Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kwasu D-mlekowego na drodze fermentacyjnej.Z brytyjskiego opisu patentowego nr 1 157 213 znany jest sposób wytwarzania kwasu D-mlekowego na drodze fermentacyjnej. Stosowany w tym sposobie Lactobacillus leichmannii ATCC 4797 jest w stanie wytwo¬ rzyc w ciagu 60 godzin 113 g kwasu D-mlekowego w 1 litrze pozywki zawierajacej obok innych zwyklych dodat¬ ków glukoze albo melase z buraków cukrowych.Ze wzgledu na wzrastajace zapotrzebowanie na kwas D-mlekowy jako substancje wyjsciowa do chemicz¬ nych syntez zwiazków optycznie czynnych powstala koniecznosc opracowania bardziej wydajnego sposobu jego wytwarzania. Chodzilo przy tym zwlaszcza o skrócenie czasu fermentacji oraz znalezienie mikroorganizmu, który zuzywa nie tylko glukoze i melase z buraków cukrowych, lecz takze cukier mlekowy, który wystepuje w duzych ilosciach w serwatce. Cel ten zostal osiagniety za pomoca Lactobacillus bulgaricus.Bakterie kwasu mlekowego Lactobacillus bulgaricus znane sa z tego, ze ze wzgledu na wysoka aktywnosc w przemianie materii zdolne sa do szczególnie szybkiej fermentacji. Stosuje sie je wiec do wytwarzania jogurtu, przy czym sa one w stanie doprowadzic fermentacje mleka do konca w ciagu 4 godzin. Jednak wystepujace w przyrodzie i w sfermentowanym mleku szczepy Lactobacillus bulgaricus nie wytwarzaja wiecej niz 25-30 g kwasu mlekowego na litr srodowiska. Wiecej niz polowa obecnego cukru mlekowego pozostaje nie przerobiona.Niespodziewanie w zakwaszonej próbce mleka znaleziono szczep Lactobacillus bulgaricus, którego wydaj¬ nosc droga planowanych selekcji udalo sie tak dalece polepszyc, ze wytwarza on do 115 g kwasu mlekowego na litr srodowiska. Dokladna identyfikacja tego szczepu wykazala, ze sklada sie on z dlugich Gram-dodatnich paleczek, które sa katalazo-ujemne, nieruchome i mikroaerofilowe oraz nie zawieraja sporów. Ponadto mozna go scharakteryzowac za pomoca nastepujacych danych: Przemiana materii: homofermentacyjna fermentacja kwasu mlekowego gaz z glukozy: — gaz z glukonianu:— Wzrost w temperaturze 15°C: — Wzrost w temperaturze 45°C: + Wytwarzanie kwasu z rybozy:- arabinozy: —2 130 289 ksylozy: — mannitu: — sorbitu: — glukozy:+ ¦ j galaktozy:- laktozy: + ^ ' maltozy:- sacharozy: — trehalozy: — cellobiozy: — melibiozy: — rafinozy: — salicyny:- amigdaliny: — Rozszczepianie argininy: — Konfiguracja kwasu mlekowego: D (-) Kwas dwuaminopimelinowy w sciance komórki: brak Szczep ten w niemieckim zbiorze mikroorganizmów zostal zdeponowany pod nr DSM 2129.Nowy szczep Lactobacillus bulgaricus jest wstanie wyprodukowac wciagu 48 godzin do 115 g kwasu D-mlekowego na litr srodowiska. Szczep ten nie jest ponadto wyspecjalizowany pod katem fermentacji glukozy, lecz prawie równie szybko jak glukoze poddaje fermentacji cukier mlekowy do kwasu mlekowego. W zwiazku z tym serwatka wystepujaca w duzych ilosciach jako produkt odpadowy w przemysle mleczarskim moze byc stosowana jako zródlo surowca do wytwarzania kwasu D-mlekowego.Przedmiotem wynalazku jest wiec sposób wytwarzania kwasu D-mlekowgo droga fermentacji pozywki zawierajacej glukoze i/lub cukier mlekowy i inne zwykle dodatki, w którym jako mikroorganizm produkujacy kwas mlekowy stosuje sie Lactobacillus bulgaricus DSM 2129. Cukier mlekowy stosuje sie przy tym na ogól w postaci swiezej serwatki albo w postaci zawiesiny sproszkowanej serwatki, przy czym ewentualnie mozna jeszcze dodawac tez glukoze.Pozywki stosowane do uzyskiwania kwasu D-mlekowego sa komponowane w znany sposób. Obok glukozy i/lub cukru mlekowego musza naturalnie zawierac jeszcze zródlo azotu, przy czym bierze sie pod uwage na przyklad wyciag miesny, namok kukurydziany lub maczke sojowa. Ponadto dodaje sie tez sole mineralne witaminy i srodki powierzchniowo czynne. Jako srodki powierzchniowo czynne bierze sie pod uwage zwlaszcza wystepujace w handlu niejonowe srodki powierzchniowo czynne, korzystnie produkty ciekle. Tesrodki powierz¬ chniowo czynne na ogól zawieraja jako substancje czynna polioksalkilany, np. produkty reakqi alkoholu i kwa¬ sów z tlenkiem etylenu i/lub tlenkiem propylenu. Jako alkohole bierze sie pod uwage alkohole jedno- i wielowo- dorotlenowe, takie jak alkohole szeregu tluszczowego, alkohole zywiczne, gliceryna, erytryt, pentaerytryt lub alkohole cukrowe, jak sorbit i mannit, a jako kwasy zwlaszcza kwasy szeregu tluszczowego i kwasy zywiczne.Korzystnie sa równiez czesciowe estry takich wielowartosciowych alkoholi i wymienionych kwasów, jak oksyety- lany monooleinianu anhydrosorbitu.Ze wzgledu na to, ze Lactobacillus bulgaricus DSM 2129 warazliwy jest na kwasy, nalezy powstajacy kwas mlekowy wiazac wodortlenkami lub weglanami metali alkalicznych lub metali ziem alkalicznych, zwlaszcza weglanem wapnia. W ten sposób wartosc pH utrzymuje sie w zakresie 4,5—7, korzystnie 6,5—6,8. Kazda pozyw¬ ke przed zaszczepieniem Lactobacillus bulgaricus DSM 2129 nalezy poddac sterylizacji w celu usuniecia ewentu¬ alnych zanieczyszczen obcymi organizmami. W tym celu wystarczajace jest ogrzewanie pozywki w ciagu 15 minut do temperatury 121°C.Jak we wszystkich procesach odfermentowywania kwasu mlekowego, równiez w sposobie wedlug wynalaz¬ ku nalezy zachowywac warunki beztlenowe. Do tego celu wystarcza dwutlenek wegla powstajacy przy zobojet¬ nianiu kwasu mlekowego weglanem wapnia albo pokrycie srodowiska fermentacyjnego warstwa azotu. Odfermen- towywanie kwasu mlekowego mozna prowadzic w temperaturze 30-50°C, korzystnie 40-45°C. Z powstajacej w sposobie wedlug wynalazku soli kwasu D-mlekowego mozna otrzymywac wolny kwas D-mlekowy za pomoca wymieniaczy jonowych albo w przypadku mleczanu wapnia przez zakwaszanie kwasem siarkowym.Wynalazek jest blizej objasniany w nastepujacych przykladach, przy czym procenty oznaczaja procenty wagowe.Przyklad I. Rozwój szczepu Lactobacillus bulgaricus DSM 2129. Stwierdzony w próbce sfermentowa¬ nego mleka szczep Lactobacillus bulgaricus wyodrebnia sie i hoduje na nastepujacej pozywce 1 (wszystkie dane wg/litr): pepton kazeinowy (tryptycznie trawiony) -10, ekstrakt miesny (Merck)-10, ekstrakt drozdzo¬ wy - 5, glukoza - 20, K2HP04 - 2, octan sodu - 5, M$S04-7H20 -0,2, MnS04#H20 - 0,05, niejonowy sro¬ dek powerzchniowo czynny- 1 ml/litr.Nastepnie próbki tego szczepu rozciencza sie i przeszczepia na plytki agarowe otrzymane z tego samego srodowiska z dodatkiem 1,8% agaru. Zaszczepiane plytki agarowe przechowuje sie-nastepnie w warunkach bez-130 289 3 tlenowych w termostacie w temperaturze 45°C w ciagu jednego dnia.Nastepnie pobiera sie 30 pojedynczych kolonii i kazdorazowo wprowadza do probówek zawierajacych nastepujaca pozywke 4 (dane w g/litr):glukoza - 50, CaC03 - 70, ekstrakt drozdzowy- 7, namok kukurydzia¬ ny (suchy) - 15, octan sodu- 5f niejonowy srodek powierzchniowo czynny — 1 ml/litr.Hodowle prowadzi sie w ciagu 24 godzin w temperaturze 45°C. Po uplywie 24 godzin wyraznie widac róznice pomiedzy hodowlami o zróznicowanej zdolnosci fermentacyjnej po kazdorazowo wytwarzanych ilos¬ ciach kwasu D-mlekowego. Probówke o najwyzszej zawartosci kwasu D-mlekowego stosuje sie do sporzadzania nowego wymazu na plytkach. Postepowanie to powtarza sie regularnie w ciagu 8 tygodni, podnoszac przy tym zawartosc cukru w pozywce najpierw do 8%, a po nastepnych 5 tygodniach do 10%. Nastepnie szczep selekcjo¬ nuje sie wciagu dalszych 12tygodni, az do momentu uzyskania zdolnosci metabolizowania 100 g glukozy w litrze pozywki wciagu 24godzin do 65%, wytwarzajac 55 g kwasu D-mlekowego/litr. Calkowita odbudowe glukozy obserwuje sie po uplywie 36—40 godzin.Przyklad II. Uzyskany wedlug przykladu I szczep Lactobacillus bulgaricus zaszczepia sie w probów¬ kach do hodowli drobnoustrojów, przy czym kazda probówka zawiera 15 ml pozywki 1. Probówki utrzymuje sie w temperaturze 45°C w ciagu co najmniej 8 godzin i najwyzej 20 godzin w polozeniu pionowym, po czym stosu¬ je jako inokulum dla kultur w kolbach Erlemneyera, zawierajacych kazdorazowo po 250 ml pozywki 1, które równiez utrzymuje sie w temperaturze 45°C w ciagu 8-20 godzin. Zawartosc 6 wyzej wymienionych kolb Erlen- meyera sluzy nastepnie jako inokulum dla fermentora o pojemnosci 30 litrów, do którego uprzednio wprowadzo¬ no nastepujaca pozywke 2 (dane w g/litr): glukoza- 30, CaC03 - 15, ekstrakt drozdzowy - 7, pepton kazeino¬ wy —10, namok kukurydziany (suchy) — 20, octan sodu — 5, niejonowy srodek powierzchniowo czynny-1 ml/litr.Zawartosc fermentora miesza sie stosujac 100 obrotów na minute i po 8—12 godzinach w temperaturze 45°C przeprowadza do fermentora o pojemnosci 270 litrów, zawierajacego wymieniona w przykladzie I pozyw¬ ke 4 albo nastepujaca pozywke 3 (dane wg/litr): glukoza -30, CaC03 - 70, ekstrakt drozdzowy - 7, maczka sojowa — 15, octan sodu — 5, niejonowy srodek powierzchniowo czynny — 1 ml/litr.Po podrosnieciu hodowli, to znaczy po uplywie okolo6-8 godzin, dodaje sie jeszcze glukoze. Dodatkowa ilosc glukozy zalezy do stopnia zuzycia glukozy i tworzenia kwasu. Lacznie w ciagu 40—50 godzin dodaje sie ilosc glukozy odpowiadajaca okolo 10% wagowych pozywki. Z glukozy tworzy sie 110—115 g kwasu D-mleko- wego/litr srodowiska hodowlanego (co odpowiada 159-166 g mleczanu wapnia). Wolny kwas mlekowy wyodreb¬ nia sie zanymi metodami, a mianowicie przez wytracanie wapnia kwasem siarkowym, saczenie, odparowywanie i oczyszczanie droga destylaqi w postaci estru etylowego lub metylowego.Stosowanie pozywki 3 ma te zalete, ze w produkcie koncowym nie wystepuje dajaca sie stwierdzic ilosc kwasu L-mlekowego. Pozywka 4 ma te zalete, ze o wiele lepiej daje sie saczyc po fermentacji w porównaniu z pozywka 3, poniewaz maczka sojowa w pozywce 3 ulega tylko czesciowej odbudowie. Produkt wytwarzany przy uzyciu pozywki 4 zawiera 1,5-2% kwasu L-mlekowego pochodzacego z namoku kukurydzianego wystepu¬ jacego w pozywce.Po przesaczeniu mozna rozszczepic kwas L-m lekowy, przeprowadzajac przesacz przez reaktor enzymatycz¬ ny zawierajacy enzym, który specyficznie rozszczepia kwas L-mlekowy. Nadaja sie tu uklady z L-laktatoksydaza, L-laktatdehydrogenaza 'lub cytochromu t2- L-laktatdehydrogenaza wymaga stosowania NAD jako ko-faktora, który moze tez byc osadzony na nosniku i w zwiazku z tym moze byc pózniej zregenerowany i ponownie zastosowany. Dla cytochromu b2 jako ko-faktor stosuje sie zelazicyjanek, który mozna ponownie utlenic za pomoca pradu elektrycznego na elektrodzie z metalu szlachetnego.Przyklad III. Wytwarza sie kulture podstawowa i inokulum w sposób opisany w przykladzie II, lecz jako pozywke stosuje sie nastepujaca pozywke 5, która jako substrat do fermentacji zawiera cukier mlekowy (dane w g/litr): sproszkowana serwatka- 60, CaC03 - 70, ekstrakt drozdzowy- 3, maczka sojowa- 5, octan sodu — 5, niejonowy srodek powierzchniowo czynny — 1. ml/litr.Analogicznie do przykladu II po podrosnieciu hodowli wprowadza sie dodatkowa ilosc substratu cukrowe¬ go, a to tak dlugo, az lacznie wprowadzana ilosc cukru mlekowego wyniesie 130 g/litr. Tworzenie kwasu mleko¬ wego trwa nieco dluzej niz w przykladzie II, lecz dobiega konca po uplywie 45—55 godzin. Poza tym postepuje sie, jak w przykladzie II.Przyklad IV. Kulture podstawowa i inokulum uzyskuje sie pod azotem, jak opisano w przykladzie I.Stosuje sie pozywki 3,4 albo 5, lecz poczatkowo bez CaC03, który dodaje sie pózniej w postaci suchej lub w postaci 20% zawiesiny, tak aby wartosc pH nigdy nie obnizyla sie ponizej 5,5. Po 48 godzinach rozpoczyna sie dodatkowe dawkowanie pozywki. Stopien rozcienczania wynosi poczatkowo 0,01 litra/godzine na litr pozywki, przy czym taka sama ilosc cieczy odbiera sie z fermentora w sposób ciagly. Stopien rozcienczania powoli pod¬ wyzsza sie az do wartosci 0,03-0,04 litra/godzine na litr pozywki, przy czym wyciek z fermentora wykazuje zawartosc 5-7% kwasu D-mlekowego. Z wycieku oddziela sie mase komórkowa za pomoca separatora, pracuja¬ cego w sposób ciagly i zawraca do 90% do fermentora. W cieczy znad osadu nastawia sie wartosc pH na 6,5 za pomoca wodorotlenku wapnia i odparowuje do okolo 1/10 pierwotnej objetosci. Wwymrazarce koncentrat chlodzi sie do temperatury +4°C, przy czym wykrystalizowuje mleczan wapnia. Stezony roztwór wplywa do4 130 289 wymrazarki w sposób ciagly, podczas gdy wytracony mleczan wapnia usuwa sie w regularnych odstepach przy uzyciu zaworu zasuwanego. Lug macierzysty zawraca sie do fermentora. Kwas mlekowy uwalnia sie z otrzymane¬ go mleczanu wapnia za pomoca kwasu siarkowego i nastepniesaczenia. ^ Przyklad V. Ciagly sposób wytwarzania kwasu mlekowego wedlug przykladu IV powtarza sie zta t róznica, ze do sterowania wartoscia pH stosuje sie nie CaC03, lecz wodorotlenek sodu. Zaleta tego sposobu polega na tym, ze mozliwe jest wtedy utrzymywanie wartosci pH 6,5—6,8, wskutek czego podwyzsza sie pred- ? kosc odfermentowywania Lactobacillus bulgaricus DSM 2129. Otrzymany roztwór mleczanu sodu wprowadza sie na kolumny jonowymienne, które adsorbuja kwas mlekowy. Po zaladowaniu kolumny kwasem mlekowym eluuje sie go kwasem solnym. Po regeneracji za pomoca rozcienczonego lugu sodowego kolumne mozna ponownie stosowac do adsorpcji kwasu mlekowego.Zastrzezenia pate ntowe 1. Sposób wytwarzania kwasu D-mlekowego droga beztlenowej fermentacji pozywki zawierajacej glukoze i/albo cukier mlekowy i inne zwykle dodatki w temperaturze 30—50°C przy wartosci pH, 4,5—7, znamien¬ ny t y m, ze jako drubnoustrój wytwarzajacy kwas mlekowy stosuje sie Lactobacillus bulgaricus DSM 2129. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze fermentacje prowadzi sie w atmosferze gazu ochronnego.PracowniaPoligraficzna UP PRL. Naklad 100 egz.Cena 100 n PL PL PL PL