NO884298L - Fremgangsmaate til fremstilling av en innretning for optisk analyse av en mikropartikkelstroem og bruk ved fremstillingen av et cytofluormeter. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte til fremstilling av en innretning for optisk analyse av en mikropartikkelstrøm.

Uttrykket "mikropartikler" skal forståes å bety animalske eller vegetabilske biologiske celler, eller subcellulære elementer, såsom kromosomer.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen angår mer spesielt fremstillingen av et cytofluorometer.

Optiske analyseinnretninger for mikropartikkelstrømmer er allerede kjent fra US-PS 4 348 107 og US-PS 4 673 289 (den siste svarende til fr'ansk patentsøknad nr. 8409676 av 20.

juni 1984). Imidlertid beskriver ingen av disse publikasjoner en fremstillingsprosess for slike innretninger, og som er tilstrekkelig enkel og økonomisk nok til å skaffe innretninger med en rimelig kostnad som tillater fjernstilling av spesi-fikke analysesystemer, f.eks. forenklede strømningscytofluoro-metere som ikke er altfor kostbare.

Mange biologiske analyselaboratorier vil få et økende behov for slike cytofluorometere for å utføre rutineanalyser, f.eks. i hematologi eller innen næringsmiddelforskning (spesielt analyse av melk).

Den foreliggende oppfinnelse angår spesielt en fremgangsmåte til fremstilling av en innretning for optisk analyse av en mikropartikkelstrøm og som er enkel og gir utstyr til en for-nuftig pris.

Mer spesielt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte til fremstilling av en innretning for optisk analyse av en mikropar-tikkelstrøm som er i stand til å emittere lys,karakterisertved at det rundt en dyse som er dannet av et materiale som er gjennomsiktig overfor lyset og i hvilken det er anordnet en åpning for passasje av strømmen, er støpt et optisk element dannet av et materiale som er gjennomsiktig overfor lyset og som har et smeltepunkt under det for dysematerialet og en optisk indeks nær den for materialet og med et dioptrisk element som tillater at en optisk akse går gjennom åpningen.

For ytterligere å redusere innretningens kostnad, er materialet av hvilket det optiske element fremstilles, fortrinnsvis et plastmateriale og det optiske element sprøytestøpes. Fortrinnsvis er det dioptriske element sfærisk og konvekst. Fortrinnsvis faller det første weierstrasspunkt for det sfæriske dioptriske element sammen med åpningens sentrum. Dette fører til optikk med en stor numerisk åpning som kan følges av optikk med mindre åpning uten at det innføres sfæriske aberrasj oner.

Bruken av et sfærisk konvekst dioptrisk element i innretningen gir en høy samleeffektivitet, men for å øke denne effektivi-teten har det optiske element motsatt det sfæriske dioptriske element med hensyn til åpningen, i en sfærisk konveks vegg sentrert på åpningen og etter at innretningen er fremstilt, gjøres denne veggen optisk reflekterende.

Dysen som benyttes, kan være en kommersielt tilgjengelig dyse, såsom en safir perforert med en kalibrert åpning. Ifølge en spesiell utførelse av oppfinnelsen er imidlertid dysen dannet på forhånd ved skjæring av et kapillarrør, mens det langs den dannede snittakse lages to boringer med hovedsakelig koniske bunner og beholdes et parti av kapillarrøret, idet partiet følgelig utgjør den nevnte åpning og boringene konvergerer mot denne.

Oppfinnelsen angår også den optiske analyseinnretning skaffet ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen og dens bruk på et cytofluorometer som omfatter montasjen av en innretning for en optisk analyse av en mikropartikkelstrøm såsom biologiske celler eller subcellulære elementer som kan emittere lys når de utsettes for et lys eller en lyseksitasjon, idet strømmen rettes langs en akse, en anordning for å danne en eksiterende lysstråle for mikropartiklene og en anordning for å analysere lyset, idet innretningen fremstilles på forhånd ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen.

Etter fremstilling av den optiske analyseinnretning kan den siste bygges sammen med en del som har et hulrom som står i forbindelse med åpningen i dysen, idet denne del er dannet i ett med de første og andre rør, hvorav de respektive ender munner ut i åpningen som vender mot dysen og det første rør er anordnet for sirkulasjon av en mikropartikkelsuspensjon i retning av åpningen og enden av det annet rør er lenger borte fra åpningen enn enden av det første rør og det annet rør er anordnet for sirkulasjon av en væske for å dekke mikro-partikkelsuspens j onen forut for dennes passasje gjennom åpningen .

De to rørene kan være elektrisk ledende og koblet til en anordning for elektrisk analyse av cellene (målinger av coulter-typen). I dette tilfellet er innretningen utstyrt med nevnte del og rørene orientert på en slik måte at rørene hovedsakelig er vertikale og plassert lavere enn innretningen. Cellestrømmen blir da orientert fra bunn til topp. Dette gjør det mulig å eliminere luftbobler når cytofluorometeret settes i drift og å fylle hullet plassert ovenfor dysen, dvs. den elektriske kontakt med en returelektrode som også er anordnet for en måling av coulter-typen.

Det er også mulig å orientere innretningen utstyrt med nevnte del og rørene på en slik måte at disse rørene er hovedsakelig vertikale og plassert høyere enn innretningen. Cellestrømmen blir da orientert fra topp til bunn. Denne prosedyren er nød-vendig i et cytofluorometer benyttet til sortering eller klas-sifisering av biologiske celler.

I en spesiell konstruksjon har endelig anordningen for å danne den eksisterende lysstråle organer til å fokusere den samme og på den optiske analyseinnretning er det anordnet en åpnings-flate for nevnte lysstråle, anbragt slik at den tillater at den fokuserte stråle emitteres inn i åpningen perpendikulært på den optiske akse av det dioptriske element og på aksen av mikropartikkelstrømmen.

Det er da mulig på den nevnte innretning motsatt av innløps- . flaten med hensyn på åpningen å anordne en utgangsflate for lyset og vendt mot denne utgangsflate å anordne et organ for

å blende den eksiterende stråle, etter at den siste har veksel-virket med mikropartikkelstrømmen, idet blendeorganet tillater å passere på hver side av seg selv, lys spredt under små vinkler av mikropartiklene.

Oppfinnelsen skal beskrives mer detaljert i det følgende med hensyn til ikke-begrensende utførelser og den vedføyde tegning. Fig. 1 viser skjematisk et utsnitt av et cytofluorometer med en innretning fremstilt ved en fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen. Fig. 2 viser skjematisk et utsnitt av et grunnriss av cytofluorometeret på fig. 1. Fig. 3 viser skjematisk utsnitt av et oppriss av cytofluorometeret. Fig. 4 viser skjematisk et utsnitt av et annet cytofluorometer med en innretning skaffet ved en fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen. Fig. 5 viser skjematisk en fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen som gjør det mulig å fremstille innretningen benyttet i cytofluorometeret vist på fig. 1. Fig. 1 viser skjematisk og i utsnitt et cytofluorometer med en optisk analyseinnretning 2 skaffet ved en fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen. Rundt en dyse 4 har innretningen et lyssamlende optisk element 6. Dysen 4 har f.eks. et sylin-drisk hull eller åpning 8 med en vertikalakse X, for passasjen av en strøm 9 av biologiske celler som er ønsket undersøkt ved

hjelp av cytofluorometeret og som er rettet langs aksen X.

Det lyssamlende element 6, spesielt for det fluoriscerende lys emittert av cellestrømmen, begrenses ved topp og bunn av to horisontale, plane flater. På hver side av hullet 8 har dysen to åpninger som hhv. munner ut på de nevnte flater. Mellom disse flatene er elementet begrenset av første og andre kon-vekse, sfæriske dioptriske elementer 10, 12 som har samme horisontale symmetriakse Y som går gjennom sentrum av åpningen 8 og av flater 14, 16 (se fig. 3), som er symmetriske med hensyn til hverandre relativ til planene definert av aksene X og Y og som utgjør partier av en omdreiningssylinder med aksen Y.

Endyseinnretningen. 2 er festet mellom de respektive plane flater av et nedre parti 18 og et øvre parti 20 som er elektrisk isolerende. Det nedre parti 18 fåes ved montasjen av to partier 18a, 18b anordnet slik at delen 18 etter montasjen har et hulrom som munner ut på den øvre flate av partiet 18 som ender mot den nedre åpning til dysen 4. Delen 18 er dannet i ett stykke med et første rør 24 som er anordnet langs aksen X og hvorav én ende munner ut i hulrommet 22 og er anordnet

i nærheten av den øvre flate av delen 18. Delen 18 er også dannet i ett stykke med et annet rør 26 parallelt med røret 24 hvorav en ende også munner ut i hulrommet 22, men som er lenger borte fra den øvre flate av delen 18 enn enden av røret 24 .

Røret 24 tillater sirkulasjon av en suspensjon av biologiske celler i retning av dysen 4 og røret 26 gjør det mulig i kam-meret 22 å innføre en medbringende væske for å danne et væske-hylster rundt cellesuspensjonen fra røret 24.

Det øvre parti 20 er forsynt med et tredje rør 28 med aksene

X og som står i forbindelse med det øvre hull i dysen 4 og

som tillater uttømning av cellestrømmen fra cytofluorometeret (f.eks. til en ikke vist beholder).

Cytofluorometeret vist på fig. 1 er mer spesielt ment for

å utføre elektriske målinger av coulter-typen for elektrisk å telle antallet celler og elektrisk å måle deres volum. For dette formål er rørene 24, 26 og 28 elektrisk ledende og f.eks. fremstilt fra et metall som platina. Rørene 26 og 28 tillater elektrisk polarisasjon av åpningen 8 i dysen 4. Et polari-serende potensial Vp gis til røret 26 via en egnet elektrisk motstand 30 og røret 28 forbindes med jord. Røret 24 er forbundet med en passende elektronisk måleanordning 32 via en forforsterker 34 for å levere et elektrisk signal som repre-senterer cellevolumet.

I cytofluorometeret vist på fig. 1 er cellestrømmen orientert fra bunn til topp, noe som er å foretrekke fremfor den om-vendte orientering, slik at det sikres eliminering av luftbobler når cytofluorometeret settes i drift og for å gi god kontakt med røret 28, som danner en øvre elektrode, idet væsken fyller den øvre åpning.

Den optiske eksitasjon av cellestrømmen fåes ved en passende lyskilde 36, fortrinnsvis en laser, hvis stråle er rettet mot flaten 14 eller innløpsflaten langs en akse sett perpendikulær på aksene Y og X. Laserstrålen fokuseres på sentrum 38 av åpningen i dysen 4 for å treffe cellestrømmen. I praksis er åpningen en mikroåpning som i alt vesentlig faller sammen med sitt sentrum 38.

Laserstrålen fokuseres ved hjelp av en fokuseringslinse 40 koblet til en sylinderlinse 42 for å gjøre det mulig å skaffe en elliptisk fokusering for å belyse cellestrømmen på en homo-gen måte. Det kan ses at den sylindriske linse 42 har en sy-lindrisk flate som ender mot innløpsflaten 14 og hvis gene-ratrise er parallell med den siste.

Den motstilte flate 16 eller utløpsflaten for laserstrålen

har anordnet en maske 44 i form av en rektangulær plate som er forlenget langs Y-aksen og gjort smalere langs X-aksen. Denne maske absorberer laserstrålen som har gått igjennom

innretningen 2, mens den tillater passasje på hver side av sidene av masken og parallelt med aksen X, av lys 46 spredt av cellene under små vinkler med hensyn til laserstråleaksen Z. Lyset 46 fokuseres ved hjelp av egnede linser 48, 50 på en fotodetektor 52, som således leverer et signal som er repre-sentativt for diffusjonsparameteren ved små vinkler.

Et annet optisk element 54 som svarer til elementet 10 i

US-PS 4 673 289 omtalt ovenfor, er anordnet vendt mot det sfærisk kovekse dioptriske element 10. Elementet 54 er definert av et første sfærisk konkavt dioptrisk element 56 og et annet sfærisk konvekst dioptrisk element 58 som gir en felles symmetriakse som faller sammen med aksen Y. Det dioptriske element 56 vender direkte mot det dioptiske element 10.

For å unngå sfæriske aberrasjoner, faller fortrinnsvis det første weierstrasspunkt for det dioptriske element 10 sammen med sentrum 38 av dyseåpningen og det annet weierstrasspunkt for det dioptriske element 10 utgjør både sentrum for det første dioptriske element 56 og det første weierstrasspunkt for det annet dioptriske element 58.

For å øke samleeffektiviteten for det optiske element 6, be-legges det dioptriske element 12 med et metallbelegg 60, f.eks. aluminium (fig. 1) for å reflektere tilbake til det dioptriske element 10 lysstrålene som emitteres i retning av det dioptriske element 12. Et ikke vist parti av det siste behøver ikke være metallisert og utgjør således et vindu som gjør det mulig å observere det indre av innretningen 2 under inn-stillingen av cytofluorometeret.

På kjent måte blir lys fra det optiske element 54 deretter levert ved hjelp av ikke viste optiske organer til en foto-detektoranordning 59 og cytofluorometeret er forsynt med pro-sessoranordninger 61 som på basis av signaler levert av de forskjellige fotodetektoranordninger i dette gjør det mulig å utføre de ønskede analyser (se f.eks. US-PS 4 673 289).

Fig. 4 viser skjematisk og i utsnitt et annet cytofluorometer som også er utstyrt med en optisk analyseinnretning 2. Dette cytofluorometer gjør det mulig å sortere cellene i cellestrøm-men, men det tillater ikke at det utføres elektriske målinger av coulter-typen.

I cytofluorometeret vist på fig. 4 sirkulerer cellestrømmen fra topp til bunn. For dette formål gjøres montasjen av kompo-nentene 2, 18, 26, 24 i cytofluorometeret på fig. 1 i omvendt rekkefølge (idet dette utsettes for en rotasjon på 180° om aksen Y), røret 28 elimineres, delen 20 erstattes av en del 21 med liten tykkelse og som er gjennomboret av et hull som står i forbindelse, med åpningen i dysen 4 som for nærværende befinner seg ved bunnen. Cellestrømmen passerer således til fri luft straks den har kommet klar av dyseåpningen. Den blir deretter brutt opp i smådråper av en kjent, ikke vist ultra-lydanordning.

Cytofluorometeret vist på fig. 4 har også en elektronisk anordning 62 for å regulere ladningen av disse dråpene og for-tegnet for ladningen via en ringformet elektrode E plassert i fri luft og vendt mot det nedre utløp av delen 21 slik at den kan gjennomløpes av dråpene og som en funksjon av signaler mottatt av forskjellige ikke viste fotodetektoranordninger i cytofluorometeret, som tjener til å detektere fluoriserende lys emittert av de passende merkede celler under virkningen av en laserstråle fokusert mot åpningen i dysen 4 og som eksi-terer cellene.

Et par av ledende plater 64, 66 som hhv. er gitt en høy posi-tiv spenning og en høy negativ spenning er plassert etter elektroden på hver side av cellestrømmen. Disse plater gjør det mulig å selektivt føre dråpene som en funksjon av deres ladninger, inn i beholdere 68.

Fig. 5 viser en spesiell utførelse av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen og som gjør det mulig å fremstille en optisk analyseinnretning, i likhet med innretningen 2 beskrevet ovenfor. For å fremstille denne innretningen består det første trinn i å fremstille en dyse 4 og for dette formål benyttes det et tykkvegget kapillarrør, som fortrinnsvis fremstilles av glass og som kan fåes i handelen, f .eks. slik som et rør av termometertypen. Dette kapillarrør skjæres av perpendikulært på aksen ved hjelp av et diamantverktøy og av de to snitt-flater som fåes, maskineres to lagerflater eller sylinder-koniske hull 70, 72 langs aksen av snittet. Maskineringen ut-føres på en slik måte at det i sentrum av snittet etterlates et lite parti av kapillaren og de koniske partier av de to åpningene konvergerende mot partiet, idet det siste utgjør dysens mikroåpning.

Det optiske element 6 som er omtalt ovenfor skaffes ved sprøy-testøping av et gl-assmater iale med en optisk indeks nær den for glass. Dette plastmateriale er f.eks. "Plexiglass" (vare-merke ) .

For dette formål gjøres det bruk av en passende utført form, hvor dysen som fåes er anbragt med nøyaktighet.

Fig. 5 viser skjematisk formen 74 som gjør det mulig å fremstille innretningen 2. Denne formen har to halv-skall 76, 78 som kan settes sammen langs et sammenføyningsplan 80. Det er også mulig å se sentreringsstifter 82, 84 som er hhv. i ett stykke med de to halv-skall 76, 78. Disse stiftene kan settes inn i de sylindriske partier av boringene 70, 72 og gjøre det mulig å holde dysen på plass i formen. Et av halv-skallene 76 er også forsynt med dyser 86 for sprøyting av plastmateriale og lufteåpninger 88 som tillater utslipp av gasser under sprøytestøpningen.

Etter støpingen av det optiske element 6, fjernes innretningen 2 fra formen og polering kan finne sted i skjøten. Det er deretter mulig å metallisere det dioptriske element 12.

Fig. 5 viser at formen er slik at når elementet 6 tas ut av formen har den førstnevnte skuldre 7 som holder dysen 4 ved omkretsen av dennes sendeflater.

I et rent indikerende og ikke-begrensende eksempel har kapil-larrøret en omtrent 3 mm tykk vegg, høyden av kapillarrør-seksjonen er omtrent 6 mm, åpningen 8 har en høyde på omtrent 100 til 120 mikrometer og en diameter på ca. 70 mikrometer og de koniske partier av boringene 70, 72 har en apeks-halv-vinkel på ca. 45°.

Claims (13)

1. Fremgangsmåte til produksjon av en innretning (2) for optisk analyse av en mikropartikkelstrøm som er i stand til å emittere lys, karakterisert ved at det rundt en dyse (4) fremstilt av et materiale gjennomsiktig ovenfor lyset, og i hvilken det er anordnet en åpning (8) for passasje av strøm-men, er støpt et optisk element (6) fremstilt av et materiale som er gjennomsiktig ovenfor lyset og som har et smeltepunkt under det for dysematerialet og en optisk indeks nær den for materialet og med et dioptrisk element (10) som tillater at en optisk akse går igjennom åpningen.

2. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at materialet hvorav det optiske element (6) er fremstilt, er et plastmateriale og at det optiske materiale er sprøytestøpt.

3. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at det dioptriske element (10) er sfærisk og konvekst.

4. Fremgangsmåte i henhold til krav 3, karakterisert ved at det første weierstrasspunkt for det sfæriske dioptriske element (10) faller sammen med sentrum av åpningen (8).

5. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at det optiske element (6) motsatt av det sfæriske dioptriske element (10) med hensyn til åpningen (8) har en sfærisk konveks vegg (12), sentrert på hullet, og at det etter at innretningen (2) er fremstilt, gjøres veggen optisk reflekterende.

6. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at dysen (4) dannes på forhånd ved å kappe et kapillarrør, langs aksen av det dannede snitt å fremstille to boringer med hovedsakelig koniske bunn-partier (70, 72) som fører til et parti av kapillarrøret og som således utgjør åpningen (8) og konvergerer mot dette partiet.

7. Fremgangsmåte til fremstilling av et cytofluorometer og som omfatter montasje av en innretning (2) for optisk analyse av en strøm (9) av mikropartikler såsom biologiske celler eller subcellulære elementer og som er i stand til å emittere lys når det utsettes for lyseksitasjon, idet strømmen føres langs en akse, anordninger (36, 40, 42) for å danne en eksiterende lysstråle for mikropartiklene og anordninger for å analysere lyset (59, 61), karakterisert ved at innretningen (2) på forhånd fremstilles ved fremgangsmåten i henhold til et av kravene 1-6.

8. Fremgangsmåte i henhold til krav 7, karakterisert ved at det etter at innretningen (2) er fremstilt, dannes den siste i ett stykke med en del av den som har et hulrom (22) som står i forbindelse med åpningen (8) i dysen (4), idet delen dannes i ett stykke med første og et annet rør (24, 26), hvorav de respektive ender munner ut i hulrommet som ender mot dysen, idet det første rør er anordnet for sirkulasjon av en mikropartikkelsuspensjon i retning av hullet og enden av det annet rør er lenger borte fra åpningen enn enden av det første rør og det annet rør tjener til å sirkulere en væske for å dekke mikro-partikkelsuspensjonen forut for dennes passasje gjennom åpningen .

9. Fremgangsmåte i henhold til krav 8, karakterisert ved at de to rør (24, 26) er elektrisk ledende og forbundet med anordningene (30, 34) anbragt for elektrisk analyse av cellene.

10. Fremgangsmåte i henhold til krav 9, karakterisert ved at innretningen (2) ut styrt med delen (18) og rørene (24, 26) er orientert på en slik måte at rørene er hovedsakelig vertikale og anbragt lavere enn innretningen.

11. Fremgangsmåte i henhold til krav 8, karakterisert ved at innretningen (2) er utstyrt med delen (18) og rørene (24, 26) er orientert på en slik måte at rørene er hovedsakelig vertikale og anbragt høyere enn innretningen.

12. Fremgangsmåte i henhold til krav 7, karakterisert ved at anordningene for å danne en eksiterende lysstråle har organer (40, 42) for å fokusere denne og at det på den optiske analyseinnretning (2) er anordnet en"innløpsflate (14) for lysstrålen, anbragt på en slik måte at den tillater passasje av den fokuserte stråle inn i åpningen (8) perpendikulær på den optiske akse av det dioptriske element (10) og til aksen av mikropartikkel-strømmen ( 9 ) .

13. Fremgangsmåte i henhold til krav 12, karakterisert ved at det på innretningen (2), motsatt innløpsflaten (14) med hensyn til hullet (8) er anordnet en lysutløpsflate (16) og at det vendt mot denne utløpsflaten er anordnet en blende (44) for den- eksiterende stråle, etter vekselvirkningen av strålen med mikropartikkel-strømmen, idet blenden er i stand til å tillate passasje på hver side av lys (46) spredt av mikropartiklene under små vinkler.