PL102256B1 - A method of producing immobilized penicillin amidase - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia immobilizowanej amidazy penicylinowej. En¬ zym ten jest stosowany do hydrolizy penicylin w produkcji kwasu 6-aminopeni'Cylanowego.

Z polskiego opisu patentowego nr 79 702 znany jest sposób otrzymywania amidazy penicylinowej, zwiazanej kowalencyjnie na kopolimerze akrylo- amidowym, polegajacy na tym, ze kopolimer akry- lóamidu, N,N'-metyleno-bis-akryloamidu i kwasu maleinowego ogrzewa sie pod zmniejszonym cis¬ nieniem, a otrzymany produkt poddaje sie reakcji z wodnym buforowanym roztworem enzymu. Spo¬ sób ten wymaga przeprowadzenia trzech operacji, a mianowicie wytworzenia kopolimeru, jego ogrze^ wania i reakcji z enzymem. * Okazalo sie, ze amidaze penicylinowa, immobili- zowana na kopolimerze akryloamidu, mozna otrzy¬ mac w sposób prostszy i dogodniejszy, obejmujacy jedynie dwa etapy.- Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze amidaze penicylinowa poddaje sie reakcji z bez¬ wodnikiem nienasyconego kwasu dwukarboksylo- wego, a otrzymany zmodyfikowany enzym przepro¬ wadza sie w kopolimer akryloamidu, ewentualnie w obecnosci substancji o charakterze wypelnia¬ cza.

Reakcji z bezwodnikiem nienasyconego kwasu dwuikarboiksylowe^o mozna poddawac amidaze pe¬ nicylinowa zarówno w postaci czystej, jak i w postaci wstepnie oczyszczonego enzymu o stosun- kowo niskiej aktywnosci. Reakcje prowadzi sie w zbuforowanym srodowisku wodno-organicznym przy wartosci pH od okolo 5 do okolo, 8 i w nliskiej temperaturze (okolo 0—5°C) dla zapobiezenia szyb¬ kiej hydrolizie bezwodnika. Bezwodnik nienasyco¬ nego kwasii dwukarboksylowego stosuje sie ko¬ rzystnie w ilosci do okolo 90 mikromoli/mg bialka, gdyz przy wyzszej ilosci otrzymuje sie preparaty o nizszej aktywnosci enzymatycznej. Jako bez¬ wodnik nienasyconego kwasu dwukarboksylowego korzystnie stosuje sie bezwodnik kwasu maleino¬ wego. Wydajnosc reakcji wynosi okolo 90°/o.

Otrzymana zmodyfikowana amidaza penicylino¬ wa jest nierozpuszczalna w srodowisku kwasnym (wartosc pH okolo 3,0), co mozna wykorzystac do jej wyodrebnienia. Charakteryzuje sie ona zmniej¬ szona iloscia wolnych grup aminowych (oznaczo¬ nych przez reakcje z TNBS), zwiekszona ruchli¬ woscia elektroforetyczna (zbadana za pomoca ele¬ ktroforezy dyskowej) i wyzsza stabilnoscia termicz¬ na w porównaniu z enzymem niezmodyfikowanym.

Wlasciwosci te przedstawione sa w tablicach 1 i 2.

Otrzymana zmodyfikowana amidaze penicylinowa przeprowadza sie nastepnie w jeden z kopolimerów, stosowanych zazwyczaj do otrzymywania immobi- lizowanych enzymów. Ze wzgledu na warunki prowadzenia procesu kopolimeryzacji szczególnie przydatne sa kopolimery, otrzymywane z mono¬ merów rozpuszczalnych w wodzie, zwlaszcza ko¬ polimery akryloamidu. Korzystnie stosuje sie ko- 102 2563 polimery otrzymane z akryloamidu i N,N'-dwu- allilodwuamidów kwasów dwukarboksylowych zwlaszcza N,N'-dwuallilodwuamidów kwasu malo- nowego lub kwasu winowego. Kopolimery te od¬ znaczaja sie duza elastycznoscia i mozna je liofili¬ zowac i przechowywac w stanie suchym przez dluzszy okres czasu bez zmniejszenia aktywnosci immobilizowanej amidazy penicylinowej. Zamiast tych dwuallilodwuamidów mozna stosowac takze metyleno-bis-akryloamid, znany czynnik usieciowu- jacy poliakrylóamid, lecz w tym przypadku uzy¬ skane kopolimery nie posiadaja wymaganej ela¬ stycznosci, sa kruche i latwo sie scieraja.

Proces kopolimeryzaeji prowadzi sie w obecnosci ukladu: kafaiizator-inicjator. Sa to substancje za¬ zwyczaj stosowane w tego typu reakcjach, na przy¬ klad nadsiarczany, ryboflawina, N,N,N',N'-tetrame- tyloktylenodwuamina iab ^-dwumetyloamino-pro- pioaitryl.

Proces kopolimeryzacji mozna prowadzic w obec¬ nosci substancji o charakterze wypelniacza. Ko¬ rzystnie stosuje sie niskoczasteczkowe substancje rozpuszczalne w wodzie, takie jak na przyklad sacharoza, które zwiekszaja porowatosc otrzymane-" go kopolimeru i podnosza jego aktywnosc enzy¬ matyczna.

Reakcje kopolimeryzaeji prowadzi sie w zbu- forowanym roztworze wodnym w atmosferze gazu obojetnego. Otrzymany kopolimer granuluje sie w zwykly sposób i dokladnie przemywa roztwo¬ rem buforu o odczynie zblizonym do obojetnego, otrzymujac preparat immobilizowanej amidazy pe¬ nicylinowej o wysokiej aktywnosci enzymatycznej (kilka j/ml). Reakcje kopolimeryzaeji mozna tez prowadzic w rozpuszczalniku organicznym w obec¬ nosci rozpuszczonego w nim srodka powierzchnio¬ wo czynnego przy energicznym mieszaniu. Jako rozpuszczalnik organiczny korzystnie stosuje sie roztwór czterochlorku wegla lub chloroformu w toluenie, a jako srodek powierzchniowo czynny — oleinian sorbitolu, znany w handlu pod nazwa Spfan 88. W tym przypadku uzyskuje sie kopoli¬ mer w postaci sferycznych granulek. Srednica tych granulek maleje wraz ze wzrostem ilosci srodka powierzchniowo czynnego, dodanego do rozpuszczalnika organicznego. Przy uzyciu srodka Span 80 w ilosci okolo l°/o mozna uzyskac gra* nulki o srednicy do 0,4 mm. Wydajnosc procesu wynosi zazwyczaj okolo 50% w przeliczeniu na enzym uzyty do immobilizacji. taraobilizowana amidaza penicylinowa, otrzymy¬ wana sposobem wedlug wynalazku, zachowuje pel- n% aktywnosc enzymatyczna przy wieJotygodiniowym przechowywaniu w chlodni w temperaturze 4°C a w temperaturze 37°C w ciagu miesiaca traci —40% aktywnosci, co przedstawia tablica 2. Im- mobilizowana amidaza jest stosowana do enzyma¬ tycznego rozszczepiania penicylin, zwlaszcza benzy- lopenicyliny, przy -czym otrzymuje sie kwas 6- -aa»inopenicylanowy z wydajnoscia powyzej 90% wydajnosci teoretycznej. Hydrolize penicylin przy uzyciu immobilizowanej amidazy penicylinowej, o- trzymanej sposobem wedlug wynalazku, prowadzi sie w zbuforowanym srodowisku wodnym o wartos¬ ci pH 7—8, przy czym korzystnie stosuje sie bufor 2 256 4 fosforanowy. Podczas przebiegu reakcji wartosc pH utrzymuje sie na stalym poziomie przez dodawanie roztworów substancji zasadowych.

Hydrolize prowadzi sie w temperaturze okolo 25—45°C, korzystnie 35—38°C. Czas trwania reak¬ cji jest zalezny od temperatury, stezenia i rodzaju uzytej penicyliny oraz od stosunku aktywnosci immobilizowanego enzymu do ilosci penicyliny. Hy¬ drolize mozna prowadzic przy stosunkowo wyso- w kich stezeniach penicyliny (do okolo 10%), przy czym korzystnie stosuje sie penicyline w postaci soli. Sposób wedlug wynalazku jest objasniony ponizszymi przykladami, które jednakze nie ogra¬ niczaja jego zakresu.

Przyklad I. a) Otrzymywanie zmodyfikowa¬ nej amidazy penicylinowej.

Do 12,4 ml oziebionego roztworu czesciowo oczy¬ szczonej amidazy penicylinowej, pochodzacej z ko¬ mórek Escherichia coli, w buforze fosforanowym 29 o wartosci pH 5,8 o stezeniu bialka 25 mg/ml i aktywnosci swoistej 1,5 j/mg wkrapla sie po¬ woli, mieszajac, 1,2 ml 4,5 M roztworu bezwodnika maleinowego w suchym acetonie.

Podczas reakcji wartosc pH utrzymuje sie na po- ziomie wyjsciowym przez dodawanie 0,8 M roz¬ tworu Weglanu sodu. Nastepnie chlodzony roz¬ twór, miesza sie przez 15 minut i pozostawia na 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po odsacze¬ niu powstalego osadu przesacz dializuje sie w ciagu 16 godzin do 1 litra 0,01 M buforu fosforanowego o wartosci pH 5,8, otrzymujac okolo 18 mf roz¬ tworu zmodyfikowanej amidazy penicylinowej o aktywnosci swoistej 1,3 j/mg. b) Otrzymyiwanie immobilizowanej amidazy peni- cylinowej przez kopolimeryzacje w bloku.

W 5 ml roztworu zmodyfikowanej amidazy peni¬ cylinowej, otrzymanej sposobem opisanym w przy¬ kladzie la, rozpuszcza sie 0,75 g akryloamidu, 0,038 g N,N'-dwuallilodwuamidu kwasu malonowe- *° go i 1 g sproszkowanej sacharozy, a nastepnie dodaje sie 0,05 ml 5% roztworu nadsiarczanu amonowego i 0,05 ml 5% roztworu N,N,N',N'-tetra- metyloetylenodwuaminy i uzyskany roztwór szybko wysyca sie azotem. Dla dalszej polimeryzacji roz- *s twór pozostawia sie w atmosferze azotu na okres godzin w temperaturze 25°C.

Otrzymany zel przeciera sie przez sito o prze¬ kroju oczek 0,3 mm, a granulki przemywa sie ko¬ lejno 0,1 M buforem fosforanowym o wartosci W pH 7,5, nastepnie tym samym buforem z dodat¬ kiem 0,5 M roztworu chlorku sodu, a wreszcie samym buforem. Otrzymuje sie okolo 17 ml upa¬ kowanego, granulowanego zelu o aktywnosci okolo 3,5 j/ml. Wydajnosc procesu immoibilizacji wynosi W okolo 60% w przeliczeniu na uzyta amidaze. c) Otrzymyiwainle immobilizowanej amidazy peni¬ cylinowej przez kopolimeryzacje w sferycznych gra¬ nulkach.

W 2 ml roztworu zmodyfikowanej amidazy peni- $o cylinowej, otrzymanej sposobem opisanym w przy¬ kladzie la, rozpuszcza sie 0,2 g akryloamidu, 0,01 g N,N'-dwuallilodwuamidu kwasu L-winowego i 0,4 g sacharozy. Nastepnie dodaje sie 0,02 ml 1,5 % roztworu nadsiarczanu amonu i taka sama ilosc 65 roztworu N,N,N',N'-tetrametyk)etylienodwi*aj]toy,5 102 256 6 po czym roztwór wysyca sie szybko azotem i wkra- pla do intensywnie mieszanej fazy organicznej o temperaturze 25°C, takze uprzednio wysyconej a- zoftem, o skladzie nastepujacym: 8 ml toluenu i 2 ml czterochlorku wegla z dodatkiem 0,6°/o deter-"- gentu Span 80 i 0,01% N,N,N^N'ntetrametyloetyle- nodrwaiairnny.

Polimeryzacja rozpoczyna sie po kilku minutach, a konczy po uplywie 15 godzin. Utworzone sfery¬ czne granulki odsacza sie na lejku Buchnera, przemywa toluenem, 0,1 M buforem fosforanowym o wartosci pH 7,5 z dodatkiem Tweenu 80, a wreszcie samym buforem. Uzyskuje sie okolo 7 ml upakowanych, okraglych granulek ó srednicy od 0,15 do 0„45 mm, wyikazujacych aktywnosc amidazy okolo 2 j/ml. Wydajnosc procesu wynosi okolo 50% w przeliczeniu na enzym uzyty do immobilizacji. d) Otrzymywanie iimmobilizowanej amidazy peni¬ cylinowej przez kopolimeryzacje w bloku.

W roztworze zmodyfikowanej amidazy penicyli¬ nowej, otrzymanym sposobem opisanym w przy¬ kladzie la, rozpuszcza sie Zfi g sacharozy, 1,8 g akryloamidu i 0,18 g N,N'-metyleno-bis-akryloamidu, po czym dodaje sie 0,75 ml 1% roztworu nadsiar¬ czanu amonu i 0,75 ml 0,l°/o roztworu N,N,N',N'- -tetrametyloetylenodwuaminy. Uzyskany roztwór pozostawia sie w temperaturze 25°C w atmosferze azotu na .Okres 15 godzin. Otrzymany zel przeciera sie przez sito o przekroju oczek 0,5 mm, a uzy¬ skane granulki przemywa sie trzykrotnie 0,1 M buforem fosforanowym o wartosci pH 7,8. Otrzymu¬ je sie 40" ml zelu o aktywnosci enzymatycznej 3,5 j/ml. Aktywnosc amidazy penicylinowej okresla sie metoda kalorymetryczna wedlug Balasinghan et al., Biochem. Biophys. Acta 1972, 276, 250—256.

Przyklad II. Wytwarzanie kwasu 6-amino- penicylanowego.

Do 10 ml immobilizowanej amidazy penicylinowej, otrzymanej sposobem opisanym w przykladzie I, dodaje sie 2 g soli potasowej penicyliny G, roz¬ puszczonej w 40 ml 0,1 M buforu fosforanowego, i miesza sie w temperaturze 37°C przez 6 godzin.

J*5 *0 Wartosc pH utrzymuje sie na poziomie 7,5—7,8 przez wkraplanie 0,8 M roztworu weglanu sodu.

Po uplywie tego czasu w mieszaninie reakcyjnej stwierdza sie obecnosc kwasu 6-aminopenicylano- wego. (96% ilosci teoretycznej). Zawiesine saczy sie, przemywa 0,1 M buforem fosforanowymi o war¬ tosci pH 7,8 i z przesaczu wyodrebnia sie kwas 6-aminopenicylanowy znanymi metodami. Zel im- mobilizowanej amidazy penicylinoweij mozna po¬ nownie uzyc do hydrolizy penicyliny. ^ •o «0 0 chh s ^ I c ^ J> Ci) £ •£ ^ * CU -3 a c^ "8102 256 O c Tabi i ca 2 Wplyw ocrzeuania w 0,1 M buf fosf. pH 75 w 37c na ciklywnosc aojlazij penicylinowej. actflaza / i mmobilizowana f0 12 14 16 f8 20 22 24 26 2 dni ogrzewania DN-3, z. 61/71 Cena 45 zl

Claims (7)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób wytwarzania amidazy penicylinowej immbilizowanej na kopolimerze akryloamidu, zna¬ mienny tym, ze amidaze penicylinowa poddaje sie reakcji z bezwodnikiem nienasyconego kwasu dwu- karboksylowego, a otrzymany zmodyfikowany en¬ zym przeprowadza sce w kopolimer, ewentualnie w obecnosci substancji o charakterze wypelniacza.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako bezwodnik nienasyconego kwiaisu dwukarbo- ksylowego stosuje sie bezwodnik kwasu maleino¬ wego.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze zmodyfikowany enzym przeprowadza sie w kopo¬ limer akryloamidu i N,N'-dwuallilodwuamidu kwa¬ su dwukarboksylowego.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze zmodyfikowany enzym przeprowadza sie w kopo¬ limer akryloamidu i metyleno-bis-akryloamidu.

5. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze jako N,N'-dwuallilodwuamid kwasu dwukarboksy- lowegp stosuje sie N,N'-dwuallilodwuamid kwasu malonowego lub kwiaisu winowego.

6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze zmodyfikowany enzym przeprowadza sie w kopo¬ limer w obecnosci ukladu: katalizator — inicjator polimeryzacji.

7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako substancje o charakterze wypelniajacym sto¬ suje sie sacharoze, Tablica 1 :> £ O cl 3 3 5 10 20 50 60 mikromok uzytego bezwodnika, rna/e/nonego Imq bialke^ ^ Rm 0.8 0,5 0? ^ Cl c « -^