karmie podstawowej Labo MR (produkowanej przez Nihon Nosan Kogyo Co., Ltd., Japonia) i wodzie wodociągowej.

Jako badane leki zastosowano (1)1% roztwór E-64c otrzymany w wyniku rozpuszczenia proszku E-64c w 0,1N wodorotlenku sodowym, nastawienia pH na 5 0,1 N kwasem solnym i dodania wody oczyszczonej; oraz (2) 1% zawiesinę E-64d otrzymaną w wyniku zawieszenia proszku E-64d w 0,3% Tween 80, przy czym ciśnienie osmotyczne obydwu preparatów nastawiono chlorkiem sodowym na 290 mosmów/kg H2O. Jako środek kontrolny (3) zastosowano sól fizjologiczną.

Zwierzęta do badań hodowano wstępnie przez tydzień, po czym hodowano je na 25% karmie galaktozowej (zestalony produkt w postaci mieszaniny galaktozy 1 karmy podstawowej Labo MR w stosunku 1:3). Zwierzęta karmiono przez 24 godziny przez pierwsze 7 dni oraz przez 9 godzin począwszy od dnia ósmego. Badane leki podawano od dnia, w którym rozpoczęto karmienie galaktozowe, przy czym (1) podawano dootrzewnowo raz dziennie (100 mg/kg, 1 ml cieczy/l 00 g), a (2) wprowadzano tylko do prawego oka 4 razy dziennie w ilości 5 pl za każdym razem, nic nie wprowadzając do lewego oka. Grupie kontrolnej podawano (3) w taki sam sposób jak (2), nic nie wprowadzając do lewego oka.

Soczewki obserwowano przy rozszerzonych źrenicach stosując lampę szczelinową (SL-50) w 7-dniowych odstępach od rozpoczęcia podawania badanego leku i soli fizjologicznej (próba kontrolna) aż do 28 dnia, oceniając rozwój zaćmy az do zaćmy dojrzałej, zgodnie z następującymi 8 stopniami stadiów zaćmy, zdefiniowanymi przez Sippela [Invest. Ophthalmol., 6, 568-575 (1966)].

Stopień	Rozwój zaćmy
0	Klarowna
0,5	Stopniowa wakuolizacja pasma równikowego
1	Stopniowa wakuolizacja 1β kory przedniej
1,5	Stopniowa wakuolizacja 2/3 kory przedniej
2	Stale powiększanie się 1 zlewanie wodmczek
3	Równomierna opalescencja lub tylne zmętnienie
4	Zaćma jądrowa
5	Całkowite zmętnienie

Udział każdego stadium w czasie obserwacji zaćmy u badanych zwierząt, którym podawano sól fizjologiczną lub odpowiednie badane leki (E-64c lub E-64d) przedstawiono na fig. 1A i B. Na fig. 1 A, B na osi rzędnych przedstawiono udział każdego stadium w stopniach Sippela w odpowiednich okresach obserwacji, przy czym znaczącą różnicę w porównaniu z grupą kontrolną wyrażono jako + ; 0,05< P<0,10, *; P,0,01.

Jak to wynika z fig. 1 A, B, badania metodą Wilcoxona pot w i erdziły, że znaczne opóźnienie zaćmy zaobserwowano w ciągu 14 dni od rozpoczęcia podawania w przypadku grupy, której podawano E-64c; w przypadku grupy, której podawano E-64d, zaobserwowano znaczne opóźnienie zaćmy w ciągu 7 i 14 dni oraz tendencję opóźniającą w ciągu 21 dni od rozpoczęcia podawania. Analiza wariancyjna serii czasowych potwierdziła, że u grup, którym podawano E-64c lub E-64d, występuje znaczne opóźnienie zaćmy w porównaniu z grupą kontrolną.

Przykład doświadczalny 2. Wpływ E-64d na wywołaną jonoforem wapniowym zaćmę w hodowanych soczewkach szczurów.

Soczewki wycięto 4-tygodniowym samcom szczurów S. D. i hodowano je przez 1 dzień w (1) podstawowym ośrodku hodowlanym (MEM), (2) w ośrodku hodowlanym (1) uzupełnionym 10 pm jonoforem wapniowym (A23187) lub (3) w ośrodku hodowlanym (2) uzupełnionym 4, 20, 100 lub 500 pM E-64 albo E-64d, Następnie ośrodki zmieniono stosując (1) ośrodek podstawowy, (2) ośrodek podstawowy i (3) ośrodek podstawowy z dodatkiem E-64 lub E-64d w różnych stężeniach i hodowlę kontynuowano przez 4 dni, po czym zmętnienie soczewek zmierzono za pomocą analizatora obrazu.

Stosunek inhibitowania pojawienia się zmętnienia soczewek przez każdy z leków (E-64 lub E-64d) w odniesieniu do grupy kontolnej przedstawiono na fig. 2. Na fig. 2 na osi odciętych

171 704 podano stężenie każdego leku w ośrodku hodowli (μΜ), a na osi rzędnych podano w procentach stopień zahamowania zmętnienia soczewki przez każdy z badanych leków w odniesieniu do zmętnienia w grupie kontrolnej.

Jak to wynika z danych przedstawionych na fig. 2 E-64 i E-64d hamują zmętnienie soczewek wywołane przez jonofor wapniowy w stopniu zależnym od stężenia. Działanie opóźniające było silniejsze w przypadku E-64d niż E-64, a zmętnienie soczewek zostało zahamowane w 50% lub w większym stopniu przy stężeniu 20 μΜ.

Przykład doświadczalny 3. Wpływ dootrzewnowego podawania E-64d na zaćmę u myszy Nakano.

myszy Nakano (9-dniowych) podzielono na 3 grupy i każdej grupie podawano dootrzewnowo raz dziennie E-64d w dawce 30 lub 100 mg/kg, albo 5% roztwór gumy arabskiej (w próbie kontrolnej). E-64d zawieszono w 5% roztworze gumy arabskiej odpowiednio w stężeniu 0,15 lub 0,5% i podawano myszom. Po otwarciu oczu obserwowano zmętnienie soczewek z wykorzystaniem lampy szczelinowej, w celu ocenienia rozwoju zaćmy.

W efekcie w grupie kontrolnej stwierdzono zmętnienie jądra soczewki u 21-dmowych myszy, u około 40% osobników. W przeciwieństwie do powyższego w grupie, której podawano E-64d (30 mg/kg) stwierdzono zmętnienie jądrowe u około 12% osobników, a w grupie, której podawano E-64d w dawce 100 mg/kg nie zaobserwowano rozwoju zmętnienia. Obserwacje prowadzone w czasie wykazały, że graniczne zmętnienie jądrowe w grupie, której podawano E-64d jest mniejsze niż w grupie kontrolnej.

Przykład doświadczalny 4. Wpływ pH na przenikanie E-64c przez rogówkę (in vitro).

Przenikanie przez rogówkę zbadano in vitro stosując celkę permeacyjną z przepuszczalną ścianką boczną, w którą wstawiono rogówkę białego królika. 1 % roztwór E-64c w buforze o składzie podanym poniżej wprowadzono do komory donorowej, a sam bufor wprowadzono do komory receptorowej. Celkę termostatowano w 34°C. Mierzono zmiany ilości E-64c przenikającego do komory receptorowej w czasie. Określono sumaryczną ilość E-64c przenikającego w ciągu 1,2 i 3 godzin. Stwierdzono, że E-64c przenika przez rogówkę przy pH me przekraczającym 7, przy czym przenikanie jest zależne od pH. Przy pH 3 lub poniżej zaobserwowano zaburzenia tkanek powodujące zmętnienie rogówki.

Skład buforu

Chlorek wapniowy	0,175 g
Chlorek potasowy	0,4 g
Siarczan magnezowy	0,4 g
Diwodorofosforan sodowy	0,187 g
Chlorek sodowy	7,97 g
Glukoza	1 g
Woda oczyszczona	1000 ml

Tabela 1.

Przenikanie E-64c przez rogówkę (in vitro)

	2 Przenikanie (ąg/cm )
1 godzina	2 godziny	3 godziny
pH 7	1,69	6,15	13,78
pH 5	63,9	309,6	611,6
pH 3	145,6	790,4	1479,9

171 704

Przykład doświadczalny 5. Wpływ pH na przenikanie E-64d przez rogówkę (in vitro).

W taki sam sposób jak w przykładzie doświadczalnym 4 zbadano przenikanie 1% zawiesiny E-64d (pH 7) przez rogówkę.

Nie wykryto E-64d w roztworze receptorowym, natomiast obecność E-64c powstałego w wyniku hydrolizy E-64d przez enzymy zawarte w rogówce stwierdzono natychmiast po rozpoczęciu doświadczenia. Ilość E-64c powstałego w wyniku metabolizmu w komorze receptorowej po 20 minutach, 1 godzinie, 2 godzinach i 3 godzinach wynosiła odpowiednio 2,8, 5,6, 10,3 i 21,4 pg/cm².

Przykład doświadczalny 6. Wpływ pH na stabilność E-64d.

Zbadano stabilność 1% zawiesin E-64d doprowadzonych do różnych pH. Wyniki testów stabilności podano w tabeli 2. Stwierdzono, że E-64d jest stabilny w zakresie pH 4-6.

Tabela 2 Stabilność E-64d

	Pozostałość (%)
40° C (4 tygodnie)	60° C (1 tydzień)
pH 4	96,6	98,7
pH 5	99,8	98,7
pH 6	95,2	97,9
pH 7	75,7

171 704

FIG. 1 B

w 28 dni później

Y///A stadium 4 stadium 5

171 704 <u i F I Ο. 2

V

Si -H

Stężenie badanych leków w ośrodku hodowlanym l^yM) *— E-64

E-64d

RIO. 1

l ------1 stadium 0,5 lllllllllllllll stadium 1 stadium 1,5 stadium 2

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania środka farmaceutycznego do leczenia lub profilaktyki zaćmy, znamienny tym, ze miesza się co najmniej jeden związek wybrany z grupy obejmującej kwas (+)-(2S,3S)-3-[(S)-3-metylo-1-(3-metylobutylokarbamoilo)butylokarbamoilo]-2oksiranokarboksylowy, jego sól i jego ester etylowy z wodnym rozpuszczalnikiem i przed lub po wymieszaniu związku nastawia się tak pH wodnego roztworu, że pH ostatecznego preparatu wynosi od 3 do 7.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nastawia się tak pH wodnego rozpuszczalnika, że pH ostatecznego preparatu wynosi od 4 do 6.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w dodatkowym etapie pH ostatecznego preparatu nastawia się na 4 - 6 po dodaniu buforu wykazującego zdolność buforowania przy pH w zakresie 2-9.
4. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 3, znamienny tym, że dodatkowo przeprowadza się sterylizację.