PL108540B2 - Method of obtaining purified diphtheria anatoxin - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania oczyszczonej anatoksyny bloniczej z anatoksyny natywnej, uzyskanej w hodowlach glebinowych na plynnym podlozu, zawierajacym proteolizat serc wolowych lub wieprzowych. .Anatoksyna blonicza jest nicoksycznym preparatem bialkowym o wysokiej aktywnosci imrnunogennej i antygenowej. Znajduje ona szerokie zastosowanie w lecznictwie jako skladnik szczepinek pojedynczych i skoja¬ rzonych, uzywanych do masowych szczepien ochronnych przeciwko blonicy.Stan techniki. Produkcja anatoksyny bloniczej polega na hodowli toksynotwórczego szczepu Corynebac- terium diphtheriae na plynnym podlozu, zawierajacym proteolizat bialkowy np. protoolizat kazeiny, miesa wolowego, serc wolowych lub wieprzowych. Po osiagnieciu odpowiednio wysokiego miana toksyny, oddziela sie komórki bakteryjne od przesaczu, w którym znajduje sie toksyna blonicza oraz inne rozpuszczalne produkty metabolizmu Corynebacterium diphtheriae i skladniki podloza. Dalsze postepowanie moze byc prowadzone dwoma metodami: - Do przesaczu hodowli Corynebacterium diphtheriae dodaje sie 0,3 —0,4% formaldehydu i inkubuje mieszanine w temperaturze 37—40°C. Prowadzi to do stopniowego zaniku wlasciwosci toksycznych i powstawa¬ nia nietoksycznej i stabilnej substancji — anatoksyny blonicznej lub toksoidu bloniczego wedlug nomenklatury angielskiej i amerykanskiej). Po calkowitym zakonczeniu procesu detoksykacji otrzymuje sie tzw. natywna (czyli nieoczyszczona) anatoksyne blonicza, która nastepnie poddaje sie frakcjonowaniu celem otrzymania oczyszczo¬ nego preparatu anatoksyny. W warunkach produkcyjnych frakcjonowanie natywnych anatoksyn polega najczes¬ ciej na wytraceniu bialka siarczanem amonu w srodowisku slabo alkalicznym lub wytraceniu kwasami (octowym, trójchlorooctowym, fosforowym) przy pH = 3,8-4,0. Uzyskane w ten sposób preparaty wykazuja znaczna heterogennosc, a ich aktywnosc wlasciwa jest stosunkowo niska i wynosi najczesciej 800—1300 Lf/mg azotu bialkowego (Rethy i wspólpr. Progr. Immunobiol. Stand. 2,27,1965).— Z przesaczu hodowli Corynebacterium diphtheriae otrzymuje se wysoko oczyszczona toksyne, któfa nastepnie poddaje sie detoksykacji formaldehydem w obecnosci lizyny. Pozwala to uzyskac jednorodne2 108 540 preparaty o wysokiej aktywnosci wlasciwej (2000-3400 Lf/mg azotu bialkowego), ale stwarza powazne trudnosci produkcyjne ze wzgledu na znaczna toksycznosc i labilnosc toksyny bloniczej.Wynalazek niniejszy dotyczy metody otrzymywania oczyszczonej anatoksyny blonicznej z przesaczu hodowli Corynebacterium diphtheriae poddanego calkowitej detoksykacji formaldehydem, a wiec otrzymywania oczyszczonego preparatu z nietoksycznej anatoksyny natywnej.Dotad stosowana metoda frakcjonowania polega na dodaniu do natywnej anatoksyny bloniczej kwasu trójchlorooctowego do pH = 3,8±0,1. W warunkach tych do osadu przechodzi anatoksyna blonicza oraz znaczna ilosc skladników balastowych m. inn. bialek, peptydów i substancji barwnych. Po dokladnym odwirowaniu osad rozpuszcza sie w buforze boranowym o pH = 7,5, którego ilosc stanowi 1/35 objetosci materialu wyjsciowego przed frakcjonowaniem. Uzyskany roztwór poddaje sie adsorpcji na weglu aktywowanym celem usuniecia substancji barwnych (glównie porfiryn). Otrzymana w ten sposób czesciowo oczyszczona Lzatezona anatoksyna o aktywnosci wlasciwej 1000—1400 Lf/mg azotu bialkowego jest jednak preparatem heterogennym i zawiera, oprócz frakcji o wysokiej aktywnosci, równiez nieaktywne skladniki balastowe. Obecnosc tych substancji obniza aktywnosc preparatu i zwieksza prawdopobobienstwo wystapienia odczynów poszczepiennych u dzieci. Nalezalo wiec opracowac metode dodatkowego oczyszczania anatoksyny bloniczej, prowadzaca do uzyskania wysoce aktywnych preparatów, pozbawionych nieczynnych skladników balastowych.Istota wynalazku. Poszczególne frakcje bialkowe natywnej anatoksyny bloniczej a wiec skladniki balasto¬ we i frakcja aktywna, róznia sie od siebie pod wzgledem ladunku elektrycznego, z którym zwiazane jest powinowactwo do wymieniaczy jonowych. Wyzyskujac te ceche poszczególnych frakcji bialkowych, sposobem wedlug wynalazku, osiagnieto pozadany cel uzyskania wysoce aktywnych preparatów anatoksyny, pozbawio¬ nych skladników balastowych, droga zastosowania dodatkowego chromatograficznego oczyszczania zatezonej i czesciowo oczyszczonej anatoksyny bloniczej na wymieniaczu — DEAE-Sefadeksie A—50 (dwuetyloaminoety- lowej pochodnej usieciowanego dekstranu) oraz dobrania takich warunków chromatografii, w których aktywna frakcja anatoksyny nie jest na sefadeksie, natomiast nieaktywne bialka balastowe wiaza sie z sefadeksem i w ten sposób zostaja usuniete z preparatu.Wyjasniajac bardziej szczególowo, istota wynalazku polega na tym, ze czesciowo oczyszczona i zatezona anatoksyna blonicza, otrzymana wedlug dotad stosowanej metody poddawana jest dodatkowemu oczyszczaniu na DEAE—Sefadeksie A—50 w 0,2 molowym buforze octanowym o pH = 5,1—5,2 zawierajacym 0,25—0,40 mol/litr chlorku spdowego. Glówna frakcja anatoksyny bloniczej pozostaje w roztworze, natomiast bialka o wysokim ladunku ujemnym wiaza sie z DEAE—Sefadeksem A—50. Po oddzieleniu sefadeksu otrzymuje sie roztwór oczyszczonej anatoksyny o aktywnosci wlasciwej okolo 2000 Lf/mg azotu bialkowego. Warunki oczyszczania anatoksyny bloniczej na DEAE—Sefadeksie A—50 (stezenie buforu, pH, stezenie chlorku sodowego i temperatura) sa tak dobrane, ze wydajnosc procesu jest powtarzalna i wynosi nie mniej niz 70% jednostek fiokulacyjnych Lfj a ostateczny produkt w calosci odpowiada wymaganiom stawianym przed tego rodzaju preparatami w lecznictwie.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze do natywnej anatoksyny bloniczej dodaje sie kwas trójchlorooctowy do pH = 3,8 ± 0,1. Utworzony osad po odwirowaniu rozpuszcza sie w 0,2 molowym roztworze octanu sodowego i odbarwia na weglu aktywowanym w pH = 7,5. Do odbarwionego roztworu czesciowo oczyszczonej i zatezonej anatoksyny dodaje sie 0,2 molowy roztwór kwasu octowego do pH - 5,1—5,2 i chlorek sodowy do stezenia 0,25—0,40 mol/litr, a nastepnie przeprowadza sie oczyszczanie preparatu w temperaturze pokojowej na DEAE—Sefadeksie A—50, uprzednio zrównowazonym 0,2 molowym buforem octanowym o pH =5,1-5,2 zawierajacym 0,25-0,40 mol/litr chlorku sodowego. Plyn, w którym znajduje sie aktywna frakcja anatoksyny bloniczej, oddziela sie od sefadeksu i w razie potrzeby przygotowania zatezonej anatoksyny (o aktywnosci 1000 Lf/MI lub wyzej), doprowadza sie do pH = 3,8 <±, 0,1 kwasem trójchlorooctowym celem wytracenia i koncentracji oczyszczonej anatoksyny bloniczej. Utworzony osad po odwirowaniu rozpuszcza sie w buforze boranowym o pH = 7,5 i poddaje sie saczeniu sterylizujacemu.Tabela przedstawia porównanie czystosci preparatów anatoksyny bloniczej, miara której jest aktywnosc wlasciwa w Lf/mg azotu bialkowego, otrzymanych dotad stosowana metoda (preparat handlowy) oraz opraco- wana metoda chromatograficzna (preparat po DEAE-SefadeksieA^5Ó) Przedstawiona tabela wskazuje, ze preparaty uzyskane za pomoca metody bedacej przedmiotem niniejszego wynalazku, posiadaja wvzsza aktywnosc wlasciwa, tzn. sa preparatami o wyzszym stopniu czystosci, niz anatoksyny handlowe, skaznik oczyszczania na DEAE-Sefadeksie A-50 dla poszczególnych serii anatoksyn wynosil 1,6 ±0,13.Przyklad I. Otrzymywanie anatoksyny bloniczej oczyszczonej na DEAE-Sefadeksie A-50 (dwuety- loaminoetylowej pochodnej usieciowanego dekstranu) metoda „batch".Hodowle glebinowa Corynebacterium diphtheriae prowadzono na plynnym podlozu, zawierajacym proteolizat serc wolowych lub wieprzowych. Przesacze hodowli poddane calkowitej detoksykacji formaldehy-108 540 3 dem (tzw natywne anatoksyny blonicze) byly materialem wyjsciowym do otrzymywania oczyszczonych preparatów. Zawieraly one okolo 100 Lf/ml, a ich aktywnosc wlasciwa wynosila 155 ±j30 Lf/mg azotu bialkowego. Do 70 litrów natywnej anatoksyny bloniczej, schlodzonej do temperatury 4-7°C, dodano przy stalym mieszaniu 7 litrów 20% roztworu kwasu trójchlorooctowego do pH = 3,8 ± 0,1. Anatoksyne pozostawio¬ no na 20 godzin w temperaturze 4-7°C, po czym osad odwirowano. Osad rozpuszczono w 2 litrach 0,2 molowego roztworu octanu sodowego. Otrzymano koncentrat I czesciowo oczyszczonej i zatezonej anatoksyny bloniczej o pH 5,5-5,6,do którego przy stalym mieszaniu dodano 63 ml i molowego roztworu wodorotlenku sodowego (do pH = 7,5, i 60 wegla aktywowanego. Mieszanine wytrzasano przez 60 minut w temperaturze pokojowej, wirowano przy 3000 obr/min i uzyskany koncentrat II klarowano droga saczenia przez swiece Berkefelda. Do 1800 ml klarownego koncentratu II dodano 450 ml 0,2 molowego roztworu kwasu octowego i 41,7 g stalego chlorku sodowego, a nastepnie- 2200 g mokrego DEAE-Sefadeksu A-50, uprzednio zrównowa¬ zonego 0,2 molowym buforem octanowym o pH = 5,1-5,2, zawierajacym 0,25-0,40 mol/litr chlorku sodowego.Chromatografie jonowymienna prowadzono, mieszajac anatoksyne blonicza z DEAE—Sefadeksem A—50 w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po zakonczeniu procesu oczyszczania mieszanine przeniesiono na lejek Schotta w celu oddzielenia aktywnej frakcji anatoksyny bloniczej, znajdujacej sie w roztworze, od sefadeksu zawierajacego zwiazane skladniki balastowe. Sefadeks przemywano na lejku Schotta szescioma litrami buforu wyjsciowego (0,2 molowy bufor octanowy o pH =5,1-5,2, zawierajacy 0,25-0,40 mol/litr chlorku sodowego) i uzyskany plyn polaczono z podstawowym roztworem oczyszczonej anatoksyny. Otrzymano 8500 ml anatoksyny oczyszczonej na DEAE-Sefadeksie A-50, do której dodano przy stalym mieszaniu 800 ml 20% roztworu kwasu trójchlorooctowego celem wytracenia i koncentracji oczyszczonej anatoksyny. Mieszanine pozostawiono na 20 godzin w temperaturze 4-7°C po czym odwirowano osad, rozpuszczono go w 2 litrach buforu boranowego o pH = 7,5 i dodano 25 ml molowego roztworu wodorotlenku sodu do pH = 7,5 oraz mertiolat do stezenia 1 : 10000. Koncentrat oczyszczonej anatoksyny bloniczej, zawierajacy 1500—2000 Lf/ml, poddano saczeniu sterylizujacemu.Przyklad II. Otrzymanie anatoksyny bloniczej, oczyszczonej na DEAE—Sefadeksie A—50 (dwuetylo- aminoetylowej pochodnej usieciowanego dekstranu) droga chromatografii kolumnowej. Do 90 ml odbarwionego roztworu czesciowo oczyszczonej i zatezonej anatoksyny bloniczej, otrzymanej jak w przykladzie I dodano 22 ml 0,2 molowego roztworu kwasu octowego i 2,1 g stalego chlorku sodowego. Tak przygotowany roztwór o PH- 5,1-5 2 nalozono na kolumne (2,5X25 cm) zawierajaca 3 g DEAE-Sefadeksu A-50 w buforze wyjsciowym którym byl 0,2 molowy bufor octanowy, zawierajacy 0,25-0,40 mol/litr chlorku sodowego. Proces chromatograf,czny prowadzono w temperaturze pokojowej, szybkosc przeplywu anatoksyny przez wymieniacz wynos.la 30-40 ml/godzine. Zbierano frakcje bialkowa, która nie byla wiazana na DElE-LadeksTI-SO Zawierala ona oczyszczona anatoksyne blonicza o aktywnosci wlasciwej okolo 2000 Lf/mg azotu bialkowego' Rm Tnn^/ ,' Tn° d° °'15 ™{a™*° otworu chlorku sodowegc^a nastepnie roztwór zawierajacy ouu-700 Lf/ml, poddawano saczeniu sterylizujacemu.Zastrzezenie patentowe Sposób otrzymywania oczyszczonej anatoksyny bloniczej z natywnej anatoksyny, uzyskanej w hodowlach glebinowych na plynnym podlozu, zawierajacym proteolizat serc wolowych lub wieprzowych i poddanej czesciowemu oczyszczeniu i zageszczeniu metoda wytracania kwasem trójchlorooctowym i adsorpqi substancji barwnych na weglu aktywowanym, znamienny tym, ze odbarwiony roztwór czesciowo oczyszczonej i zageszczonej anatoksyny bloniczej doprowadza sie do pH = 5,1-5,2 przez dodanie 0,2 molowego roztworu kwasu octowego i skladniki balastowe usuwa sie z preparatu droga chromatografii jonowymiennej na dwuetylo- aminoetylowej pochodnej dekstranu w 0,2 molowym buforze octanowym opH = 51-5,2 zawierajacym 0,25—0,40 mol/litr chlorku sodowego w temperaturze pokojowej.Tabela Aktywnosc wlasciwa — Lf/mg azotu bialkowego Seria anatoksyny bloniczej ser. 1 ser. 2 ser. 3 preparat 06 preparat handlowy DEAE-Sefadeksie A-50 1450 2160 1430 2330 1294 2240 Wskaznik oczyszczania na DEAE-Sefadeksie A-50 1,48 1,63 1,73 PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób otrzymywania oczyszczonej anatoksyny bloniczej z natywnej anatoksyny, uzyskanej w hodowlach glebinowych na plynnym podlozu, zawierajacym proteolizat serc wolowych lub wieprzowych i poddanej czesciowemu oczyszczeniu i zageszczeniu metoda wytracania kwasem trójchlorooctowym i adsorpqi substancji barwnych na weglu aktywowanym, znamienny tym, ze odbarwiony roztwór czesciowo oczyszczonej i zageszczonej anatoksyny bloniczej doprowadza sie do pH = 5,1-5,2 przez dodanie 0,2 molowego roztworu kwasu octowego i skladniki balastowe usuwa sie z preparatu droga chromatografii jonowymiennej na dwuetylo- aminoetylowej pochodnej dekstranu w 0,2 molowym buforze octanowym opH = 51-5,2 zawierajacym 0,25—0,40 mol/litr chlorku sodowego w temperaturze pokojowej. Tabela Aktywnosc wlasciwa — Lf/mg azotu bialkowego Seria anatoksyny bloniczej ser. 1 ser. 2 ser. 3 preparat 06 preparat handlowy DEAE-Sefadeksie A-50 1450 2160 1430 2330 1294 2240 Wskaznik oczyszczania na DEAE-Sefadeksie A-50 1,48 1,63 1,73 PL