NO874360L - Hybridplasmid til replikasjon i metylotrofe mikroorganismer og framgangsmaate til deres framstilling. - Google Patents

Description

I den europeiske patentsøknad 0 098 967 omtales en fremgangsmåte til fremstilling av obligat metylotrofe fremmed-DNA eksprimerende bakterier, samt dertil egnede plasmider og vertsorganismer. Dertil sammenknyttes et plasmid fra obligat metylotrofe bakterier med en E. coli vektor til et hybridplasmid som igjen ved konjugasjon kan transfereres til metylotrofe bakterier.

En av de angjeldende plasmider fra de obligat metylotrofe bakterier, pBE 3 fra Metylomonas clara, DSM 2397, er imidlertid med en molekylvekt på 10 MD forholdsvis stor. P.g.a. bekvemmere håndtering er spaltningen av dette plasmid ønskelig. Dette har imidlertid vist seg vanskelig, da plasmidet for de fleste enzymer med heksamere erkjennelses-sekvens har ingen eller bare få snittsted (EP-A 0 098 967).

Overraskende lar plasmidet pBE 3 seg imidlertid oppspalte med restriksjonsenzymet Not I, som erkjenner en oktamer sekvens i minst 9 fragmenter. Det kunne vises at den for en replikasjon av M. clara nødvendig og tilstrekkelig informasjon, er lokalisert på det største av disse Not I fragementer. Dette fragment er enten å innbygge i vektorer som likeledes har Not I snittsteder, eller kan endres således at det ved fordøyning med andre enzymer er tilgjengelig fra de respektive hybridplasmider og kan innbygges i vektorer med de tilsvarende snittsteder.

Oppfinnelsen vedrører følgelig:

1. Hybridplasmider med et fragment frfa pBE 3, som er ansvarlig for replikasjon i Metylomonas clara. 2. En fremgangsmåte til fremstilling av de under punkt 1 nevnte hybridplasmider som erkarakterisert vedat man ligerer plasmidf ragmentet av pBE 3 med et plasmid med seleksjonsmarkerere. 3. Anvendelsen av de under punkt 1 nevnte hybridplasmider til konstruksjon av vektorer for metylotrofe bakterier.

Oppfinnelsen forklares detaljert i det følgende, spesielt i den foretrukkete utførelsesformen, respektiv defineres i kravene.

En foretrukket mulighet å danne hybridplasmider med et Not I snittsted, består i, i Eco RI snittstedet av et plasmid med seleksjonsmarkerere å klonere et Eco RI fragment med Not I snittsteder, fortrinnsvis det fjerde største Eco RI fragment av plasmidet pBE 3.

Som utgangsplasmid med seleksjonsmarkerere foretrekkes pBR ,322, som ikke inneholder Not I snittsteder. Man får således pRM plasmider og i den foretrukkete utførelsesform plasmidet pRM 4.

Etter ligering av med Not I snittet pBE 3 og pRM plasmider, spesielt pRM 4, og etterfølgende transformasjon av kompetente vertceller, f.eks. E. coil, kan det ved seleksjon finne celler som inneholder hybridplasmider med forskjellige Not I-fragmenter.

Ved anvendelse av disse plasmider i konjugasjonssystemer og deres transfer fra f.eks. E. coli til M. clara, fortrinnsvis i et system slik det er omtalt i den EP-PS 0 098 967 kan man fastslå hvilke av Not I fragmentene inneholder den fullsten-dige Informasjon til replikasjon. I et hvert tilfelle er det det største fragment. De tilsvarende hybridplasmider betegnes som pRM-notori, det foretrukkete hybridplasmid som pRM4-notori.

I den videre omtale av oppfinnelsen beskrives fremgangsmåten ved hjelp av det foretrukkete anvendte hybridplasmid pRM4-notori. Analogt kan det imidlertid også anvendes andre pRM- notoriplasmider. De tilsvarende betingelser dertil kan fastslås i korte forforsøk.

Til ytterligere minskning behandles plasmidet pRM4-notori med restriksjonsenzymer Pvu I. pRM4-notori Inneholder to Pvu I snittsteder, hvorav et ligger i pBR 322 delen av plasmidet, den andre i pBE 3 delen, men utenfor det for replikasjonen nødvendig Not I fragment. Ved fordøyning av plasmidet pRM4-notori med Pvu I oppstår derved to fragmenter, hvorav det største inneholder alle for en replikasjon til M. clara samt E. coil nødvendige funksjoner, samt et funksjonelt tetracyk-lid-resistensgen. Når restriksjonsblandingen deretter behandles med en ligase, så får man av det største av de to Pvu I fragmentet plasmidet pSE 1.

Dette plasmid kan ved hjelp av et konjugasjonssystem transfereres til metylotrofe bakterier som Metylomonas clara og forblir også stabilt i denne mikroorganisme under ikke selektive betingelser over flere generasjoner.

Ved hjelp av pSE 1 og et plasmid med polylinker, eksempelvis pUC 12, kan man endre endene av det fragment som har det replikasjonsopprinnelige bærende Not I, således at det fragment som har replikasjonsopprinnelsen av pBE 3 ikke mere begrenses ved Not I snittsteder, men ved en kombinasjon av andre restriksjonssnittsteder. Også ved påhengning av syntetisk fremstilte kortere DNA-sekvenser på begge sider av det replikasjonsopprinnelige holdige Not I fragment eller ved en forbindelse av Not I fragmenter med andre polylinker-sekvenser enn de til pUC 12 er det mulig en slik endring av Not I. Det oppstår på denne måte hybridplasmider eksempelvis pUC 12-notori hvorav det fragment som har repliksjonsopprinn-elsen fra pBE 3 er tilgjengelig med forskjellige restriksjonsenzymer og kan overføres til ønskelige andre plasmider som skal replisere de metylotrofe bakterier, spesielt Metylomonas clara.

For å transferere et ønskelig hybridplasmid som har replikasjonsopprinnelsen av plasmidet pBE 3 til M. clara med det i den europeiske søknad 0 098 967 omtalte system, må det på det tilsvarende plasmidet være tilstede en som "basis av mobili-serbarheten" (bom) betegnet DNA-sekvens. Denne DNA-sekvens er eksempelvis også å finne på plasmidet pBR 322. Dets stilling er Ikke nøyaktig kjent og kan tilordnes det nest største Eae III-fragment av plasmidet pBR 322. Dette fragment kan behandles analogt den ovennevnte fremgangsmåte således at det ved forskjellige restriksjonsenzymer blir tilgjenglig fra de tilsvarende hybridplasmider.

Av den således konstruerte "origin" resp. "bom" DNA-sekvens er det mulig å omforme ønskelig ekspresjonsplasmider således at de transfererer de metylotrofe bakterier, spesielt Metylomonas clara, og kan repliseres der stabilt. Dertil utløses i et første trinn origin-DNA segmentet ved en kombinasjon av egnede restriksjonsenzymer, f.eks. fra plasmidet pUC 12-notori og forbindes med ekspresjonsvektoren. Skulle det på ekspresjonsvektoren ikke være tilstede for en transfer etter de tilsvarende metylotrofe bakterier nødven-dige bom-stilling, så blir et annet trinn i bom-stillinghol-dige DNA-segement, f.eks. utløst fra plasmidet pUC 12-bom, ved en kombinasjon av egnede restriksjonssystemer og på samme måte overført på plasmidet. På denne måte kan man kodere ønskelig genprodukter, transferere i metylotrofe bakterier og ved fermentering fremstille de tilsvarende genprodukter.

Man kan således eksempelvis bringe genet for den aromatiske transaminase i Metylomonas clara. Dertil går man eksempelvis ut fra plasmidet pIMS 4004, et derivat av vektoren pBR 322, hvor et 4,5 kb stort Cia I fragment fra E. coli K12 samlet DNA er blitt klonert I det eneste Cia I snittsted av pBR 322. Dette 4,5 kb store Cia I fragment har tyrB genet for den aromatiske transaminase fra E. coli K12. Genet strekker seg ikke over det samlede området av 4,5 kb, men ligger innen et ved et Cia I snittsted, samt et Hind III snittsted definert DNA-avsnitt. Snittes derfor plasmidet pIMS 4004 derfor med Hind III, så dannes ved hjelp av snittstedet på det 4,5 kb store Cia I fragment og den på pBR 322 delen tilstedeværende Hind III snittesteder et fragment som etter resirkulariserlng av det store Hind III fragment kan deleteres uten å beskadige tyrB genet. Det resulterende plasmid inneholder bare et Hind III og et Sal I snittsted, som begge liggeri pBR 322 delen av plasmidet. Som derivater av pBR 322 disponerer dette plasmid over den for transferen i metylotrofe bakterier nødvendige bom-sekvens, et funksjonelt og godt eksprimert tyrB gen, samt et til seleksjon anvendbar Ampicillin-resistgen. Det er riktignok ikke tilstede noen DNA-sekvenser som muliggjør en replikasjon av dette plasmid i metylotrofe bakterier. For å innføre denne sekvens, fordøyes plasmidet fullstendig med enzymene Hind III og Sal I, likeledes som plasmid pUC 12-notori hvori den DNA-sekvens som har replikasjonsopprinnelsen for metylotrope bakterier utløses fra dette plasmid. I tillegg fordøyes plasmideet pUC12-notori, dessuten med restriksjonsenzymet Pvu I for å hindre en religasjon av det fra pUC12-notori stammende Hind III/Sal I fragment i utgangs-vektoren. Etter ligasjon av de ønskede gener til et plasmid anvendes dette i det den europeiske søknad omtalte konjugasjonssystem og transfereres i det obligat metylotrofe bakteriesammen M. clara. Ved minilyse av den seleksjonerte klone og etterfølgende restriksjonsfordøyning av Isolerte plasmider kan det sikres at DNA som skal transfereres er kommet til uforandret form i reslpientstammen M. clara hvori den forblir stabil.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av eksempler.

Eksempeler

I tillegg til eksemplene er det på fig. 1 vist plasmidet pRM 4 og pRM 4-notori, samt på fig. 2 plasmidet pSE 1 og pUC 12-notori av restriksjonskart. Det er bare angitt de for oppfinnelsen vesentlige snittsteder. Størrelsesangivelsene er oppført i MD.

1. Konstruksjon av pRM 4-notori og pSE 1.

Plasmidet pRM 4 ble fordøyet fullstendig med restriksjonsenzymet Not I. Derved ble endonuklease Not I fjernet ved fenolisering, DNA felt ved hjelp av etanol, vasket med 7056-ig etanol og etter tørking i vakuum oppløst i et egnet volum av buffer som av firma Boehringer Mannheim angis som optimal for enzymet alkalisk fosfatase (CIP). Etter tilsetning av 10 U alkalisk fosfatase, ble det inkubert i 30 minutter ved 37°C, enzymet fjernet ved fenolisering fra reaksjonsblandingen og DNA renset som omtalt ovenfor. Endelig ble det resuspendert i TE-buffer. M. clara plasmidet pBE-3 ble fordøyet fullstendig med enzymet Not I, hvorved det oppspaltes i minst 9 fragmenter av forskjellig størrelse.

Fullstendigheten av fordøyningen ble undersøkt ved påføring av en alikvot av Inkubasjonsblandingen på en agarosegel. I tilknytning til fordøyelsen ble enzymet fjernet ved fenolisering, DNA renset som omtalt ovenfor, og resuspendert i TE-buffer.

Det Not I fordøyede pRM 4 og pBE 3 ble satt sammen i forskjellige blandinger i et molart forhold på 2:1 over 1:1 til 1:5. De resulterende blandinger ble ifølge angivelser av fremstilleren (New England Biolabs) blandet med buffer således at det fremkom et optimalt medium for enzym T4-DNA-ligasen. Blandingen ble blandet med 1 pl av et preparat av enzymet T4-ligase (Biolabs, 400U/pl) og inkubert minst 14 timer ved 14 til 16°C. Blandingens samlede volum utgjorde 50 pl.

I tilknytning til inkubasjonen ble 10 pl av ligaseblandingen avpipettert og i et sterilt Eppendorf-reaksjonskar blandet med 100 pl av en suspensjon av kompetente celler av E. coli stammen EB101. Cellene var etter kjente fremgangsmåter gjort kompetente for opptak av ekstern DNA. Det ble transformert etter fremgangsmåten av Cohen et al., (Proe. Nati. Acad. Sei. 69 (1972) 2110-14), Ampicillin-resp. tetracyklinresistene kolonier ble isolert på egnede selektive næringsbunner og etter dyrkning i L-buljong { 1% Bacto-trypton, 0,5$ gjærekstrakt, 0,5$ NaCl) ved minilyse undersøkt på deres plasmidinnhold.

Etter fordøyning av plasmidene med enzym Not I og etter-følgende agarose-gelelektroforese kunne det påvises innbygning av Not I fragmenter fra pBE 3 i pRM 4.

Ved den omtalte fremgangsmåte kunne Not I fragmentene 1, 3 og 4 fra pBE 3 kloneres i plasmidet pRM 4.

De dannede plasmider ble anvendt i det i den europeiske søknad 0 098 976, eksempel 10, omtalte konjugasjonssystem og deres transfer fra E. coli til M. clara undersøkt. Derved kunne det fastslås at bare plasmidet som inneholder Not I fragment I fra pBE 3 klonerer i pRM 4, førte til dannelse av tetracyklin-ampicillinresisetent M. clara-kloner. I disse kloner ble det ved minilyse påvist det tilsvarende plasmid. Plasmidet fikk betegnelsen pRM4-notori.

pRM4-notori ble fullstendig snittet med enzymet Pvu I og reaksjonsblandingen oppvarmet til 65 °C. 10 pl av blandingen ble fortynnet med vann og en buffer således at det i et samlet volum på 100 pl fremkom det fra fremstilleren som optimalt anbefalte miljø, for enzymet T4-DNA-ligase. Etter tilsetning av 1 pl T4-DNA-ligase (Biolabs., 400 U/pl) ble det inkubert 16 timer ved 16° C. Deretter ble det transformert kompetente celler fra E. coli-stammen HB101, med en alikvot av ligaseblandingen, og på egnede seleksjonsplater (L-buljong med 20 pg/ml tetracyklin)

seleksjonert tetracyklinresistente kolonier. 50 av de tetracyklinresistente kloner ble prikket på ampicillinpla-ter (L-buljong med 50 pg/ml ampicillin). Av 5 kolonier som har fenotypen Tc<r>Ap<s>, ble ved minilyse plasmid-DNA isolert og undersøkt. I alle tilfeller besto plasmidene bare dessuten av det store Pvu I fragment av plasmidet pRM4-notori. Disse hybridplasmider fikk betegnelsen pSE 1.

Plasmidet pSE 1 ble anvendt i det omtalte konjugasjonssystem og transferert til den plasmidløse metylotrofe bakteriestamme M. clara ATCC 31226. De dannede tetracyklinresistente M. clara-kloner inneholdt alle det ventede plasmid pSE 1 i uendret form. Tap av plasmid kunne ikke Iakttas over flere enn 100 generasjoner under ikke selektive betingelser.

2. Konstruksjon av pUC12-notori

Plasmidet pSE 1 ble fullstendig fordøyet med enzymet Not I og de dannede overhengende ender ved behandling med enzymet DNA-polymerase I (Klenow-fragment), oppfylt i en fremstilleren Boehringer Mannheim, anbefalt buffer, under de likeledes av fremstilleren angitte betingelser således at det fremkom glatte ender. Etter adskillelse av enzymet ved fenolisering og rensing av DNA ved hjelp av etanolfel-ling ble fragmentblandingen igjen fordøyet med restriksjonsenzymet Sal I. Enzymet Sal I snitter ikke Not I fragment I 1 fra pBE 3, vel imidlertid i tetracyklin-resistensgen av vektoren pSE 1.

Det således forbehandlede DNA ble hatt sammen med pUC 12 DNA, som var blitt fordøyet fullstendig med enzymet Xba I og deretter med Klenow-polymerase og ligert som angitt i eksempel 1. Etter transformering av kompetente celler av E. coli stammen HB 101 ble ampicillinresistente kolonier seleksjonert og etter dyrkning i L-buljongmedium undersøkt ved minilyse på deres plasmidinnhold. Plasmid-DNA, som i forhold til plasmid pUC 12 har en størrelsesvekst ved agarosegelelektroforese, hie nærmerekarakterisert vedfordøyning med Eco R I. Derved kunne det Identifiseres kloner som inneholdt plasmidet pUC 12 med det i den oppfylte Xba I snittsted klonert oppfylte Not I fragment 1 av M. clara plasmidet pBE 3. Begge mulige orienteringer av dette fragment ble isolert. Fra disse plasmider kan det fremstilles en for en replikasjon i M. clara nødven-dige område av plasmidet pBE 3 i store mengder og isoleres ved kombinasjon av restriksjonsenzymene Sst I, Sma I, Barn HI og Sal I, Pst I og Hind III.

3. Konstruksjon av pUC12-bom

Det handelsvanlige plasmid pUC 12 ble fullstendig fordøyet med enzymeet Xba I, og de dannede overhengende ender oppfylt ved anvendelse av enzymet DNA-polymerase I (Klenow-fragment). Plasmidet pBR 322 ble fullstendig fordøyet med enzymet Hae III, hvilket førte til dannelse av 22 fragmenter med glatte ender. De største av disse fragmenter kunne adskilles fra hverandre ved agarosegel-elektrof orese . Oppdeling av fragmentene fra hverandre ble undersøkt under elektroforesen ved betraktning av gelen under UV-lys i intervaller, i det DNA-fragmentene kunne kjennes ved det i agarosegelen inneholdte fargestoff etidiumbromid ved fluorescens.

Da det var gitt en tilstrekkelig adskillelse av fragmentene ble en liten agaroseskive som Inneholdt det nest største Hae III fragment fra pBR 322, utsnittet ved hjelp av en skalpell fra gelen og transferert i en dialyse-slange. Dialyseslangen ble fylt med buffer [89 mmol/1 Tris, 89 mmol/1 borsyre, 2,5 mmol/1 EDTA (ph 8,2)], såvidt at de små skiver var fullstendig dekket, fiksert i et elektroforesekammer og i den samme buffer som var fylt i dialyseslangen gjennomført en elektroelusjon. Elusjonen ble gjennomført ved 100 V minst 12 timer. Deretter ble det eluert ennå i ytterligere 5 minutter, i det imidlertid pluss- og minuspol ble vekslet i forhold til hovedløpet. Bufferen ble transferert fra dialyseslangen til et plastikkar. Ved iakttagelse av de små agaroseskiver under TJV-lys ble det sikret at alle DNA var blitt eluert fra de små skiver. Bufferen ble ekstrahert minst 2 ganger med fenol, de vandige faser forenet og utfelt med etanol. Deretter ble det vasket minst 3 ganger med 70#-ig etanol. Etter tørking i vakuum, ble DNA opptatt i et egnet volum av TE-buffer, og sammengitt og ligert en alikvot herav, med pUC 12 DNA som var på forhånd forberedt som omtalt ovenfor. På L-bul jongplater som inneholdt 50 jjg/ml ampicillin, ble transformert E. coli kloner seleksjonert og de fra disse ved minilyse isolerte plasmid DNA under-søkt ved agarosegelelektroforese på størrelsesøkning.

Det kunne således identifiseres kloner hvori bom-DNA-segmentet fra pBR 322 var blitt klonert i begge orienteringer.

Claims (14)

1. Hybridplasmid med et fragment fra pBE 3, som er ansvarlig for replikasjon av Metylomonas clara.

2. DNA-segment med replikasjonsopprinnelsen av plasmidet pBE 3, oppnådd ved total fordøyelse av pBE 3 med Not I og isolering av det største fragment på 2,3 MD.

3. Hybridplasmid ifølge krav 1, karakterisert ved at fragmentet av pBE 3 er et Not I fragment med 2,3 MD.

4 . Hybridplasmid ifølge krav 1 og 3, karakterisert ved at det inneholdt deri et plasmid med seleksjonsmarkerere.

5. Hybridplasmid ifølge krav 4, karakterisert ved at det deri er inneholdt pBR 322.

6. Hybridplasmid ifølge krav 5, karakterisert ved at det i dette plasmid er inneholdt et pRM-plasmid.

7. Hybridplasmid ifølge krav 6, karakterisert ved at pRM 4 er inneholdt i dette plasmid.

8. Hybridplasmid ifølge krav 7 oppnådd ved fullstendig fordøy-ning med Pvu I og ringslutning av det største fragment på 4,82 MD.

9. Fremgangsmåte til fremstilling av hybridplasmider med fragmentet fra pBE 3 ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at man ligerer det nevnte plasmidfragment fra pBE 3 med et plasmid med seleksjonsmarkerere.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at man ligerer det nevnte plasmidfragment fra pBE 3 med pRM 4.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at det dannede hybridplasmid pRM 4-notori fullstendig snittes med Pvu I, restriksjonsblandingen behandles med ligase, og det ved fordøyning dannede største fragment av 4,82 MD isoleres som plasmid.

12. Anvendelsen av hybridplasmidet med et fragment fra pBE 3, som er ansvarlig for replikasjon I Metylomonas clara til konstruksjon av ekspressjonsplasmider med metylotrofe bakterier.

13. Anvendelse av hybridplasmid ifølge krav 12, til konstruksjon av ekspressjonsplasmider for Metylomonas clara.

14 . Anvendelse av hybridplasmid Ifølge krav 13, til konstruksjon av ekspressjonsplasmider for den aromatiske transaminase i Metylomonas clara.