PL126069B2 - Method of manufacture of proteolytic enzymes - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania na drodze mikrobiologicznej enzymów proteolitycznych, a zwlaszcza sluzacych do koagulacji bialek mleka.Znane sa liczne sposoby otrzymywania, w oparciu o hodowane na pozywkach plynnych mikroorganizmy, aktywnych koagulacyjnie enzymów proteolitycznych.Jednym ze znanych przkladówjest otrzymywanie preparatu znanego pod nazwa protopolimy- xyna Q-158, w którym zastosowanie znajduje szczep bakterii Bacillus polimyxa 13-13 hodowany na podlozu plynnym metoda wstrzasana w okresie czasu 32 godzin i w temperaturze 25°C. W celu wyhodowania szczepu bakterii wykorzystano 750 ml kolby, stosujac 100 ml plynnego podloza i 4% materialu siewnego w postaci inokulum, przy czym w sklad podloza wchodzilo 1% odtluszczonego suchego mleka, 2% ziemniaczanej skrobi, 0,5% K2HP04, 0,05% MgS04, 0,05% MnS04 i 0,001% FeSo4. Po zakonczeniu hodowli oddzielono poprzez wirowanie biomase, a dalszym badaniom poddano supernatant. Z supernatantu wytracono siarczanem amonu i o stopniu nasycenia 40-80% oraz rozpuszczalnikami organicznymi bialka enzymatyczne, przy czym jako rozpuszczalnik stoso¬ wano etanol o stezeniu koncowym 48-80%, izopropanol 66-83% i aceton 66-83%. Optymalny efekt uzyskiwano przez wysalanie plynu pohodowlanego (NH4)2S04 do 0,7 stopnia nasycenia.Oddzielony wirowaniem przy 5000 obr/min osad rozpuszczano w malej objetosci wody destylowa¬ nej i poddawano 12-godzinnej dializie-przeplywowej wobec wody wodociagowej w temperaturze 1°C. Poprzez sublimacyjne wysuszenie dializatu uzyskano wysoko aktywny koagulacyjnie prepa¬ rat, przy wydajnosci procesu 98,6%. (I. Ja Veselov,Smirnowa: Proteoloticzeskij preparat iz kultury bakterii Bacillus polimyxa 13-13. Prikldnaja biochimja i mikrobiologija XI, wyp. 6, s.824 1975).Znany jest równiez przyklad, w którym badany szczep bakterii Bacillus cereus wyizolowano z mleka na agarze cukrowym prowadzac hodowle na bodlozu syntetycznym zawierajacym 1% glukozy. Maksymalne uwalnianie proteaz obserwowano po siedmiu dniach w temperaturze 40°C i pH 8,0. Uzyskany oczyszczony enzym wykazal wobec kazeiny aktywnosc proteolityczna wyzsza od dostepnych preparatów handlowych (TaniJ., Noami S., Ashida H. at all.; Studies on the bacterial protease I. Isolation and charakterization of protease produced by a strain of Bacillus cereus.J. Bact. 23/2/, 145-51, 1968).2 126069 Zgodnie z istota wynalazku szczepiac podloze hodowlane dwudziestoczterogodzinna hodowla plynna bakterii Bacillus circulans w ilosci 1-2% i nastepnie prowadzac ja przez 17-24 godzin w warunkach wstrzasania i temperaturze 25-40°C otrzymuje sie produkt wyjsciowy, który po odwi¬ rowaniu przy 10 000 obr/min w okresie 20-30 minut pozwala na wydzielenie supernatantu, z którego pod dzialaniem acetonu w stezeniu koncowym 75-90% w temperaturze -10°C wydziela sie osad bialka enzymatycznego rozpuszczony nastepnie w 5 ml wody destylowanej. Jako podloze hodowlane bakterii stosuje sie rozcienczona 2-5 krotnie serwatke z mleka odtluszczonego z dodatkiem 0,1-1,0% maki sojowej, wzglednie zarodków zbozowych, przy wyjsciowym pH 6-8,5.Zastosowana serwatka moze byc zastapiona sokiem ziemniaczanym uzyskanym w wyniku pier¬ wszego wirowania.Sposób wedlug wynalazku dotyczacy otrzymywania enzymów proteolitycznych polega na zaszczepieniu 50 ml podloza w postaci rozcienczonej 2-5 krotnie woda destylowana serwatki z odluszczonego mleka, wzglednie soku ziemniaczanego uzyskanego przy pierwszym wirowaniu miazgi, w ilosci 1-2% inokulum w postaci 24-godzinnej kultury bakterii Bacillus circulans. Jakosc wykorzystywanego podloza warunkuja wyjsciowe pH 6-8,5 i wzbogacenie jego dodatkiem w postaci 0,1-1,0% maki sojowej, wzglednie zarodników zbozowych.Uzyskana ta droga hodowla zostaje poddana w okresie 17-48 godzin wstrzasaniu przy czestotliwosci 180 obr/min i w temperaturze 25-40°C.Otrzymany produkt wyjsciowy poddaje sie wirowaniu przy 10000 obr/min w okresie 0,5 godziny, a uzyskany plyn pohodowlany w postaci supernatantu charakteryzuje pH 7-9, zawartosc bialka 1-3 mg/ml, aktywnosc proteolityczna 3000-4000 jednostek na mililitr plynu i aktywnosc koagulacyjna 1000-2000 jednostek na mililitr plynu.Stosujac aceton o stezeniu koncowym 75-90% z otrzymanego supernatanu w temperaturze -10°C wytraca sie bialko enzymatyczne, uzyskujac 90-100% wydajnosc koagulacyjna i 30-40% wydajnosc aktywnosci proteolitycznej.Przyklad I. Umieszczone w 500 ml kolbie 50 ml podloza, w postaci dwukrotnie rozcienczo¬ nej woda destylowana serwatki z odtluszczonego mleka i 0,5% maki sojowej o wyjsciowym pH 7,5 szczepi sie 24-godzinna hodowla plynna bakerii Bacillus ciroculans w ilosci 1%. Przedmiotowa hodowle prowadzi sie przez 24 godzin w temperaturze 30°C na wstrzasaczu przy 180 obr/min.Uzyskany ta droga material wyjsciowy poddaje sie wirowaiu przy 10 000 obr/min w okresie 20 minut, otrzymujac w wyniku rozdzielenia supernatant o pH 8, zawartosci bialka 1,5mg/ml, aktywnosci proteolitycznej na hemoglobinie 7,6 mg tyrozyny na mililitrze i aktywnosci koagulacyj- nej 3000jednostek na mililitr plynu pohodowlanego. Stosujac aceton o stezeniu koncowym 80% w temperaturze -10°C i przy ciaglym mieszaniu wytraca sie osad bialka enzymatycznego, który kolejno po godzinie odstawia, wykorzystujac wirówke z chlodzeniem, odwirowuje sie przy 3500 obr/min i rozpuszcza w 5 ml wody destylowanej otrzymujac ta droga produkt koncowy w postaci wstepnie oczyszczonego roztworu enzymów proteolitycznych.Przedmiotowy proces charakteryzuje wydajnosc koagulacyjna 99% i wydajnosc aktywnosci proteolitycznej na hemoglobinie 30%, a na kazeinie 44%.Przykladu. Umieszczone w 500 ml kolbie 50 ml podloza w postaci uzyskanego w wyniku pierwszego wirowania miazgi soku ziemniaczanego wzbogaconego 0,5% zarodników zbozowych o wyjsciowym ph 8 szczepi sie 24-godzinna hodowla plynna bakterii Bacillus circulans w ilosci 1,5%.Przedmiotowa hodowle prowadzi sie przez 17 godzin w temperaturze 30°C na wytrzasaczu przy 180 obr/min.Uzyskany ta droga material wyjsciowy poddaje sie wirowaniu przy 10 000 obr/min w czasie 20 minut, otrzymujac w wyniku rozdzialu supernatant o pH 8,6, zawartosci bialka 2 mg/ml, aktyw¬ nosci proteolitycznej na hemoglobinie 8 mg tyrozyny na mililitr i aktywnosci koagulacyjnej 3 500 jednostek na mililitr plynu pohodowlanego.Stosujac aceton o stezeniu koncowym 80% w tempera¬ turze -10°C i przy ciaglym mieszaniu wytraca sie osad bialka enzymatycznego, który kolejno po godzinie odstania, wykorzystujac wirówke z chlodzeniem, odwirowuje sie przy 3500 obr/min i rozpuszcza w 5 ml wody destylowanej otrzymujac ta droga produkt koncowy w postaci wstepnie oczyszczonego roztworu enzymów proteolitycznych.Przedmiotowy proces charakteryzuje wydajnosc koagulacyjna 99% i wydajnosc aktywnosci proteolitycznej na hemoglobinie 30%, a na kazeinie 44%.126069 3 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób otrzymywania enzymów proteolitycznych, a zwlaszcza sluzacych do koagulacji bialek mleka, znamienny tym, ze szczepiac podloze hodowlane dwudziestoczterogodzinna hodowla plynna bakterii Bacillus circulans w ilosci 1-2% i nastepnie prowadzac ja przez 17-24 godzin w warunkach wstrzasania i temperaturze 25-40°C otrzymuje sie produkt wyjsciowy, który po odwi¬ rowaniu przy 10000 obr/min w okresie 20-30 minut pozwala na wydzielenie supernatantu, z którego pod dzialaniem acetonu o stezeniu koncowym 75-90% w temperaturze -10°C wydziela sie osad bialka enzymatycznego rozpuszczany nastepnie w 5ml wody destylowanej. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako podloze hodowlane bakterii stosuje sie rozcienczona 2-5 krotnie serwatke z mleka odtluszczonego z dodatkiem 0,1-1,0% maki sojowej, wzglednie zarodków zbozowych, przy wyjsciowym pH 6-8,5. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako podloze hodowlane bakterii stosuje sie Uzyskany w wyniku pierwszego wirowania sok ziemniaczany z dodatkiem 0,1-1,0% maki sojowej, Wzglednie zarodków zbozowych, przy wyjsciowym pH 6-8,5. PL

Claims (3)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób otrzymywania enzymów proteolitycznych, a zwlaszcza sluzacych do koagulacji bialek mleka, znamienny tym, ze szczepiac podloze hodowlane dwudziestoczterogodzinna hodowla plynna bakterii Bacillus circulans w ilosci 1-2% i nastepnie prowadzac ja przez 17-24 godzin w warunkach wstrzasania i temperaturze 25-40°C otrzymuje sie produkt wyjsciowy, który po odwi¬ rowaniu przy 10000 obr/min w okresie 20-30 minut pozwala na wydzielenie supernatantu, z którego pod dzialaniem acetonu o stezeniu koncowym 75-90% w temperaturze -10°C wydziela sie osad bialka enzymatycznego rozpuszczany nastepnie w 5ml wody destylowanej.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako podloze hodowlane bakterii stosuje sie rozcienczona 2-5 krotnie serwatke z mleka odtluszczonego z dodatkiem 0,1-1,0% maki sojowej, wzglednie zarodków zbozowych, przy wyjsciowym pH 6-8,5.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako podloze hodowlane bakterii stosuje sie Uzyskany w wyniku pierwszego wirowania sok ziemniaczany z dodatkiem 0,1-1,0% maki sojowej, Wzglednie zarodków zbozowych, przy wyjsciowym pH 6-8,5. PL