PL165103B1 - Sposób wytwarzania 16e-metylohydrokortyzonu oraz jego 17a-acylowych I 17 , 21-diacylowych pochodnych - Google Patents

Abstract

Sposób wytwarzania Ιό -metylohydrokortyzonu oraz jego 17 -acylowych i 17 , 21-diacylowych pochodnych o wzorze 1, w których R oznacza atom wodoru lub grupę acylową, znamienny tym, że 16 - metylokorteksolon lub jego 17 -acylowe i 17 ,21-diacylowe pochodne o wzorze 2, w którym R ma podane wyżej znaczenie poddaje się 11 - hydroksylacji przy użyciu nowych klonów szczepu Curvularia lunata IM 2901 otrzymanych drogą regeneracji do formy grzybni mutagenizowanych protoplastów, uzyskanych przez lizę ściany komórkowej grzybni Curvularia lunata enzymami litycznymi.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 16β - metylohydrokortyzonu lub jego 17α - acylowych lub 17α ,21- diacylowych pochodnych z 16β - metylokorteksolonu lub jego 17α - acylowych lub 17α ,21- diacylowych pochodnych, korzystnie z 17α - monopropionianu na drodze 11 β - hydroksylacji przy użyciu nowych klonów szczepu Curvularia lunata IM 2901, otrzymanych drogą regeneracji do formy grzybni mutagenizowanych protoplastrów.

Protoplastry uzyskano przez lizę ściany komórkowej grzybni Curvularia lunata enzymami litycznymi np. preparatem Novozym 234 f - my Calbiochem. Curvularia lunata IM 2901 jest grzybem mikroskopowym, należącym do klasy Deuteromycetes /Fungi Imperfeci/, rzędu Moniliales. Grzyb ten wytwarza na podłożach zestalonych agarem kolonie o kolorze czarnym, szczególnie w części stykającej się bezpośrednio z pożywką. Powierzchnia grzybni, lekko wyniesiona ponad podłoże, jest wyraźnie spilśniona i ma odcień stalowo - szary. Grzybnia substratowa wykazuje tendencje do wrastania wgłąb agaru. Strzępki grzybni uzyskanej z hodowli odznaczają się barwą brązową lub jasno - brązową; ich szerokość waha się od 1,5 pm do 4,5 pm.

Grzybnia wytwarza konidiofory, pojedyncze i w wiązkach, proste lub rozgałęzione, niekiedy zakrzywione, na których mogą występować guzowate zgrubienia. Konidiofory mają barwę czerwono - brązową, jaśniejszą na wierzchołkach wzrostu. Ich długość w hodowli może dochodzić do 400 pm, a szerokość do 3 - 7 pm. Na konidioforach wytwarzane są charakterystyczne konidia, podzielone trzema przegrodami na 4 komórki. Konidia najczęściej są zakrzywione na poziomie trzeciej komórki, która jest szersza i ciemniejsza niż pozostałe. Powierzchnia konidiów jest gładka, a ich wymiary wahają się w granicach 18 - 30 pm x 9 - 14 pm. Konidiofory i konidia są uznanymi elementami klasyfikacyjnymi grzybów mikroskopowych.

Zdolności 11β - hydroksylujące steroidów ma szereg innych drobnoustrojów między innymi: Curvularia lunata patent US 265 823, 1953, Cunninghamella blakesleeana J.Am.Chem.Soc. 1975, 75, 5339, Absidia orchidis Folia Microbiol 1961, 6, 392, Tieghemella orchidis Microbiologia 1975, 44, 351. Drobnoustroje te /jak również kolekcje szczepów 11 β hydroksylujących posiadane przez Pabianickie Zakłady Farmaceutyczne Polfa /w procesie 11 β - hydroksylacji steroidów wytwarzają produkty uboczne 1β, 6 β, Μα - hydroksypochodne, 7 α, Μα oraz 11 β, Μα - dihydroksypochodne i 11 - ketopochodne, co znacznie obniża wydajność procesu czyniąc go mało opłacalnym ekonomicznie. Zastosowanie do procesu 11 β - hydroksylacji steroidów nowych klonów szczepu Curvularia lunata, pozbawionych niekorzystnych cech szczepu wyjściowego wyeliminowało lub znacznie ograniczyło powstawanie produktów ubocznych, co w efekcie zwiększyło wydajność procesu z 40% do 60%. Ponadto poprzez zastosowanie do procesu biokon wersji 17α i 17α ,21 - acylowych pochodnych 16 β - metylokorteksolonu korzystnie 17 - monopropionianu uzyskano prawie jednokierunkowy przebieg procesu 11β -hydroksylacji.

165 103

Według wynalazku procesowi 11 β - hydroksylacji przy użyciu grzybni wegetatywnej nowych klonów szczepu Curvularia lunata IM 2901 poddaje się 17ta - acylowe lub 17α, 21 diacylowe pochodne 16β - metylokorteksolonu, korzystnie 17 - monopropionianu 16β - metylokorteksolonu, w wyniku czego otrzymuje się 16β - metylohydrokortyzon 17α - acylo lub jego 17α, 21 - diacylowe pochodne. Zatrzymanie procesu biokonwersji na odpowiednim etapie jest proste, gdyż uprzywilejowanym kierunkiem reakcji jest proces 11 β - hydroksylacji.

Grzybnie namnażamy w warunkach tlenowych na pożywkach zawierających przyswajalne źródła węgla, azotu, jonów metali i substancji odżywczych. Do namnożonej grzybni, korzystnie odwirowanej i zawieszonej w wodzie, dodajemy steroid jednorazowo lub w porcjach rozpuszczony w mieszaninie aceton - metanol 1:1. Proces 11 β -hydroksylacji przebiega przy odpowiednim mieszaniu, napowietrzaniu 0,6 - 0,8 dm³ na 1 dm³ kultury na 1 minutę, przy nadciśnieniu 0,08 - 0,1 MPa, temperaturze 28°C i pH 6,0 - 6,6. Przebieg procesu kontroluje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Po zakończeniu procesu 11 β - hydroksylacji, korzystnie również procesu hydrolizy 17α - estru i 17α, 21 - diestru, grzybnie odfiltrowuje się i wydziela z filtratu produkt przez ekstrakcję np. chloroformem. Steroid z ekstraktów wydziela się przez frakcjonowane zatężanie i oczyszcza przez krystalizację.

Przykład I. Klony szczepu Curvularia lunata IM 2901 hodowano w ciągu 7-10 dni w temperaturze 28°na podłożu stałym /skosy/ o składzie:

Ekstrakt drożdżowy - 4g

Glukoza - 4g

Agar - 255;

Brzeczka słodowa 6°Blg -1000 cm?

pH podłoża 6,7 - 7,0. Podłoże sterylizowano 20 minut w 117 °C.

Po uzyskaniu dobrego wzrostu grzybni barwy brunatno - pomarańczowej skos zmywano 3 ml sterylnej wody destylowanej z dodatkiem tweenu 80. Zawiesiną uzyskaną ze zmycia 5 skosów szczepiono 5 kolb stożkowych poj. 500 cm3 z 30 cm3 podłoża o składzie:

Pepto - 55

Ekstrakt drożdżowy - 55

Fosforan potasu I zas. - 55

Glukoza - 10g

Brzeczka słodowa 12°Blg - H^cr^³

Woda destylowana - do 1000 cm3 pH podłoża 5,8 - 6,0. Podłoże sterylizowano 20 minut w 120°C.

Wzrost kultury prowadzono w warunkach tlenowych na trzęsawce obrotowej w temperaturze 28°C. Po 24 godzinach wzrostu grzybnię przeszczepiono do 5 kolb stożkowych o poj. 2000 cm3 zawierających po 250 cm3 podłoża o składzie jak w poprzednim etapie wzrostu. Wzrost prowadzono przez g8 - 72 godziny w warunkach jak przedni etap, do uzyskania gęstej kłaczkowatej grzybni koloru beżowo - brunatnego. Kultura ta stanowi inoculum do zaszczepienia fermentora poj. 25 dm3 zawierającego 12 dm3 podłoża o składzie:

Mąka sojowa - 30g

Sacharoza - 10g

Fosforan potasu I zas. - 5g

Glukoza - 8g

Olej sojowy - 1g

Olej silikonowy - 0,5g

Woda technologiczna - do 1000 cm?

pH podłoża 6,9. Podłoże sterylizowano 40 minut w 121°C.

Wzrost w fermentorze prowadzono przy mieszaniu i napowietrzaniu 0,6 - 0,8 dm? na 1 dm? kultury na 1 minutę przy nadciśnieniu 0,08 - 0,1 MPa. Po 24 godzinach wzrostu gęstą kulturę barwy beżowo - brunatnej przeszczepiono do następnego fermentora poj. 200 dm? z 100 dm? podłoża o składzie:

Mąka sojowa - 30g

Sacharoza - 10g

Glukoza - 8g

165 103

NaNO3 - 2g

KH2PO4 - 5g

MgSOą . 7 H20 - 0,5g

FeSOą . 7 H2O - 0,01 g

CaCL2 - 0,5g

Olej sojowy - 1 g

Olej silikonowy - 0,5g

Woda technologiczna - do 1000 cm³ pH podłoża 6,9. Podłoże sterylizowano 40 minut w 121°C.

Parametry prowadzenia procesu jak w fermentorze pierwszym. Po 24 godzinach gęstą wyrośniętą grzybnię odfiltrowano, przemyto wodą i zawieszono w 100 dm3 wody destylowanej, biorąc 8, - 1 oOg grzybni na 1 dm³ wody, pH zawieszonej w wodzie grzybni 6,4 - 6,6. Do tak przygotowanej kultury dodano 88, 17 - 16β - metylokorteksolonu rozuusczzongoo w 800 cm3 mieszaniny aceton - metanol 1:1. Proces 11β - l^^^<rn^!kyllcci i prowadzono w takich samych warunkach jak wzrost w fermentorze, w ciągu około 16 godzin do momentu całkowitej przemiany substratu do 16β - metylohydrokortyzonu. Po zakończeniu procesu grzybnię odfiltrowano, przemyto wodą i steroid z filtratu wyodrębniono przez ekstrakcję chloroformem i następnie oddestylowano rozpuszczalnik. Otrzymany surowy produkt krystalizowano z metanolu. Wydajność procesu 60%.

Przykład II. Do wyhodowanej i zawieszonej w wodzie jak w przykładzie I grzybni, steroid do biokonwersji-n - mooopropiooiao 16β - metylokorteksoloou dodawano w porcjach po 0,8g/l do końcowego stężenia 1,6g/l. Proces 11 β - hydroksylacji prowadzono w ciągu 2g 30 godzin w warunkach jak w przykładzie I. Po zakończeniu procesu, grzybnię odfiltrowano, przemyto wodą i steroid z filtratu wyodrębniono analogicznie jak w przykładzie I. Z grzybni produkt wyodrębniono przez przemywanie jej acetonem i następnie oddestylowanie rozpuszczalnika. Wydajność procesu 60%.

Przykład III. Postępując analogicznie jak w przykładzie I, proces 11 β- hydroksylacji 17 - monoprzpiooiaou 16β - metylo-korteksolonu prowadzono w ciągu 6 godzin do momentu całkowitej przemiany substratu do 17 - propionianu 16β - metylohydrokortyooou. Produkt wyodrębniono analogicznie jak w przykładzie I. Wydajność procesu 65%.

CH₂0R

wzór 1 wzór 2

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 zł

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Sposób wytwarzania 15e-metylohydrokortyzonu oraz jego 17α-acylowych i 17α, 21 -diacylowych pochodnych o wzorze 1, w których R oznacza atom wodoru lub grupę acylową, znamienny tym, że 16P-metylokorteksolon lub jego 17α -acylowei 17 a,21-diacylowe pochodne o wzorze 2, w którym R ma podane wyżej znaczenie poddaje się 11 β - hydroksylacji przy użyciu nowych klonów szczepu Curvularia lunata IM 2901 otrzymanych drogą regeneracji do formy grzybni mutagenizowanych protoplastów, uzyskanych przez lizę ściany komórkowej grzybni Curvularia lunata enzymami litycznymi.