PL167173B1 - Sposób wytwarzania niezakażającego osocza krwi - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania niezakażającego osocza krwi, w którym osocze traktuje się za pomocą niejonowych środków powierzchniowo czynnych, w postaci tri-N-butylo-fosforanu (TNBP)i oktylofenoksy polietoksyetanolu (Triton X-100), które usuwa się chromatograficznie, znamienny tym, że po traktowaniu, ale przed oddzieleniem warstwy lipidów dodaje się lipidy biologicznie zgodne, w postaci oleju roślinnego, oddziela się fazę lipidów, korzystnie przez wirowanie odśrodkowe, filtrację na hydrofobowych materiałach filtracyjnych, a pozostające w wodnej fazie niejonowe środki powierzchniowo czynne usuwa się przez adsorpcję na fazie stałej za pomocą materiałów hydrofobowych.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania niezakażającego osocza krwi.

Osocze krwi stosuje się w medycynie do dużej ilości wskazań. Odpowiednio duże jest jego znaczenie kliniczne. Osocze krwi uzyskuje się przez oddzielenie krwinek od pełnej krwi, która jest pobierana od dawców. W celu uniknięcia zakażenia pacjenta składnikami chorobotwórczymi, jak wirusy żółtaczki zakaźnej i HIV, osocza dawców muszą być od nich uwolnione. Dotychczas było tylko możliwe używanie osoczy pobranych od pojedynczych dawców, które po dłuższym okresie obserwacji zostały uznane za zdrowe w sensie braku wirusów. Zmieszanie osoczy od wielu dawców było wykluczone.

Niedogodnością tego sposobu postępowania jest olbrzymi nakład, ponoszony na uzyskanie poszczególnych preparatów, a także niemożliwe jest zachowanie ich ciągłego wytwarzania. Jedynie przy ponoszeniu nieproporcjonalnie wysokich nakładów możliwe jest wytwarzanie znormalizowanych preparatów osocza. Przykładowo przy indywidualnym przygotowaniu preparatów spada zawartość proteiny we frakcji dawcy. Przy tym w przypadku stosowania osocza, wytworzonego z indywidualnego preparatu, należy uwzględnić każdorazowo aktualną zawartość protein w odnośnej partii.

Zasadniczo możliwa jest dezaktywacja wirusów za pomocą dodatków chemicznych. Duży problem stanowi jednak usunięcie środka, użytego do dezaktywacji składników zakaźnych. W

167 173 sposobie postępowania opracowanym przez New-York-Blood-Center, do dezaktywacji wirusów stosuje się detergenty. Duży problem stanowi usunięcie tych detergentów z osocza po przeprowadzonej dezaktywacji wirusów.

W europejskim opisie zgłoszeniowym EP-A nr 0 239 859 jest opisany sposób oczyszczania osocza krwi przez ekstrakcje naturalnymi olejami roślinnymi, np. olejem sojowym.

Z nieopublikowanego europejskiego opisu zgłoszeniowego EP-A nr 0 366 946 jest znany sposób usuwania detergentów z osocza krwi poprzez hydrofobową chromatografię z odwróconymi fazami za pomocą pokrytej grupami oktadecylowymi C-18 matrycy żelu krzemionkowego.

Substancje nośne, stosowawne w chromatografii z odwróconymi fazami, podczas obróbki tracą jednakże w pewnym stopniu swoje powłoki. Niepowleczone cząstki nośnika powodują aktywację czynników krzepnięcia, zawartych w osoczu krwi i prowadzą do ich niepożądanego zniszczenia.

Sposobu tego praktycznie nie daje się przeprowadzić, ponieważ wymaga on bardzo dużych ilości materiałów do chromatografii w celu ponownego usunięcia niejonowych związków powierzchniowo czynnych.

Zadaniem wynalazku jest opracowanie ciągłego sposobu wytwarzania niezakażonego osocza krwi, umożliwiającego między innymi pewne i niezawodne postępowanie w celu usunięcia detergentów dezaktywujących wirusy, a także w przypadku wytwarzania preparatów osocza ich otrzymywanie ze znormalizowaną zawartością protein.

Zadanie to zostało rozwiązane dzięki temu, że po traktowaniu, ale przed oddzieleniem warstwy lipidów dodaje się lipidy biologicznie zgodne w postaci oleju roślinnego, oddziela się fazę lipidów, korzystnie przez wirowanie odśrodkowe, filtrację na hydrofobowych materiałach filtracyjnych, a pozostające w wodnej fazie niejonowe środki powierzchniowo czynne usuwa się przed adsorpcją na fazie stałej za pomocą materiałów hydrofobowych.

Istotne dla wynalazku jest to, że w przypadku dezaktywacji wirusów za pomocą tri-N-butylofosforanu, zwanego dalej TNBP i oktylofenoksy-polietoksyetanolu, zwanego dalej Triton Χ-100, usuwanie tych niejonowych środków powierzchniowo czynnych przebiega w dwóch etapach. Pierwszy niejonowy środek powierzchniowo czynny TNBP w pierwszym etapie w przeważającym stopniu wchodzi w fazę lipidową i wraz z nią jest oddzielany z fazy wodnej.

Drugi niejonowy środek powierzchniowo czynny Triton Χ-100 pozostaje w tym etapie w przeważającym stoniu w fazie wodnej, jednak później jest usuwany przez adsorpcję na fazie stałej za pomocą materiałów hydrofobowych. To usuwanie udaje się jedynie wówczas, jeżeli przedtem w znacznym stopniu został usunięty TNBP i dlatego też jest konieczne dodanie przedtem biologicznie zgodnych lipidów - oleju roślinnego - i oddzielenie powstającej przy tym warstwy lipidów.

Osocze krwi może pochodzić przy tym ze świeżo wytworzonych preparatów osocza, jak i frakcji liofilizowanych. Przy tym liofilizowane osocze topi się w kąpieli wodnej w temperaturze 20 do 30°C. Po uzyskaniu określonej temperatury, przykłdowo 25°C, osocze filtruje się i kontroluje wartość pH roztworu, którą nastawia się w granicach od 7,0 do 7,4.

Na tak potraktowane osocze krwi działa się następnie wspomnianymi niejonowymi środkami powierzchniowo czynnymi TNBP, Triton Χ-100 i wodą destylowaną w temperaturze 20 do 40°C, korzystnie 30°C, a stosunek tej mieszaniny wynosi 0,5 do 2:0,5 do 2:2 do 4.

Korzystnie dodatek oleju roślinnego, zwłaszcza oleju sojowego, oleju rycynowego wynosi około 10%o (v/v). Pozostające niejonowe związki powierzchniow czynne usuwa się przez adsorpcję za pomocą materiałów hydrofobowych znanych z chromatografii z odwróconymi fazami. Należą do nich korzystnie materiały nośnikowe, które zawierają grupy oktadecylowe C-18. Jako materiał nośnikowy stosuje się między innymi żel krzemionkowy, który ma jednak tę niedogodność, że w przypadku braku powłoki wywołuje aktywację czynników w osoczu krwi i powoduje ich zniszczenie. Ten niepożądany efekt został wyeliminowany dzięki doborowi odpowiednich, organicznych materiałów nośnikowych, znanych pod nazwą Sephacryl, Superose (firma Pharmacia) lub Fractogel typ TSK (firma E. Merck).

W korzystnej postaci wykonania adsorpcję przeprowadza się przez chromatografię z odwróconymi fazami.

Po odsorpcji przeprowadza się kontrolę wartości pH, którą nastawia się na pH 7,0 do 7,4. Następnie przeprowadza się filtrację sterylizującą, po czym w zależności od życzenia liofilizuje się osocze krwi w obecności zwykłych liofilizujących środków pomocniczych, jak lizyna lub glicyna.

167 173

Korzystnie stosuje się mikronizowany materiał filtracyjny.

Sposób według wynalazku pozwala na odejście od tradycyjnego indywidualnego przygotowania osocza krwi. Sposób nadaje się do przeprowadzania w skali przemysłowej. Zwłaszcza możliwy jest ciągły sposób postępowania. Dalsza zaleta sposobu według wynalazku polega na tym, że dzięki ciągłemu procesowi postępowania warunki można tak dobrać, że produkt końcowy zawiera każdorazowo jednakowe lub przynajmniej bardzo zbliżone stężenie protein. Dzięki temu kliniczny dostęp do preparatów osocza krwi, zwłaszcza przy dawkach wielokrotnych, jest mniej problematyczny, ponieważ nie występuje zmiana ilości protein, wynikająca z preparatów indywidualnych.

Przykład. 201 osocza krwi (80X250ml) topi się w kąpieli wodnej w temperaturze 25°C w czasie 1,5 godziny. Na życzenie frakcję po stopieniu filtruje się przez filtr gazowy lub świece filtracyjne (np. firmy Pal, ^^!0^m). Następnie osocze wlewa się do kotła ze stali szlachetnej o pojemności 501, w temperaturze 30°C. Do operacji mieszania stosuje się mieszadło łopatkowe. Kontroluje się wartość pH stopionego osocza i za pomocą 0,5 N-kwasu solnego nastawia się na wartość pH 7,0 do 7,4.

Wytwarza się mieszaninę: TNBP, Triton X-100 i woda destylowana. Korzystnie stosunek TNBP: Triton X-100: woda destylowana wynosi 0,5 do 2:0,5 do 2:2 do 4. W przypadku takiej ilości wsadowej stosuje się w szczególnie korzystny sposób następujące ilości: 200 ml TNBP, 200 ml Tritonu X-100 i 800 ml wody destylowanej. Mieszaninę ogrzewa się również do temperatury około 30°C i dodaje się do osocza. Całość miesza się ostrożnie w temperaturze 30°C. Po 4 godzinach rozpoczyna się wirowanie odśrodkowe osocza, które korzystnie przeprowadza się z prędkością 4000 obrotów/min w czasie jednej godziny i w temperaturze 12°C, dodając przedtem około 10% objętościowych oleju sojowego lub rycynowego. W ten sposób powstaje dwufazowa ciecz, w której około 90% stanowi woda, a około 10% olej.

Przez wirowanie oddziela się główną ilość fazy olejowej, która zawiera największy udział niejonowych związków powierzchniowo czynnych wraz z innymi składnikami osocza, przykładowo wirusami HIV i wirusami zapalenia wątroby. W ten sposób otrzymano 191 fazy wodnej, która zawiera jeszcze resztkowe ilości fazy olejowej.

Otrzymaną ilość traktuje się za pomocą żelu krzemowego pokrytego materiałami zawierającymi grupy C-18 - adsorbentu Prep C-18 (firmy Waters) lub adsorbentu 5/5 Pro RPC HR (firmy Pharmacia). Otrzymane 101 osocza łączy się z 1,2 kg adsorbentu w 2,41 wody. Tę mieszaninę wprowadza się do kolumny chromatograficznej o średnicy 15 cm, przez co ponownie oddziela się adsorbent. Przepływ eluatu-frakcji osocza wynosi 300 ml/min i kontroluje się go za pomocą monitora UV.

Wypływającą frakcję osocza, która jest całkowicie wolna od dodanego oleju, dodanych niejonowych środków powierzchniowo czynnych i ewentualnie występujących wirusów HIV i wirusów zapalenia wątroby zbiera się i w dowolnym wypadku nastawia się na wartość pH 7,0 za pomocą 0,5 N-ługu sodowego. Osocze filtruje się sterylnie przez filtr membranowy (0,22 /zm) i liofilizuje, po czym napełnia nim butelki o pojemności 250 ml.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 1,00 zł.

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania niezakażającego osocza krwi, w którym osocze traktuje się za pomocą niejonowych środków powierzchniowo czynnych, w postaci tri-N-butylo-fosforanu (TNBP) i oktylofenoksy polietoksyetanolu (Triton X-100), które usuwa się chromatograficznie, znamienny tym, że po traktowaniu, ale przed oddzieleniem warstwy lipidów dodaje się lipidy biologicznie zgodne, w postaci oleju roślinnego, oddziela się fazę lipidów, korzystnie przez wirowanie odśrodkowe, filtrację na hydrofobowych materiałach filtracyjnych, a pozostające w wodnej fazie niejonowe środki powierzchniowo czynne usuwa się przez adsorpcję na fazie stałej za pomocą materiałów hydrofobowych.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że liofilizowane osocze krwi topi się w kąpieli wodnej w temperaturze 20 do 30°C.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wartość pH osocza nastawia się na pH 7,0 do 7,4.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się mieszaninę TNB:Triton X-100:woda w stosunku 0,5 do 2:0,5 do 2:2 do 4.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatek oleju roślinnego, korzystnie oleju sojowego, rycynowego wynosi około 10% (v/v).
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że adsorpcję przeprowadza się za pomocą materiałów stosowanych w chromatografii z odwróconymi fazami.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stosuje się materiały, które zawierają grupy oktadecylowe C-18.
8. 8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że adsorpcję realizuje się metodą chromatografii z odwróconymi fazami zawierającymi grupy C-18.
9. 9. Sposób według zastrz. 6 albo 8, znamienny tym, że po adsorpcji i ewentualnie po kontroli wartości pH i nastawieniu na pH 7,0 do 7,4, przeprowadza się filtrację sterylizującą.
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że osocze krwi liofilizuje się w obecności zwykłych środków pomocniczych do liofilizacji.
11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się mikronizowany materiał filtracyjny.