DD207731A1

DD207731A1 - Verfahren zur virusfreien vegetativen vermehrung und erhaltung von digitalis-hochleistungspflanzen

Info

Publication number: DD207731A1
Application number: DD23974082A
Authority: DD
Inventors: Klaus Breuel; Heinrich Poetter; Martin Luckner; Beate Diettrich; Monika Springer
Original assignee: Dresden Arzneimittel
Priority date: 1982-05-11
Filing date: 1982-05-11
Publication date: 1984-03-14

Abstract

DIE ERFINDUNG BETRIFFT EIN VERFAHREN ZUR VIRUSFREIEN VEGETATIVEN VERMEHRUNG UND ERHALTUNG VON DIGITALIS-HOCHLEISTUNGSPFLANZEN IN VITRO, DAS UEBER EINE LANGE ZEIT EINEN INNERHALB DER POPULATION GLEICHMAESSIG HOHEN UND IN SEINER ZUSAMMENSETZUNG KONSTANTEN CARDENOLIDGEHALT BEWIRKT. DAZU WERDEN NACH EINER INTERMITTIERENDEN TEMPERATUR- UND LICHTEINWIRKUNG, DIE ZUR ELIMINIERUNG VON VIREN AUS DEN MERISTEMATISCHEN GEWEBEN FUEHRT, AUS MERISTEMEN ODER MERISTEMANLAGEN BZW. SPROSSSPITZEN, STENGELSTUECKEN, SEITENKNOSPEN ODER BLUETEN MIT MERISTEMEN ODER MERISTEMANLAGEN UNTER STERILEN BEDINGUNGEN AUF UEBLICHEN NAEHRMEDIEN, DIE CYTOKININE UND/ODER AUXINE ENTHALTEN KOENNEN, SPROSSE UND MERISTEMGEWEBE ANGEZOGEN, DIESE VON DEN AUSGANGSEXPLATATEN ABGETRENNT, WEITER VERMEHRT UND VEREINZELT UND AUF NAEHRLOESUNG MIT GESTEINSMEHL AUS ALUMINIUMSILIKAT BESTIMMTER KORNGROESSE ZUR BEWURZELUNG GEBRACHT. DIE SO ERHALTENEN PFLANZEN WERDEN ISOLIERT, IN GESTEINSMEHL PIKIERT UND UNTER FOLIETUNNEL AN GEWAECHSHAUS- BZW. FREILANDBEDINGUNGEN ADAPTIERT.

Description

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Titel der Erfindung

Verfahren zur virusfreien vegetativen Vermehrung und Erhaltung von Digitalis-Hochleistungspflanzen

Anwendungsgebiet der Erfindung

^s '.. .

Daa zur Gewinnung von Herzglykoaiden benutzte pflanzenmaterial von Digitalia lanata⁷und Digitalis purpurea wird feldbaumäßig unter Verwendung von Elitesaatgut erzeugt, welches jährlich durch einen aufwendigen Kreuzungs- und SeLektionsprozeß hergestellt werden muß. Die Erfindung ermöglicht die Gewinnung von gesundem und einheitlichem Ausgangsmaterial für den Produktionsanbau ohne den jährlichen Zyklus der Srhaltungsziichtung·

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Zur Gewinnung von Herzglykosiden werden üblicherweise definierte Sorten von Digitalis lanata und Digitalis purpurea landwirtschaftlich angebaut· Da die.Digitalispflanzen nach der Samenreife absterben, ist zur Erhaltung -der Sorten sowie zur Saatguterzeugung für den Anbau ein regelmäßiger Züchtungsprozeß erforderlich.! Aufgrund der Fremdbestäubung bei der Gattung Digitalis kommt es dabei, zu einer unerwünschten Variationsbreite in den Merkmalen der nachkommen, die durch,einen außerordentlich hohen analytischen und kreuzungstechnischen Aufwand eliminiert werden muß· Um diesen Schwierigkeiten zu begegnen, wurden bisher

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prinzipiell zwei Wege eingeschlagen, nämlich: 1· die Bildung von Cardenoliden in Zellkultüren von Digitalis, z. B. nach BD-PS Ir· 151 451, oder 2· die Verklonung von genetisch hochwertigen üutterpf lanzen, ζ·'Β· auf der Basis embryogener Zellkulturen nach BD-PS Mrw 151 473.

Die lachteile der erstgenannten Methode liegen vor allem in zu geringen Glykosidausbetiten, unäblichem Cardenolidspektrum und in einer langen und aufwendigen Submerskultur. Hach dem zweiten Verfahren besteht die Gefahr, daß bei embryogenen Zellkulturen die genetisch wertvollen Eigenschaften der Mutterpflanze verlorengehen oder nachteilig beeinflußt werden können·

In Plant Cell Reports (1981) 2» 34 - 35 wurde von Erdei, I·, Kistf, Z»'und Maliga, P. über eine Methode zur klonalen Vermehrung von Digitalis lanata berichtet, wonach in aseptischer Kultur"Sproßkulturen gewonnen werden durch Beimpfen von RH-Hedium nach linsmaier und Skoog, das mit 1 mg 6-BAP und 0,1 mg IES/1 ergänzt ist, mit 3 - 5,am langen Triebspitzen von gekeimten Samen oder Feldpflanzen. In diesem Medium wird die Bildung von bis zu 30 neuen Sprossen erreicht. Der Anteil der wurzelbildenden Sprosse wird durch Senkung der Salz- und Auxinkonzentration erhöht· Die Übertragung der bewurzelten Triebe in das Gewächshaus ge*· lingt in 85 - 98 % der Fälle, wenn die Bewürzelung in hormonfre.iem Medium erfolgt. Diese !Methode hat verschiedene Nachteile. Sie liegen einmal darin, daß Samen als Ausgangsmaterial für Klonpflanzen zur Saatguterzeugung aus z&chtungstechnischen Gründen schlecht geeignet sind, ferner, kann auf diesem Weg nur eine relativ niedrige Yermehrungsrate erreicht werden· Außerdem zeigte sich, daß die Bewurzelung der Meristemkultur zwar unter bestimmten Bedingungen gelingt, jedoch die Überlebensrate beim Übergang zu Gewächshaus- und insbesondere Freilandbedingungen gering bleibt, da die Jungpflanzen zu wenig widerstandsfähig

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Aus der Literatur ist weiterhin begannt, daß Digitalis . häufig durch Viren infiziert ist, die z. B. im Pail τοπ Digitalis lanata als ein Stamm des Tabakmosaikvirus und als Ackerbohnenwelkevirus identifiziert wurden (Schumann, Phytopath. Z* 48 (1963) 1 - 28). lach Silva und Pop (Pharmazie 2Q (1965) 110 - 112) kann der Glykosidgehalt solcher viruskranker Pflanzen um 32 - 46 % absinken· ]?ür eine intensive vegetative Vermehrung, wie sie die Invitro-Termehrung darstellt, sind daher vimsfreies Ausgangsmaterial und die M'dglichkeit eines zuverlässigen Yirustestes eine unabdingbare Voraussetzung* Die Aufgabe der virusfreien vegetativen Vermehrung von Hochleistungspflan* zen, die hinsichtlich Vitalität und Wirkstoffgehalt dem üblicherweise vorliegenden Zuchtmaterial überlegen sind, wurde bisher noch nicht gelöst, '

Ziel der Erfindung '. >'" ',

Ziel der Erfindung ist die effektivere Hutzung von Digitalis-Hochleistungspflanzen bei gleichzeitiger qualitativer Verbesserung des Zuchtmaterials und Senkung des ZiiChtungsaufwandes·

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, die Mängel der bisher bekannten Verfahren zur Erhaltung und Vermehrung von hochwertigem Digitalispflanzenmaterial zu überwinden und ein Verfahren zu entwickeln, welches

- die Erhaltung des genetischen Materials einmal zur Saatgutgewinnung ausgelesener Digitalishochleistungspflanzen für einen langen Zeitraum über das natürliche Lebensalter hinaus ermöglicht,

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- die vegetative Vermehrung dieser Pflanzen in einer sehr hohen Zahl und mit praktischer Eignung für den Feldanbau, erlaubt, wobei die erhaltenen iEochterpflanzen einen XLon mit gleichmäßig hohem lind in seiner Zusammensetzung einheitlichen Cardenolidgehalt bilden and . ' - die Eliminierung von Virusbefall sowie die Prüfung

auf Tirusfreiheit bei den Klonpflanzen gestattet. Durch Anbau geeigneter virusfreier Klone in Mischung kann in der Folge ein Hybridsaatgut erhalten werden, aus dem sich Pflanzen entwickeln, die durch Heteroaiseffekt dem verklonten Ausgangsmaterial in den genannten Merkmalen noch überlegen sind«

Ss wurde ein Verfahren zur virusfreien vegetativen Vermehrung und Erhaltung genetisch hochwertiger Individuen von Digit ausarten gefunden, wonach die Pflanzen im ersten oder zweiten Vegetationsjähr für eine bestimmte Zeit intermittierenden Temperatur- und lichteinwirkungen ausgesetzt werden, um vorhandene Viren aus den Meristemen und Meristemanlagen der Pflanzen praktisch zu eliminieren. Danach werden meristematische Gewebe unter sterilen Bedingungen auf ein cvtokinis- und ggf· auxinhaltiges Me-' 4ium übertragen und bis zur Bildung von Sprossen oder netfem Meristemgewebe kultiviert. Diese Heubildungen werden von den Ausgangsexplantaten abgetrennt, vereinzelt und in an sich bekannter Weise vermehrt, wobei der VermehrungszYklus sich nach Bedarf wiederholen kann. Die Bewurzelung der Sprosse erfolgt unter ebenfalls sterilen Bedingungen durch Kultivierung auf Gesteinsmehl und Bewuraäungsmedium. Die so erhaltenen Pflanzen werden isoliert, aus dem sterilen Milieu in Geateinsmehl überführt und unter Folietunneln an Gewächshaus- bzw. Freilandbedingungen adaptiert« Im folgenden wird die Virusfreiheit der Pflanzen durch empfindliche Hachweisverfahren überprüft. Die

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virusfreien pflanzen können wiederum wie oben beschrieben vegetativ vermehrt oder zur Saatgutgewinnung herangezogen werden. Die Erhaltung des Materials erfolgt durch Konservierung,entweder in Form von sterilen Pflanzen als Arbeitskonserven oder in Form von sterilen Meristemen als Langzeitdepot.

Far das erfindungsgemäße Verfahren wird die· Virusfreiheit erzielt ,^ indem die pflanzen 4 bis 10 Wochen intermittierend 16 Stunden etwa 37 ⁰C sowie etwa 5000 Lux, und 8 Stunden etwa 24 ⁰C sowie Dunkelheit ausgesetzt werden. Als Ausgangsmaterial für die Sterilkultur dienen erfin-'dungsgemäß Meristeme oder Meristemanlagen bzw. Sproßspitzen, Stengelstücke, Seitenknospen oder Blüten mit Meristemen oder Meri-atemaniagen.

Zur Bildung bzw. Vermehrung von Sprossen oder Meristemen wird für das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt das Kulturmedium nach Hurashige und Skoog (MS-Medium, Tabelle 1) in originaler oder ζ. B. durch Zusatz verschiedener Cytokinine und Auxine modifizierter Zusammensetzung verwendet. . \ \ ' .. ' , ' .· '. Zur Bewurzelung werden die angezogenen Sprosse erfindungsgemäß in Röhrchen-.mit Gesteinsmehl aus Aluminiumsilikaten einer Korngröße von 0,5-3 mm und einer Nährlösung mit verringerter oder fehlender Cytokinin- oder erhöhter Auxinaktivität überführt; dabei erweist sich nach Weglassen der Cytokifiine z. B. ein Zusatz von 0,1 mg X-JTaphthylessigaäure/1 als" geeignet, die Wurzelbildung ist jedoch auch in ausinfreien Medien möglich. Das für die Adaptation nach der In-vitro-Phas.e verwendete Gesteinsmehl entspricht dem für die Bewurzelung angewandten.

Der nachweis der Virusfreiheit- erfolgt erfindungsgemäß durch spezifische Testungen auf serologischer Basis. Zur Konservierung des Materials werden nach dem erfinduiigsgemäßen Verfahren entweder die sterilen Pflanzen auf einem

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Wuchsstofffreien Substrat bei 0 bis 4 ⁰O und 500 - 1000 Lux aufbewahrt oder die sterilen Meristeme nach Torbehandlung mit KryoProtektoren, insbesondere Mischungen von Dimethylsulfoxid und Wasser oder Dimethylsulfoxid, mehrwertigen Alkoholen, vorzugsweise Glyzerol, sowie Saccharose mit Wasser langsam oder sehr schnell Temperaturen von unter - 100 ⁰C ausgesetzt, in diesen Bereich gelagert und zur Rekultivierung schnell aufgetaut.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht- somit die Erhaltung von genetisch wertvollem Zuchtmaterial von Digitalis-Arten über einen langen Zeitraum, führt zu virusfreien, genetisch einheitlichen Pflanzen (Klonen) mit hoher Vitalität und qualitativ sowie quantitativ einheitlichem Cardenoldgehalt und gewährleistet die reproduzierbare Vermehrung dieses Pflanzenmaterials über lange Zeiträume, in beliebiger Menge und unabhängig von den natürlichen Vegetationsbedingungen. !fach dem'erfindungsgemäßen Verfahren können hierbei unter produktionsmäßigen Bedingungen ausgehend: von einer Digitalis-Soehleistungspflanze mehrere zehntausend virusfreie Tochterpflanzen mit untereinander gleichen Eigenschaften erhalten werden.

Die Erfindung wird nachstehend anhand der Ausführungsbeispiele näher erläutert»

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Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

(Virus f re imachung von Meristemen)

Digitalispflanzen im 1* oder 2· Vegetations;] ahr werden für 8-10 Wochen täglich für Τβ Stunden einer Temperatur von ca. 37 C ausgesetzt und gleichzeitig mit weißem Licht von ca· 5000 Lux bestrahlt, sie werden zwisehen den einzelnen Wärmebehandlungen jeweils 8 Stunden bei ca. 24 ⁰C im Dunkeln aufbewahrt.

Beispiel 2 ' ,

(Anzucht steriler Sprosse)

Meristeme oder Meristemanlagen bzw. Sproßspitzen, Stengelstacke, Seitenknospen oder Blüten mit Meristemen oder Meristemanlagen gemäß Beispiel 1 behandelter Pflanzen werden äußerlich desinfiziert und auf ein flüssiges oder festes Uährmedium nach Tabelle 1 gebracht, das zusätzlich 0,02 mg Kinetin/1 oder andere Cytokinine und eventuell andere Auxine, z. B. 1,0 mg 2,4-Dichlorphenosyessigsäure/l enthält ( 1 Explantat auf 10 - 15 ml Nährlösung in Rollrandflaschen mit Abmessungen von 80 χ 30 mm). Die Kultivation erfolgt bei 22 ⁰C bei einer täglichen I6stündigen Belichtung, die durch 8stündige Dunkelperioden bei 20 ⁰C unterbrochen wird. lach 6 Wochen bilden sich Sprosse und es entwickeln sich neue Meristeme und Knospen.

Beispiel 3

(Vermehrung steriler Sprosse) , ' !fach Beispiel 2 erhaltene Sprosse werden auf ein Medium nach Beispiel 2 gebracht ( 1 Sproß auf 10 - 15 ml Medium in Rollrandflaschen mit Abmessungen von 80 χ 30 mm) und

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im Lieht-Dunkel-Wechsel wie bei Beispiel 2 beschrieben kultiviert. Innerhalb von 2-3 lochen bilden sich Tochtersprosse, die vereinzelt and entweder zur weiteren Vermehrung benutzt oder zu Pflanzen regeneriert werden können , sowie neue Meristeme und Knospen«

Beispiel 4

(Bewurzelung steriler Sprosse) ^[

Nach Beispiel 3 erhaltene Sprosse werden in einem Medium nach Tabelle 1, das zur Förderung der Wurzelbildung Ausine ,vorzugsweise 1,0 mg 2,4-Dichlorphenozyessigsäure/l, und Gesteinsmehl aus Aluminiumsilikaten mit einer Korngröße von 1 - 2 mm, z. B« Perlit, enthält, kultiviert. Innerhalb von etwa 8 Wochen hat sieh eine für die überführung' aus dem sterilen Milieu ausreichende Wurzelmasse gebildet.

Beispiel 5 ' '

(Anpassung der steril vermehrten Pflanzen an Freilandbedingungen und Überprüfung der Virusfreiheit) Die nach Beispiel 4 hergestellten sterilen Pflanzen werden in Gesteinsmehl, das dem in Beispiel 4 entspricht, pikiert und unter Folietunneln kultiviert. Durch sich ständig verlängernde Lüftungszeiten wird die Luftfeuchtigkeit unter den Folietunneln vermindert, bis die Pflanzen an Gewächshausbedingungen und später an Freilandbedingungen adaptiert sind. Die Gewächshauspflanzen werden mit hochempfindlichen Hachwelsverfahren auf ihre Virusfreiheit getestet. Zu diesem Zwecke werden die auf Digitalispflanzen vorkommenden Viren (z. B. broad bean wilt virus, Stämme des Tabakmosaik-Virus) isoliert. Diese Viren werden für die Antigengewinnung nach dem Verfahren von Leiser und Richter (Arch. Phvtopathol. und Pflanzenschutz H (1978), S. 337 - 350) gereinigt. Haeh Aufstellen eines Immunisierungsschemas

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werden too Kaninchen Antiseren gewonnen· Ala hochempfindlicher, spezifischer Test wird der Agargel-Doppeldiffusionateat angewendet, der sich für Routineüberprüfungen besonders eignet.

Beispiel 6

(Konservierung von virusfreien sterilen Mutterpflanzen) Each Beispiel 4 hergestellte sterile Pflanzen werden auf einem hormonfreien, zur Verfestigung mit Agar* oder Gesteinsmehl aus Aluminiumsilikaten mit einer Korngröße von 1 bis 2 mm (z. B· Perlit) versetzten medium bei 0 bis 4⁰C und einer Beleuchtung von ea 500 LuS aufbewahrt« Die Sposse dieser Pflanzen können für einen Zeitraum bis zu 1,2 Monaten zur erneuten Vermehrung nach Beispiel 3 herangezogen werden· '

Beispiel 7 ' . .

(Konservierung von Meristemen) , , -. Sterile Meristeme, die nach Beispiel 2 oder 3 erhalten wurden, werden mit Kryoprotektoren in Porm von Mischungen aus 5 - 10 % Dimethylsulfozid und^90 - 95 % fasser oder aus 5 10 %. Dimethylsulfoxid, 5 - 10 % Glycerol sowie 5 - 10 % Saccharose und 70 - 85 % Wasser versetzt und nach ^ständiger Einwirkung dieser Kryoprotektoren langsam (0,5 bis 1 ⁰C/min) auf etwa - 100 ⁰C abgekühlt. Die Meristeme werden danach in flüssigen Stickstoff überführt und in oder über flüssigem Stickstoff beliebig lange gelagert. Bei Bedarf werden die Meristeme im Wasserbad bei + 40 ⁰G schnell aufgetaut und wie in Beispiel.2 beschrieben kultiviert. Die sich entwickelriden Sprosse können nach Beispiel 3 zur weiteren Vermehrung benutzt werden. ''· .

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Tabelle 1

Modifiziertes Häiirmediuia nach IURASHIGB und SKOOG (Phyaiol. Plant· Ί5(1962) 479 -497)

mg/1

CaCl₀ . 6-HoO Cm Cm	661
KH₂PQ₄	170
Ha₂BDTA . 2 H₂O	37,3
H₃BO₃ . .	6,2
MnSO₄	15,1
ZnSO₄ . 7 H₂O	8,6
KJ	' 0,83
Sa₂MoO₄; _{# 2} Jj₂O	0,25
M₄IO₃	1650,0
MO₃ SIgSO₄ , 7 H₂Q	1900,0 370,0
FeSO₄ · 7 H₂O	27,8
Thiamin	0,5
Pyridoxin	0,5
licotinsäureamid	1,0-
m-Inoait	100,0
Saccharose	30000
Amino3ätjregemiach (a«Tabelle 2)	10,0 ml

- 11 Tabelle 2

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Modifiziertes Aminosäaregemiseh nach KOBLITZ (H, KOBUTZ,

J.· HAGEI, Flora J^2 (1962) 447).

fflg/1.

!-Alanin 2970

!-Arginin, . 310

!-Asparagin ·. " . 380

!-Asparaginsäure 170

!-Glutamin 30

!-Glutaminsäure 175

Glycin ^ . 470

!-Histidin 5 '

!-Hydroxyprolin 125

!-!eucin 495

!-lysin/HCl . 195

!-Methionin .5

!-Phenylalanin 5

L-»Prolin 195

!-Serin , . 1275

!-Threonin 265 '

1-Tyroain 5

i-Yalin .230

Claims

- 12 Erfindungsanspräche 740 5

1. Verfahren zur virusfreien vegetativen Vermehrung und Erhaltung von Digitalis-Hochleistungspflanzen durch Verklonung meristematischer Gewebe in vitro in einem für Gewebekulturen üblichen Hährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ausgangspflanzen intermittierenden Temperatur- und Lichteinwirkungen unterwirft, atis den Pflanzen Meristeme oder Heristemanlagen bzw, Sproßspitzen, Stengelstücke, Seitenknospen oder Blüten mit Meristemen oder Heristemanlagen gewinnt, diese sterilisiert und auf einem Cytokinine und gegebenenfalls Auxine enthaltenden Hährmedium bis zur Neubildung von Sprossen und Meristemgewebe kultiviert, diese von den Ausgangsexplantaten abtrennt, vereinzelt und in an sich bekannter Weise auf einem Gytokinine und gegebenenfalls Auxine enthaltenden Hährmedium vermehrt, anschließend ,auf Gesteinsmehl mit Bewurzelungsnährlösung mit verringertem oder fehlendem Cytokinin-Gehalt,,vorzugsweise in Gegenwart von Auxinen bis zur Bewurzelung kultiviert, die so erhaltenen Pflanzen isoliert, durch Pikieren in Gesteinsmehl unter Folietunneln an Gewächshaus- bzw* Freilandbedingungen adaptiert sowie auf Virusfreiheit prüft und sterile Pflanzen bei minimalen Entwicklungsbedingungen oder sterile Meristeme in Anwesenheit von Kryoprotekto:

konserviert·

KryoProtektoren bei Temperaturen von unter -100 ⁰C

2* Verfahren nach Punkt 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur- und Lichteinwirkung über einen Zeitraum von 4 - 10, vorzugsweise 6 - 8 Wochen intermittierend 16 Stunden mit 37 ⁰C und 5000 Lux und 8 Stunden mit 24 ⁰C und Dunkelheit erfolgt.

3· Verfahren nach Punkt 1 dadurch gekennzeichnet, daß man

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für die Bewurzelungs- und Adaptationsphase Gesteinsmehl aus Aluminiumsilikaten mit einer Korngröße von 0,5 3 mm, vorzugsweise 1-2 mm, wie z. B· das Altiminiuasilikatmehl Perlit, anwendet.

4. Verfahren nach Punkt 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Gewächshausp'flanzen mit hochempfindlichen Hachweisverfahren auf der Basis eines spezifischen serologischen Testes mittels Antiseren, vorzugsweise gegen das Ackerbohnenwelke- und Tabakmosaikvirus, auf ihre Virusfreiheit getestet· werden·

5. Verfahren zur Konservierung von Hochleistungspflanzen nach Punkt 1 dadurch gekennzeichnet, daß in vitro angezogene Pflanzen im sterilen Zustand bei 0 bis 4 ⁰C und 500 - 1000 Lux auf einem hormonfreien mit Agar oder Gesteinsmehl aus Aluminiumsilikaten, vorzugsweise Perlit, verfestigtem Bahrmedium verschlossen, d· h· bei einer relativen Luftfeuchtigkeit nahe 100 % aufbewahrt

. werden· ' . - · .

6. Verfahren zur Konservierung von Hoehleistungspflanzen nach Punkt 1 dadurch gekennzeichnet, daß in vitro angezogene Meristeme nach Kryoprotektorbehandlung entweder sehr langsam (ca.. 0,5 bis 5 °C/min) auf - 100 ⁰C oder

sehr schnell durch Eintauchen in flussigen Stickstoff eingefroren und dann in oder über flüssigem Stickstoff gelagert, bei Bedarf möglichst schnell wieder aufgetaut und auf-einem geeigneten Hährboden weiter kulti-' viert werden·

7· Terfahren nach Punkt 1 und 6 dadurch gekennzeichnet, daß als KryoProtektoren Mischungen von 5 - 10 % Dimethylsulfoxid und 90 - 95 % Wasser oder,von 5 -.10 % Dimethylsulfosid, 5 - 10 % Glycerol sowie 5 - 10 % Saccha-

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- 14 rose und 70 - 85 % Wasser eingesetzt werden.

8, Verfahren nach. Punkt 6 dadureh gekennzeichnet, daß zur Einleitung der Konservierung die KryoProtektoren bis zu 48 Stunden auf die Meristeme einwirken·

9. Verfahren nach Punkt 6 dadureh gekennzeichnet, daß das Aufbauen durch Erwärmen mit Wasser Ton etwa 40 ⁰G erfolgt. J

10. Verfahren nach Punkt 6 dadureh gekennzeichnet, daß der Eryoprotektor nach dem Auftauen aus den Meristemen langsam in das umgebende Medium diffundiert und durch Austausch des Mediums entfernt wird.