PL165647B1

PL165647B1 - Sposób wytwarzania czystego zwiazku poliaminowego obecnego w jadzie Ageienopsis aperta PL PL PL

Info

Publication number: PL165647B1
Application number: PL90288490A
Authority: PL
Inventors: Nicholas A Saccomano; Robert A Volkmann
Original assignee: Nps Pharma Inc; Pfizer
Priority date: 1990-01-02
Filing date: 1990-12-27
Publication date: 1995-01-31
Also published as: DE69025305T2; PH27608A; IL96793A0; IE70757B1; FI906466A; GR3019487T3; JPH04210677A; DK0436332T3; FI93644C; DE69025305D1; CA2033480A1; CA2033480C; NZ236550A; ES2083439T3; NO173733B; AU1592692A; ATE133941T1; FI906466A0; AU640565B2; EP0436332B1

Abstract

. Sposób wytwarzania czystego zwiazku poliam inowego o wzorze 1 obecnego w ja- dzie Agelenopsis aperta oraz farmakologicz- nie d op u szczaln ych so li tego zw iazku, znam ienny tym , ze zwiazek o wzorze 19 poddaje sie reakcji ze zwiazkiem o wzorze 16 w obojetnym rozpuszczalniku i obojetnej atmosferze, otrzymany produkt poddaje sie reakcji z weglanem dwu-t-butylu, a nastepnie z 4-/N,N-dwumetyloam inopirydyna/ w obo- jetnej atmosferze, tak otrzymany produkt poddaje sie reakcji z kwasem trójfluoroocto wym w obojetnej atmosferze i otrzymane zwiazki ewentualnie przeksztalca sie w ich farmakologicznie dopuszczalne sole w znany sposób. Wzór 1 PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania czystego związku poliaminowego o wzorze 1 obecnego w jadzie Agelenopsis aperta. Poliamina ta, jej pochodne i ich farmakologicznie dopuszczalne sole są antagonistami neurotransmiterów typu aminokwasów pobudzających, które to neurotransmitery oddziaływują na komórki, w tym na komórki neuronalne różnych organizmów, w tym kręgowców i bezkręgowców. Związki wytwarzane sposobem według wynalazku służą do antagonizowania neurotransmiterów typu aminokwasów pobudzających, które to neurotransmitery oddziaływują na komórki takie jak komórki układu nerwowego w organizmie, per se, do leczenia chorób i stanów, w których powstawaniu pośredniczą neurotransmitery typu aminokwasów pobudzających, u ssaków, do zwalczania szkodników bezkręgowców, a także mogą wchodzić w skład środków farmaceutycznych zawierających wspomniane polimery i ich sole. Wiadomo, Ze jad pająka Agelenopsis aperta zawiera co najmniej dwie toksyny, które oddziaływują na prądy wapniowe. Jackson H., i inni, Soc.Neu.Sci.Abstr. 12 1078 /1987/. Autorzy powyższej publikacji ujawnili toksynę, oznaczoną przez nich jako AG2, mającą ciężar cząsteczkowy mniejszy niż 1000 daltonów i najwidoczniej tłumiącą prądy wapniowe w szerokim zakresie tkanek. Następnie Jackson H. , i inni, Soc,Neu.Sci.Abstr. 12:730 /1986/ opisali inną toksynę z Agelenopsis aperta, zawierającą składnik o ciężarze cząsteczkowym około 6000. Według tej publikacji toksyna ta powoduje presynaptyczną blokadę transmisji i blokuje kanały wapniowe, uczestniczące w uwalnianiu neurotransmitera.

Pewne poliaminy, wykryte w jadzie pająka Agelenopsis aperta jawniono w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki' nr 07/346181, z 28 kwietnia 1989 r. Poliaminy te i ich .farmakologicznie dopuszczalne sole, wedł g zgłoszenia 07/346181 stanowią blokery receptorów uminokwasów pobudzających w komórkach, a jedna z tych poliamin oznaczona tam jako Bj, stanowi b.. )ker kanałów wapniowych w komórkach. Poliaminy te scharakteryzowano w powyższym zgłoszeniu jako

AGEL A52 o wzorze 2,

AGEL A68 o wzorze 3,

AGEL 448 o wzorze 4,

AGEL 505 o wzorze 5,

AGEL 489 o wzorze 6,

AGEL 50A stanowiący związek o następującej charakterystyce identyfikacyjnej:

/a/ obecny we frakcji surowego jadu pająka Agelenopsis aperta, który eluuje po około 22,75 minuty z kolumny C-18 Vydac o wymiarach 22 mm x 250 mm, przy rozmiarze porów 300 i. rozmiarze cząstek 10 μ, przy zastosowaniu prędkości przepływu wynoszącej 15 ml/min i układu rozpuszczalników o zmiennym składzie z następującym programem gradientu liniowego: 5¾ —»» 20¾ Β, 95¾ —i» 80¾ A [ 0 —> 30 min^, następnie 20¾ —70¾ 8, 80¾ —*· 30¾ A C 30 —* 55 min^, gdzie A oznacza 0,1¾ wodny roztwór TFA a 8 oznacza acetonitryl;

165 647 /b/ obecny we frakcji, frakcji opisanej powyżej w /a/, który eluuje po około 21,5 minuty z kolumny C-18 Vydac o wymiarach 22 mm x 250 mm, przy rozmiarze porów 300 A, rozmiarze cząstek 10 μ, przy zastosowaniu prędkości przepływu 15 ml/min i układu rozpuszczalników o zmiennym składzie z następującym programem gradientu nieliniowego: 0% —> 0¾ B, 100% —> 100% A £”0 —— 5 min,], następnie 0% —> 10% B, 100% —— 90% A [5 —— 20 min JAkrzywa Watersa 1/, następnie 100 —► 200 B, 900 —> 800 A [ 20 —:> 30 min [/krzywa Watersa 6/, następnie 200 —> 500 B, 800 —► 500 A [30 —* 40 min]/krzywa Watersa 11/, gdzie A oznacza 0,10 roztwór wodny TFA a B oznacza acetonitryl i /c/ widmo masowe FAB-MS, wysoka zdolność rozdzielcza: 505, 3861 obliczono dla C27H48N6O3.

Związki, będące antagonistami neurotransmiterów typu aminokwasów pobudzających, mają wiele zastosowań. Antagoniści neurotransmiterów typu aminokwasów pobudzających mogą znaleźć zastosowanie kliniczne w leczeniu takich stanów jak udar mózgowy, niedokrwienie mózgowe, degeneracje neuronalne takie jak choroba Alzheimera i podaczka oraz między innymi jako leki psychiatryczne. Patrz D.Lodge, Excitatory Amino Acids in Health and Disease, Ed. John Wiley and Sons Ltd., Nowy Jork, NY 1988. Ponadto związki takie znajdują zastosowanie w badaniach fizjologii komórek takich jak komórki neuronalne oraz w zwalczaniu szkodników bezkręgowców.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania czystego związku poliaminowego o wzorze 1 obecnego w jadzie Agelenopsis aperta, czyli poliaminy scharakteryzowanej jako AGEL 416.

Związek poliaminowy wytwarzany sposobem według wynalazku i jego farmaceutycznie dopuszczalne sole są antagonistami neurotransmiterów typu aminokwasów pobudzających, oddziaływujących na komórki. Zatem wspomniana poliamina ma zastosowanie do antagonizowania takich neurotransmiterów typu aminokwasów pobudzających, per se. Poliamina ta ma także zastosowanie do zwalczania szkodników bezkręgowców oraz do leczenia chorób i stanów ssaków, powstających za pośrednictwem neurotransmiterów typu aminokwasów pobudzających. Wspomniana poliamina ma także zastosowanie jako lek psychiatryczny dla ssaków.

Jak otrzymuje się z pająka Agelenopsis aperta w procesie dojenia za pomocą stymulacji elektrycznej według standardowych sposobów, dobrze znanych specjalistom. Korzystnie stosuje się sposób, zabezpieczający przed zanieczyszczeniem pełnego jadu płynem cofającym się z jamy brzusznej czy hemolimfą. Takie sposoby są dobrze znane specjalistom. Tak otrzymany pełny jad przechowuje się w stanie zamrożonym w temperaturze około -78°C, przed jego oczyszczeniem prowadzonym w sposób opisany poniżej.

Oczyszczania składników pełnego jadu dokonuje się za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej /HPLC/ na różnych kolumnach preparatywnych lub półpreparatywnych, takich jak kolumny C-4 i C-18 Vydac /firmy Rainin Instrument Co. Inc., Mack Road, Woburn Massachusetts 01801/, kolumny C-18 Baker /firmy J.T.Baker Inc., 22 Red School Lane, Phillipsburg, NJ 08865/ i kolumny Oynamax Phenyl /firmy Rainin Instruments Co. Inc., Mack Road, Woburn Masschusetts 01801/. Stosuje się detekcję piku monochromatycznego przy długości fali 220-230 nm. Dalszą analizę frakcji przeprowadza się na przykład na podstawie danych widma UV w całym zakresie widma, uzyskanych za pomocą detektora macierzowego Waters 990 /firmy Millipore Corporation, Waters Chromatography Division, 34 Maple Street, Milford, Massachusetts 01757/. Frakcje z kolumn zbiera się znanymi sposobami, przykładowo stosując kolektor frakcji ISCO/-/FOXY i detektor pików ISCO 2159 /firmy ISCO, 4700 Superior, Lincoln, Nebraska 68504/. Frakcje zbiera się do naczyń o odpowiednim rozmiarze, takich jak sterylne polietylenowe naczynia laboratoryjne. Zatężania frakcji dokonuje się przez liofilizację z eluenta a następnie liofilizację z wody. Czystość uzyskanych składników frakcji oznacza się następnie za pomocą analizy chromatograficznej z zastosowaniem kolumny analitycznej z układem gradientowym bardziej izokratycznym niż układ stosowany do końcowego oczyszczania frakcji.

Budowę związków zawartych w odpowiednich frakcjach oznacza się znanymi metodami analitycznymi, takimi jak spektrometria masowa i magnetyczny rezonans jądrowy.

Nieoczekiwanie okazało się, - że odpowiednią kolumną do początkowego frakcjonowania jadu jest kolumna C-18 Vydac o wymiarach 22 mm x 250 mm, rozmiarze porów 300 A i rozmiarze cząstek 10 μ. Kolumnę tę eluuje się z prędkością przepływu 15 ml/min z zastosowaniem rozpuszczalnika o zmiennym układzie z następującym programem gradientu liniowego: 1000 —> 800 A, 00 —► 200 B [0 —> 30 min[, gdzie A oznacza 0,10 wodny roztwór kwasu trójfluorooctowego /TFA/ a B ozna4

165 647 cza acetonitryl. Frakcje zbiera się w sposób opisany powyżej. Do dalszej analizy i/lub oczyszczania wybiera się sześć frakcji otrzymanych w ten sposób, oznaczonych tu jako frakcje 1, 2, 3, 4, 5 i 6. Inny sposób frakcjonowania pełnego jadu polega na zastosowaniu kolumny C-18 Baker /4,6 mm x 250 mm, rozmiar porów A, rozmiar cząstek 5 μ/, którą eluuje się z prędkością przepływu 1 ml/min i w izokratycznych warunkach 8% B, 92% A, gdzie A i B mają znaczenie opisane powyżej. Jednakże dla celów niniejszego wynalazku do wstępnego frakcjonowania całego jadu korzystnie stosuje się kolumnę C-18 Vydac i sposób opisany powyżej.

Stwierdzono, że frakcje 1, 2 i 3 zawierają poliaminy, opisane w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 07/346181. Frakcje 4, 5 i 6 poddaje się dalszemu oczyszczaniu na różnych kolumnach i w różnych warunkach. Przeprowadzono charakterystykę każdego podfrakcjonowania i stwierdzono, na podstawie analiz, że we frakcjach obecne są związki AGEL 416, AGEL 464, AGEL 489/A/ i AGEL 521. W przykładzie I i II przedstawiono charakterystykę wstępnego frakcjonowania oraz podfrakcjonowania związku AGEL 416 o wzorze 1.

Sposób wytwarzania czystego związku poliaminowego o wzorze 1 obecnego w jadzie Agelenopsis aperta oraz farmakologicznie dopuszczalnych soli tego związku, polega na tym, że związek o wzorze 19 poddaje się reakcji ze związkiem o wzorze 16 w obojętnym rozpuszczalniku i obojętnej atmosferze, otrzymany produkt poddaje się reakcji z węglanem dwu-t-butylu, a następnie z 4-/N,N-dwumetyloaminopirydyną/ w obojętnej atmosferze, tak otrzymany produkt poddaje się reakcji z kwasem trójfluorooctowym w obojętnej atmosferze i otrzymane związki ewentualnie przekształca się w ich farmakologicznie dopuszczalne sole w znany sposób.

Poliaminowe związki o wzorze 1 wytwarza się według wynalazku na drodze bezpośredniej syntezy stosując reakcje według schematu 1-3, przedstawionego na załączonym rysunku.

Zgodnie ze schematem 1, poliaminowy związek pośredni o wzorze 12 wytwarza się z dwuaminobutanu o wzorze 7. Warunki reakcji, odpowiednie do wytworzenia związku pośredniego o wzorze 16 zgodnie ze schematem 1 przedstawiono w przykładzie V-A do G. Schemat 2 ilustruje sposób wytwarzania związku pośredniego o wzorze 19. Warunki reakcji, odpowiednie do wytworzenia tego związku pośredniego według schematu 2 przedstawiono w przykładzie V-H. Wytwarzanie związku poliaminowego o wzorze 1 przedstawiono na schemacie 3. Warunki, reakcji, potrzebne do sprzężenia związków pośrednich o wzorach 16 i 19 i do wytworzenia związku o wzorze 1 podano w przykładzie V-I do K.

Poliaminy wytworzone sposobem według wynalazku odwracalnie antagonizują neurotransmitery typu aminokwasów pobudzających, które to neurotransmitery oddziaływują na komórki takie jak komórki układu nerwowego różnych organizmów, w tym bezkręgowców i kręgowców. Stosowane tu określenie bezkręgowce obejmuje na przykład owady, pasożyty wewnętrzne i pasożyty zewnętrzne.

Zdolność poliamin wytworzonych sposobem według wynalazku do antagonizowania neurotransmiterów typu aminokwasów pobudzających uwidacznia się jako zdolność blokowania wzrostu poziomu cGMP w móżdżkach nowodordków szczurzych, wywołanego kwasem N-metylo-D-asparaginowym /NMDA/. Móżdżki szczurów Wistar w wieku 8-14 dni szybko wycięto i umieszczono w temperaturze 4’C, w buforze węglanowym Krebsa o pH 7,4 i następnie pocięto na sekcje wielkości 0,5 mm x 0,5 mm, stosując siekacz do tkanek Mcllwain'a /firmy The Nickle Laboratory Engineering Co., Gomshall, Anglia/. Otrzymane fragmenty móżdżku przeniesiono do 100 ml buforu węglanowego o temperaturze 37’C, równowagowanego w sposób ciągły za pomocą mieszaniny O2/CO2 95:5. Fragmenty móżdżku inkubowano w ten sposób w ciągu 90 minut z trzykrotną zmianą buforu. Następnie bufor zdekantowano, tkankę odwirowano /1min, 3200 obrotów na minutę/, a tkankę ponownie zawieszono w 20 ml buforu węglanowego Krebsa. Następnie pobrano podwielokrotności 250 μ /w przybliżeniu 2 mg/ i umieszczono w probówkach do wirowania o pojemności 1,5 ml. Do probówek tych dodano 10 μΐ badanego związku z roztworu badanego a następnie 10 μl roztworu NMDA o stężeniu 2,5 mM w celu zapoczątkowania reakcji. Końcowe stężenie NMDA wynosi 100 μΝ1. Do probówek kontrolnych nie dodano NMDA. Probówki inkubowano, wstrząsając w ciągu jednej minuty w temperaturze 37°C na łaźni wodnej, po czym dodano 750 μΐ roztworu o stężeniu 50 mM Tris-Cl i 5 mM EDTA w celu zatrzymania reakcji. Probówki umieszczono natychmiast w łaźni z wrzącą wodą na pięć minut. Zawartość każdej z probówek poddano następnie działaniu ultradźwięków przez 15 sekund, stosując zestaw sondy dźwiękowej na poziomie mocy trzy. Pobrano 10 mikrolitrów i oznaczono białka metodą Lowry’ego, Anal. Biochem. 100:201-220 /1979/. Probówki następnie wirowano /5 min., 10000 g/,

165 647 pobrano 100 μ supernatanta i oznaczono poziom cyklicznego GMP /cGMP/, stosując radioimmunologiczny test do oznaczania cGMP, firmy New England Nuclear /Boston, Massachusetts/, zgodnie z zaleceniami producenta. Dane przedstawiono w pikomolach wytwarzanego cGMP na mg białka.

Ponadto, zdolność poliamin wytworzonych sposobem według wynalazku do antagonizowania neurotransmiterćw typu aminokwasów pobudzających uwidacznia się jako zdolność do blokowania wzrostu stężenia cytosolicznego wolnego wapnia [ Ca+2wywołanego NMDA/glicyną, w rozdrobnionych komórkach ziarnistych móżdżku. Móżdżkowe komórki ziarniste przygotowano z móżdżków 8-dniowych szczurów /Wilkin, G.P. et al., Brain Res. 115: 181-199, 1976/. Kwadraty /1 cm^/ z Aclar'u /proplasties Inc., 5033 Industrial Ave., Wall, N.J., 07719/ powleczono poli-L-lizyną i umieszczono w naczyniach z 12 zagłębieniami, zawierającymi 1 ml Eagles Basal Medium. Komórki podzielono i podwielokrotności, zawierające 6,25 x 10^ć komórek dodano do każdego zagłębienia, zawierającego kwadraty z Aclaru. W 24 godziny po powleczeniu dodano cytozono-beta-D-arabinofuranozyd /końcowe stężenie 10 pM/. Po 6, 7 i 8 dniach hodowli komórki użyto do analizy fura2. Komórki /przyłączone do kwadratów Aclar/ przeniesiono do naczyń z 12 zagłębieniami, zawierającymi 1 ml roztworu fura2/ /AM o stężeniu 2 M /Molecular Probes Inc., Eugene, OR, 97402/ w buforze HEPES /zawierającym 0,1% albuminy surowicy wołowej, 0,1% dekstrozy, pH 7,4, wolnym od magnezu/. Komórki inkubowano w ciągu 40 minut w temperaturze 37’C; bufor zawierający fura2/ AM usunięto i zamieniono na 1 ml tego samego buforu nie zawierającego fura2/AM. Do kuwety kwarcowej dodano 2,0 ml wstępnie ogrzanego buforu /37°C/. Komórki na płytkach Aclar umieszczono w kuwecie, a kuwetę wstawiono do termostatowanego statywu /37’C/ wyposażonego w mieszadło magnetyczne i mierzono fluorescencję za pomocą spektrofotometru fluorescencyjnego /Biomedical Instrument Hroup, University oi Pennsylvania/. Sygnał fluorescencyjny ustalono w ciągu około dwóch minut/.

Wzrost cytosolicznego poziomu wolnego wapnia, objawiający się wzrostem fluorescencji, wywołano przez dodanie 50 pM NMDA i 1 pM glicyny. Następnie dodano 5-20 1 roztworu badanego związku w solance buforowanej fosforanem /PBS, pH 7,4/ o odpowiednich stężeniach do kuwety. Kalibrację sygnałów fluorescencyjnych oraz korekcję wpływu fura2/AM przeprowadzono, stosując znane sposoby Grynkiewicza i innych, J. Biol.Chem. 260:3440 /19B5/. Po zakończeniu każdego testu oznaczano wartość maksimum fluorescencji /F_max/ przez dodanie jonomycyny, a wartość minimum fluorescencji oznaczano przez kolejne dodanie EDTA /12 mM/ w celu schelatowania wapnia. Przy zastosowaniu powyższej procedury zdolność przedmiotowego związku do antagonizowania neurotransmiterów typu aminokwasów pobudzających uwidacznia się przez zmniejszenie fluorescencji po dodaniu przedmiotowego związku.

Poliaminy wytworzone sposobem według wynalazku mają zastosowanie do antagonizowania neurotransmiterów typu aminokwasów pobudzających per ee. aaoo aakie , poliaminy mają także zastosowanie do zwalczania szkodników bezkręgowców oraz do leczenia chorób i stanów ssaków, w postawaniu których pośredniczą neueoteansmitery typu aminokwasów pobudzających, takich jak udar mózgowy, niedotlenienie mózgowe, degeneratywne zaburzenia neuronalne, takie jak choroba Alzheimer’a i padaczka. Wspomniane poliaminy mają także zastosowanie jako leki psychiatryczne dla ssaków. Ponadto poliaminy te znajdują zastosowanie w badaniach fizjologii komórek, w tym komórek układu nerwowego, ale nie tylko.

Wynalazek obejmuje również sposób wytwarzania farmakologicznie dopuszczalnych soli tych poliamin. Sole takie wytwarza się znanymi sposobami. Przykładowo, wytwarza się sole addycyjne poliamin, stosując znane metody. Wytwarza się sole addycyjne z kwasami, takie jak sole addycyjne z kwasem chlorowoddrrwym o z Owasem trójfluorooctowym. Korzystnie wytwarza sii ssie addycyjne poliamin z kwasem chldewwwdorwwmm. Poliaminy wytworzone sposobem według wynalazku lub ich fafmrkologicznie Oopuszczalne rosę ootiaae się ssakom, pojedyccoo albo o kombinacii z farmakologicznie dopuszczalnymi nośnikami lub rozcieńczalnikami, w postaci kompozycji farmaceutycznej zgodnie ze standardową praktyką farmaceutyczną. Poliamkim lub ich farmakologicznie dopuszczalne sole podaje się doustnie lub pozajelitowo. Podawanie pozajelitowe polega na podawaniu dożylnym, domięśniowym, dootrzewnowym, podskórnym lub miejiawwyk.

Przy stosowaniu doustnym, pdliakiny lub ich farmakologicznie dopuszczalne sole podaje się na przykład w postaci tabletek lub kapsułek, lub w postaci wodnego roztworu albo w postaci zawiesiny. W przypadku tabletek do podawania doustnego, zwykle stosuje się nośniki takie, jak

165 647 laktoza lub skrobia kukurydziana, a także zwykle dodaje się środki smarujące, takie jak stearynian magnezu. W przypadku podawania doustnego w postaci kapsułek, użyteczne rozcieńczalniki obejmują laktozę i suszoną skrobię kukurydzianą. W przypadku podawania doustnego w postaci zawiesiny wodnej składnik czynny łączy się ze środkami emulgującymi i zawieszającymi. W razie potrzeby dodaje się pewne środki słodzące i/lub zapachowe.

Do podawania domięśniowego, dootrzewnowego, podskórnego i dożylnego zazwyczaj przygotowuje się sterylne roztwory składnika czynnego, a pH tych roztworów powinno być odpowiednio ustawione i buforowane. W przypadku stosowania dożylnego całkowite stężenie substancji rozpuszczonych powinno być kontrolowane w celu uczynienia preparatu izotonicznym. Przy stosowaniu poliaminy lub jej soli dla ludzi, dawkę dzienną ustala zazwyczaj lekarz. Niemniej jednak odpowiednie dawki poliamin wytworzonych sposobem według wynalazku wynoszą od około 3 do 30 mg/kg/dzień. Poza tym dawkowanie zależy od wieku, wagi i reakcji chorego, jak również od objawów pacjenta oraz od mocy podawanego związku. A zatem możliwe są dawki wychodzące poza podany wyżej zakres.

W przypadku stosowania poliaminy lub jej soli według wynalazku do zwalczania szkodników bezkręgowców, wspomniany związek podaje się bezpośrednio bezkręgowcowi lub dostarcza się go do otoczenia bezkręgowca. Na przykład związek otrzymany sposobem według wynalazku rozpyla się w postaci roztworu na bezkręgowca. O ilości związku, niezbędnego do zwalczania bezkręgowca decyduje osoba stosująca związek, zależnie od rodzaju bezkręgowca i warunków otoczenia.

W przypadku stosowania poliaminy lub jej soli do badań fizjologii komórek, wspomniany związek wprowadza się do komórek znanymi sposobami. Na przykład wspomniany związek wyprowadza się do komórek w odpowiednim buforze fizjologicznym. Odpowiednie do takich badań stężenie związków wytworzonych sposobem według wynalazku wynosi 100 pM. Jednakże stężenie wspomnianych związków w takich badaniach może być większe lub znacznie mniejsze niż 100 pM. O ilości wprowadzanego związku decyduje specjalista stosujący go.

Przykład I. Wstępne frakcjonowanie pełnego jadu Agelenopsis aperta

Pełny jad Agelenopsis aperta, uzyskany z Natural Product Sciences, In., Salt Lake City, Utah 84108, przechowywany w stanie zamrożonym w około -78*C, w ilości od 10 do 60 pl rozmrożono, rozcieńczono do 200 pl i załadowano na kolumnę C-18 Vydac /22 mm x 250 mm, rozmiar porów 300 A, rozmiar cząstek 10 p/ i eluowano z prędkością przepływu 15 ml/min układem rozpuszczalników o zmiennym składzie z następującym programem gradientu liniowego 0% —> 20% B, 100% —» B0% A [0 —> 30 min^, gdzie A oznacza 0,1% wodny roztwór kwasu trójfluorooctowego /TFA/ a B oznacza acetonitryl. Stosowano detekcję monochromatycznego piku przy długości fali 220 nm, a frakcje zbierano za pomocą kolektora frakcji ISC0/F0XY i detektora piku ISCO 2159. Frakcje zbierano w czasie od 0 do 30 minut. Bazując na detekcji piku, zebrano między innymi następujące frakcje:

Frakcja Czas elucji

1	oooło	13,8 min.
2	około	19,25 min
3	około	21,0 (πΐπ.
4	oooło	22,3 πΐπ.
5	oooło	23,1 πΰπ.
6	około	26,0 πιίη.

Frakcję 1 poddano dalszemu frakcjonowaniu, stosując taką samą kolumnę i warunki jak opisano powyżej, lecz z detektorem macierzowym Waters 990, i stwierdzono, że frakcja 1 zawiera poliaminę AGEL 452 o wzorze 2. Poliamina ta jest opisana w zgłoszeniu Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 07/346181. Z frakcją 2 postępowano tak samo jak opisano dla podfrakcjonowania frakcji 1 i stwierdzonowo, że frakcja 2 zawiera poliaminy AGEL 448 o wzorze 4 i AGEL 468 o wzorze 3, które obie opisane są we wspomnianym zgłoszeniu Stanów Zjednoczonych Ameryki. Następnie podfrakcjonowano frakcję 3, stosując kolumnę C-4 Vydac /22 mm x 250 mm, rozmiar porów 300 λ, rozmiar cząstek 10p/ i rozpuszczalnik o zmiennym składzie liniowym 5% —> 10% B, 95% —> 90% A [0 —> 30 min ], gdzie A i B mają wyżej podane znaczenie, oraz detektor macierzowy Waters 990. Stwierdzono, że frakcja 3 zawiera poliaminy AGEL 504 i AGEL 505 o wzorze 5, które opisane są w zgłoszeniu Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 07/346181.

165 647

Przykład II. Podfrakcjonowanie frakcji 5 i oznaczanie budowy zawartych w niej związków

Frakcję 5, otrzymaną w sposób podany w przykładzie I, załadowano na kolumnę Dynamax Phenyl /4,6 mm x 250 mm, rozmiar porów 60 A, rozmiar cząstek 8 μ/ i eluowano z prędkością przepływu 1 ml/min i warunkach izokratycznych 10% B, 90% A, gdzie A i B mają znaczenie podane w przykładzie I. Detekcji piku dokonywano, stosując detektor macierzowy Waters / λ =220 mm/, a zbieranie frakcji przeprowadzono w sposób opisany w przykładzie I. Frakcję, oznaczono tu AGEL 416, otrzymano w następujący sposób:

Frakcja Czas elucji

AGEL 416 około 26,47 min.

Frakcję AGEL 416 przygotowano do analizy spektralnej przez liofilizację z eluenta a następnie przez liofilizację z wody, zgodnie ze znanymi sposobami. Liofilizowany związek z frakcji AGEL 416 przechowywano w temperaturze około -78°C w atmosferze argonu.

Budowę związku, zawartego we frakcji AGEL 416, oznaczono za pomocą spektroskopii masowej FAB i otrzymano następujące wyniki:

FAB MS: /wysoka rozdzielczość/ obserwowano /M+H/ dla C23^H41^N6°4 wyliczono M/Z = 417,3336 /zarejestrowano 417,3342/.

Budowa: 2-/1H-indolilo-3/-N-/16-amino-4,8,13-trójazaheksadecylo-1/-acetamid o wzorze 1.

Przykład III . 2-/1H-indolilo-3/-N-/16-amino-4,B,13-trójazaheksadecylo-1/-acetamid /wzór 1/

Syntezy powyższego związku, stwierdzonego we frakcji AGEL 416 jak opisano w przykładzie II dokonano według schematu 1, 2, 3.

Etap A: Związek o wzorze 9 otrzymano z dwuaminobutanu (wzór 7) i akrylonitrylu (wzór 8) zgodnie z opublikowaną procedurą Yamamoto, Hisashi, 3.Am.Chem.Soc. 103:6133-6136 /1981/.

Etap B: Do 75 ml CH3CN i 11,48 g KF na Celicie dodano w atmosferze azotu 5,78 g /0,041 mola/ związku o wzorze 9, otrzymanego w etapie A, i mieszano. Do mieszanej mieszaniny dodano roztwór 9,75 g /0,041 mola/ związku o wzorze 10 w 25 ml CH3CN, otrzymanego w sposób opisany w przykładzie IV. Mieszaninę ogrzewano do wrzenia przez sześć godzin, a następnie ochłodzono do temperatury pokojowej i pozostawiono na noc. Następnie odsączono KF-Celit a placek filtracyjny dobrze przemyto CH3CN. Przesącz zatężono pod próżnią, otrzymując 14 g surowego produktu w postaci oleju. Surowy produkt poddano chromatografii na 400 g żelu krzemionkowego, stosując 500 ml dwuchlorometanu, następnie 1 litr układu CH2Cl2/MeOH 85:15, 1 litr układu CH2Cl2/MeOH 75:25, 1 litr układu CH2C^/MeOH 75:25 plus 25 ml izopropyloaminy, następnie 1 1 CH2Cl2/MeOH 75:25 plus 50 ml izopropyloaminy, po czym 400 ml układu CF^C^/MeOH 75:25 pluu 77 ml izooropyloaminy. Frakcje k-ntroU-wano za romocą chromatografii cienkowarstwowej i frrkcje zzwiiiOa jące pożądany produkt, co potwierdzono za pomocą spektroskopii NMR, połączono i zatężono pod próżnią, otrzymując 4,7 g związku o wzorze 14.

Etap C: 4,7 g /15,8 mmola/ związku o wzorze 11, otrzymanego w etapie B, rozpuszczono w 150 ml dwuchUooometanu w atmosferze azotu. Następnie dodano 7,56 g /34,7 mmola/ węglanu dwu-t-butylu i mieszaninę reakcyjną mieszano w ciągu nocy w temperaturze pokojowej. Mieszaninę następnie zatężono pod ^dżnią i poddano chromatografii na 400 g żelu krzemionkowego, stosując układ octan etylu/heksan 50:50. Frakcje kontrolowano za pomocą chromatografii cienkowarstwowej /octan etylu/heksan 50:50/. Frakcje, zawierające produkt o wzorze 12 połączono i zztężono ppd p^C^żni^, oHrzymując 7,9 g piroduktu w postaci otaju.

Etap D: Do 125 ml kwasu octowego dodano w atmosferze azotu 7,B5 g /15,8 mmola/ związku o wzorze 12, otrzymanego w etapie C, oraz 6,5 g Pd/OH/2 na węglu. Mieszaninę uwodorniano pod ciśnieniem 344,5 kPa w ciągu 2 godzin. Katalizator odsączono, a placek filtracyjny przemyto dobrze kwasem octowym. Przesącz zatężono, rozpuszczono w 250 ml dωuchl-o-metαnu, przemyto dwukrotnie 100 ml 1N NaOH i wysuszono nad ^COj. Roztwór przesączono, a przesącz zatężono pod próżnią, otrzymując 7,8 g związku o wzorze 13.

Etap E: 7,15 g /14,2 mmola/ związku o wzorze 13 otrzymanego w etapie D, rozpuszczono w 150 ml metanolu w atmosferze azotu. Następnie dodano 1,03 ml /15,6 mmola/ akrylonitrylu i mieszaninę reakcyjną mieszano w ciągu 72 godzin w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną zatężono, rozcieńczono trzy razy dwuchloroletanel i odpędzono rozpuszczalnik pod podżnZą, otrzymując 7,65 g produktu o wzorze 14 w postaci oleju.

165 647

Etap F: 6,45 g /11,6 mmola/ związku o wzorze 14, otrzymanego w etapie E, rozpuszczono w 125 ml dwuchlorometanu w atmosferze azotu. Do roztworu tego dodano 2,6 g /12 mmoli/ węglanu dwu-t-butylu i mieszaninę reakcyjną mieszano w ciągu nocy w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną następnie zatężono i poddano chromatografii na 400 g żelu krzemionkowego, stosując jako eluent układ octan etylu/heksan 50:50. Frakcje połączono i zatężono, otrzymując 6,6 g produktu o wzorze 15 w postaci oleju.

Etap G: Do 150 ml kwasu octowego dodano w atmosferze azotu 6,6 g /10,1 mmola/ związku o wzorze 15, otrzymanego w etapie F oraz 6 g Pd/CH/2 na węglu. Mieszaninę uwodorniano pod ciśnieniem 344,5 kPa w ciągu 2 godzin. Katalizator oddzielono przez odsączenie, a placek filtracyjny przemyto dobrze kwasem octowym. Przesącz zatężono, rozpuszczono w 200 ml dwuchlorometanu, przemyto dwukrotnie 100 ml 1N NaOH i wysuszono nad KjCOj. Roztwór odsączono i przesącz zatężono pod próżnią, otrzymując 6,5 g produktu o wzorze 16.

Etap H: Do 75 ml tetrahydrofuranu dodano w atmosferze azotu 1,75 g /10 mmoli/ kwasu indolooctowego /wzór 17/, 1,15 g /10 mmoli/ N-hydroksysukcynimidu /wzór 18/ i 2,06 g /10 mmoli/ dwucykloheksylokarbodwuimidu. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej a po około 5 minutach utworzył się osad. Po około 1,5 godziny osad usunięto przez odsączenie, a placek filtracyjny przemyto 75 ml tetrahydrofuranu i wysuszono na powietrzu, otrzymując 1,84 g wysuszonej pozostałości. Połączone przesącze zatężono, rozpuszczono w octanie etylu i przesączono, przemywając filtr octanem etylu. Przesącz zatężono, otrzymując pianę. Pianę roztarto z 75 ml eteru dwuetylowego, otrzymując twardą żywicę. Następnie dodano około 30 ml octanu etylu i eter etylowy. Substancje stałe odsączono, przemyto eterem dwuetylowym i wysuszono w atmosferze azotu, otrzymując 1,74 g produktu o wzorze 19. Stwierdzono, że w wyniku traktowania cieczy macierzystej eterem naftowym można otrzymać dodatkowo 0,47 g produktu.

Etap I: 0,33 g /5 mmoli/ związku o wzorze 16, otrzymanego w etapie G, rozpuszczono mieszając w 10 ml dwuchlorometanu w atmosferze azotu, a następnie dodano 0,136 g /5 mmoli/ związku o wzorze 19, otrzymanego w etapie H. Mieszaninę reakcyjną mieszano w ciągu nocy w temperaturze pokojowej. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 35 ml dwuchlorometanu, przemyto 10 ml 0,5 N NaOH, wysuszono nad K2CO3 i zatężono. Koncentrat poddano chromatografii na żelu krzemionkowym stosując jako eluent układ octan etylu/heksan 4:1. Frakcje produktu zatężono, otrzymując 0,37 g białej piany, zawierającej produkt o wzorze 20 i trochę octanu etylu.

Etap J: 0,37 g /0,05 mmola/ związku o wzorze; 22, ottzymanneg w ettpie I, rozpuusczono w atmosferze azotu w 1 0 ml dwuchlorometanu. Następnie dodano 0,218 g /1 γποοΠ więlιnt ddw-t-butylu, a potem 12 ml /0,1 (οιο^// 4-1N,N-dąmttyloamino/piΓydyny. Mitszatitę mieszatr w temutoataoot pokojowej w ciągu 1 godziny, po czym uooosCaiirtr na noc. Mitsz/titę poddano chromatografii na żelu Oztemionkowyri, soosując aak o luuent adi ad anian an , :1, frjkcje' produktu zatężrtr, otrzymując 0,32 g produktu o izorot 21 w postaci białej piany.

Etap K: Do 15 ml kwasu tzójflurrrrctrwtgr dodano w atmosferze azotu 0,32 g /0,35 omoaa/ związku o izozze 21 crzzarnanego w c/poie j , i ąteozano w cćiąu 15 manut. Mieszaninę Γot/kcjnę następnie oatężonr pop /^róin i /οΗβ/Ιο z eterem dwu^aloNym/ o0fzzmując 0^3 g ppo0ul<tu o izooze 1 w poot/ci białego proszku.

Przykład IV. Wytwarzanie związku o wzorze 10

34,5 g /157, 6 mmoZaa 3-bromopropyloaminy HBr mieszano w atmosferze azotu w 600 ml N,N-dwuotCyloformamidu. Do tego roztirru dodano 34,4 g /157,6 moola/ węglanu dwu-t-butylu, a potem 32,3 ml /236 mmoli/ trójetyloaminy. Natychmiast utworzył się osad. Mieszaninę reakcyjną mieszanr w ciągu nocy. Następnie oitoz/titę reakcyjną rrziieńczotr octattm etylu do objętości 1,5 litra, przemyto rao 1N HC1, trzy razy 500 ml wody, raz oolatką i wysuszono nad Na2SO4Po z/tężeniu produkt poddano ihromatrgrafii na 800 g żelu kzztmionUriegr, stosując jako eluent układ heUo/n1rct/t etylu 4:1, i kontrolując frakcje za pomocą chromatrgoafii cienkowarstwowej 1KMNO3/L21. Frakcje zawitrające produkt połączono, o/Cężotr pod próżnią, przemyto dwukrotnie 50 ml dichlorometanu i wysuszono pod wysoką próżnią, otrzymując 25,8 g produktu o izroze 10.

165 647

Η Η Η

Η

Wzór 1

Wzór 2

ΝΗ2

Wzór 3

165 647

OH Η ^H9 Η

Ή

Wzór 4

Wzór 5

Η ^H0 Η Η

Wzór 6

165 647

A. H^l—⁺ nc

Wzór 7 Wzór 8

B. N^CN + Br—

Wzór 9 |_j

BOC-N^N~~N^CN

Η H Wzór 11

C. l^(B0c^BOC

BOC-ΙΨ^Ν—^N-^CN H BOC Wzór 12

D. [^PdtOHlgHOAc

E BOC-N^N''—N-—'NH ‘ H ŚOC

Wzór 13 BOC H BOC-N~^}b—ΙΨ—N^CN H BOC wzór 14 _F |(ΒΟΟ/0

-NBOC—

H

Wzór 10 ⁺ NC^ Wzór 8

I bocboc

BOC Wzór 15 [H^FtiiOHI^HOAc ⁶ BOC BOC

BOC-N—-N— NH2

H BOC Wzór 16

BOC-Ν'

H

Schemat 1

Wzór 19

Schemat 2

165 647

O BOC BOC w O o H BOC

H

Wzór 19 Wzór 16 _μ BOC BOC

J.

(B0C)20

BOC

Wzór 20

K.

H BOC BOC k'l J.

θ BOC^H

BOC

Wzór 21

BOC

Schemat 3·

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 10 000 zł

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Sposób wytwarzania czystego związku poliaminowego o wzorze 1 obecnego w jadżie Agelenopsis aperta oraz farmakologicznie dopuszczalnych soli tego związku, znamienny tym, Ze związek o wzorze 19 poddaje się reakcji ze związkiem o wzorze 16 w obojętnym rozpuszczalniku i obojętnej atmosferze, otrzymany produkt poddaje się reakcji z węglanem dwu-t-butylu, a następnie z 4-/N,N-dwumetyloaminopirydyną/ w obojętnej atmosferze, tak otrzymany produkt poddaje się reakcji z kwasem trójfluorooctowym w obojętnej atmosferze i otrzymane związki ewentualnie przekształca się w ich farmakologicznie dopuszczalne sole w znany sposób.