PL167750B1 - Sorbent do pozaustrojowego usuwania lipoprotein o niskiej gęstości z krwi lub osocza ludzkiego i sposób jego wytwarzania - Google Patents

Abstract

1. Sorbent do pozaustrojowego usuwania lipoprotein o niskiej gęstości z krwi lub osocza ludzkiego, znamiennytym, że stanowi go zżelowana i ewentualnie usieciowanapektyna, polimer kwasu galakturonowego - naturalny polisacharyd pochodzenia roślinnego, o stopniu estryfikacji grup kwasowych do 80% łańcucha polimeru, przy czym sorbent ma rozmiary porów od 20 do 200 nm. 7. Sposób otrzymywania sorbentu do pozaustrojowego usuwania lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) z krwi lub osocza ludzkiego, z ewentualnym wykorzystaniem reakcjisieciowania za pomocą dwufunkcyjnych, związków chemicznych o wzorze X-R-Y, gdzie X i Y oznaczają atom chlorowca, grupę aldehydową lub grupę epoksydową, a R jest grupą alifatyczną o 3 -10 atomach węgla, znamienny tym, że pektynę o stopniu estryfikacji do 80%, korzystnie od 10 do 50%, poddaje się żelowaniujonami metali dwuwartościowych, dodającjej roztwór kroplami do roztworujonów metali dwuwartościowych, korzystnie magnezu, wapnia lub manganu, fromującjedocześnie odpowiednią postać fizyczną sorbentu, po czym sorbent ewentualnie sieciuje się dwufunkcyjnym związkiem chemicznym w znany sposób.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sorbent do pozaustrojowego usuwania lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) z krwi lub osocza ludzkiego, oparty na naturalnych surowcach pochodzenia roślinnego oraz sposób jego wytwarzania.

Jednym z przejawów zaburzeń przemiany lipidowej w organizmie człowiekajest podwyższenie poziomu frakcji lipoprotein o niskiej gęstości (LDL). Choroba ta polegająca na całkowitym braku lub drastycznym ograniczeniu liczby receptorów komórkowych na LDL znana jest pod nazwą hipercholeetedolemii rodzinnej (FH). Skutkiem klinicznym tej dolegliwości jest wczesna (już w drugiej dekadzie życia) miażdżyca tętnic prowadząca do śmierci w wyniku zawału serca często przed trzydziestym rokiem życia.

Jedną z klinicznie stosowanych metod leczenia FH jest pozaustrojowe usuwanie nadmiaru LDL z krwi lub osocza ludzkiego za pomocą odpowiednich sorbentów.

Generalnie stosowane sorbenty dzieli się na: specyficzne i selektywne.

Pierwsza grupa to sorbenty, których działanie opiera się na wykorzystaniu reakcji przeciwciało-antygen, zachodzącej między cząsteczką LDL a przeciwciałem anty-LDL, zaczep^ nym na stałym nośniku. Sorbenty tego typu nie znalazły jak dotąd szerokiego zastosowania w

167 750 3 praktyce klinicznej zarówno ze względu na wysokie koszty produkcji (wytwarzanie i oczyszczanie przeciwciał), jak i ciągle niedopracowaną technologię zaczepiania przeciwciał na nośniku.

Ze względu na surowce, drugą grupę sorbentów podzielić można na: sorbenty syntetyczne i sorbenty naturalne.

Sorbenty syntetyczne bazują na przemysłowo otrzymywanych polimerach syntetycznych. Pod kątem zastosowania do pozaustrojowego usuwania LDL z osocza lub krwi ludzkiej badano takie polimery syntetyczne jak: sulfonowany alkohol poliwinylowy, poliakryl. Jednakże ze względu na nienajlepszą biozgodność tych materiałów z krwią, do tej pory sorbenty te nie są stosowane w praktyce klinicznej.

Znacznie lepsze własności biozgodności przejawiają polimery naturalne od lat stosowane w medycynie takie jak: heparyna, agaroza czy celuloza i ich pochodne. Próby skonstruowania sorbentu anty-LDL na bazie heparyny zakończyły się niepowodzeniem. Praktycznie jedynym obecnie stosowanym klinicznie sorbentem tego typu jest japoński sorbent LA-40 orazjego analogi. Jest to materiał, w którym substancją aktywną wobec LDL jest dekstran sulfonowany naniesiony na celulozę. Z prowadzonych badań wynika jednak, że obecne na powierzchni sorbentu grupy sulfonowe, odpowiedzialne za sorpcję LDL, powodują także niekorzystne skutki uboczne. W związku z tym konieczne było znalezienie innego polimeru naturalnego, o dobrej biozgodności z krwią, zawierającego jednocześnie odpowiednią liczbę ujemnie naładowanych grup funkcyjnych o mniejszej gęstości ładunku ujemnego, umożliwiającego sorpcję LDL.

Z opisu patentowego RP nr 129 670 znany jest sposób wytwarzania materiału filtracyjnego do papierosów, polegający na sieciowaniu epichlorohydryną naturalnych polimerów takich jak celuloza, skrobia lub dekstran, w których rozprowadza się różne metale: jedno, dwu i więcej wartościowe, służące do pochłaniania określonych substancji z dymu tytoniowego. Materiał ten ma zarówno budowę chemiczną jak i fizyczną wykluczającą zastosowanie go do technik krążenia pozaustrojowego.

Nieoczekiwanie okazało się, że możliwe jest otrzymanie sposobem według wynalazku nowego sorbentu opartego na polimerze pochodzenia roślinnego, o dobrej biozgodności z krwią, zawierającego jednocześnie odpowiednią liczbę ujemnie naładowanych grup funkcyjnych, umożliwiającego skuteczną sorpcję LDL.

Sorbent według wynalazku charakteryzuje się tym, że stanowią go pektyny, polisacharydy pochodzenia roślinnego, korzystnie otrzymywane z jabłek lub cytryn, będące polimerami kwasu galakturonowego, o stopniu estryfikacji grup kwasowych do 80% łańcucha polimeru, zżelowane i ewentualnie usieciowane w taki sposób, że rozmiary porów wynoszą 20 do 200 nm.

Sposób wytwarzania sorbentu według wynalazku polega na tym, że pektyny o stopniu estryfikacji do 80% poddaje się żelowaniu w układzie hydrofitowym w obecności jonów metali dwuwartościowych, korzystnie magnezu, wapnia lub manganu, z jednoczesnym formowaniem odpowiedniej postaci fizycznej adsorbentu, po czym sorbent ewentualnie sieciuje się za pomocą powszechnie znanych dwufunkcyjnych związków chemicznych o wzorze X-R-Y, gdzie X i Y oznaczają atom chlorowca, grupę aldehydową lub grupę epoxy a R jest grupą alifatyczną, zawierającą od 3 do 10 atomów węgla.

Jako dwufunkcyjne związki chemiczne o wzorze X-R-Y stosuje się korzystnie 1,3-dichloro-2propanol, glutaraldehyd, epichlorohydrynę, dibromopropanol, 1,2,3,4-diepoxybutan.

Istotę wynalazku stanowi zastosowanie naturalnych polimerów kwasu galakturonowego (znanych pod nazwą pektyn) w postaci odpowiednio spreparowanego hydrożelu, jako adsorbentu lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) oraz preparatyka takiego adsorbentu.

Sorbent według wynalazku charakteryzuje się tym, że stanowi go zżelowana i usieciowana pektyna o stopniu estryfikacji grup kwasowych do 80% łańcucha, a sorbent ma rozmiary porów od 20 do 200 nm.

Preparatyka pektynowego sorbentu anty-LDL według wynalazku obejmuje dwa zasadnicze etapy:

- żelowanie pektyny i nadanie odpowiedniej postaci fizycznej sorbentu,

- ewentualne sieciowanie produktu, mające na celu utrwalenie struktury i zabezpieczenie przed rozpuszczaniem w środowisku działania sorbentu.

167 750

Żelowanie prowadzi się w układzie wodnym w obecności niewielkiej ilości jonów metali dwuwartościowych (Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺). Etap ten obejmuje jednocześnie formowanie odpowiedniej postaci fizycznej adsorbentu. Może on występować w postaci: jednolitej granulki żelu pektynowego, włókna zżelowanej pektyny lub powłoki żelu pektynowego powlekającej stały, obojętny nośnik.

Etap drugi, czyli ewentualne sieciowanie, prowadzony może być za pomocą powszechnie stosowanych, dwufunkcyjnych związków chemicznych o wzorze X-R-Y, gdzie X i Y oznaczają atom chlorowca, grupę aldehydową lub grupę epoxy a R jest grupą alifatyczną, zawierającą od 3 do 10 atomów węgla. Jako przykłady tego typu związków mogą służyć: 1,3-dichloro-2-propanol, glutaraldehyd, epichlorohydryna, dibromopropanol, 1,2,3,4-diepoxybutan i inne.

Zarówno etap pierwszy jak i drugi mają zasadniczy wpływ na efekt końcowy, czyli zdolność sorpcyjną otrzymanego sorbentu oraz jego selektywność w stosunku do LDL.

Dobór odpowiednich warunków żelowania jest uzależniony od stopnia estryfikacji wyjściowego surowca, a jednocześnie wpływa na zdolność sorpcyjną sorbentu. Stwierdzono, że przy zastosowaniu pektyny o stopniu estryfikacji od 10 do 70 optymalne stężenia jonów metali dwuwartościowych wynoszą od 10% do 0,01%.

Jeżeli omawiany adsorbent anty-LDL stosowany ma być w postaci jednolitych kulek, lub powłoki naniesionej na obojętnym nośniku wielkość ziarna powinna wahać się w granicach od 0,1 mm do 1,0 mm, a grubość naniesionej powłoki żelu pektynowego od 0,1 jmdo 10 /jm.

Optymalizacja procesu sieciowania polega na otrzymaniu materiału nierozpuszczalnego, dostatecznie twardego o odpowiedniej porowatości. Wielkość porów ma fundamentalne znaczenie zarówno dla wydajności jak i selektywności otrzymanego sorbentu. Parametr ten ma swoje odbicie w stopniu spęcznienia, charakterystycznym dla danego sorbentu. Stwierdzono, że najlepsze rezultaty otrzymano, gdy sorbent jest tak usieciowany, że po wysuszeniu stosunek masy mokrej do suchej wynosi od 10 do 75 g/g.

Otrzymany adsorbent po sterylizacji może być umieszczony w kolumnie, przez którą przepuszczane jest osocze lub krew, z którego ma być usunięta frakcja LDL. Ilość sorbentu potrzebna do usunięcia nadmiaru LDL w trakcie jednego zabiegu silnie zależy od powierzchni właściwej ziaren, stopnia sieciowania oraz stopnia estryfikacji wyjściowego surowca.

Sposób według wynalazku opisano w następujących poniżej przykładach, nieograniczających jego zakresu.

Przykład I. Żelowanie sorbentu pektynowego w postaci jednolitych kulek.

Do 200 ml 10% wodnego roztworu CaCl2 dodawano kroplami wodny roztwór zawierający 2,5% pektyny i 30% cukru. Żel pozostawiono w roztworze żelującym około 30 minut, a następnie odsączono i przemyto.

Sieciowanie żelu pektynowego.

Do przemytego wodą destylowaną żelu pektynowego dodano równoważną objętościowo ilość mieszaniny epichlorohydryny w 1M roztworu NaOH. Całość ogrzewano do temperatury 60°C. Reakcję prowadzono 2 godziny. Następnie żel odsączono, przemyto wodą destylowaną i dwukrotnie wygotowano w etanolu. Otrzymano nierozpuszczalny w wodzie sorbent w postaci jednolitych kulek, w którym ilość zestryfikowanych grup wynosiła 45%, o rozmiarach porów 35 nm. Po wysuszeniu stosunek masy mokrej do masy suchej wynosił 40 g/g.

Przykładu. Badanie zdolności sorpcyjnej otrzymanego materiału.

g sorbentu, otrzymanego w przykładzie I wytrząsano z 2 ml osocza w łaźni wodnej o temperaturze 37°C w ciągu 30 minut. Cholesterol całkowity (TC), frakcję lipoprotein o niskiej gęstości (LDL), lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL) oraz trójglicerydy (TG) oznaczano metodą enzymatyczną przed i po wytrząsaniu. Badanie przeprowadzono na osoczu o różnym początkowym stężeniu cholesterolu całkowitego (TC). Wyniki zamieszczono w tabeli 1.

Tabela 1

TC [mg %] początkowe	TC% związany	TG % związany	LDL % związany	HDL % związany
229	48	39	54	NS
308	54	47	63	NS
350	66	56	79	NS

NS - zmiana nieistotna

167 750

Przykład III. Żelowanie sorbentu pektynowego w postaci jednolitych kulek.

Do 200 ml 1% wodnego roztworu CaCh dodawano kroplami 5% roztwór nieestryfikowanej pektyny rozpuszczonej w mieszaninie woda—DMSO w stosunku 1:1. Żel pozostawiono w roztwo•*r-,A Azxl *· 1 ł Zł /łT’złA Zł lz 1 Zł O f\ WS « 11 4* Λ ·*% Zł Zł ł Zł Zł zł Zł Zł r*T<^** Zł « ··» a /łzvłł Zł Zł 4- Zł Zł 1 Zł ł^ł < 1 CTfg «· Zł rr+TT , Zł Ził »Vł rze żelującym około 30 minut., a następnie odsączono i przemyto etanolem i 17% toztwoicm wodnym NaCl.

Przykład IV. Badanie zdolności sorpcyjnej otrzymanego materiału.

g sorbentu, otrzymanego w przykładzie III wytrząsano z 2 ml osocza w łaźni wodnej o temperaturze 37°C w ciągu 30 minut. Cholesterol całkowity (TC), frakcję lipoprotein o niskiej gęstości (LDL), lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL) oraz trójglicerydy (TG) oznaczano metodą enzymatyczną przed i po wytrząsaniu. Badanie przeprowadzono na osoczu o różnym początkowym stężeniu cholesterolu całkowitego (TC). Wyniki zamieszczono w tabeli 2.

Tabela 2

TC [mg %] początkowe	TC% związany	TG % związany	LDL % związany	HDL % związany
229	48	39	54	NS
308	54	47	63	NS
350	66	56	79	• NS

NS - zmiana nieistotna

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł

Claims (9)

Zastrzeżenia patentowe

1. Sorbent do pozaustrojowego usuwania lipoprotein o niskiej gęstości z krwi lub osocza ludzkiego, znamienny tym, że stanowi go zżelowana i ewentualnie usieciowana pektyna, polimer kwasu galakturonowego - naturalny polisacharyd pochodzenia roślinnego, o stopniu estryfikacji grup kwasowych do 80% łańcucha polimeru, przy czym sorbent ma rozmiary porów od 20 do 200 nm.

2. Sorbent według zastrz. 1, znamienny tym, że zbudowany jest z pektyny o stopniu estryfikacji od 10 do 50%.

3. Sorben t wedłgg zastrz. 1 , zaamienny tym, że ma oostać hydrożelu naniesinnego lbb nie naniesionego na nośniku, a wielkość ziarna sorbentu w obu przypadkach mieści się w granicach od 0,1 mm do 10 mm.

4. Sorbent według z^trz. 1, znamienny tym, że po wysuszeniu stosunek masy mokrej do suchej jest od 10 do 75 g/g.

5. Sorbent według 1, znamienny tym, że jest naniesiony na powierzchni nośnika.

6. Sorbent według zastrz. 1, znamienny tym, że grubość warstwy naniesiona na nośnik wynosi od 0,1 pmdo 10 μτη .

7. Sposób otrzymywania sorbentu do pozaustrojowego usuwania lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) z krwi lub osocza ludzkiego, z ewentualnym wykorzystaniem reakcji sieciowania za pomocą dwufunkcyjnych, związków chemicznych o wzorze X-R-Y, gdzie X i Y oznaczają atom chlorowca, grupę aldehydową lub grupę epoksydową, a R jest grupą alifatyczną o 3 - 10 atomach węgla, znamienny tym, że pektynę o stopniu estryfikacji do 80%, korzystnie od 10 do 50%, poddaje się żelowaniu jonami metali dwuwartościowych, dodając jej roztwór kroplami do roztworu jonów metali dwuwartościowych, korzystnie magnezu, wapnia lub manganu, fromując jedocześnie odpowiednią postać fizyczną sorbentu, po czym sorbent ewentualnie sieciuje się dwufunkchjnhm związkiem chemicznym w znany sposób.

8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako dwufunkcyjne związki chemiczne o wzorze X-R-Y stosuje się l,3-dichloro-2-propanol, glutaraldehyd, epichlorohydryna, yibromopdopanol, 1,2,3,4-diepoxybutan.

9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się roztwór jonów metali dwuwartościowych o stężeniu od 0,01% do 10%.