NO851165L - Gjaeridentifiseringssystem i miniatyrskala - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder fremgangsmåter og preparater som er anvendbare ved rask og effektiv identifi-sering av patogene sopper. De fremgangsmåter og preparater som beskrives i foreliggende oppfinnelse anvender forskjel-lene i morfologiske og nutritive trekk til slekter og arter av patogene sopper som skal identifiseres. I et aspekt av foreliggende oppfinnelse identifiseres patogene sopper differensiert ved hjelp av fremgangsmåter som anvender en forbedret sammensetning av et medium omfattende en blanding av renset saponin, oksegalle, et substrat for fenoloxidase, en bærer og et ammoniumsalt. I et annet aspekt oppnås rask og differensiert identifikasjon av patogene sopper ved hjelp av en forbedret fremgangsmåte for karbohydratassimilasjon, hvilken forbedring omfatter preinkubering av nevnte patogene sopper i et karbohydratfritt medium før overføring av nevnte patogene sopper til dyrkningsskåler inneholdende et karbo-hydratassimilas jonsmedium. I et annet aspekt beskrives fremgangsmåter hvor det anvendes miniatyrdyrkningsskåler, f.eks. med dimensjoner på 33 x 75 x 5 mm, som er i stand til å skille patogene sopper og en fem til 15 ganger mindre mengde soppvekstmedium enn det som behøves for standard-dyrkningsskåler. I et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse beskrives fremgangsmåter hvor det anvendes overflateinokuleringsfremgangsmåter, som oppnår et større forhold mellom overflateareal og volum enn konvensjonelle teknikker. I enda et aspekt av foreliggende oppfinnelse beskrives fremgangsmåter som anvender en enkelt miniatyrdyrkningsskål som inneholder enten en kombinasjon av forskjellige soppvekstmedia eller et antall forskjellige soppatogener, eller begge. I enda et aspekt tilveiebringer de forbedrede soppvekstmedia, den forbedrede karbohydrat-assimilas jonsfremgangsmåten og fremgangsmåtene hvor det anvendes miniatyrdyrkningsplater alene, og i kombinasjon, spesielt raske og pålitelige teknikker for påvisning og differensiering av tre klinisk viktige sopper: Candida albicans, Candida stellatoidea og Cryptococcus neoformans.

Patogene sopper varierer i deres patogenitet, dvs. deres evne til å forårsake sykdom. I en ende av spekteret kan høypatogene sopper forårsake systemisk sykdom når de infiserer. I den andre enden av spekteret noen sopper etablere et mer eller mindre permanent oppholdssted på, og til og med i, overflatekroppsvevet. Disse sopper er ikke i stand til å gjennomtrenge kroppens naturlige forsvar med mindre disse forsvarene er alvorlig svekket. Slike leilighetsvise infeksjoner er blitt mer vanlig som et biprodukt av terapeutiske fremskritt og utgjør for tiden en alvorlig medisinsk trussel til visse klasser av individer eller pasienter. For eksempel har pasienter som mottar antibio-tisk terapi, underkastes kirurgiske inngrep, manipulasjon av inneliggende katetre og de med endrede vertsforsvarsmekanismer på grunn av bruk av antibiotika, immunoundertrykkede medisiner eller strålingsterapi, en øket risk for leilighetsvis soppinfeksjon. Soppinfeksjoner hos disse allerede truede individer kan resultere i livstruende sykdom.

To av de medisinsk viktigste typer av sopper er Candida albicans og Cryptococcus neoformans. Candida albicans er et eksempel på en relativt ikke-patogen gjær (dvs. enkeltcellesopp) som ofte foreligger på normale slimmembraner i munnen og tarmtrakten. Candida albicans vil generelt ikke etablere en infeksjon hos friske mennesker, men kan forårsake leilighetsvise infeksjoner som resulterer i kroniske lokale infeksjoner hos dem som har nedsatte vertsforsvarsmekanismer. Cryptococcus neoformans er spesielt viktig på grunn av dens forkjærlighet for sentralnervesystemet, hvilket kan forårsake alvorlig sykdom hos biologisk forsvarsløse pasienter.

Den forutsatte identifikasjon av Candida albicans avhenger bare av morfologiske forandringer som opptrer når denne soppen overføres til en skål og får lov å vokse på et passende medium. Den første morfologiske forandringen som indikerer nærvær av Candida albicans er dannelsen av kimrør, som viser seg som små vedheng som strekker seg fra de over-førte encellede eksemplarene. Disse kimrørene vokser eventuelt til forlengede filamenter som strekker seg utover fra et legeme av Candida albicans. Dannelse av kimrør i løpet av to til tre timer etter overføring av soppen er et antatt bevis på at Candida albicans eller Candida stellatoidea er til stede. I et andre vekststadium "...ser det seg generelt runde legemer ved endene av filamentene. Disse runde legemene er kjent som chlamydosporer. Bare tre arter av slekten Candida vil danne chlamydosporer. Disse er Candida albicans, Candida stellatoidea og Candida tropicalis. Således indikerer chlamydosporedannelse nærvær av Candida albicans, Candida stellatoidea eller Candida tropicalis.

Den differensierte identifikasjonen av Candida albicans og Candida stellatoidea utføres ved hjelp av en etterfølgende karbohydratassimilasjonstest. Denne testen omfatter en serie forskjellige media som inneholder et spesielt karbohydrat, en nitrogenkilde og et fargestoff som f.eks. bromcresol-fiolett som er ph-følsomt. For gjær er karbohydratassimilasjon en sur reaksjon, som kan følges med pH-indikerende fargestoffer, mens fermentering omfatter syre- og gassproduksjon, som krever et pH-indikerende fargestoff og en gassfelle.

Det er to metoder som for tiden anvendes for assimilasjon: (1) en modifisert Wickerham-metode og (2) en auxanografisk metode. Generelt anvender den modifiserte Wickerham-metoden reagensglass med karbohydratagarmedia som inneholder et pH-følsomt fargestoff. Gassene inokuleres direkte fra en gjærsubkultur som er utsådd på et vekstmedium som f.eks. Sabouraud's dextroseagar ved å overføre en løkke-av organisme til overflaten av karbohydratagaren. Positive assimileringsreaksjoner kan merkes i løpet av en til syv dager. Et konvensjonelt eksempel på denne metoden omfatter inokuleringen av et reagensglass med sucrosemedia inneholdende bromcresol-fiolett med gjær fulgt av en under-søkelse etter 24 til 72 timer på en fargeforandring fra fiolett til gult, hvilket indikerer sucroseassimilering. Candida albicans vil gi en positiv assimilering mens Candida stellatoidea er negativ. Hovedulempene er lang tid til et fastslått resultat og besværlig og stort lagringsrom, hvilket krever spesielle stativer for lagring.

Et annet konvensjonelt eksempel anvender også den modifiserte Wickerham-metoden med en hovedforandring. Skålen består av en serie kiler arrangert i sirkelformig konfigurasjon som inneholder et karbohydratmedium med bromcresol-f iolett , en ureaagar og et nitratmedium. Istedenfor en direkte overføring av inoculum, suspenderes gjæren først i sterilt vann og overføres så med en steril pipette til de forskjellige media. Skålen inkuberes så og undersøkes etter 24 timer til seks dager på positive reaksjoner. Ulempene med dette systemet er lang tid til positivt resultat, relativt kostbart og en øket mengde brukte media, idet hver brønn krever ca. 10 ml medium.

Den auxanografiske metoden innbefatter en ren teknikk med helleskål, hvor gjæren suspenderes i smeltet karbo-hydratagarmedium. Gjærsuspensjonen helles så over i en steril kultur- (heretter noen ganger referert til som "petri") skål og tillatt å bli fast. Det er to variasjoner av denne metoden. I en metode inneholder mediet ikke karbohydrat, og etter fastgjøring, plasseres skiver som er impregnert med et spesielt karbohydrat på agaroverflaten i den inokulerte helleskålen. Karbohydratet diffunderer så fra platen inn i det inokulerte medium. Positiv assimilering måles så enten ved en pH-forandring rundt skiven i nærvær av et pH-følsomt fargestoff, eller med en uklarhets-ring som dannes rundt papirskiven, hvilket indikerer at gjæren har evne til å assimilere, eller å vokse på, denne spesielle karbohydratkilden. Sterile karbohydratskiver er tilgjengelige og kan innføres i et identifikasjonssystem. Med dette systemet kan åtte eller 12 forskjellige karbohydratskiver påføres i én påføring på en standard 100 x 15 mm petriskål med inokulert gjærassimileringsmedium. Ulempene med denne metoden er nødvendigheten av et kokende bad for å smelte agarmediet, lang arbeidstid for tek-nikeren, besværlig lagring og lang tid for å oppnå positivt resultat. I tillegg er temperaturen til den smeltede agaren typisk mellom 40 og 45°C når gjæren suspenderes i agaren. Temperaturer over disse temperaturer kan drepe gjærkulturer og således produsere falske negativer i assimileringstest-resultatene.

En annen utførelsesform av den auxanografiske metoden illustreres ved A.P.I. 20C system. I dette^ystemet anvendes en serie på 20 brønner inneholdende lyofiliserte karbohydrater og et glasskår fylt med hovedgjærassimiler-ingsmediet, uten et pH-følsomt fargestoff. Glasskåret plasseres i et kokende vannbad for å smelte agarmediet. Etter avkjøling overføres gjæren til mediet ved bruk av en steril trepåføringspinne og mediet omrøres for å fremstille en jevn suspensjon. Denne suspensjonen overføres så med en steril pipette til de 20 karbohydratbrønnene og tillates å bli fast. Den inokulerte brønnstrimmelen plasseres så i et inkuberingskar av plast fra A.P.I. og inkuberes ved 30°C. I dette systemet skal reaksjonene avleses etter 24, 48 og 72 timer idet en positiv reaksjon bestemmes ved økende uklar-het. Ulempene med dette systemet er nødvendigheten av et kokende vannbad for å smelte agarmediet, teknikertid, lang tid for å oppnå positivt resultat og relativt kostbart system. I tillegg er temperaturen for den smeltede agaren typisk mellom 40 og 45°C når gjæren skal suspenderes i nevnte agar.

Temperaturer over disse temperaturer kan drepe gjærkulturer og således produsere falske negativer i testresultatene.

Identifikasjon av Cryptococcus neoformans ansees generelt å være vanskeligere enn identifikasjonen av Candida albicans ved at Cryptococcus neoformans ikke underkastes noen morfologiske forandringer som kan observeres, og forblir enkeltcellet i hele dens vekstsykler. Inntil nylig ble én eller flere av tre hovedtester, eller en kombinasjon derav, anvendt for å identifisere nærværet av Cryptococcus. En av identifikasjonsmetodene omfatter mikroskopisk inspeksjon av et eksemplar for å identifisere om det foreligger en kapsellignende dannelse rundt soppcellene eller ikke. Som hjelp ved undersøkelsen av slike kapsellignende dannelser omgis et eksemplar med tusj som forbedrer utseendet til kapselen ved å tilveiebringe et klart og gjennomskinnelig bilde mot den mørke bakgrunnen, hvilket gjør det lettere å identifisere slike kapsler under mikroskopisk undersøkelse. En annen metode som anvendes for å identifisere slekten Cryptococcus omfatter å overføre eksemplaret eil et medium som inneholder urea og en fargeindikator. Fordi Cryptococcus produserer et enzym som er kjent som urease, har den evnen til å nedbryte og anvende det nitrogen som inneholdes i urea, hvilket får pH til å stige, og derved forandre fargen til indikatoren.

Vekst på et ureaholdig medium er derfor en indikasjon på nærvær av Cryptococcus, Trichosporon beigelii eller Candida krusei. En tredje metode for identifikasjon av slekten Cryptococcus bygger på denne slektens evne til å produsere en stivelselignende forbindelse. Når den stivelselignende forbindelsen er til stede, vil tilsetning av jod forårsake at det kommer til syne en fiolett ring rundt kolonien. Det skal bemerkes at ingen av disse testene er spesifikke for Cryptococcus neoformans i seg selv eller i kombinasjon, idet andre arter innenfor slekten Cryptococcus og andre gjærslekter også kan gi en positiv reaksjon.

Selv om den ureasetesten som er beskrevet ovenfor, ikke er spesifikk for Cryptococcus neoformans, er den en relativt rask foreløpig test på slekten Cryptococcus, som karakteristisk har enzymet urease som er nødvendig for hydrolysen av urea. Tre metoder anvendes for tiden for å påvise ureaseproduksjon av gjærkulturer: (1) ureaskrå-agar, (2) ureanæringsmedium og (3) ureasesvabertesten. ureaskrå agar fremstilles fra kommersielt tørket medium inneholdende en fargeindikator. Etter autoklavering, skråsetting og fastgjøring er glassene ferdige til bruk. Positive ureasereaksjoner bemerkes som en fargeforandring fra orange til rosa som opptrer i løpet av 24 til 72 timer. Hovedulempene er en lang tid for å oppnå positivt resultat og teknikertid.

Ureanæringsmediumtesten forandrer i hovedsak testen til en flytende tilstand og øker forholdet mellom inoculum og substrat. Ureamediet kan kjøpes kommersielt i en lyofilisert form og må derfor rekonstitueres før bruk. Denne testen krever tre til fire timer for positive reaksjoner, hvilket indikeres ved en fargeforandring fra orange til rosa. Hovedulempene er fremstillingstid og ønskelig-heten av en enda raskere forhåndstest.

Ureasvabrene fremstilles ved å impregnere sterile bomullsapplikatorsvabere med konsentrert ureaagarbase, kvikkfrysing ved -70°C og lyofilisering over natten. Svabrene inokuleres med to til tre gjærkolonier, plasseres i et testmedium, mediets pH justeres til 4,6, inkuberes så og undersøkes på en positiv reaksjon, hvilken angis ved en fargeforandring som opptrer i løpet av 15 til 20 minutter. Hovedproblemet med denne testen er at svabrene ikke er kommersielt tilgjengelige og at pH-justeringen av svaberen er så kritisk at det er sannsynlig at det opptrer falske negativer eller positive reaksjoner.

Den kanskje mest vellykkede og spesifikke konvensjonelle testen på Cryptococcus neoformans innbefatter bruken av fuglefrøagar. Det ble oppdaget at når Cryptococcus neoformans var til stede i en prøve som var utsådd på fuglefrø-agar ville det vise seg en spesiell avslørende brun farge i løpet av en periode på fem dager til to uker. Denne metoden ble forbedret ved å anvende en ekstrakt av fuglefrø som senket identifikasjonstiden tre til fem dager. Senere ble det oppdaget at den brune pigmentfargingen var resul-tatet av reaksjonen mellom enzymet fenoloxidase og et spesielt substrat som forelå i fuglefrøagar. Bruk av substitu-erte fenoler som f.eks. kaffesyre i vekstmediet forkortet derfor den tidsperiode som var nødvendig for identifikasjon ytterligere til ca. 48 timer. En enda større forbedring ved bruken av kaffesyre for å identifisere Cryptococcus neoformans er angitt i en artikkel av Hopfer og Groschel med tittelen "Six Hour Pigmentation Tests for the Identification of Cryptococcus neoformans", Journal of Clinical Microbiology, August 1975, vol. II, nr. 2, s. 96-98. Den angitte forbedring der omfatter å kombinere kaffesyre med ferricitrat og påføre disse forbindelsene på papirskiver for bruk som substrater for fenoloxidaseenzymaktivitet i Cryptococcus neoformans. Bruk av disse kaffesyre-ferricitrat-impregnerte papirskivene forkortet ytterligere identifikasjonstiden til tre til seks timer. Løsningen av kaffesyre og ferricitrat som anvendes for å impregnere papirskivene er imidlertid ganske ustabil når den eksponeres for lys c~temperatur og oppviser derfor alvorlige lagringsproblemer. Disse skivene må lagres ved -20°C. Dessuten er den relative konsentrasjonen av kaffesyre og ferricitrat kritisk og en ubalansert kombinasjon vil kreve lengre inkuberingsperioder for produksjon av et mørkt pigment, eller i noen tilfeller ikke spesifikk pigmentering av saprofyttisk Cryptococcus og mange Candidaarter. I en artikkel med tittelen "Two Rapid Pigmentation Tests for Identification of Cryptococcus neoformans", Journal of Clinical Microbiology, Februar 1982, vol. 15, nr. 2, s. 339-341 av Kaufmann og Merz, presenterer forfatterne to tester for Cryptococcus neoformans delvis basert på modifikasjoner av tidligere metoder for å påvise fenoloxidaseaktivitet. Den første testen anvender maismel-agar inneholdende et emulgeringsmiddel som selges under varemerket Tween® 8 0 av Atlas Chemical Company supplemen-tert med kaffesyre. Den andre er en ikke-mediumtest som anvender en påvisningsstrimmel for fenoloxidase som er mettet med bufret L-$- 3,4-dihydroxyfenylalanin (L-DOPA)-ferricitratløsning. Mens substratstabiliteten økes i disse testene, byr lagringen fortsatt på noen problemer, idet eksempelvis ferricitrat må lagres ved -20°C.

Nylig er det oppdaget et nytt dyrkningsmedium for identifikasjonen av Cryptococcus neoformans, Candida albicans og Candida stellatoidea som omfatter kaffesyre, oksegalle, saponin og en bærer. Dette medium (heretter iblant referert til som original SOC) er beskrevet i U.S. patent nr. 4,144,133. Fenoloxidasesubstratet, fortrinnsvis i form av kaffesyre, muliggjør en spesifikk identifikasjon av Cryptococcus neoformans ved hjelp av tilsynekomst av den karakteristiske brune fargingen som oppstår fra spesifikk enzymaktivitet av Cryptococcus neoformans på fenoloxidasesubstratet. Det er også oppdaget at oksegallen, i tillegg til dens kjente funksjon med å undertrykke bakterievekst, også øker filament- og chlamydosporeproduksjonen av de medisinsk viktige soppene Candida albicans og Candida stellatoidea. Det rensede saponinet som anvendes i sopp mediet øker signifikant dannelsen av kimrør og chlamydosporedannelsen av Candida albicans og muliggjør således rask identifikasjon av disse spesielt alvorlige typer av patogene sopper. Bæreren, som f.eks. vanlig agar eller silicagel, utgjør ganske enkelt en understøttende base for de ovenfor beskrevne ingredienser.

Selv-om SOC-dyrkningsmediene er spesifikke for identifikasjon av Cryptococcus neoformans og raskt angir nærværet av enten albicans- eller stellatoideaartene av slekten Candida, er chlamydosporedannelsen svak hos noen stammer av Candida albicans, hvilket krever 48 til 72 timer for dannelsen istedenfor 28 til 48 timer for de som danner chlamydosporer raskt.

Mens en rekke metoder og medier er anvendt for å identifisere og differensiere forskjellige patogene sopper omfattende de kritisk viktige slekter og arter Candida albicans og Cryptococcus neoformans, er det således et kontinuerlig behov for et soppvekstmedium og -system som raskt vil identifisere og differensiere disse slekter og arter, så vel som andre patogene sopper på en rask, virksom, økonomisk og teknisk effektiv måte.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et miniatyr-gjæridentifikasjonssystem som muliggjør en rask og pålitelig identifikasjon av de fleste opportunistiske sopper som man vanligvis støter på, og som infiserer pasienter med nedsatt kroppsforsvar. Foreliggende og forbedrede, differensierende soppvekstmedia modifiseres eller tilpasses til miniatyr-dyrkningsbeholdere med slike dimensjoner at de vil passe på et observasjonsbord i et kommersielt mikroskop, f.eks. en størrelse på ca. 33 x 75 x 5 mm. Fortrinnsvis er et lokk som kan vippes opp hengslet til sideveggene, hvilket når det er i den senkede eller lukkede stillingen vil innelukke mediet inne i beholderen, men når den er åpen vil tillate lett tilsetning, fjerning og inspeksjon av prøvene. Disse miniatyrskålene har en fysisk form som er hensiktsmessig for lagring, undersøkelse og lett bibeholdt sterilitet. Miniatyrutformningen påvirker også ytelsen til forskjellige differensierende vekstmedia. Spesielt muliggjør det større forhold mellom overflateareal og volum i miniatyrskålen en rask varmeoverføring mellom inkuberingsomgi*" j.sene cg mediet, og tilveiebringer således en forbedret temperaturregulering, noe som er avgjørende når det gjelder SOC-mediet, og tilveiebringer et lett oppnåelig høyt forhold mellom organisme og substrat, som kreves ved karbohydrat-assimileringen og ureaholdige media, f.eks. fra ca. 10~<*>og 12 2 2 10 organismer pr. ca. 0,2 cm til ca. 5 cm medium. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer i tillegg et forbedret SOC-medium, idet forbedringen omfatter tilsetningen av ammoniumioner. Tilsetningen av ammoniumioner øker chlamydosporedannelsen hos tidligere svake chlamydosporedannende stammer av Candida albicans. I tillegg er dette forbedrede SOC-medium ytterligere modifisert ved å øke konsentrasjonen av fenoloxidasesubstratet, kaffesyre, for å tillate tilpasning av SOC-mediet til miniatyrsystemet. Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse beskriver videre bruken av disse miniatyrskålene slik at de kan tilpasses til én eller flere organismer, ett eller flere differensierende vekstmedia eller en kombinasjon derav for å tilveiebringe et kompakt og raskt gjæridentifikasjonssystem.

Et aspekt ved foreliggende oppfinnelse, den nye miniatyrdyrkningsbeholderen, har dimensjoner slik at den vil passe på observasjonsstillingen i et konvensjonelt mikro^-skop, f.eks. en størrelse på ca. 33 x 75 x 5 mm. De mange utførelsesformene av de nye beholderne kan lettere forstås ved å-studere tegningene i hvilke: Figurene 1 til 4 i perspektiv viser fire forskjellige utførelsesformer av den nye miniatyrdyrkningsbeholderen. Figur 5 viser et forstørret fragment i tverrsnitt av strukturen i figur 1. Figurene 6 til 11 viser i perspektiv seks forskjellige utførelsesformer av den nye miniatyrdyrkningsbeholderen. Figur 12 viser et forstørret fragment i tverrsnitt av figur 10 tatt langs linjene 12-12. Figur 13 er et diagram som viser virkningen av soppmediumdybden på tiden for å oppnå positivt resultat i

karbohydratassimilasjonstesten fra eksempel 7.

Foreliggende oppfinnelse gjelder fremgangsmåter og preparater som er anvendbare ved rask og effektiv identifikasjon av patogene sopper.

I foreliggende beskrivelse skal følgende uttrykk defineres som følger om ikke annet er angitt: "blastospore" er en spore som dannes ved knopp-skyting som i gjær (syn: gjær, gjærcelle),

"chlamydospore" er en tykkvegget, ikke-fellende aseksuell spore fremstilt ved å runde av en celle enten innskutt (ved sammenbindingen av to celler i et filament) eller i enden (i enden av et filament), "filament" er en trådlignende serie av forlengede gjærceller,

"kimrør" er en hyfal forlengelse fra en gjærcelle som ikke har noen sammensnøring eller cellevegg ved produksjons-punktet,

"pseudohyfe" er en hyfal forlengelse fra en gjærcelle som dannes ved forlengelsen av et celleskudd hvor sammen-snøring og cellevegger skiller en gjærcelle fra den andre,

"pseudomycelium" er en masse av filamenter som er dannet av forlengede gjærceller,

"gjær" er en encellet, knoppskytende sopp.

Miniatyrgjæridentifikasjonssystemet ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en spesielt rask, pålitelig, økonomisk og teknisk effektiv måte for differensiering av de fleste medisinsk viktige typer av potensielt patogene sopper.

Gjæridentifikasjonssystemet inneholder minst ett skillemedium som tilveiebringes i en miniatyrdyrkningsskål som er beskrevet mer i detalj nedenfor. Mediene omfatter et forbedret soppvekstmediumÅdet forbedringen omfatter tilsetningen av ammoniumioner til et medium omfattende renset saponin, oksegalle, et substrat for fenoloxidase og en bærer (heretter noen ganger referert til som SOC), karbohydrat-assimilas jonsmedia og et ureasemedium. Miniatyrskålene som inneholder media, kan være konstruert for å inneholde et enkelt medium, som vist i figurene 1 til 4, eller kan være oppdelt, som eksempelvis vist i figurene 6 til 11. Det er meningen at skålene skal være oppdelt slik at de kan romme så mange som 20 forskjellige media.

Generelt kan saponiner renses ved bruk av de teknikker som er angitt i U.S. patent 3,883,425, som mottas her som referanse, og de rensede saponinene kan så anvendes i soppmediet i foreliggende oppfinnelse. Bruken og tilpasningen av disse media til miniatyrdyrkningsplater forbedrer signifikant ytelsen til disse media når det gjelder differensiert å identifisere forskjellige slekter og arter av klinisk viktige sopper. Miniatyrgjæridentifikasjonssystemet ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter også en modifikasjon av karbohydratassimilasjonstesten, idet nevnte modifikasjon omfatter preinkubering av soppene i et karbohydratfritt medium før utsåing på et karbohydratassimilasjons-medium. Den beskrevne modifikasjonen minsker signifikant den tiden som behøves for positiv test, spesielt fra 24 til mellom fire og seks timer for noen arter. Bruken og tilpasningen av disse media til miniatyrsystemet tilveiebringer både en overflateinokuleringsmetode og større forhold mellom overflatearealet og volum enn konvensjonelle metoder, hvilket kan redusere antallet falske negative identifika-sjoner som kan opptre når det anvendes helleskålmetoder. Denne miniatyrisering har også økonomiske og mekaniske fordeler. Miniatyrgjæridentifikasjonssystemet ifølge foreliggende oppfinnelse er spesielt anvendbart i den differensierte identifikasjonen av Cryptococcus neoformans, Candida albicans og Candida stellatoidea.

Miniatyrskålen har dimensjoner slik at den vil passe på observasjonsstillingen i et konvensjonelt mikroskop, f.eks. på fra ca. 0,03 til ca. 3 cm's bredde og fra ca. 0,7 til ca. 8 cm's lengde med en dybde på fra ca. 0,025 cm ril ca. 1,0 cm. Den foretrukne størrelse er omtrent 35 x 75 x 5 mm, hhv. utførelsesformer 10 og 20 i figurene 1 og 2, og har et lokk 12 som med hengsler er festet til sideveggene 14a og 14b og som når det er i senket stilling, se figur 5, vil innelukke mediene 16 inne i skålen 18 men når det er hengslet åpent, se figur 1, lett vil tillate tilsetning, fjerning og inspeksjon av prøvene. Standard petriskålen er en sirkelformig skål med omtrentlige dimensjoner på 100 x 15 mm og har et ikke festet lokk som passer bunnen, den medieholdige skålen. Miniatyrutformningen har flere fordeler. Spesielt omfatter disse fordeler letthet ved pakking og lagring, krever lite kjølerom og øket letthet ved å bibe-holde sterilitet da skålene lett håndteres og stables uten fare for å slå av lokket, noe som ofte opptrer med konvensjonelle petriskåler.

Med morfologimediet SOC passer i tillegg miniatyr-skålutformningen til glassplateholderen på mikroskopet, hvilket tillater rask manipulering av skålene i motsetning til den langsomme, tungvinte manipuleringen av standard petriskåler med hånd og ved å eliminere behovet for å over-føre gjæreksemplaret til en andre mikroskopglassplate for undersøkelse.

Idet det refereres til tegningene, representerer figurene 1, 2, 8, 9, 10 og 11 rektangulære utførelsesformer av miniatyrdyrkningsskålen ifølge oppfinnelsen. Slik det eksempelvis vises i figurene 1 og 2 kan disse utførelses-formene ha et lokk 12 som med hengsler er festet til sideveggene 14a og 14b eller kan ha et ikke festet lokk 22. Begge lokk 12 og 22 kan være senket på skålene hhv. 18 og 28, for å lukke mediet 16 inne i skålene 18, 28, 50, 54, 60 og 70 på en måte som er best vist i figur 5. Som eksempelvis vist i figurene 8 til 11 kan de rektangulære skålene 18 og 28 i utførelsesformene hhv. 10 og 20, være oppdelt på en slik måte at det skapes sirkelformige brønner 62a, 62b, 72a-h, vist i detalj i figur 12, firkantede brønner 55a-h eller rektangulære brønner 52a-c, og 64a-b eller en kombinasjon derav som vist i utførelsesform 60. Alternativt kan miniatyrdyrkningsskålene være formet som sirkler slik dt=t vises i utførelsesformene hhv. 30 og 40 i figurene 3 og 4. De sirkelformige skålene 38, 48, 80 og 90 kan likeledes ha et fast lokk 32 som er festet med hengsler til den sirkelformige sideveggen 34 eller kan ha et ikke festet lokk 42, hvilke begge innelukker mediet 16 som inneholdes i skålene 38, 48, 80 og 90 når lokkene 32 og 42 senkes på de sirkelformige sideveggene hhv. 34 og 44. På lignende måte som de rektangulære skålene 18, 28, 50, 54, 60 og 70 kan de sirkelformige skålene 38, 48, 80 og 90 være oppdelt som vist i figurene 6 og 7 for å danne brønner med slike former som sirkler 92a og 92b eller triangelformede, paiformede brønner 82a-f og 94a-d eller en hvilken som helet kombinasjon derav, f.eks. utførelsesform 90, figur 7. Formen på miniatyrdyrkningsskålen og mediene som inneholdes i brønnene, vist i figurene 1 til 12, er vist som eksempler og er ikke ment å begrense typene av mulige former og kombinasjoner som kan anvendes. Miniatyrdyrkningsskålen kan være konstruert av plast eller slikt materiale som for tiden anvendes ved fremstilling av petriskåler.

Miniatyrskålene er mer økonomiske ved at de anvender mellom ca. 2,5 og 5 ml medium i motsetning til de ca. 20 til 30 ml medium som kreves av standard petriskåler. Miniatyrgjæridentifikasjonssystemet er konstruert for å anvende en slideoppvarmer som en alternativ miniinkubator. En slik slideoppvarmer er kommersielt tilgjengelig fra Fisher Scientific Company. Det er to krav ved bruk av slideoppvar-mere: (1) en justerbar termostat som kan settes på 3 7°C og (2) et dekke eller lokk for varmeoverflaten. Både innkjøps-kostnaden og plassbehov til en slideoppvarmer er betydelig mindre enn for en konvensjonell inkubator.

Miniatyrgjæridentifikasjonssystemet ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringer forhåndshelte, steriliserte medier som er ferdig for bruk og derved omgår ulempene ved foreliggende systemer, som f.eks. den auxanografiske karbo-hydratassimilas jonsmetoden som krever slike trinn som koking, for å oppløse bærermiddelet agaren og sterilisering før bruk. Et konvensjonelt produkt med en agar som er ferdig til bruk for chlamydosporeproduksjon, anvender måis-melagar med et emulgeringsmiddel solgt under varemerket

(R)

Tweerr-^ 8 0 av Atlas Chemical Company og følger med media for urea-, nitrat- og karbohydratanvendelse. Maismelagaren inokuleres og undersøkes etter 24 til 72 timer for chlamydo-sporeproduks jon. De to hovedulempene ved dette systemet er at chlamydosporetestene ikke kan utføres uten å anvende hele skålen som er relativt kostbar og det går lang tid før det

oppnås bestemt resultat.

I miniatyrgjæridentifikasjonssystemet ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles mediene, helles i miniatyrskålene og lokkene lukkes etter fastgjøring og skålene pakkes i aluminiumposer som er belagt med plast. Disse skålene kan lagres opptil minst åtte måneder ved 4°C uten tap av vekstskillende egenskaper.

Miniatyrutformningen påvirker også medienes ytelse. Temperaturregulering er essensiell ved disse medier og det mindre volumet av medier i miniatyrskålen muliggjør rask varmeoverføring mellom inkuberingsomgivelsene og mediet. Følsomheten og nøyaktigheten ved korttidsinkuberinger, som f.eks. tre timers inkubering ved 37°C for kimrørdannelse og etterfølgende forandring til romstemperatur for chlamydosporeproduksjon på SOC-mediet, økes signifikant ved miniatyrisering av systemet. Ytelsen ved sucroseassimilerings-og ureasetestene økes også. Begge de sistnevnte testene krever et meget høyt forhold mellom organisme og substrat, hvilket lett kan oppnås i det lille volum av medium som anvendes i miniatyrskålen. I tillegg omfatter begge testene en fargeforandring som gjøres mye lettere synlig med en mediumdybde på ca. 1 til 4,5 mm enn ved ca. 5 til 15 mm. Dette økede forhold mellom organisme og substrat og lettere synliggjort fargeforandring ansees å være delvis ansvarlig for den minskede tid før bestemt resultat av sucrose- og ureasetestene i miniatyrsystemet ifølge oppfinnelsen, idet tidene er hhv. fem og en time.

Bruk av SOC-mediene i miniatyrsystemet ifølge foreliggende oppfinnelse krever en modifikasjon i konsentrasjonen av fenoloxidasesubstratet. Det foretrukne substratet er kaffesyre, imidlertid kan noen andre egnede substrater for fenoloxidaseenzymer anvendes. Egnede fenoloxidase-substrater omfatter 2,3-dihydroxybenzosyre, 3,4-dihydroxybenzosyre (protokatekusyre), DOPA, 3,4-dihydroxykanelsyre (kaffesyre), methylesteren og diacetatet av kaffesyre, 3,4-dihydroxytryptamin, 3,4-dihydroxyfenylethanolamin (norepi-nefrin) og 4-hydroxy-3,5-dimethoxykanelsyre. Substratet for fenoloxidase anvendes som et identifikasjonsmiddel for Cryptococcus neoformans siden reaksjonen mellom fenoloxidaseenzymer fra denne soppen producerer en kr^naktig pigmentering som er spesifikk for Cryptococcus neoformans. Den opprinnelige SOC-sammensetningen slik den er angitt i U.S. patent 4,144,133 var fra ca. 0,005 til ca. 0,05 vektprosent kaffesyre. Tilpasningen av det opprinnelige SOC-mediet til miniatyrsystemet krever et øket område på ca. 0,005 til ca. 0,5 vektprosent, med en foretrukken konsentrasjon på ca. 0,012 til 0,12 vektprosent og mest foretrukken konsentrasjon på ca. 0,06 vektprosent kaffesyre. Denne høyere konsentrasjon av kaffesyre nødvendiggjorde en oppoverjustering av pH i mediet til en nøytral pH på grunn av den sure naturen av kaffesyre.

Det ble bemerket at chlamydosporedannelse hos visse stammer av Candida albicans var meget svak med det opprinnelige SOC-mediet, og krevde en 48 til 72 timers inkubering for produksjon. Publikasjoner av McClary, Annals Missouri Bot. Gar., 39:137-164 (1952) og Nickerson, Internat. 1. Congress of Microbiol. Report Proceedings, 5. kongress, Rio de Janeiro, s. 130-131 (1950), indikerte at lave konsentrasjoner av ammoniumsulfat eller ammoniumklorid understøtter filamentering hos Candidaarter. Andre arbeider av Jansons, et al., J. Bacteriol., 104, 2:910-921 (1970), Land, et al., Infect. and Immun., 11, 5:1014-1023 (1975), Mardon et al., J. Bacteriol., 100:701-707 (1969) og Nickerson ibid konsta-terte at ammoniumsalter understøtter gjærvekst. 20 stammer av Candida albicans ble valgt, som leilighetsvis hadde gitt negativ eller svak chlamydosporedannelse, og ble testet på kimrør- og chlamydosporedannelse på SOC-medium inneholdende et område av ammoniumionkonsentrasjoner i miniatyrsystemet. Alle 20 stammer produserte en rekke kimrør på ammonium--"-ionholdig SOC-medium etter tre timer ved 37°C. Det konsen-trasjonsområdet av ammoniumioner, tilsatt i form av ammoniumsalter, som understøttet chlamydosporedannelse ble funnet å være mellom ca. 0,001 M og ca. 0,5 M med en foretrukken konsentrasjon på ca. 0,005 M til ca. 0,05 M og en mest foretrukken konsentrasjon av ammoniumsalt på ca. 0,01 M. Ammoniumsalter kan velges fra en ikke-begrenset klasse omfattende ammoniumklorid, ammoniumsulfat, ammoniumnitrat og ammoniumcitrat, av hvilke det foretrukne Cmmoniumsaltet er ammoniumklorid. Andre salter som f.eks. natriumklorid og kaliumklorid ble testet ved tilsetning til SOC-mediet, men ble funnet å være mindre effektivt for å fremme chlamydosporedannelse enn ammoniumsaltene.

Miniatyrisering av SOC-mediet krevde også en økning i den foretrukne konsentrasjonen av renset saponin fra den opprinnelige konsentrasjonen på ca. 0,5 vektprosent til ca. 1,0 vektprosent i det forbedrede SOC-medium ifølge foreliggende oppfinnelse.

Det SOC-medium som ble brukt i miniatyrgjæridentifikasjonssystemet ble fremstilt ved å tilsette en pulverisert bærer som f.eks. agar, oksegalle, renset saponin, en substans for fenoloxidase som f.eks. kaffesyre, og ammoniumsalt til avionisert vann. Den resulterende blandingen omrøres så og oppvarmes til koking for å oppløse ingrediensene og justeres til en slutt-pH på ca. 6,5 til ca. 7,5. Løsningen steriliseres så ved 121°C og ca. 1,05 kg/cm^ i 15 minutter. Etter avkjøling ble mediet overført til en dybde på ca. 2 mm i 33 x 75 x 5 mm rektangulære plastskåler med festede lokk. Mediet fikk lov å bli fast, og skålene ble pakket i plastbelagte aluminiumfolieposer og lagret ved 4°C. Fremstilling og lagring på denne måte gir en holdbarhet på minst åtte måneder.

Generelt omfatter det forbedrede SOC-medium ifølge

foreliggende oppfinnelse fra ca. 1,0 til ca. 5,0 vektprosent agar, fra ca. 0,25 til ca. 30 vektprosent oksegalle, fra ca. 0,1 til ca. 5,0 vektprosent renset saponin, fra ca. 0,05 til ca. 0,5 vektprosent kaffesyre, basert på mengden vann tilsatt til disse bestanddelene og fra ca. 0,001 M til ca.- 0,5 M ammoniumsalter.

Foretrukne medier kan fremstilles ved å følge den fremgangsmåte som er angitt ovenfor og anvende fra ca.

1,0 til ca. 5,0 vektprosent agar, fra ca. 0,5 til ca. 5,0 vektprosent oksegalle, fra ca. 0,1 til ca. 2,5 vektprosent renset saponin, fra ca. 0,012 til ca. 0,12 vektprosent kaffesyre, og fra ca. 0,005 M til ca. 0,05 M ammoniumsalter.

Et foretrukket medium inneholder ca. 2,0 vektprosent agar, ca. 1,0 vektprosent oksegalle, ca. 1,0 vektprosent renset saponin, ca. 0,06 vektprosent kaffesyre og ca. 0,01 M ammoniumsalter.

Før inokulering av miniatyrskålene som inneholder SOC-mediet, med gjærprøvene, dyrkes gjæren på et generelt vekstmedium, som f.eks. Sabouraud-dextroseagar med gentamicin, i opptil 72 timer. Fra ca. en til tre gjærkolonier kan tas fra det generelle vekstmediet og utsås på hver miniatyrskål. All gjær ble først dyrket på et generelt vekstmedium før inokulering av mediumholdige miniatyr-skåler. Disse generelle vekstmedier kan inneholde antibiotika .

Miniatyrgjæridentifikasjonssystemet ifølge foreliggende oppfinnelse er også tilpasset for å oppta karbo-hydratassimilas jonsmedier . Tilpasning av disse assimila-sjonsmedier til miniatyrsystemet gjør det mulig for kliniske teknikere selektivt å velge de assimilasjoner som kreves for en spesifikk artsbestemmelse av potensielle patogene sopper og derved forkorte tiden for identifikasjon av artene fra en uke til ca. fem til 24 timer. Sucroseassimilasjon differen-sierer f.eks. spesifikt Candida albicans, som assimilerer sucrose, fra Candida stellatoidea, som ikke gjør det. Når den anvendes i forbindelse med slike morfologitester som kimrør- og chlamydosporedannelse, som gir en presumptiv identifikasjon av albicans- eller stellatoideaartene, vil utførelsen av sucroseassimilasjonstestene gi en avgjørende artsidentifikasjon. Tilpasning av slike karbohydratassi-milas jonsmedier som sucrose har i tillegg dramatisk forkortet tiden for bestemt Candida albicans- og Candida stella-toideadifferensiering.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse forkorter tiden til positiv bestemmelse for sucroseassimilasjon fra 24 timer, og i noen tester seks dager, til en periode på ca. fem timer. Denne økede effektiviteten antas å være forårsaket av minst to nye trekk ved foreliggende oppfinnelse. For det første anvender fremgangsmåten for sucroseassimilasjon seg av et utsultingstrinn, i et karbo hydratfritt medium, før utsåing av soppene på assimilasjons-mediet. Formålet med dette forutsuitingstriruiot er å tømme gjærcellene for i hovedsak alle indre karbohydratlagre, hvilket hindrer falsk positiv reaksjon. Denne forutsul-tingen antas å øke graden av karbohydratassimilasjon når gjæren er utsådd på karbohydratholdige medier og således øke tiden til positiv bestemmelse. For det andre har miniatyrskålene en mediumsdybde på ca. 1 mm til ca. 4,5 mm i motsetning til 5 mm til 15 mm i standard petriskålen. Den mindre dybde i miniatyrskålene antas å hjelpe til med en raskere synliggjøring av fargeforandringen som oppstår ved positiv karbohydratassimilasjon og å tilveiebringe det avgjørende høye forhold mellom organisme og substrat.

I miniatyrgjærassimilasjonssystemet anvendes en sucroseassimilasjon for å differensiere mellom Candida albicans og Candida stellatoidea. Mediet ble fremstilt ved å tilsette en pulverisert bærer, som f.eks. agar, et pH-følsomt fargestoff, som f.eks. bromcresol-fiolett og gjærnitrogenbase til avionisert vann. Den resulterende blanding omrøres så, oppvarmes til koking for å oppløse mediebestand-delene og justeres til en pH på ca. 6,85 til ca. 7,55 med en base, som f.eks. natriumhydroxyd. Mediet steriliseres så ved oppvarming til 121°C ved 1,05 kg/cm i 15 minutter. Sucrosen forhåndssteriliseres og tilsettes aseptisk til medieblandingen. Det avkjølte, sucroseholdige mediet fordeles så i ca. 5 ml's aliquoter i sterile rektangulære skåler med festede lokk, hvilke skåler har de omtrentlige dimensjonene 33 x 75 x 5 mm. Etter fastgjøring lukkes lokkene og skålene pakkes i plastbelagte aluminiumfolieposer og lagres vd 4°C. Disse skålene kan lagres opptil minst åtte måneder ved 4°C uten uttørking eller tap av farge.'Andre sukkere som f.eks. maltose, galactose, trehalose og lactose, kan anvendes istedenfor sucrose for å tilveiebringe ytterligere karbohydratassimilasjonsmedier. Disse sukkere er bare ikke-begrensende eksempler på karbohydrater som kan erstatte sucrose i det ovenfor beskrevne karbohydratassi-milas jonsmedium. I tillegg er det tenkt at en serie av forskjellige karbohydratassimilasjoner kan utføres samtidig ved å anvende beholdere som f.eks. de som er vist i figurene 6 til 11. Fluorescerende indikatorer som vi:ix en avgjort forandring i fluoroscens med forandring i pH kan anvendes istedenfor de pH-følsomme fargestoffene som anvendes i eksemplene i foreliggende oppfinnelse. Fluorescerende indikatorer som arbeider i pH-området fra 5 til 8, i karbohydrat-assimilas jonssystemet omfatter f.eks. surt R-fosfin, brilliant Diazol-gult, Cleves syre, kumarinsyre, 3,6-dioxyf tal-dinitril, magnesium-8-hydroxykinolinat, / g-methylumbelli-feron, 1-naftol-4-sulfonsyre, orcinaurin, patent fosfin, tioflavin og umbelliferon.

Et foretrukket medium kan fremstilles ved å følge den fremgangsmåte som er angitt ovenfor og anvende fra ca. 1 til ca. 5 vektprosent agar, fra 0,0005 til ca. 0,02 vektprosent bromcresol-fiolett, fra ca. 0,02 til ca. 0,7 vektprosent gjærnitrogenbase og ca. 0,02 til ca. 1,0 vektprosent sucrose, basert på den mengde vann som er tilsatt til disse bestanddelene. Den foretrukne pH i mediet før sterilisering er ca. 6,85 til ca. 7,55. Før inokulering av assimilerings-mediet ble gjær tatt fra skåler inneholdende et generelt vekstmedium og suspendert i sterile, karbohydratfrie medier ved en pH på ca. 7,0 til ca. 8,5 og holdt ved romstemperatur. Eksempler på karbohydratfrie medier omfatter sterilt, avionisert vann eller avionisert vann tilsatt en gjærnitrogenbase. Forhåndssulteperioden kan oppgå til fra ca. 30 minutter til 24 timer med et foretrukket område på fra ca. 30 minutter til ca. åtte timer, og en mest foretrukken periode på ca. en time. Forsulting utføres i forseglede og sterile beholdere som ikke er av glass. Slike forsultetek-nikker er anvendt i genetiske og biokjemiske undersøkelser av mikroorganismer generelt, men har ikke tidligere væi-t anvendt i gjærassimilasjonsmetoder for taksionomiske formål.

Etter forhåndssulting omrøres det karbohydratfrie mediet som inneholder gjæren kraftig og deretter plasseres minst 10 mikroliter gjærsuspensjon på overflaten av assi-milas jonsmediet . Flere enkle aliquoter av gjærsuspensjoner kan plasseres på hver miniatyrskål. Skålene inkuberes så ved romstemperatur i ca. fire til seks timer og undersøkes deretter på fargeforandring fra fiolett til gult, hvilket angir karbohydratassimilasjon.

En alternativ utførelsesform av miniatyrgjærassimilasjonssystemet er utviklet som kombinerer forsulting av gjærinocula med etterfølgende inokulering av den forsultede gjæren på en serie av miniatyriserte karbohydratagarer, inkubering av nevnte inocula på nevnte agar og etter inkuberingen tilsetning av fargestoff eller fluoréscerende indikator for påvisning av karbohydratassimilasjon.

I denne alternative utførelsesformen ble gjæren tatt fra skåler inneholdende et generelt gjærvekstmedium og suspendert i en konsentrasjon på McFarland nr. 8, ca. 10g organismer, i hver av de forsultede medier som tidligere er beskrevet eller 1 x 10 M NaOH. Forhåndssulteperioden kan oppgå til fra ca. 30 minutter til ca. 24 timer med et foretrukket område fra ca. 30 minutter til ca. åtte timer, og en mest foretrukket forhåndssulteinkuberingsperiode på ca. en time ved en foretrukken temperatur på ca. 20-25°C. Forhånds-sultingene utføres igjen i sterile, forseglede beholdere som ikke er av glass ved den tidligere beskrevne pH.

Etter forsultingen blandes det karbohydratfrie mediet som inneholder gjæren kraftig og deretter plasseres minst 10 mikroliter gjærsuspensjon på overflaten av assimilasjons-mediet.

De karbohydratassimilasjonsmedier som anvendes i denne alternative utførelsesformen ble fremstilt ved å suspendere passende mengder gjærnitrogenbase og agar i avionisert vann. Den resulterende blanding ble omrørt med tilstrekkelig varme til å oppløse ingrediensene og pH i suspensjonen ble justert til ca. 7,2 med et tillatelig ph-område på fra ca. 6,65 til ca. 7,35. Blandingen ble så-sterilisert ved 121°C og 1,05 kg/cm^ i 15 minutter, avkjølt til ca. 40 til 55°C og deretter ble en passende mengde filtersterilisert karbohydrat tilsatt aseptisk. Ca. 5 ml<1>s aliquoter av dette smeltede medium ble så pipettert over i sterile, rektangulære skåler med festede lokk, idet skålene har de omtrentlige dimensjonene 33 x 75 x 5 mm. Etter fastgjøring lukkes lokkene og skålene pakkes i plastbelagte aluminiumfolieposer og lagres ved 4°C. Disse skålene kan lagres i opptil minst åtte måneder ved 4°C uLon tørking. En ikke-begrensende liste av typen av sukkeret som kan anvendes i denne alternative utførelsesformen omfatter dextrose, galactose, sucrose, maltose, cellobiose, trehalose, lactose, melibiose og raffinose. I tilfelle av at ett enkelt gjær-inoculum samtidig skal testes på dens evne til å assimilere mange forskjellige karbohydrater, kan miniatyrskålene som vises i fugurene 6 til 11 anvendes. De enkelte brønner som f.eks. 72a til 72h i figur 10 eller avdelinger som f.eks. 55a til 55h i figur 9 vil hver inneholde et ulikt karbohydratholdig medium og minst 10 mikroliter gjærsuspensjon ble fordelt på hver enkelt brønn eller avdeling.

Et foretrukket medium kan fremstilles ved å følge den fremgangsmåte som er angitt ovenfor og anvende fra ca. 0,0 2 til ca. 0,5 vektprosent gjærnitrogenbase, fra ca. 1,0 til ca. 5,0 vektprosent agar og fra ca. 0,02 til ca. 1,0 vektprosent karbohydrat, basert på mengden vann som tilsettes til disse bestanddelene. Den foretrukne pH i mediet er fra ca. 6,65 til ca. 7,35. Et mest foretrukket medium inneholder ca. 0,067 vektprosent gjærnitrogenbase, ca. 2,0 vektprosent agar og ca. 0,1 vektprosent karbohydrat, basert på mengden vann som tilsettes til disse bestanddelene. Den mest foretrukne pH er ca. 7,2.

Etter inokulering av det karbohydratholdige medium med en passende aliquot av gjærsuspensjon, dekkes skålene med sterilt lokk og inkuberes ved romstemperatur i ca. seks til 24 timer. Etter inkuberingen tilsettes en passende mengde fargestoffløsning til hver assimilasjonstestskål og assimilasjon påvises ved fargeforandringer i fargestoffet. Tre fargestoffer ble undersøkt for mulig bruk i dette systemet, bromcresol-fiolett, klorfenol-rødt og p-nitrofenol som gir hhv. en fiolett til gul, rød til gul og fargeløs til gul fargeforandring når det opptrer karbohydratassimilasjon.

Fargestoffblandingene ble fremstilt ved å oppløse en passende mengde fargestoff i vann, justere pH i fargeløs-ningen til ca. 7,2 ved bruk av 0,05 N NaOH og filtersterili-sere løsningen gjennom et 0,22 ^um filter. Et bredt konsen- trasjonsområde av fargestoffløsninger, fra ca. 20 mg til 250 mg bromcresol-fiolett eller klorfenol-rødt pi. ml eller fra ca. 15 mg til 45 mg p-nitrofenol pr. ml, kan anvendes som lagerløsninger fra hvilke det uttas en passende aliquot av fargestoff og tilsettes til karbohydratassimilasjonstest-skålene. Den foretrukne konsentrasjonen for fargestoff-lagerløsningene er ca. 40 mg bromcresol-fiolett pr. ml, 60 mg klorfenol-rødt pr. ml og 20 mg p-nitrofenol pr. ml. Det mest foretrukne fargestoffet er bromcresol-fiolett. Omtrent 0,2 ml til ca. 1,0 ml lagerfargestoffløsning tilsettes pr. ca. hhv. 0,1 til ca. 5,0 ml gjærinokulert karbohydratassi-milas jonstestmedium. Bromcresol-fiolett-reaksjonen krever ca. fem til 15 minutter for å fullføres, mens klorfenol-rødt krever ca. 15 til 60 minutter for fullføring.

Miniatyrgjæridentifikasjonssystemet ifølge foreliggende oppfinnelse er også tilpasset til å omfatte ureaholdige medier. Cryptococcusartene og leilighetsvis Trichosporon beigelii og en meget sjelden Candida krusei har enzymet urease, som er nødvendig for hydrolyse av urea. Nærvær av ureaseenzym i gjærkulturer indikeres ved fargeforandring fra orange til rosa.

Tilpasningen av ureaholdig medium til miniatyrsystemet ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en positiv påvisning av enzymet urease i løpet av ca. en time i motsetning til 24 til 72 timer og tre til fire timer som kreves for ureasepåvisning i hhv. tilgjengelig ureaskrå agar og ureanæringsløsning. Den forkortede tiden for positiv bestemmelse ved foreliggende fremgangsmåte antas å være forårsaket av det økede forhold mellom organisme og substrat som tilveiebringes ved det lille medievolumet og øket relativt overflateareal og ved lettere synliggjøring av fargeforandringen på grunn av den mindre mediedybden i miniatyrsystemet sammenlignet med standard petriskåler og næringsvæskerør.

Miniatyrureaseskålene ifølge foreliggende oppfinnelse lages ved fremstilling av ureaagar i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Mediet ble sterilisert ved oppvarming til 121°C ved ca. 1,05 kg/cm<2>i 15 minutter og fordeles så i ca. 5 ml<1>s aliquoter i de miniatyrskålene som er beskrevet ovenfor. Etter fastgiøring ble skålene pakket inn og lagret som beskrevet ovenfor slik at do forblir stabile i minst åtte måneder når de lagres som beskrevet ovenfor. Skålene ble inokulert ved overføring av en til tre gjærkolonier fra et generelt vekstmedium til ureasemediene. Skålene ble så inkubert ved 35°C i en time.

De medier som er tilpasset for bruk i miniatyrgjær-identif ikas jonssystemet ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes alene eller i kombinasjon. Når de oppdelte skålene som er vist i figurene 6 til 11 anvendes, kan hver skål inneholde f.eks. en enkelt type medium inokulert med flere forskjellige typer gjær, eller hver skål kan inneholde flere, forskjellige differensierte medier inokulert med den samme eller flere gjærtyper.

Mediene for soppene ifølge foreliggende oppfinnelse alene og i kombinasjon muliggjør en rask skillefremgangsmåte for idententifikasjon av klinisk viktige gjærtyper. Spesielt muliggjør de miniatyrgjæridentifikasjonssystemer som er beskrevet her en relativt rask differensiert identifikasjon av Cryptococcus neoformans og de to Candidaartene, albicans og stellatoidea. Det skal videre forstås at mens denne oppfinnelse er beskrevet når det gjelder dens foretrukne utførel-sesformer, vil de forskjellige modifikasjonene derav ikke være selvsagte for fagmannen ved lesning av dette patent og det er ment å dekke slike modifikasjoner som faller innenfor området av de medfølgende krav.

Eksempler

Følgende eksempler viser de mekaniske fordeler, den økede nøyaktighet og den minskede tiden for positiv bestemmelse ifølge foreliggende oppfinnelse sammenlignet med de metoder som tidligere er anvendt for identifikasjon av forskjellige sopper, inkludert Candida albicans, Candida stellatoidea og Cryptococcus neoformans. Disse eksemplene er anført med det formål å tilveiebringe en bedre forståelse av foreliggende oppfinnelse og skal ikke ansees som en be-grensning av området derav.

Eksempel 1

Dette eksempel ble utført for å sammenligne nøyaktig-het og følsomhet til eggehvitemedier, kvegfostermedier, to kommersielle systemer hhv. Flow GBE og A.P.I. GT Microtest, og miniatyr-SOC-mediene ifølge foreliggende oppfinnelse ved påvisning av kimrørdannelse. Lettheten ved manipulasjon og mikroskopisk undersøkelse av disse mediene ble også sammenlignet.

Lagergjærstammer ble dyrket på Sabouraud-dextroseagar og fikk lov å vokse i opptil 72 timer. De gjærkolonier som ble dannet ved vekst av lagergjæren på Sabouraud-dextrose-agaren ble brukt for å inokulere testmediene i denne sammen-ligningsundersøkeIsen.

I både eggehvite- og serummediene ble substratet tilsatt til et reagensglass, som var inokulert med gjær og inkubert ved 37°C i tre timer. Etter inkuberingen ble én dråpe gjærsuspensjon plassert på et mikroskopglass, dekket med et dekkglass og undersøkt under mikroskopet i 100X til 400X forstørrelse på kimrør. Eggehvitesubstratet ble fremstilt ved å separere eggehviten fra plommen i et egg. Kvegfosterserumsubstrat ble kjøpt fra Gibco. Flow GBE-glasset, inneholdende 0,1 vektprosent pr. volum glucose og 2,6 vektprosent pr. volum kjøttekstrakt, ble inokulert med gjær og inkubert ifølge produsentens instruksjoner i en 35 til 37°C inkubator i to til fire timer. Etter inkubering ble én dråpe inokulert næringsvæske plassert på et mikroskopglass, dekket med et dekkglass, og undersøkt under mikroskopet i 100X forstørrelse på kimrør. A.P.I. GT Microtest, bestående av mikrorør inneholdende 70 mikroliter lyofilisert kaninplasma med EDTA ble fremstilt ifølge produsentens instruksjoner, inokulert med gjær og inkubert, ifølge produsentens instruksjoner, i en inkubator ved 35 til 37oC i to til fem timer. Etter inkubering ble en dråpe gjærsuspensjon plassert på et mikroskopglass, dekket med et dekkglass og undersøkt under mikroskopet i 400X forstørrelse på nærvær av kimrør. Miniatyr-SOC-skålene ble fremstilt som beskrevet tidligere. En til fire kolonier gjær tas opp med en steril bomullsdott og hele inoculumet ble avsatt som en enkelt haug på miniatyr-SOC-mediet. Fra det gjenværende inoculum på dotten ble en tynn filr.i av gjær uLstrøket på mediet i en dollartegnform og den tynne gjærfilmen deretter dekket med et dekkglass. Lokket på miniatyrskålen ble lukket og skålen ble inkubert ved 37 til 40°C i tre timer. Etter inkuberingen ble miniatyrskålen åpnet, plassert under mikroskopet -og inoculumet, som befinner seg sentralt under vektglasset, ble undersøkt i 100X til 400X forstørrelse på kimrør.

Tabell 1 viser de sammenlignende resultater av ytelsen i kimrørsystemer. 20 stammer av Candida albicans ble testet på kimrørdannelse og letthet ved mikroskopisk undersøkelse av eggehvite, kvegfosterserum, Flow GBE, A.P.I. GT Microtest og miniatyr-SOC-mediet ifølge foreliggende oppfinnelse. Hver stamme ble undersøkt etter tre timers inkubering og markert som positiv (+) når det gjelder kimrørdannelse når minst åtte av ti mikroskopfelt viste kimrørdannelse. Stammene ble markert som marginale (+) når kimrørene var synlige i bare ett eller to av ti mikroskopfelt. Klumping ble sagt å opptre når, på tross av omrøring, de kimende cellene forble knyttet sammen i masser, hvilket gjorde det vanskelig å observere i mikroskopet om det er en sann kimrør- eller en pseudohyfedannelse.

Som det kan sees ved studier av tabell 1 dannet 100% av de stammer som ble testet, kimrør i løpet av tre timer på miniatyr-SOC-, eggehvite- og kvegfosterserummediene, mens bare 90% og 85% av stammene dannet kimrør i hhv. Flow GBE og A.P.I. GT Microtest. Slik det fremgår av de resultater som er vist i tabell 1, ble det observert signifikant klumping i serum-Flow GBE og A.P.I. GT Microtestsystemene. Miniatyr-SOC-mediet er et fast bærermedium på hvilket gjærcellene er dispergert i en tynn film som tillater observa-sjon av enkle, stasjonære celler. I de andre systemene er gjæren vanligvis i bevegelse i væsken under dekkglasset, hvilket gjør det vanskelig å fokusere på en enkelt celle.

Når det gjelder manipulering krever miniatyr-SOC-skålen bare en startinoculumoverføring, mens de andre systemene krever en andre overføring til et mikroskopglass som øker teknikertiden og nødvendiggjør ytterligere materi-aler .

Eksempel 2

Dette eksempel ble utført for å fastslå virkningen av forskjellige konsentrasjoner av fenoloxidasesubstratet, kaffesyre, på gjærmorfologi og pigmentdannelse på SOC-medier i miniatyrsystemet. De spesifikke morfologien som bie observert var kimrør-, chlamydospore-, blastospore-, filament-og pseudohyfedannelse. Den brune pigmentproduksjonen som er karakteristisk for flere Cryptococcus neoformansstammer ble også undersøkt.

Testmediet, miniatyr-SOC-mediet, i det foreliggende eksempel ble fremstilt som følger: 20 g agar, 10 g oksegalle, 10 g renset saponin, 0,54 g ammoniumklorid og forskjellige mengder kaffesyre, som er oppført i tabell 2 nedenfor, ble tilsatt til 1 1 avionisert vann. Den således oppnådde blandingen ble omrørt og oppvarmet til koking for å oppløse ingrediensene og justert til en slutt-pH på ca. 7,2. Løsningen steriliseres så ved oppvarming til ca. 121°C ved

1,05 kg/cm 2 i 15 minutter. Etter avkjøling ble mediet over-ført til en dybde på ca. 2 mm (ca. 5 ml) i sterile miniatyr-skåler som tidligere er beskrevet, og tillatt å fastgjøres.

En til fire gjærkolonier ble overført fra et generelt vekstmedium til testmediet, som beskrevet i eksempel 1. De inokulerte skålene ble inkubert i tre timer ved 37°C og deretter ved romstemperatur.

Tabell 2 angir resultatene av testen som ble utført for å sammenligne virkningen av forskjellige konsentrasjoner av kaffesyre på gjærmorfologi og pigmentproduksjon på miniatyr-SOC-mediet. Seks arter av Candida og fire arter av Cryptococcus ble utsådd på testmediet og observert ved det tidsintervall som er spesifisert i tabell 2. Mikroskopisk undersøkelse ved de tidsintervaller som er angitt i tabell 2 ble utført i 100X forstørrelse på den måte som er beskrevet i eksempel 1. Positiv morfologi (+) ble definert ved at i det minste åtte av ti mikroskopfelt hadde vist en spesiell morfologi eller kombinasjon av morfologier. Negativ morfologi (-) ble definert ved at mindre enn ett eller to av ti mikroskopfelt hadde vist en spesiell ventet morfologi eller kombinasjon derav.

Som det kan sees fra tabell 2 nedenfor understøttet miniatyr-SOC-mediene de karakteristiske gjærmorfologiene og pigmentproduksjonen over et relativt bredt område av kaffe- syrekonsentrasjoner, fra ca. 0,005 vektprosent til ca. 0,5 vektprosent. Når det gjelder pigmentdanneicc, produserte 10% av de Cryptococcus neoformansstammer som ble testet brun farge etter 18 timer på SOC med 0,006 vektprosent kaffesyre. Ved 0,6 vektprosent var SOC i seg selv mørkebrun og gjorde det vanskelig å fastslå gjærfargens forandring, SOC-mediet ble også mørkere brunfarget for hver dag, hvilket indikerte ustabilitet. Effekten av kaffesyrekonsentrasjonen på gene-rell gjærmorfologi, slik det vises i tabell 2 nedenfor, fastslår en øvre grense for kaffesyre. I hovedsak all filamentering av Candidaarter ble inhibert ved 0,6 vektprosent kaffesyre.

Eksempel 3

Dette eksempel ble utført for å bestc:,ui.e virkningene av ammoniumkloridtilsetning til SOC-medium på chlamydosporeproduksjon av Candida albicans.

Testmediet i foreliggende eksempel ble fremstilt som følger: 20 g agar, 10 g oksegalle, 10 g renset saponin, 0,06 g kaffesyre og varierende konsentrasjoner av ammoniumklorid, som er angitt i tabell 3 nedenfor, ble tilsatt til 1 1 avionisert vann.Blandingen ble så omrørt, oppvarmet til koking, justert til en slutt-pH på ca. 7,2 og sterilisert ved oppvarming til 121°C ved 1,05 kg/cm<2>i 15 minutter. Etter en kjøleperiode ble ca. 5 ml avkjølt medium overført til miniatyrskålene som beskrevet i eksempel 1. Disse skålene kan lagres opptil åtte måneder når de lagres som beskrevet i eksempel 1.

En til fire gjærkolonier som var dyrket på Sabouraud-dextroseagar ble utsådd som beskrevet i eksempel 1 på SOC-medium inneholdende de forskjellige konsentrasjonene av ammoniumklorid som er oppført i tabell 3 nedenfor. Ved 1,0 M ammoniumklorid, falt noen av mediumbestanddelene ut, hvilket gjorde det umulig å teste denne sammensetningen. De således utsådde gjærkoloniene omfattet 20 forskjellige stammer av Candida albicans som leilighetsvis hadde gitt negativ eller svak chlamydosporeproduksjon. Skålene ble inkubert i tre timer ved 37°C og undersøkt på kimrørdannelse. Alle 20 stammer produserte flere kimrør ved alle konsentrasjoner av ammoniumklorid som er oppført i tabell 3. Skålene ble så inkubert ved romstemperatur i 24 til 72 timer og undersøkt på chlamydosporeproduksjon ved hjelp av de metodene som er beskrevet i eksempel 1 og ved de tidsintervaller som er angitt i tabell 3 nedenfor.

Som det kan sees ved undersøkelse av tabell 3 øket tilsetningen av ammoniumklorid chlamydosporeproduksjonen signifikant. Den optimale tiden for bestemmelse av chla-mydosporeproduks jonen var 24 timer.

Eksempel 4

Dette eksempel ble utført for å teste evnen hos miniatyrkarbohydratassimilasjonsmediene ifølge foreliggende oppfinnelse, utført ifølge fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, til å differensiere mellom Candida albicans og Candida stellatoidea.

De miniatyrsucroseassimilasjonsmedier som anvendes i foreliggende eksempel ble fremstilt ved å tilsette 20 g agar, 20 mg bromcresol-fiolett, 0,67 g gjærnitrogenbase og 4 ml 0,5 N natriumhydroxyd til 1 1 avionisert vann og justering av pH til ca. 7,2. Mediene ble sterilisert ved oppvarming til ca. 121°C ved 1,05 kg/cm<2>i 15 minutter og etter avkjøling, tilsettes forhåndssterilisert sucrose aseptisk for å gi en sluttsucrosekonsentrasjon på 1,0 Mediene ble så fordelt i ca. 5 ml's aliquoter til miniatyrskålene, som beskrevet ovenfor. Disse skålene kan lagres, ved hjelp av den metoden som er beskrevet i eksempel 1, i opptil åtte måneder uten tørking eller tap av farge.

Seks arter av Candida ble først dyrket på Sabouraud dextroseagar inneholdende gentamicin som beskrevet tidligere. Gjær ble tatt fra dette primære vekstmedium og suspendert i sterilt, avionisert vann og holdt i minst én time ved romstempertur for å forhåndssultce. Etter forhåndssulting ble suspensjonen omrørt og ved bruk av en steril pipette ble en til ca. tre dråper gjærsuspensjon plassert på overflaten av miniatyrsucrosemediet. Skålene ble så inkubert ved romstemperatur i fire til seks timer. Etter inkuberingsperioden ble skålene undersøkt på fargeforandring fra fiolett til gult, hvilket indikerer sucrose-assimilas jon. Skålene ble holdt ved romstemperatur i 24 timer og avlest en andre gang.

Resultatene av dette eksempel fremgår av tabell 4A. Candida albicans, Candida stellatoidea, Candida tropicalis, Candida krusei og Candida glabrata ga den korrekte assimila-sjonsrespons på miniatyrsucroseassimilasjonsskålene etter fem timers inkubering ved romstemperatur og bibeholdt den korrekte responsen i 24 timer. Candida parapsilosis viste imidlertid ikke en karakteristisk positiv reaksjon før etter 18 til 24 timer. Fra disse data er det tydelig at Candida albicans og Candida stellatoidea kan differensieres på fem timer.

For ytterligere å fortsette undersøkelsen av minia-tyrassimilasjon for andre karbohydrater vedoiden av sucrose, ble identiske forsøk utført hvor mediene ble fremstilt som beskrevet ovenfor, bortsett fra at 1 g av hvert sukker som er oppført i tabell 4B ble anvendt istedenfor sucrose for å gi et spesifikt sukkerholdig medium. Gjær ble inokulert,-utsådd og dyrket som beskrevet ovenfor og under-søkt på karbohydratassimilasjon ved den tid som er angitt i tabell 4B nedenfor.

Som vist i tabell 4B kan det riktige assimilasjons-mønster for hver art oppnås i løpet av 24 timer. Med Candida parapsilosis, var det en uoverensstemmelse med den positive sucroseassimilasjonen ved fem timer og de negative resultatene i det foregående forsøk som angitt i tabell 4A. Dette er et signifikant eksempel på stammevariasjon blant gjærstammer.

Eksempel 5

Dette eksempel ble utført for å teste evnen hos miniatyrureasemedier for å påvise nærvær av ureaseenzymet i forskjellige arter av Cryptococcus.

Miniatyrureaseskålene i foreliggende eksempel ble fremstilt ved å fremstille ureaagar ifølge produsentens instruksjoner, sterilisere ved oppvarming ved 121°C ved 1,05 kg/cm 2 i 15 minutter og så fordele.mediene i skålene som beskrevet i de foregående eksempler. Ved lagring som beskrevet i eksempel 1 forble igjen skålene stabile i opptil minst åtte måneder.

Skålene ble inokulert med fire arter av Cryptococcus og seks arter av Candida, ved å overføre ved hjelp av en steril bomullssvaber to til tre gjærkolonier fra et generelt vekstmedium som f.eks. Sabouraud-dextroseagar. To til tre gjærprøver av én enkelt art ble inokulert pr. skål og skålene ble inkubert ved 35°C i 24 timer.

Resultatene av dette eksempel fremgår av tabell 5. Cryptococcusartene var positive på en time og de andre gjærisolatene forble negative i 24 timer. En hydrolyse av urea frigjør ammoniumgass som er basisk og sprer seg raskt i hele mediet og forandrer mediets farge fra orange til rosa. En positiv organisme forandrer mediets farge i miniatyrskålen fullstendig i løpet av to til tre timer. Dersom mer enn én organisme er inokulert på miniatyrurease-skålen, må skålen derfor avleses mellom ca. en og to timer, ellers kan falske positive reaksjoner opptre.

Eksempel 6

Dette eksempel ble utført for å sammenligne ettex-inkuberingstilsetning av fargestoff for påvisning av karbo-hydratassimilas jon med konvensjonelle karbohydratassimila-sjonsmetoder. De karbohydratassimilasjoner som ble påvist ved etterinkuberingstilsetning av fargestoff ble utført i Microtiter-skåler og er derfor referert til som "Microtiter

karbohydratagarassimilasjon" i teksten og tabellene 6A og GB nedenfor.

De Microtiter karbohydratassimilasjonsmedier som ble anvendt i dette eksempel ble fremstilt ved L tilsette 20 g agar og 0,67 g gjærnitrogenbase til 950 ml avionisert vann. Blandingen ble omrørt med varme for å oppløse ingrediensene, justert til en pH på ca. 7,2 med 0,5 N NaOH, delt i åtte like deler, sterilisert ved 121°C ved 1,05 kg/cm<2>i 15 minutter og fikk deretter lov å kjøle seg ned til ca. 45 til 55°C. Så ble 6,25 ml av en 2%-ig, filtersterilisert karbo-hydratløsning inneholdende en av hver av de åtte karbohyd-ratene som er oppført i tabell 6A eller 6B nedenfor, aseptisk tilsatt til en av hver av de avkjølte løsningene. De 2%-ige karbohydratløsningene ble fremstilt ved tilsetning av 0,2 g karbohydrat til 10 ml avionisert vann og justering til en pH på ca. 7,0 med 0,05 N NaOH. Etter blanding ble 0,15 ml's aliquoter av karbohydratholdig medium sterilt fordelt i brønnene i en Microtiter-skål.

Den gjær som er oppført i tabellene 6A og 6B nedenfor, ble tatt fra skåler inneholdende et generelt gjærvekstmedium som beskrevet i eksempel 4 og suspendert i en konsentrasjon på McFarland nr. 8, ca. 10 8 organismer, i 1 x 10 — 5 M NaOH og holdt i ca. en time ved romstemperatur for forhåndssulting. Etter forhåndssulting ble suspensjonen omrørt og

0,02 ml's aliquoter ble aseptisk overført til hver medium-holdig brønn i Microtiter-skålen. Skålene ble dekket med et sterilt lokk og inkubert ved romstemperatur i 24 timer. Etter inkubering ble 0,02 ml's aliquoter av filtersterilisert - f argestof f løsning som inneholdt 20 ^urn bromcresol-fiolett pr. ml, tilsatt til hver brønn i Microtiter-skålene. Skålene ble avlest fem til ti minutter etter fargestoff-tilsetningen på en forandring fra fiolett til gul farge, hvilket indikerer positiv assimilasjon av karbohydrat.'

Resultatene av Microtiter karbohydratagarassimila-sjonene er angitt i tabellene 6A og 6B nedenfor, hvor dataene er sammenlignet med rapporter for konvensjonelle metoder angitt i The Yeasts av Lodder og A.P.I. 20C Strip. De konvensjonelle metodene omfatter Wickerham væske-, Saito-agar- og auxanografisk -teknikk.

Som vist i tabell 6A ovenfor er det god korrelasjon mellom Microtiter karbohydratagarassimilecjwnstesten og de publiserte resultatene fra konvensjonelle Wickerham væske-, Saito-agar- og auxanografisk-metodene. Visse karbohydrat-reaksjoner med Cr. neoformans og Cr. albidus krever imidlertid undersøkelse.

Som-vist i tabell 6B ovenfor er det en totalt sett god korrelasjon mellom Microtiter karbohydratagarassimila-sjonstest og A.P.I. 20C Strip-metoden.

Eksempel 7

Dette eksempel ble utført for å teste virkningen av et øket forhold mellom overflatearealet til organismene og mediets volum på tiden til bestemt resultat ved karbohydrat-assimilas jon . En måte å påvise effekten av nevnte økede forhold er å holde overflatearealet og mikrobielt inoculum konstant mens volumet varieres, her uttrykt som mediedybde, i en gitt testskål eller -glass.

Tre forskjellige beholdere ble brukt for å undersøke virkningen av forholdene mellom overflatearealet og volum på tiden før bestemt resultat: miniatyrdyrkningsskålene ifølge foreliggende oppfinnelse, standard 100 x 15 mm petriskåler og standard 16 x 125 mm flatbunnede dyrkningsrør. De teoretiske grenser for forholdet mellom overflatearealet og volum som anvendes i en gitt beholder vil fastsettes av de dimensjoner som er nødvendige for å synliggjøre fargeforandringen som forårsakes av positiv karbohydratassimilasjon og en minimal dybde som er nødvendig for å forebygge tørking av mediet.

Sucroseassimilasjonsmedium fremstilt som beskrevet i eksempel 4 ovenfor ble aseptisk helt i hver av beholderne i dybde som er vist i figur 13.

Candida albicans, testorganismen, ble først dyrket på Sabouraud-dextroseagar inneholdende gentamicin, som tidligere beskrevet. Gjærprøver ble tatt fra dette primære vekstmedium og suspendert i sterilt avionisert vann og holdt i minst en time ved romstemperatur for forhåndssulting. Etter forhåndssultingen ble suspensjonen omrørt og ved hjelp av en steril pipette ble en til ca. tre dråper gjærsuspensjon plassert på overflaten av hv^-r miniatyr^kål og dyrk-ningsrør inneholdende sucrosemedium og tre endråpes inoku-leringer av gjær ble plassert på hver 100 x 15 mm petriskål inneholdende sucrosemedium. Skålene og rørene ble så inkubert ved romstemperatur i ikke mer enn 12 timer. Hver skål eller-hvert rør med dybde som spesifisert i diagrammet i figur 3, ble kjørt som duplikat. Positive reaksjoner, som angir sucroseassimilasjon, ble bestemt ved en tydelig fargeforandring fra fiolett til gult ved de etterinokulerings-tidsintervaller som er vist i diagrammet i figur 13, angitt som "tid til bestemt resultat" i timer.

Resultatene fra dette eksempel er vist i diagrammet i figur 13. Dette eksempel bekrefter at ved et mediumdybde-område på 2 til 2,5 mm omtrent 4 til 5 ml medium pr. skål, i miniatyrskålene (0-0), er tiden til bestemt resultat for sucroseassimilasjon ved Candida albicans fra ca. fire til fem timer. Selv om det kan sees en forandring i tiden til bestemt resultat med økende dybde eller volum ved et konstant overflateareal av organismer i miniatyrskålene, sees den mest dramatiske effekten av øket mediumdybde eller

-volum ved et konstant overflateareal av organismer, i standard 100 x 15 mm petriskålene (A -A). I tillegg er mediedybden i standard petriskålen typisk 5 mm, tilsvarende 18 til 20 ml medium pr. 100 x 15 mm skål, som er vist å gi

en ca. ti timers tid til bestemt resultat for Candida albicans i sucroseassimilasjonstesten. Videre foretrekkes ikke mediumdybder på 3 mm eller mindre i 100 x 15 mm petriskålene, på grunn av mulige problemer med tørking under lagring. Den lengre tid til bestemt resultat som kan sees i de 16 x 125 mm flatbunnede dyrkningsrørene ( m-~ m) antas å være forårsaket av problemer med oxygenspenning skapt av de lukkede omgivelsene til dyrkningsrørene sammenlignet med det åpne systemet i skålene.