NO882418L - Fremgangsmaate for masseproduksjon av potetavlingsmateriale som er fritt for viroider og virus. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder en fremgangsmåte for masseproduksjon av potetavlingsmateriale som er fritt for viroider og virus., ved hjelp av plantevevkultur.

Poteten (Solanum tuberosum) er et essensielt nær-ingsmiddel, og derfor er det gjort store forsøks- og prak-tiske anstrengelser for å forbedre dens fruktbarhet og dens resistens mot sykdommer og å utvikle en god tilpasning til omgivelsene. På tross av alle anstrengelser er det til nå ikke fremstilt noen kultivarer som motstår alle de alvorlige sykdommene og på samme tid har andre passende egenskaper.

De fleste kultivarer av potet er klassifisert under underartene tetraploid Solanum tuberosum ssp. tuberosum (Howard, H.W.: Genetics of the potato (Solanum tuberosum), Logos Press, London (1970) s. 126), selv om dihaploide og monohaploide potetlinjer også kan fremstilles (Houglas, R.W., Ploquin, S.J., Gabert A.C.: Effect of seed parent and pollinator on frequency of haploids in Solanum tuberosum. Crop. Sei. 4, 593-595 (1964)).

Det antas generelt at for å bibeholde den maksimale fruktbarhet og veksthastighet må poteten være heterozygot,

og størst mulig. Ved å redusere den interallelisk heterozy-gote karakter ved endogami, vil også veksthastigheten til potetfrøplantene reduseres signifikant.

De økologiske betingelser i mange land tillater

ikke langvarig bibehold av forskjellige potet-kultivarer som er frie fra sykdommer, og således var målet for forbedr-ingen å fremstille kultivarer som motstår miljøbetingelsene og de forskjellige patogenene ved å anvende ville, motstands-dyktige, arter, som hybridiseringsmateriale.

Resistensforbedringen hadde imidlertid bare moderate resultater da den tradisjonelle såkalte "enkelttrinns"-metoden når det gjelder poteter, ikke virket (ved denne metode fremstilles de nye, ønskede egenskaper ved å bibeholde de andre fordelaktige trekk).

Mange metoder er utviklet for den in vitro vegetative avl av poteten (Roca, W.M., Esponoza, N.O., Roca, M.R., Bryan, J.E.: A tissue culture method for -the rapid propagation of potatoes; Am. Potato J. 5_5, 691-701 (1978); Goodwin, P.B., Kim, Y.C. Adisarwanto, T.: Propagation of potato by shoot-tip culture, Potato Res. 23, 9-23 (1 80); Roest, S., Bokelmann, G.S.: In vitro adventitious bud techniques for vegetative propagation and mutation breeding of potato (Solanum tuberosum L.) I. Vegetative propagation in vitro through adventitious shoot formation. Potato Res. 23, 167-181 (1980); Hussey, G., Stacey, N.J.; In vitro propagation of potato (Solanum tuberosum L.) Ann. Bot. 48, 787-796 (1981); Henszky, L.E., Enyingi, K., Szabo I: Tissue culture technolgy for longterm storage and propagation of potato (Solanum tuberosum L.) germplants (Plant cell Culture in Crop. Improvement, S.K. Sen, K.L. Giles ad., Plenum Press, New York, London, (1983), 9-18).

Disse metodene er primært anbefalt for avl av virusfrie potetlinjer. Ved siden av seleksjonen er det en annen mulighet for å fremstille virusfrie linjer, dvs. ved isolering av de meristeme celler i de virus-infiserte plantene og å dyrke dem in vitro (Morel, G., Muller, J.F.: La culture in vitro du méristéme apicale de la pomme de terre; Compt. Rend. 258, 5250-5252 (1964); Mellor, R.C., Stace-Smith, R.: Virus-free potatoes by tissue culture, "Applied and Fundamental Aspects of Plant Cell, Tissue and Organ Culture", red.: Reinert J. and Bajaj Y.P.S., Springer-Verlag, Berlin-New York, (1977), 615-637;

Faccioli, G.; Rubies-Autonell, C.: PVX and PVY distribution in potato meristem-tips and their eradication by the use of thermotherapy and meristem-tip culture, Phytopath. Z. 103, 66-76 (1982)). Grunnen for dette er at de meristeme celler i plantene er frie for virus som et resultat av visse bio-kjemiske prosesser som hittil delvis er forklart.

Å forskåne fra virus og den in vitro vegetative dyrkning, begge basert på meristem dyrkning, er meget populære metoder for beskyttelse av potetarter. In vitro-produksjonen av de små, såkalte miniknollene av poteten, er også en kjent metode (American Potato Journal _59 , 33-37 (1982)).

Den videre dyrkning av potetplanter, produsert in vitro, vil utføres i drivhus. Avdelte enkeltknopper er også meget brukt ved multiplikasjon av virusfrie moder-planter (Sunarjono, H., Krisnawati, Y.: Potato seed multi-plication by stem cutting I. The influence of the mother plant age on the growth and yield of the cutting. Bull. Penel, Hort, 8(2) 39-47 (1980); Goodwin, P.B., Brown, G.: Field performance of potato shoot-tips proliferated in culture. Potato Res. 2J3 , 449-452 (1980); Goodwin,P.B.: Rapid propagation of potato by single node cuttings, Field Crops, Res. 4_, 165-173 (1981).

På tross av alle anstrengelser som er gjort for å fremstille avlingsmaterialet av poteten ved vevkultur, er det ikke ennå oppnådd å fremstille avlingsmaterialet i store mengder og økonomisk. Selv om flere delresultater er tilgjengelige, er intet komplekst system tilgjengelig så langt, som med hell kan anvendes for fremstilling av et passende avlingsmateriale av potet i stor skala, og som kunne gi en løsning som tilpasser seg til kravene til fremstilling av forskjellige avlingsmaterialer, dvs. rotfestede stiklinger, miniknoller og/eller små knoller.

Det er funnet, og det er formålet med foreliggende oppfinnelse, at potetens avlingsmateriale som er fritt for viroider (og virus), dvs. rotfestede stiklinger, miniknoller og/eller små knoller, kan fremstilles i store mengder ved vevkultur som følger: de spirede potetmeristemceller (skuddets endeved) vil isoleres, de isolerte fraksjoner som er frie fra viroider og virus, vil separeres og dyrkes i næringsstoffer in vitro opp til 6-8 knopper, og senere vil de rotfestes i næringsstoff, eller miniknoller vil induseres på skuddene. Plantene som er rotfestet in vitro, vil overføres til drivhus der de separert som meristemlinjer vil dyrkes for å bli morplanter, eller miniknoller vil igjen induseres på de in vitro rotfestede plantene, og morplanter vil dyrkes fra miniknollene, og fra disse morplantene kan det oppnås frøplanter eller små knoller som avlingsmaterialer, eller miniknollene vil anvendes som avlingsmaterialer, og dannelsen av, frø-planter eller knoller kan dirigeres ved påvirkning av patatinsyntesen i morplantene.

Den fremgangsmåte som er angitt i detalj i foreliggende oppfinnelse, kan med utbytte anvendes for den økonomiske produksjonen av potetens avlingsmateriale i store mengder,

og den er egnet for stabil tilførsel av avlingsmateriale hele året rundt.

Isolasjonen av meristemcellene, dyrkningen og mangfoldiggjørelsen av skuddene, rotfestingen og dannelsen av miniknoller utføres under laboratoriebetingelser, dyrkningen av moderplantene fra de rotfestede plantene utføres i drivhus, og dyrkningen av frøplantene eller små knoller fra morplantene vil utføres i drivhus eller på feltet, under vektorfrie omgivelser.

Det første trinn ifølge foreliggende oppfinnelse er å velge potetlinjer som er frie fra virus og viroider.

På potetknoller av samme kultivarer induseres skudd-dannelse, f.eks. med gibberellinsyre, så vil knollene spires og forseres i et klimakammer uten belysning. Etter ca. 3 uker vil 0,2-0,3 mm skuddtopp isoleres fra toppen av 5-10 cm skudd, under aseptiske betingelser. Den isolerte skuddspiss vil enkeltvis bli satt i sterilt næringsstoff. Hver meristem vil behandles og multipliseres som separate linjer. Forskåningen av hver multiplisert linje fra virus og viroider vil kontrolleres ved hjelp av virologiske test-metoder, dvs. enzym-immunoprøve (EIA). (J. gen. Virol. 33, 165-167 (1976); Revue Suisse Agric. 11, 253-265 (1979);

J. gen. Virol. 3_4 , 475-483 (1977); Novényvédelem 15(8), 354-358 (1979); Phytopath. Z. 90, 364-368 (1977); Phytopath. 67, 145-150 (1977)).

For lengre dyrkning er bare de meristemlinjer an-vendt som er frie fra alle potet-virus og -viroider. Etter starting av in vitro-avlingen, kontrolleres forskåningen av de utvalgte virusfrie linjer flere ganger i løpet av prosessen.

De meristemer som på tilfredsstillende måte er kon- trollert og utvalgt, dyrkes i Wassermanr^rør, i næringsstoffer, opp til 6-8 knopper. Sammensetningen av næringsstoffet er som følger.:

Når det gjelder makro- og mikroelementer, se publikasjonen til Hurashige og Skoog: Physiol. Plant 15, 473-497 (1962).

De utviklede meristem-planter med 6-8 knopper settes horisontalt i fast næringsstoff, likt det ovenfor nevnte (makroelementene har den opprinnelige konsentrasjon, 3% saccharose), som er svakt utklemt i mediet. Ved hjelp av denne metode vil det gjøres mulig at alle knoppene begynner å gro. I dette stadium dyrkes plantene in vitro.

For rotfestingen vil det samme næringsstoff anvendes som for dyrkningen, imidlertid uten agar. For dannelsen av miniknoller kan de næringsstoffer som er angitt i de ungarske patenter 183.978 og 187.396, også anvendes. I væsker skyter knollene av skuddelene raskt og genererer rotvev. Etter 10-12 dager vil de forgrenede røtter bindes opp og kan tas ut med en gang. Det vil være bare meget få blader på plantene, og dette er meget fordelaktig når det gjelder planting av dem i drivhus. De vil påvirkes på kjent måte slik at det oppnås enten rotfestede .skudd eller miniknoller (Annals of Botany, _5_3, 565-578 (1984)).

Plantene som, er rotfestet in vitro, vil dyrkes i drivhus på fast jord.

De rotfestede plantene tas i bånd på overflaten av jorden. For å bibeholde fuktighetsgraden på passende nivå dekkes plantene med folie, og lyset må reguleres. Plantene under foliene må luftes hver dag, og den andre uken vil plantene avdekkes trinnvis for å tilpasse plantene til omgivelsesbetingelsene i drivhuset. 3 uker etter at plantene er transplantert, vokser plantene uten dekke, og det kan tas stiklinger fra dem.

Veksten av planten er ikke jevn nok til å være egnet for direkte fremstilling av frøplanter fra dem, og således anvendes disse plantene som morplanter for å gi skudd.

For produksjon av et jevnt frøplantemateriale vil toppstiklinger (med 3-4 knopper) rotfestes på brett.

Stiklingene dannes av unge skudd med 1-2 cm lange blader fordi de eldre skuddene vil utvikle knoller, og de er således ikke egnet for dyrkning av rotfestede frøplanter. Frøplantene rotfestes under dekke, og de vil dyrkes på brett i to uker, opp til 5-6 blader. Frøplantene kan overføres til drivhus eller på feltet i en vektorfri omgivelse.

Planter som er oppnådd fra miniknoller som er indusert i skuddyrkningsstadiet, kan også anvendes som mor-plante.

De frøplanter som er dyrket i drivhus, skal over-føres til et vektorfritt felt på en måte slik at bare de øvre bladene av frøplantene er over grunnivået. Fra alle de underjordiske knoppene i de horisontalt plasserte plantene vil det utvikle seg skudd og senere knoller.

Det er å anbefale å sette plantene skilt ifølge meristemlinjene i den omgivelse som er fri fra vektorer slik at riktigheten av varieteten og fruktbarheten kan kontrolleres. På denne måte er det mulig å fjerne de dårlige linjene og å velge de fordelaktige egenskapene.

Den videre avlingen av dette avlingsmateriale på feltet kan utføres ved hjelp av tradisjonelle jordbruks-metoder.

Som nevnt ovenfor, vil de stiklingene som er oppnådd fra foreldreplantene, overføres for å oppnå knoller. I til-feller der det ikke er ønskelig å oppnå knoller, men målet er å oppnå ytterligere foreldreplanter som gir stiklinger, må knolldannelsen inhiberes for å øke evnen til dens stik-lingdannelse. Etter at knolldannelsen har startet, kan ikke stiklingene rotfestes effektivt.

Det er funnet at induksjonen av potetens knolldannelse står i nær forbindelse med begynnelsen av potetens patatinsyntese. Patatinsyntesen som starter i bladene, er en forutsigelse av induksjonen av knolldannelse. Patatinsyntesen og således induksjonen eller inhiberingen av knolldannelsen kan oppfølges med en enzym-bundet patatin-antiserumprøve.

På basis av kontrollen med patatinsyntesen kan knolldannelsen påvirkes ved å forandre omgivelsesbetingelsene eller ved kjemisk behandling. Patatinsyntesen kan induseres ved avkjøling eller ved å ta bort uorganisk nitrogen (ammoniakk, nitrat), hhv. ved å erstatte det med en organisk nitrogenkilde (carbamid).

Ifølge en av utførelsesformene av fremgangsmåten som er beskrevet i foreliggende oppfinnelse, vil knolldannelsen til laboratorieskuddene induseres slik at det in vitro vil oppnås miniknoller som har noen mm diameter. Disse miniknollene er meget hensiktsmessige som avlingsmaterialer. I motsetning til den sesongmessige skuddproduk-sjonen kan miniknollene produseres jevnt hele året rundt, og de kan lagres i små volumer i kjøleskap.

Ulempen med miniknollene er imidlertid at de har løs konsistens, de visner meget lett og de kan meget lett ødelegges. Disse ulempene kan elimineres ved å belegge knollene som er produsert in vitro, med et beskyttende skikt, for så å beskytte dem fra visning og fra mekaniske ødeleggelser. De belagte knollene er egnet for såing med såmaskiner.

Fremgangsmåten er som følger: etter å ha tatt miniknollene fra kolhene, må restene av stammen fjernes, knollene må vaskes grundig og tørkes. Tørkingen kan utføres på brett, i 1-2 lag, ved 20°C temperatur, 40% fuktighet,

i ca. 2 uker. Tørkingen må fortsettes inntil det opprinnelige knollvolumet er redusert med en tredel. Så belegges knollene på kjent måte (0,5-0,6 mm) ved granulering. Granul-eringen kan utføres ved hjelp av de metoder som er vanlige for belegning av frø. De belagte knollene skal tørkes og lagres ved en temperatur på ca. 2-5°C. I løpet av den prak-tiske gjennomføringen av denne fremgangsmåte er det ikke funnet noen spontane, genetiske forandringer.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen uten å begrense den.

Eksempel 1

Produksjon av virusfritt avlingsmateriale og in vitro reservasjon av kultivarer 10 stk. "Somogy gyongye" potetknoller vaskes med en løsning av 10% natriumhypokloritt og 0,1% fuktemiddel og med en håndskrubb, og de bløtes i samme løsning i 30 minutter. Etter steriliseringen skylles knollene 3 ganger med sterilt, destillert vann og tørkes så. For å fremme spiring bløtes de tørre knollene i GA-3 (gibberellinsyre)-løsning på 10 mg/liter i 30 minutter og tørkes så, og de vil spire i en klimakasse ved temperatur på 5°C, 70-80% relativ fuktighet, uten lys, i 18-22 dager, opp til 4-6 cm skudd. Kul-turene skal merkes og nedtegnes med knoller og skudd.

De kuttede skuddene skal steriliseres i en løs-ning av 4% natrium-hypokloritt, så skylles 3 ganger med sterilt, destillert vann, og skuddtoppen må kuttes under mikroskop med skarp lansett og settes på et næringsstoff

som angitt i detalj ovenfor. En skuddtopp-meristem settes i et reagensglass, og den begynner å vokse i løpet av 3-4 uker, ved en temperatur på 20-22°C og en lysintensitet på 500 Lux. Over de voksende kulturer vil lysintensiteten

økes til 2000 Lux, hvorved små planter med 5-7 blader vil utvikles i løpet av 6-8 uker.

Plantene må ;tas ut av reagensglassene og settes i et næringsstoff likt det som er nevnt ovenfor, bortsett fra saccharoseinnholdet som må økes opp til 3%. En standard-beholder med skrukork (400 ml), inneholdende 40 ml næringsstoff, er hensiktsmessig for dette formål (1 plante/be-holder) . Ved 20-22°C og en lysintensitet på 3000 Lux vil alle knoppene starte å vokse i løpet av 6-8 uker, og

4-8 cm skudd vil utvikles i beholderen. På dette stadium

må den første kontrollen på utelukkelse av virus utføres.

De virusinfiserte linjene elimineres fra ytterligere dyrkning, og de tilfredsstillende skuddene deles i biter med 1 til 2 knoller, settes i andre dyrkningsbeholdere, og de vil dyrkes på ovenfor nevnte måte. I hver pode-syklus må det utføres ytterligere kontroller minst 3 ganger, og så kan de virusfrie linjene multipliseres. Ved bruk av den fremgangsmåte som er angitt i detalj ovenfor, kan det fremstilles ubegrensede mengder av planter fra hver linje.

Eksempel 2

Produksjon av miniknoller

De planter som er produsert ifølge eksempel 1, vil dyrkes ytterligere i det ovenfor nevnte næringsstoff (væske) som ikke inneholder agar (22°C, 3000 Lux). Beholderne vil bli gjennomvevet av plantene, og så, etter ca. 3 uker,

må næringsstoffet utbyttes med et annet som fremmer patatinsyntesen. Dette stoffet skiller seg fra det andre: det inneholder 10 mg/liter benzyl-adenin, 10 mg/liter, kumarin og 8% saccharose, men bare 10% uorganisk nitrogenkilde av den opprinnelige mengde. Dyrkningen utføres ved en temperatur på 17°C, 1000 Lux, i 10-12 uker. På dette tidspunkt er det utviklet 40-60 stk. miniknoller (0,3-0,6 cm diameter). Beholderen må tømmes, plantene tørkes, knollene tas av, de får ligge i en uke ved romtemperatur (forkorkning), og der-etter lagres de ved +2 - 4°C på et tørt og mørkt sted.

Eksempel 3 Produksjon av foreldreplanter og frøplanter

De planter som er produsert ifølge eksempel 1, overføres til et drivhus, i løse bunter, i en jord som inneholder en blanding av torv og perlitt (500-750 planter/m 2). Jorden må holdes ved 20°C og luften ved 24°C, og for å sikre fuktigheten må bordet dekkes med folie. Kulturen kan til-passes i 2-4 uker til betingelsene i drivhuset: plantene blir sterkere og 7-8 blader vil utvikles. Dette er foreldreplanten hvor dannelsen av knoller vil inhiberes ved å hindre patatinsyntesen, ved å sprøyte dem med kunstig gjødsel-løsning med 0,2% Mikramid. Fra denne foreldreplanten kan topp-endeskudd med 4-5 blader igjen oppnås, og disse kan dyrkes etter å være rotfestet, eller de kan markedsføres som potetfrøplanter. 80-100 stk. frøplanter kan oppnås fra en dyrkningsbeholder.

Eksempel 4

Produksjon av små knoller

Fra miniknollene ifølge eksempel 2 eller fra frø-plantene ifølge eksempel 3 kan det produseres små knoller i drivhus eller i isolatorer. Såingen eller plantingen ut-føres i en blanding av torv og perlitt, inneholdende 0,5 kg/m 3av det kunstige gjødningsstoffet carbamid

2

(400 planter/m ).

Plantene må vannes ved naturlig temperatur og lys som tilfredsstiller deres krav. Tilførselen av næringsstoffer kan skje gjennom bladene. Etter 8 uker må utvik-lingen av bladverket hindres ved bruk av klor-cholin-klorid, en vekstregulator, vanningen må stoppes, slik at det 85-90 dager etter såingen kan oppnås 3-4 små knoller (lagermateriale) (0,5-2,0 cm diameter).

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for masseproduksjon av potetavlingsmateriale som er fritt fra virus og viroider ved bruk av vevkultur, karakterisert ved at spirede celler fra vev av potetskuddtopper isoleres, cellene dyrkes in vitro i næringsstoff, de multipliseres så in vitro i næringsstoff, de oppnådde skuddene rotfestes i næringsstoff eller knolldannelse induseres på skuddene, plantene som er rotfestet in vitro, overføres til drivhus og dyrkes for å bli foreldreplanter y^ller det induseres knolldannelse på de planter som er rotfestet in vitro, om ønsket dyrkes morplanter fra miniknollene, og fra morplantene oppnås det avlingsmateriale i form av frøplanter eller små knoller, eller de oppnådde miniknollene anvendes som avlingsmateriale, og dannelsen av frøplanter, hhv. knoller, dirigeres på egnet måte ved å påvirke patatinsyntesen i foreldreplantene.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for produksjon av miniknoller, som avlingsmateriale, karakterisert ved at det på skuddene, som er oppnådd ved avling in vitro, etter direkte eller in vitro rotfesting, induseres dannelse av knoller.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det oppnådde miniknoll-avlingsmateriale belegges med et beskyttende skikt.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for produksjon av potetfrøplante som avlingsmateriale, karakterisert ved at skuddene som er oppnådd ved avling in vitro, rotfestes in vitro i næringsstoff, så overføres til drivhus, og dyrkes for å bli foreldreplanter, og fra disse foreldreplantene oppnås frøplanteavlings-materiale, mens patatinsyntesen i foreldreplanten hindres.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 4, karakterisert ved at patatinsyntesen påvirkes ved å forandre omgivelsesbetingelsene, eller ved bruk av kjemisk behandling.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for produksjon av små potetknoller som avlingsmateriale, karakterisert ved at det på foreldreplanten som er dyrket fra planter som er rotfestet in vitro, eller på miniknollene, induseres knolldannelse.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 4, karakterisert ved at det fra skuddene, som er oppnådd fra morplantene, dyrkes ytterligere morplanter.

8. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, karakterisert ved at potetavlingsmaterialet produseres i omgivelser som er frie fra virus og viroider.