Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych pochodnych chinoksaliny, które obejmuja acienaftoi[l,2-b]chinoiksaliny i dwubenzo[a,c]fenazyny, 0 ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza grupe trójfluorometylowa, n oznacza liczbe 1 lub 2, a Z oznacza grupe o wzorze 2 lub 3. Zwiazki o wzorze 1 sa uzyteczne jako srodki immunoregulacyjne.Srodki immunoregulacyjne, a zwlaszcza immu¬ nosupresyjne, nabraly w ostatnich latach, znaczenia, ze wzgledu na stosowanie ich przy przeszczepianiu narzadów u ludzi, zwlaszcza przy przeszczepach serca i nerek. Czescia mechanizmu obronnego czlo¬ wieka jest odrzucanie obcego antygenu (w tym przypadku przeszczepionego organu) na drodze re¬ akcji odpornosciowej. Przy wszystkich opera¬ cjach przeszczepiania organów konieczne jest po¬ danie duzej dawki srodka immunosupresyjnego (zmniejszajacego reakcje odpornosciowa) przed jej wykonaniem i kontynuowanie podawania tego srodka po operacji, aby zapobiec odrzuceniu prze¬ szczepionego organu przez organizm biorcy.Odpowiedz odpornosciowa sklada sie z ciagu prze¬ ksztalcen komórkowych i zjawisk- biochemicznych, prowadzacych do bimodalnej reakcji na obca sub¬ stancje (antygen). Uczestniczace w reakcji komórki sa wytwarzane w szpiku kostnym i przesylane do narzadów limfatycznych. Z tych organów, po bodz¬ cu antygenowym, nastepuje reakcja organizmu w postaci komórek osocza (wytwarzajacych przeciw¬ cialo) i specyficznych limfacytów odpornoscio- 2 wych. Przeciwcialo jest uwalniane do ukladu kra¬ zenia i w ten sposób moze dzialac na odleglosc od wytwarzajacej je komóiriki (odpornosc humonalna).Specyficzne limfocyty odpornosciowe równiez prze- chodza do ukladu krazenia i dzialaja w miejscu inwazji (odpornosc komórkowa). Reakcja przeciw¬ ciala z antygenem wyzwala wydzielanie histaminy z bazofilnych leukocytów. Z kolei histamina zmie¬ nia przepuszczalnosc naczyn krwionosnych, przy- 1° spieszajac doplyw zarówno przeciwcial jak i spe¬ cyficznych limfocytów odpornosciowych do miej¬ sca inwazji. Tak wiec odpowiedz odpornosciowa sklada sie z szeregu zjawisk biochemicznych w sekwencji komórek, w róznych miejscach ciala.Moze ona byc zmieniona, w przypadku omawia¬ nych zwiazków oslabiona, na róznych etapach bio¬ chemicznych i w róznych komórkach.Czynniki przeciwhistaminowe maja jedynie wtór¬ ny wplyw na reakcje odpornosciowa, nie oddzialu- ja natomiast bezposrednio na komórki wytwarza¬ jace przeciwciala i specyficzne limfocyty odporno¬ sciowe. Pewna liczba srodków stosowanych obecnie jako leki immunosupresyjne dziala blizej poczatka lancucha zjawisk zwanych reakcja odpornosciowa.Pewne przeciwzapalne steroidy, na przyklad korti- zon, ograniczaja wytwarzanie przeciwcial i specy¬ ficznych limfocytów odpornosciowych, lecz równo¬ czesnie znacznie uszczuplaja normalna tkanke lim- fatyczina i wywieraja inne niepozadane dzialania uboczne. Pewne leki przeciwnowotworowe stosowa- 100 5013 100 501 4 ne jako srodki immiunosupresyjne, jak azatioprinia, cyklofosfamid • i metotreksat równiez uszczuplaja tkanke liimfiatyozna i znacznie ograniczaja wytwa- rzanie innych komórek w szpiku kostnym. Ogól¬ na cytotoksycznosc tych leków jest oczekiwana, w swietle ich doboru na podstawie toksycznosci wo¬ bec pewnego spektrum typów komórek.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych zwiazków zmieniajacych reakcje od¬ pornosciowa ssaków, przez oddzialywanie na ko¬ mórki biorace udzial w tej reakcji, które nie wy¬ woluja skutków ubocznych i nie posiadaja innych niepozadanych wlasciwosci zwiazków obecnie sto¬ sowanych jako srodki immunoregulacyjne.Chinoksaliny. sa zwiazkami znanymi. Mozna je otrzymywac przez kondensacje aromatycznych o-dwuamin z 1,2-dwuketonami. Ogólny sposób wy¬ twarzania chinoksalin jest opisany w „The Che- mistry of Heterocyclic Compounds", tom 5, roz¬ dzialy 24-38, Wydawca A. Weissberger (Interscience Publishers, Inc. New York, 1953). Kondensacja ta¬ kich dwuketonów jak acenaftenochin lub fenontre- ochinon z o-fenylenodwuaminami daje odpowiednio aiceniaftol[l,2-b]chinoksaliny lub dwubenzo[a,c]fenia- zyny. Acenofta[l,2-b]chinoksalina jest opisana w Ber. 43, 441 (1910) a dwubenzoi[a,c]fenazyna w Ann. 237, 341 (1887).Aoenafto[l,2-b]chinoksialiny sa nazywane i nume¬ rowane wedlug Ring Index, The American Chemi¬ cal Society, nr 5998, w sposób przedstawiony wzo¬ rem 6, a dwubenzo[a,c]fenazyny wedlug Ring In- dex nr 6221, w sposób przedstawiony wzorem 7.Sposobem wedlug wynalazku nowe pochodne chinoksaliny o ogólnym wzorze 1, w którym R, n i Z maja wyzej podane znaczenie wytwarza sie na drodze kondensacji aromatycznej dwuaiminy o wzo¬ rze 4, w którym R i n maja wyzej podane zna¬ czenie z 1,2-dwuketonem o wzorze 5, w którym Z ma wyzej podane znaczenie.Dwubenzo[a,,c]fenazyny o wzorze 1, w którym Z oznacza grupe o wzorze 3 sa korzystniejsze od po¬ chodnych acenaiftoitl^-bjchinoksaliny o wzorze 1, w którym Z oznacza grupe o wzorze 2.Fenazyny i chinoksaliny o ogólnym wzorze 1 sa uzyteczne jako czynniki imniunoregulacyjne, zdolna do zmiany reakcji odpornosciowej u ssaków.Zwiazki te wytwarza sie przez kondensacje od¬ powiednich aromatycznych dwuamin z odpowied¬ nimi 1,2-dwuketonami. Reakcja dwuaminy z fenan- trenochinonem daje pochodne dwubenzo[a,c]fenazy- ny, a kondensacja dwuaminy z acenaftenochino¬ nem daje acenaftoi[l,2-b]chinoksaliny. Odczynniki ketonowe sa dostepne w handlu.Chinoksaliny i fenazyny o wzorze 1 mozna równiez otrzymywac z odpowiednich o-nitroanilinowych prekursorów aromatycznych o-dwuamin. W sposo¬ bie tym o-nitroaniliny poddaje sie katalityczneniu uwodornieniu i nie wyodrebniajac ich z mieszaniny reakcyjnej kondensuje z odipowiednim ketonern.Odpowiednimi katalizatorami uwodorniania sa ni¬ kiel Raney'a, 5% pallad na weglu, tlenek platyny itp. Nitroanilina mozna uwodornic w obecnosci re¬ agujacego ketonu, w którym to przypadku kon¬ densacje przeprowadza sie przez ogrzewanie w podwyzszonej temperaturze. Reakcje przeprowadza sie w rozpuszczalniku obojetnym w warunkach u- wodorniania, jak etanol lub czterowodorofuran. W reakcji kondensacji mozna zamiast o-nitroaniliny stosowac odpowiednia o-fenylenodwuamine. O-feny- lenodwuamine lub o-nitroaniline i dwuketon stosuje sie z reguly w ilosciach równowaznikowych. Jeze¬ li to jest korzystne mozna stosowac jeden z rea¬ gentów w nadmiarze, nie obnizajac wydajnosci re¬ akcji. Produkt reakcji — chinoksaline lub fenazy- ne mozna odzyskac przez odparowanie rozpuszczal¬ nika, i oczyscic znanymi sposobami, jak krystali¬ zacja lub chromatografia.Stosowane jako reagenty o-nitroaniliny lub o- fenylenodwuarniny sa dostepne w handlu lub mo¬ ga byc otrzymane znanymi sposobami laminowania, nitrowania lub redukcji odpowiednich aromatycz¬ nych prekursorów. Reagenty benizotrójfluorowe mozna otrzymywac przez fluorowanie odpowied¬ nich kwasów benzoesowych czterofluorkiem siarki.Zwiazki o wzorze 1 przebadano na zdolnosc ograniczania produkcji przeciwcial. Badania prze¬ prowadzono nastepujacymi sposobami.Myszom rasy szwajcarskiej, osobnikom plci mes¬ kiej z przypadkowo kojarzonych par, laczonym w grupy po 5, droga dozylnej iniekcji wprowadzono po 5 X 107 czerwonych cialek krwi. Iniekcje przy¬ gotowano z krwi jagniecia (w roztworze Alsvera), przez trzykrotne przemycie 0,85% solanka i po¬ wtórne utworzenie zawiesiny krwinek w tej so¬ lance. Rozpoczynajac 3 dni przed iniekcja, bada¬ nym zwierzetom podawano w ciagu 9 dni codzien¬ nie doustnie 0,1 ml dawki zwiazków rozpuszczo¬ nych w glikolu polietylenowym 400. Kazdy ze zwiazków podawano w kilku dawkach o inkre- mencie 2. Kontrole stanowila grupa, której doko¬ nano takiej samej iniekcji czerwonych cialek krwi i w ciagu 9 dni podawano jedynie nosnik. Szóstego dnia po iniekcji antygenu, myszy wykrwawiono przez naklucie serca i polaczono surowiec z 5 zwie¬ rzat w kazdej z grup. Polaczone surowice poddano calkowitej inaktywacji i standardowymi sposoba¬ mi badano zawartosc hemaglutyniny, stosujac mie¬ szanine seryjnych dwukrotnych rozcienczen solan¬ ka badanych surowic z 0,5% zawartoscia czerwo¬ nych cialek krwi owczej, w plastikowych plytkach z zaglebieniami. Po inkubacji plytek w ciagu 3 godzin w 37°C dokonano oceny hemiaglutynacji.Jako znaczaco przyjeto czterokrotne (75%) lub wyzsze ograniczenie przeciwcial w badanej suro¬ wicy, w odniesieniu do surowicy kontrolnej. Wy¬ niki wyrazono jako najnizsza dawke wywolujaca 75% lub wieksze ograniczenie przeciwcial.Efekt podania podskórnego okreslano w wyzej podany sposób,, stosujac w miejsce doustnego po¬ dania badanego zwiazku podanie podskórne. Efekt podania dootrzewnowego okreslano na myszach otrzymujacych dootrzewnowo antygen czerwonych cialek krwi i 2 dawki badanego zwiazku, 48 go¬ dzin przed i po iniekcji antygenu. Przy wprowa¬ dzaniu pozajelitowym stosowano zawiesiny zwiaz¬ ków w solance zawierajacej 0,125% „Methocel" (metyloceluloza o lepkosci 4000 centypuazów, DOW) i 0,2% „Ecmulphor" (polioksyetylowany olej roslin¬ ny EL 620, GAF), zwanej „Methocel E". Wykrwa- 40 45 50 55 60100 501 wienie i oznaczenia przeciwcial wykonywano jak wyzej.Wyniki badan chinoksalin i fenazyn o wzorze 1 na zdolnosc ograniczania wytwarzania przeciwcial przedstawiono w tablicach 1 i 2. Za próg czynno¬ sci iirimunosupresyjnej przyjeto dawka leku powo¬ dujaca co najmniej 75% ograniczenia wytwarza¬ nia przeciwdzial. Dla azatiopriny , (azathioprine Imimiunan), stosowanej klinicznie dla wywolania icm- munosupersji, okreslona w tej próbie wartosc wy¬ nosi 100 mg/kg. Nalezy zauwazyc, ze znana do¬ tychczas aoenafto[l,2-b]chinoksalma i dwubenzo- [a,c]fenazyna wykazuja jedynie nieznaczna aktyw¬ nosc (tablice 1 i 2).Tablica 1 Dwubenzo[a,c]fenazyny Podstawnik Rn atom wodoru 11-trójfluorometylowy -trójfluorometylowy Próg czynnosci immuno- supresyjnej (mg/kg)* IP x 2 vs IP 100 0,8 doustnie x9 vs IV 100 3,1 6,2 *) Sposób podawania okreslony w podtytule ru¬ bryki, np. „IP X 2 v,s IP" oznacza 2 dawki podane dootrzewnowo, 48 godzin przed i po dootrzewno¬ wym podaniu antygenu czerwonych cialek krwi owczej. Terapie doustna rozpoczynano 3 dni przed dozylnym podaniem antygenu, stosujac lacznie 9 jednorazowych dawek dziennych. Myszy wykrwa¬ wiano szóstego dnia po podaniu antygenu, a suro¬ wice poddano badaniom na zawartosc hemogluta- niny (HA). Jako pirogowa przyjeto dawke powo¬ dujaca 75% lub wieksze zmniejszenie HA, w po¬ równaniu z wartoscia kontrolna dla zwierzat, którym nie podano badanego zwiazku.Tablica 2 Acenafto[l,2-b]chinoksaliny Podstawnik Rn atom wodoru 8-trójfluorometylowy 9-trójfluorometylowy Próg czynnosci immuno- 1 supresyjnej (mg/kg) * IP x 2 vs IP 6,2 doustnie x9 vs IV 100 100 *) Sposób podawania okreslony w podtytule ru¬ bryki. Np. „IP X 2 vs IP" oznacza 2 dawki podane dootrzewnowo, 48 godzin przed i po dootrzewno¬ wym podaniu antygenu czerwonych cialek krwi ofwczej. Terapie doustna rozpoczynano 3 dni przed dozylnym podaniem antygenu, stosujac lacznie 9 jednorazowych dawek dziennych. Myszy wykrwa¬ wiono szóstego dnia, a surowice poddawano 'bada¬ niom na zawartosc hemaglutyniny (HA). Jako pro¬ gowa przyjeto daiwke powodujaca 75°/o lub wieksze zmniejszenie HA, .w porównaniu z wartoscia kon¬ trolna dla zwierzat, którym nie podano badanego zwiazku. 40 45 50 55 60 65 Zwiazki poddano dalszym testom zmodyfikowa¬ nym sposobem oznaczania surowicy.Oddzielne badania surowicy. W próbach tych za¬ stosowano wyzej opisany sposób postepowania zmodyfikowany przez prowadzenie badan w gru¬ pach nie po 5, a po 10 myszy, po czym surowice mianowano indywidualnie, po wykrwawieniu my¬ szy w wyzej opisany sposób. Dla kazdej z grup po 10 myszy oznaczono srednia wantoisc hemagluty¬ niny (log2)± odchylanie standardowe oraz wartosci p (wedlug testu T Studanta), w porównaniu z gru¬ pa kontrolna. Wartosc progowa okreslala najnizsza dawka znacznie (p<0,01) zmniejszajaca miano przeciwcial. W pewnych przypadkach lek podawa¬ no nie w 9, a w 10 dawkach dziennych. W tych przypadkach myszy wykrwawiano nie szóstego, a siódmego dnia po iniekcji antygenu. Typowe wy¬ niki uzyskane w indywidualnych próbach suro¬ wiczych z przebadanymi zwiazkami o wzorze 1 przedstawiono w tablicy 3.Czynnosc imimunosupresyjna zwiazków o wzorze 1 w ograniczaniu powiekszania sledziony u myszy w reakcji na limfiatyczny przeszczep komórek sle¬ dziony innego osobnika, badano sposobem zwanym reakcja przeszczepu na biorce.Reakcja przeszczepu na biorce (GVH). Komórki sledziony myszy szczepu rodzicielskiego (C57BL) wstrzykuje sie myszy szczepu hybrydowego F± (C57BL X C3H). Organizm biorcy nie odrzuca ich, poniewaz antygeny C57BL z hoiinozygotycznego ro- dziciela uznanej za „swoje". Jednak wstrzykniete komórki reaguja na komórki biorcy, zawierajace obce dla nich antygeny C3H. Wynikiem tej reak¬ cji jest powiekszenie sledziony biorcy. Immunosu¬ presja zapobiega temu powiekszeniu lub ogranicza je. Waga sledziony staje sie wiec miara reakcji GVH i jej zmniejszenia w wyniku immunosupresji.Zastosowano modyfikacje oryginalnego sposobu Simonsensa (Ann, N.Y. Acad. Sci 73, 834, 1958).Stosujac przyrzad Waringa z odwróconymi ostrza¬ mi tnacymi uzyskano duza wydajnosc komórek sledziony, bez zwykle stosowanego recznego draz¬ nienia tego narzadu. W dwóch szesciosekundowych operacjach rozcierania sledziony (25 sledzion C57BL w 25 ml solanki) uzyskano wystarczajace oddziele¬ nie jej komórek od tkanki lacznej. Przygotowana w ten sposób zawiesine komórek standaryzowano sposobem liczen komorowych Levy-Hausera, do za¬ wartosci 6 X 108 nukleowanych komórek w mili- litrze, 5 myszom C57B1 X C3H o wadze 16—18 g w grupach po 5 osobników wstrzyknieto dootrze¬ wnowo po 1 ml zawiesiny komórek dawcy. Droga podskórna, na 3 dni przed iniekcja komórek, po¬ dano badany zwiazek w objetosci 0,2 ml Iniekcje kontynuowano w ciagiu 13 dni. Zwierzeta kontrolne otrzymywaly jedynie komórki i nosnik. W 10 dni po iniekcji komórek wycieto i zwazono sledziony.Wyniki wyrazono w mg sledziony na g wagi ciala.W obliczeniach zahamowania wywolanego dzia¬ laniem immunoisupresyjnych zwiazków, za war¬ tosc odpowiadajaca 100% zmniejszeniu przyjeto wage sledziony myszy, którym wstrzyknieto syn- genetyczne komónki sledziony, tj. sledziony myszy szczepu C57BL X C3H. Taki zabieg powoduje nie¬ znaczne powiekszenie sledziony. Sposób obliczania100 501 I -m Wzór 1 mór 2 Rn"" NH5 mó/3 Wzór4 Wzór? WZGraf. Z-d 2, zam. 67/79, nakl. 90 Cena 45 zl PL PL