PL113379B2 - Method of immobilization of rennin enzyme - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób unieruchamiania enzymu renniny, stosowanego w przemysle serowarskim.W przemysle serowarskim, zwlaszcza przy produkcji sera podpuszczkowego, stosuje sice eznym rennine, koagulu- jaca bialko mleka, wydzielana z zoladków mlodych cie¬ lat. Ze wzgledu na deficytowosc tego enzymu zaczeto prowadzic badania nad mozliwoscia uzyskania unieru¬ chomionej renniny, umozliwiajacej wielokrotne jej stosowanie.Znanych jest szereg chemicznych sposobów unieru¬ chamiania enzymu renniny, z których jak podano w cza¬ sopismie „Biotechnology and Bioengineering". vol XVII, 1975 r., s. 585-598, sposób unieruchomienia renniny, polega na osadzeniu enzymu na powierzchniowo usiecio- wanym alkiloaminowym szkle porowatym. Tak uzyska¬ nym preparatem wypelnia sie kolumne, tworzac zloze fluidyzacyjne przy ciaglym przeplywie swiezego mleka.Inny, znany z japonskiego opisu patentowego nr 42594, sposób polega na mikrokapsulkowaniu renniny droga zamkniecia enzymu w membranie polimeru, chro¬ niacej enzym przed utrata jego aktywnosci, zezwalajacej jednoczesnie na przenikanie substratu do enzymu.W opisie patentowym belgijskim nr 807069 opisany jest z kolei sposób polegajacy na utworzeniu kompleksu rennino-celulozowego. Unieruchomiony tym sposobem enzym jest otrzymywany w postaci dosc duzych ziaren i jest stosowany w ukladzie kolumnowym z ruchomym zlozem.Znanyjest takze sposób unieruchomienia enzymu ren¬ niny, który polega na osadzeniu renniny na sepharozie lub aminoetylowanej celulozie. Sposób taki jest opisany w czasopismie „Kakuno Kagaku No Kenkyn", 1974,23, s. 83-87.Jak podano w czasopismie „Proces Biochemistry" 1975, 5, s. 16, zaden z wyzej omawianych chemicznych sposobów nie daje pozytywnych efektów, gdyz otrzy¬ mane preparaty posiadajaniska aktywnosc. Nadto znane sposoby wymagaja w wiekszosci oczyszczenia enzymu, zanieczyszczenia bowiem utrudniaja powstawanie ukla¬ du polimer-enzym, przy czym sam proces oczyszczania jest pracochlonny i powoduje duze straty aktywnosci oraz duze straty ilosciowe enzymu. Otrzymane znanymi sposobami preparaty, charakteryzuje niska stabilnosc unieruchomionej renniny, nadto w preparatach tych nastepuje wymywanie duzej ilosci enzymu podczas pro¬ cesu technologicznego, enzym zostaje uwolniony z nos¬ nika. Takze moc enzymatycznajest redukowana podczas reakcji z mlekiem i jest trudna do zregenerowania.Sposób unieruchomienia renniny wedlug wynalazku polega na tym, ze enzym rennine miesza sie z monome¬ rem amidu kwasu akrylowego i N,N'-metylenobisakry loamidem oraz skrobia rozpuszczalna, po czym uzy¬ skany roztwór rozprowadza siew postaci cienkiego filmu i natychmiast zamraza, korzystnie w cieklym azocie. Tak zamrozony roztwór poddaje sie napromieniowaniu gamma 60Co dawka 1 kGy z predkoscia dawkowania3 1H379 4 0,7-1,5 kGy/h, a nastepnie poddaje sie dalszej polimery¬ zacji w temperaturze od —15 do —20°C w czasie 20-24 godzin. Otrzymany w postaci cienkiego filmu polimer liofilizuje sie, przemywa woda destylowana, po czym suszy i rozdrabnia do wielkosci ziaren § 0,1 mm.W sposobie wedlug wynalazku na 0,5-1,5% wagowych enzymu renniny stosuje sie 11-13% wagowych amidu kwasu akrylowego, 0,60-0,68% wagowych N,N'-metyle- nobisakryloamidu i 3,0-5,0% wagowych skrobi.Zastosowanie w sposobie wedlug wynalazku, sensybi- lizatora polimeryzacji w postfttifdwufunkcyjnego zwiaz¬ ku N,N'-metyienobisakrylda*rnidu, zezwala na stosowa¬ nie niskiej dawki promieniowania jonizujacego, natomiast dodatek skrobi* generujacej aktywne osrodki polimeryzacji, zapewnia przyspieszenie procesu polime¬ ryzacji, co w efekcie prowadzi takze do obnizenia dawki promieniowania jonizujacego. Stosowanie niskich da¬ wek promieniowania do inicjacji procesu polimeryzacji nosnika i niska temperatura powoduje zabezpieczenie enzymu przed inaktywacja.Sposób wedlug wynalazku w odniesieniu do znanych sposobów chemicznych, zezwala na zachowanie aktyw¬ nosci enzymu przy korzystnej strukturze nosnika gwa¬ rantujacej dobra dostepnosc substratu do enzymu.Umozliwia równiez ominiecie procesu oczyszczania pre¬ paratów przemyslowych, który takze powoduje czes¬ ciowa utrate aktywnosci.Rennina unieruchomiona sposobem wedlug wyna¬ lazku, odznacza sie wysoka aktywnoscia, wynoszaca okolo 65%, w stosunku do aktywnosci rozpuszczalnego enzymu wyjsciowego, przy czym posiada zadawalajaca stabilnosc. Stosowana w przemysle se.rowarskim pozwoli na wielokrotne zmniejszenie deficytu tego7 enzymu, co pozwoli na ciagly, automatyczny proces produkcji serów.Sposób wedlug wynalazku ilustruje nizej podany przy¬ klad nie ograniczajacy jego zakresu.Przyklad. Do kolby okraglodennej wprowadzono 1 ml 31,691 roztworu monomerów zawierajacego 30% wagowych amidu kwasu akrylowego i 1,6% wagowych N,N'-metylenobisakryloamidu w buforze octanowym o pH = 5,6 lml 10% wodnego roztworu skrobi rozpu¬ szczalnej oraz 0,5 ml 5% roztworu enzymu renniny, zwa¬ nego pod nazwa handlowa chymosyna, w buforze octanowym o pH^SA Mieszanine rozprowadzono szybko na sciankach kolby i natychmiast zamrozono zanurzajac w cieklym azocie. Celem zainicjowania pro¬ cesu polimeryzacji zamrozony na sciankach kolby roz¬ twór napromieniowano dawka 1 kGy promieniowania gamma 60Co, z predkoscia dawkowania 1 kGy/h, w cza¬ sie 1 godziny, po czym prowadzono dalsza polimeryzacje w temperaturze —15°C w czasie 24godzin. Spolimeryzo- wany uklad liofilizowano uzyskujac cienki film unieru¬ chomionej j-enniny. Próbki preparatu przemyto woda destylowana az do zaniku w roztworze aktywnosci enzy¬ matycznej, wysuszono powietrznie w temperaturze pokojowej, rozdrobniono i przesiano przez sito o sred¬ nicy otworów 0,1 mm, otrzymujac ziarna preparatu jed¬ norodne i o pozadanych wymiarach. Nastepnie oznaczo¬ no aktywnosc enzymatyczna otrzymanego preparatu metoda wiskozymetru ultradzwiekowej, przy czym jako substratu do reakcji uzyto roztwórodtluszczonego mleka w proszku, typu „Instant", zawierajacy 12g mleka w 100 ml 0,01 M CaCb o pH - 6,14. Reakcje enzmatyczna prowadzono w termostatowanym naczynku w tempera¬ turze 35°C w czasie 20 minut, przy stosunku 0,5 mg enzymu na 1 ml mleka. Nastepnie próbke 5 ml mleka, po oddzieleniu od enzymu unieruchomionego, umieszczono w termostatowanym naczynku, równiez w temperaturze 35°C, w którym dokonano pomiaru aktywnosci. Aktyw¬ nosc ta wynosila 65% w stosunku do aktywnosciwyjscio¬ wej renniny rozpuszczalnej.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób unieruchamiania enzymu renniny, zna¬ mienny tym, ze enzym miesza sie z monomerami amidu kwasu akrylowego, N,N'-metylenobisakryIoamidu oraz skrobi, po czym uzyskany roztwór rozprowadza sie w postaci cienkiego filmu, natychmiast zamraza, korzyst¬ nie w cieklym azocie i zamrozony poddaje sie napromie¬ niowaniu gamma wCo dawka lkGy z predkoscia dawkowania 0,7-1,5 kGy/h, a nastepnie dalszej polime¬ ryzacji w temperaturze od — 15 do -~20°C w czasie 20-24 godzin, przy czym otrzymany w postaci cienkiego filmu polimer liofilizuje sie, przemywa woda destylowana oraz suszy i rozdrabnia do wielkosci ziaren $ 0,1 mm. 2. Sposób wedlug zastrz. I, znamienny tym, ze na 0,5-1,5% wagowych enzymu renniny stosuje sie w pro¬ centach wagowych 11-13% amidu kwasu akrylowego 0,60-0,65% N,N'-metylenobisakryloamidu i 3,0-5,0% skrobi.Prac. Poligraf. UP PRL naklad 120+18 Cena 45 zl PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób unieruchamiania enzymu renniny, zna¬ mienny tym, ze enzym miesza sie z monomerami amidu kwasu akrylowego, N,N'-metylenobisakryIoamidu oraz skrobi, po czym uzyskany roztwór rozprowadza sie w postaci cienkiego filmu, natychmiast zamraza, korzyst¬ nie w cieklym azocie i zamrozony poddaje sie napromie¬ niowaniu gamma wCo dawka lkGy z predkoscia dawkowania 0,7-1,5 kGy/h, a nastepnie dalszej polime¬ ryzacji w temperaturze od — 15 do -~20°C w czasie 20-24 godzin, przy czym otrzymany w postaci cienkiego filmu polimer liofilizuje sie, przemywa woda destylowana oraz suszy i rozdrabnia do wielkosci ziaren $ 0,1 mm.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. I, znamienny tym, ze na 0,5-1,5% wagowych enzymu renniny stosuje sie w pro¬ centach wagowych 11-13% amidu kwasu akrylowego 0,60-0,65% N,N'-metylenobisakryloamidu i 3,0-5,0% skrobi. Prac. Poligraf. UP PRL naklad 120+18 Cena 45 zl PL