PL166921B1

PL166921B1 - Method of obtaining penicillin g by biosynthesis process

Info

Publication number: PL166921B1
Application number: PL28805990A
Authority: PL
Inventors: Andrzej Dalewski; Leonard Karabin; Marian Tryc; Jerzy Szymanski; Barbara Ostrowska-Krysiak; Barbara Krawczyk; Ludomir Kotala; Stanislaw Pracz
Original assignee: Tarchominskie Zaklad Farma
Priority date: 1990-11-30
Filing date: 1990-11-30
Publication date: 1995-07-31
Also published as: PL288059A1

Abstract

1. Sposób wytwarzania penicyliny G metodą biosyntezy w półciągłej hodowli szczepu Penicillium chrysogenum, znamienny tym, że proces biosyntezy prowadzi się również w mieszaninie odlewek hodowli zebranych w początkowych fazach hodowli z kilku lub kilkunastu aparatów fermentacyjnych prowadzonych równolegle.1. Method for the production of penicillin G by biosynthesis in fed-batch culture a strain of Penicillium chrysogenum, characterized in that the biosynthetic process is carried out also in the mixture of the culture castings collected in the initial phases of the cultivation from several or a dozen fermentation machines run in parallel.

Description

Sposób wytwarzania penicyliny G w procesie biosyntezy polega na optymalnym wykorzystaniu wysokowydajnych szczepów Penicillium chrysogenum w hodowli półciągłej, prowadzonej przy ścisłej kontroli stężeń składników odżywczych i prekursorów dodawanych do podłoża produkcyjnego.The method of producing penicillin G in the biosynthetic process is based on the optimal use of high-yielding strains of Penicillium chrysogenum in fed-batch culture with strict control of the concentrations of nutrients and precursors added to the production medium.

W znanych metodach otrzymywania penicyliny G składniki odżywcze, takie jak glukoza, siarczan amonu, a także fenylooctan potasu jako prekursor, są dodawane do podłoża produkcyjnego w postaci sterylnych roztworów wodnych w ilościach zapewniających optymalny przebieg procesu wytwarzania penicyliny G.In the known methods for the preparation of penicillin G, nutrients such as glucose, ammonium sulfate and also potassium phenylacetate as a precursor are added to the production medium in the form of sterile aqueous solutions in amounts ensuring the optimal course of the penicillin G production process.

W czasie procesu biosyntezy jest dodawana również mieszanina tłuszczów zwierzęcych z olejami roślinnymi, którą stosuje się jako źródło węgla i równocześnie stanowi ona środek przeciwpianowy.During the biosynthesis process, a mixture of animal fats and vegetable oils is also added, which is used as a carbon source and at the same time serves as an anti-foaming agent.

Dodawanie w trakcie procesu biosyntezy glukozy, siarczanu amonu i fenylooctanu potasu w postaci sterylnych, wodnych roztworów powoduje wzrost objętości hodowli w fermentorze, co wymusza konieczność dokonywania odbioru części hodowli jako tak zwanych odlewek już w początkowych godzinach procesu biosyntezy.The addition of glucose, ammonium sulphate and potassium phenylacetate in the form of sterile, aqueous solutions during the biosynthesis process causes an increase in the volume of the culture in the fermentor, which necessitates the reception of part of the culture as so-called waste in the initial hours of the biosynthesis process.

Pierwsza odlewka dokonywana jest około 60 godzin biosyntezy, a następne co 12 godzin. Następnie odlewki te są przekazywane w małych porcjach do dalszego przerobu. W pierwszej odlewce z hodowli kierowanej do przerobu chemicznego zawartość penicyliny G jest niewielka i wynosi około 5000-6000 jednostek w 1 cm³ hodowli. Wobec tak małej zawartości antybiotyku w odbieranej części hodowli z początkowego stadium biosyntezy oraz przy dużej ilości składników balastowych, pochodzących z podłoża produkcyjnego, jakie nie zostały zużyte w pierwszych godzinach bioprocesu, wydajność z fazy izolacji penicyliny G jest niska i wynosi tylko 65%.The first decant is biosynthesized for about 60 hours, and the next one every 12 hours. Then these castings are sent in small portions for further processing. In the first decant from the culture directed to chemical processing, the penicillin G content is low, approximately 5000-6000 units per 1 cm ^{3 of the} culture. Due to such a low content of the antibiotic in the part of the culture received from the initial stage of biosynthesis and with a large amount of ballast components from the production medium that were not consumed in the first hours of the bioprocess, the efficiency of the penicillin G isolation phase is low and amounts to only 65%.

Dotychczas stosowane metody wykorzystywania odlewek mają następujące wady: nieracjonalne wykorzystanie składników odżywczych podłoża produkcyjnego, które niezużyte podczas procesu stają się balastem, zbieranie zbyt małych porcji odlewek i przekazywanie ich do przerobu po długim oczekiwaniu, co powoduje najczęściej spadek zawartości antybiotyku.The methods of using castings used so far have the following disadvantages: irrational use of nutrients in the production substrate, which become ballast when not used during the process, collecting too small portions of castings and transferring them to processing after a long wait, which usually causes a decrease in the antibiotic content.

W dostępnym piśmiennictwie naukowym i patentowym nie znaleziono opisu metody pozwalającej na zwiększenie wydajności w procesie biosyntezy penicyliny G w hodowli półciągłej z wykorzystaniem bogatej w składniki odżywcze części hodowli, odbieranej z wczesnej fazy procesu i kierowanej do dalszej biosyntezy, z zastosowaniem odpowiednio dobranych parametrów.The available scientific and patent literature has not found a description of a method allowing to increase the efficiency of penicillin G biosynthesis in fed-batch culture with the use of a nutrient-rich part of the culture, collected from the early stage of the process and directed to further biosynthesis, using appropriately selected parameters.

166 921166 921

Obecne kierunki nadań nad udoskonaleniem metod produkcji penicyliny G zawarte są w przeglądowym artykule: Hersbach G.J.M, Van der Beek C.P., Van Dijck P.W.M. - The Penicillins: Properties, Biosynthesis and Fermentation. Biotechnology of Industriel Antibiotics, Ed.: E.J. Vandamme, Dekker M. Inc. New Jork and Basel, 1984.The current directions for the improvement of penicillin G production methods are contained in the review article: Hersbach G.J.M, Van der Beek C.P., Van Dijck P.W.M. - The Penicillins: Properties, Biosynthesis and Fermentation. Biotechnology of Industriel Antibiotics, Ed .: E.J. Vandamme, Dekker M. Inc. New York and Basel, 1984.

Jednakże opisane w tej publikacji metody nie zawierają informacji o sposobie wykorzystywania tej części hodowli w postaci odlewek, które uzyskuje się z procesu fermentacji penicyliny G.However, the methods described in this publication do not provide information on how to use that portion of the culture in the form of casts which is obtained from the fermentation of penicillin G.

W czasie prowadzonych doświadczeń okazało się, że najbardziej korzystne jest równoczesne prowadzenie z podstawową biosyntezą penicyliny G w kilku lub kilkunastu fermentorach także biosyntezy tego antybiotyku w dodatkowym fermentorze lub fermentorach napełnianych mieszaniną odlewek z podstawowej biosyntezy penicyliny G.During the conducted experiments, it turned out that it is most advantageous to simultaneously carry out the biosynthesis of this antibiotic in a dozen or so fermenters with the basic biosynthesis of penicillin G in an additional fermenter or fermenters filled with a mixture of castings from the primary biosynthesis of penicillin G.

Zgodnie z wynalazkiem procesu biosyntezy penicyliny G metodą biosyntezy w półciągłej hodowli szczepu Penicillium chrysogenum prowadzi się również równolegle w mieszaninie odlewek hodowli zebranych w początkowych fazach hodowli produkcyjnej z kilku lub kilkunastu aparatów fermentacyjnych zwanych fermentorami. W mieszaninie odlewek hodowli, wypełniającej dodatkowo zainstalowany fermentor, dozowanie składników odżywczych i prekursorów do podłoża produkcyjnego doprowadza się do ściśle określonego poziomu, stosując sterylne, wodne roztwory glukozy, siarczanu amonu i fenylooctanu potasu oraz dodatek mieszaniny tłuszczów zwierzęcych z olejami roślinnymi jako źródła węgla, która jest jednocześnie środkiem przeciwpianowym.According to the invention, the biosynthesis process of penicillin G by biosynthesis in a fed-batch culture of the Penicillium chrysogenum strain is also carried out in parallel in a mixture of the culture casts collected in the initial stages of the production culture from several or a dozen fermentation apparatuses called fermenters. In the mixture of culture castings, filling the additionally installed fermenter, the dosage of nutrients and precursors to the production medium is brought to a strictly defined level using sterile aqueous solutions of glucose, ammonium sulphate and potassium phenylacetate and the addition of a mixture of animal fats with vegetable oils as a carbon source, which it is also an anti-foaming agent.

Sposób wytwarzania penicyliny G według wynalazku z znacznym i istotnym stopniu obniża koszt wytwarzania tego antybiotyku dzięki zmniejszeniu zużycia surowców o 10% 15%, a także mediów energetycznych o 15%, natomiast wskutek wyeliminowania niewykorzystanych składników podłoża wraz z kierowaniem do przerobu brzeczki fermentacyjnej o wyższej zawatości penicyliny G od dotychczas stosowanej, zwiększa wydajność izolowanego antybiotyku w kolejnym stadium procesu o około 10%.The method of producing penicillin G according to the invention significantly and significantly reduces the cost of producing this antibiotic due to the reduction of the consumption of raw materials by 10%, 15%, and of energy media by 15%, while by eliminating the unused components of the medium and sending the fermentation broth with a higher content to the processing. penicillin G from the one used so far, increases the efficiency of the isolated antibiotic in the next stage of the process by about 10%.

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady.The following examples illustrate the invention.

Przykład I. Fermentor o pojemności 150 m³ wysterylizowano, schłodzono i zatrzymano w nim 4,5 m³ skroplin pary wodnej do 3% pojemności. Do tak przygotowanego aparatu fermentacyjnego, oznaczonego symbolem 0-9, zwanego odlewkowym -szarża 9, dodano łącznie 30,6 m odlanej hodowli z trzech fermentorów będących w toku wczesnej fazy procesu biosyntezy. Początkowa zawartość fermentora 0-9 wynosiła 35,1 m3 hodowli o łącznej ilości penicyliny G 482,2 giga jednostek antybiotyku. Przygotowany w ten sposób fermentor 0-9 włączono do cyklu produkcyjnego programując parametry procesu, przeliczone odpowiednio dla aktualnej hodowli w szarży 0-9.EXAMPLE The fermenter with a capacity of 150 m ³ sterilized, cooled and quenched in the 4.5 m ^{3 of} water vapor condensation up to 3% of its capacity. A total of 30.6 m of the cast culture from three fermenters in the early phase of the biosynthesis process was added to the fermentation apparatus prepared in this way, marked with the symbol 0-9, known as the cast iron - lot 9. The initial content of the fermentor 0-9 was 35.1 m3 of culture with a total amount of penicillin G 482.2 g of antibiotic units. The fermenter 0-9 prepared in this way was included in the production cycle by programming the process parameters, calculated appropriately for the current culture in batch 0-9.

W godzinie 0 tej szarży produkcyjnej zastosowano następujące dozowania:At 0 hours of this production batch the following dosages were used:

25% roztworu glukozy - 210 l/godzinę25% glucose solution - 210 l / hour

60% roztworu fenylooctanu potasu - 2 l/godzinę60% solution of potassium phenylacetate - 2 l / hour

20% roztworu siarczanu amonu -12 l/godzinę i mieszaniny tłuszczu zwierzęcego z olejem roślinnym /1:1/-10 l/godzinę.20% ammonium sulphate solution -12 l / hour and mixtures of animal fat with vegetable oil / 1: 1 / -10 l / hour.

Ustalono przepływ powietrza -50 m3/minutę i obroty mieszadła -100 rpm. W dalszych godzinach prowadzono proces biosyntezy zgodnie z obowiązującą technologią z uwzględnieniem zawartości hodowli w fermentorze. Proces prowadzono do 223 godziny hodowli, dodając w tym czasie do fermentora 0-9 10 porcji hodowli z innych trzech prowadzonych równolegle fermentorów jako mieszaniny odlewek. Począwszy od 82 godziny procesu przy stężeniach antybiotyku od 26.000 j/cm3 34.850 j/cm3 przekazano 7 porcji hodowli do przerobu chemicznego w celu izolacji penicyliny G. Bilans procesu biosyntezy w fermentorze 0-9 przedstawia się następująco: dodano z 3 innych fermentorów 10 porcji odlewek hodowli o łącznej zawartości penicyliny G 1736,8 giga jednostek. Z fermentora 0-9 uzyskano 6925,9 giga jednostek, w tym z hodowli podstawowej uzyskano 3908,2 giga jednostek i 3017,7 giga jednostek z 7 dokonanych odlewek. Są to ilości brutto, natomiast netto obliczenia są następujące: otrzymano brutto 6925,9 giga jednostek - 1736,8 giga jednostek = 5189,1 giga jednostek penicyliny G.An air flow of -50 m3 / min and a mixer speed of -100 rpm were established. In the following hours, the biosynthesis process was carried out in accordance with the applicable technology, taking into account the culture content in the fermentor. The process was carried out up to 223 hours of cultivation, during which time 0-9 aliquots of the culture from the other three fermenters run in parallel were added as a mixture of slugs to the fermentor. Starting from the 82nd hour of the process, at the concentration of the antibiotic from 26,000 U / cm3 34,850 U / cm3, 7 portions of culture were transferred for chemical processing in order to isolate penicillin G. The balance of the biosynthesis process in the 0-9 fermentor is as follows: 10 portions of castings were added from 3 other fermenters cultures with a total penicillin content of 1736.8 giga units. Fermenter 0-9 yielded 6925.9 g of units, of which 3908.2 g units were obtained from the stock culture and 3017.7 g units were obtained from the 7 castings made. These are gross amounts, while the net calculation is as follows: gross amounts were received 6,925.9 giga units - 1736.8 giga units = 5189.1 giga units of penicillin G.

W wyniku dokonanych obliczeń uzyskano redukcję kosztu surowców o 40% i redukcję kosztów energetycznych o 60%. / w szarży produkcyjnej zawartej w fermentorze 0-9/.As a result of the performed calculations, the cost of raw materials was reduced by 40% and energy costs were reduced by 60%. / in the production batch contained in the fermenter 0-9 /.

W celu porównawczym dla grupy 4 pracujących równolegle fermentorów, z których 3 były prowadzone według dotychczasowej technologii i 1 fermentor 0-9 -według wynalazku uzyskano redukcję kosztów surowcowych o 10%o oraz zmniejszono koszty energii o 15%.For the purpose of comparison, for a group of 4 fermenters working in parallel, 3 of which were operated according to the current technology and 1 fermenter 0-9 - according to the invention, the raw material costs were reduced by 10% and the energy costs were reduced by 15%.

Przykład II. Przygotowano jak w przykładzie I fermentor o pojemności 150 m3 rozpoczynając szarżę produkcyjną o symbolu 0-17 z wsadem wyjściowym 35,1 m3 hodowli o łącznej zawartości 427,8 giga jednostek antybiotyku. W 0 godzinie hodowli szarży produkcyjnej 0-17 zastosowano dozowanie:Example II. A fermentor with a capacity of 150 m3 was prepared as in Example 1, starting a production batch with the symbol 0-17 with a starting batch of 35.1 m3 of culture with a total content of 427.8 g of antibiotic units. At 0 hours of cultivation of the production batch 0-17, the dosing was applied:

25% roztworu glukozy w ilości 210 l/godzinę25% glucose solution at the rate of 210 l / hour

60% roztworu fenylooctanu potasu w ilości 2 l/godzinę60% solution of potassium phenylacetate in the amount of 2 l / hour

20% roztworu siarczanu amonu w ilości 9 l/godzinę i mieszaniny tłuszczu zwierzęcego z olejem roślinnym /1:1/-10 l/godzinę. Przepływ powietrza wynosił 50 m³/ minutę, a obroty mieszadła-100 rpm.20% ammonium sulphate solution in the amount of 9 l / hour and mixtures of animal fat with vegetable oil / 1: 1 / -10 l / hour. The air flow was 50 m ³ / minute and the agitator speed-100 rpm.

Proces biosyntezy penicyliny G prowadzono programując parametry zgodnie z obowiązującą technologią do 209 godziny hodowli, wykonując w tym czasie 7-krotne dodawanie hodowli i 7-krotne odbieranie hodowli.The penicillin G biosynthesis process was carried out by programming the parameters in accordance with the technology in force up to 209 hours of culture, during which time the culture was added 7 times and the culture was removed 7 times.

Bilans przebiegu biosyntezy prowadzonej w szarży produkcyjnej :0-17 przedstawia się następująco: z trzech innych fermentorów prowadzonych równolegle dodano 7 porcji hodowli o łącznej zawartości antybiotyku 1786,8 giga jednostek, a uzyskano łącznie z hodowli głównej i z 7 porcji odebranych jako odlewki 7186,9 giga jednostek brutto, z czego netto w szarży produkcyjnej 0-17 otrzymano: 7186,9 giga jednostek -1786,8 giga jednostek = 5400,1 giga jednostek penicyliny G.The balance of the course of biosynthesis carried out in the production batch: 0-17 is as follows: from three other fermenters run in parallel, 7 portions of culture with a total antibiotic content of 1786.8 g of units were added, and the total of 7 portions received as casts was obtained 7186.9 giga gross units, of which net in the production batch of 0-17 was: 7186.9 giga units -1786.8 giga units = 5400.1 giga units of penicillin G.

Oszczędności z szarży 0-17 prowadzonej według wynalazku w stosunku do szarż produkcyjnych według znanej technologii są następujące: w zakresie surowców, wobec zastosowania jedynie dokarmiania hodowli a nie używania surowców do fermentorów-tanków matecznych jak i do przygotowania pożywki podstawowej, to zredukowanie ilości surowców do tego procesu wynosi 50%. W zakresie pobieranej energii oszczędności wydatków energetycznych wyniosły 60% wobec zaniechania sterylizacji fermentorów posiewowych i pożywki podstawowej. Wskutek prowadzenia biosyntezy szarży produkcyjnej 0-17 łącznie z trzema innymi, standardowymi szarżami produkcyjnymi, to wspólne oszczędności dla zespołu 4-ch szarż produkcyjnych penicyliny G wynoszą:The savings from the batch 0-17 carried out according to the invention in relation to the production batch according to the known technology are as follows: in terms of raw materials, because only the use of feeding the culture and not the use of raw materials for mother fermentors and for the preparation of the basic nutrient solution, it is the reduction of the amount of raw materials to of this process is 50%. In terms of consumed energy, savings in energy expenditure amounted to 60%, as the sterilization of the seed fermentors and the basal medium was not sterilized. By biosynthesis of 0-17 batch runs together with three other standard batch runs, the joint savings for a team of 4 penicillin G batches are:

oszczędności surowcowe 12,5% oszczędności energii 15,0%.raw material savings 12.5% energy savings 15.0%.

Claims

Patent claims

1. Method for the production of penicillin G by biosynthesis in a semi-continuous culture of the Penicillium chrysogenum strain, characterized in that the biosynthesis process is also carried out in a mixture of culture casts collected in the initial stages of culture from several or a dozen fermentation apparatuses run in parallel.

2. The method according to p. The method of claim 1, characterized in that in the process of penicillin G biosynthesis carried out in the mixture of castings, the dosage of nutrients and precursors to the production medium is carried out to a strictly defined level using sterile aqueous solutions of glucose, ammonium sulphate, potassium phenylacetate and a mixture of animal fats with oils is added vegetable as a carbon source and at the same time as an anti-foaming agent.