NO833756L - Adenocarcinombeslektede nye antigendeterminanter og antistoffer spesifikke for disse, fremgangsmaate ved fremstilling og reagenssystemer i forbindelse med dem - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører adenocarcinoma-beslek-tede nye antigen-determinanter, antistoffer som er spesifikke for disse og fremgangsmåter for diagnosen av adenocarcinomas hos mennesker basert på påvisning av antigen-determinantene i biologiske væsker, i.vevsekstrakter eller snitt og in vivo på tumorcellene eller massene.

Oppfinnelsen vedrører også bruk av spesifikke antistoffer

i terapien av adenocarcinomas for å transportere anti-kreftmidler eller andre cytotoksiske midler til tumorcellene eller -massene. Det er kjent at ved tumorpatologi er det mulig å isolere fra selve tumormassene eller fra de biologiske væsker, substansene som henger sammen med disse

patologier. Mange av disse substanser har antigene egen-skaper som er sterkere på dyr enn på mennesker; noen av dem,

i alminnelighet kalt "tumor-markøre.r"(er oncofetale antigener. Tilstedeværelsen av et antigen som er fastslått å hovedsakelig å ha sammenheng med adenocarcinomas, og spesielt med deres metastaser, er påvist av Gold et al., J. Expt. Med. 121: 439-462 (1965). Dette antigen som kalles carcinoembryonisk antigen (CEA) kan måles både i biologiske væsker og i vevsekstrakter eller snitt ved forskjellige kjente metodikker, f.eks. slike som er beskrevet i US-patentene nr. 3.663.684 og 3.697.638; Ann. of Clin.

and Lab. Science A, 5, 357 , 1974 ; Clin. Chem. !L9, 10, 1973;

Cancer 34:1504-1509, 1974; Clin. Res. 19:143, 1971; Proe. Nati. Acad. Sei. USA 64:161-167, 1969; Cancer 37:62-81, 1976; Scand. J. Immunol., Vol.. 7 Suppl. 6, 1978; Cancer 45:1243-1247, 1980, og J. Nati. Cancer Inst. 57, 1, 1976.

De tallrike studier av disse forhold omfatter f.eks. ovennevnte referanser, men har vist en meget lav spesifisitet for CEA ettersom dette bare ikke er påvist i tilfeller av tumorpatologier, men også i nærvær av forskjellige, dvs. ikke-tumorale patologier, såsom f.eks. mange nedbrytende-inflammatoriske prosesser, og selv hos friske donatorer. Videre har biologiske studier [Urba R., Alpert E., Issel-bacher K.J., Proe. Nati.Acad.Sei. U.S.A. 72, 4602-6 (1975)]

! I

vist forskjeller mellom CEA'er oppnådd fra forskjellige laboratorier, og følgelig oppnås forskjellige kliniske resultater når de samme teknikker brukes med materialer av forskjellig opprinnelse.

Det er nå funnet at det er mulig å fremstille fra menneske-adenocarcinoma-metastaser, såvel som fra alle humane adenocarcinomas, f.eks. gastriske, bryst- og tyroide ade-nocarcinoms, antigene determinanter (K), som er "spesifikke" overfor adenocarcinomas og antigen-determinanter (P ), som har "forbindelse" med K-determinantene på adenocarci-nornas. Skjønt P antigen-determinantene viser en meget sterk kryssreaksjon med antigen-determinantene (P<n>), som foreligger i plasma eller serum hos normale donatorer, viser ikke K antigen-determinantene noen kryssreaksjon med P<n>antigen-determinantene. Blandingen av disse antigen-dé-terminanter K og P og, kanskje, noen andre ukjente antigener, er det som tidligere var kjent som CEA.

Ved å bruke de ovenfor nevnte antigen-determinanter K og k n

antigen-determinanter P og P erholdes spesifikke antistoffer anti-K, anti-P k og anti-P n ifølge foreliggende oppfinnelse.

Bruken av antigen-determinantene K og P og av antistoffene anti-K og anti-P som er spesifikk for disse i de kjente im munologiske metoder, slik som f.eks. radioimmunologisk måling, enzymimmunologisk måling, immunofluorescens, immuno-luminescens og meget annet, gjør det mulgi å påvise og kvantifisere utelukkende de antigen-determinanter K som er spesifikke overfor adenocarcinomas, uten forstyrrelser som stammer fra antigen-determinantene P<n>i det normale plasma eller serum, eller, om ønsket, slike antigen-determi nanter P^ som har sammenheng med K-determinantene på adenocarcinomas. Forannevnte bestemmelse kan utføres enten kvalitativt eller kvantitativt eller semi-kvantitativt.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer derfor en forbed ret fremgangsmåte for diagnosen av menneskelige adenocar- ' cinomas gjennom bestemmelsen av adenocarcinoma forbundet antigen-materiale, enten i en prøve tatt fra et menneske, f.eks. in vitro.på biologiske væsker eller vevsekstrakter eller snitt, eller in vjvo på tumorceller eller -masser, hvor forbedringen består i at man bestemmer, ved hjelp av spesifikke anti-K eller anti-P antistoffer, utelukkende slike antigen-determinanter K som er spesifikke overfor adenocarcinomas uten å vise P<n>antigen-determinantene til de normale celler, eller henh., slike antigen-determinanter P ksom er knyttet til K determinantene på adenocarcinomas. Således reduseres falske positive resultater.

Uttrykket "antigen-determinanter K" betyr antigen-determinanter, som som allerede nevnt er spesifikke overfor adenocarcinomas og som ikke viser noen kryssbinding med P<n>anti gendeterminantene til de normale celler, og bare gjen-kjennes av antistoff er som er spesifikke overfor dem, dvs. anti-K-antistof f er : denne definisjon innbefatter enhver CEA-antigenblanding, hvori antigen-determinantene som er forskjellige fra K-ene er blitt fullstendig eller i det vesentlige fjernet.

Uttrykket 'antigen-determinanter P " betyr antigen-determinanter som foreligger på adenocarcinoma-cellene i "forbindelse" med, dvs. sammen med, antigen-determinantene K som e spesifikke overfor adenocarcinomas, hvilke P k antigen-determinanter som allerede nevnt viser kryssreaksjon med P<n>antigen-determinantene til de normale celler: denne definisjon innbefatter alle CEA antigen-blandinger, hvor antigen-determinantene som er forskjellige fra P k-ene er fullstendig eller i det vesentlige fjernet.

P<n>antigen-determinantene er, som allerede nevnt, antigen-determinanter som er tilstede i det normale plasma eller serum og kryssreagerer med P antigen-determinantene.

Et anti-K antistoff er enten et antistoff som erholdes j ved immunisering av dyr med de ovenfor nevnte K antigejn- determinantene, eller alle anti-CEA antistoffer (dvs. an- ' tistoffet som produseres ved immunisering av dyr med CEA) modifisert på en slik måte at antistoffpunktene som er forskjellige fra anti-K-ene er blitt deri fullstendig eller hovedsakelig mettet med antigen-determinanter som"er spesifikke overfor dem.

På lignende måte er etanti-P kantistoff enten et antistoff erholdt ved immunisering av dyr med ovennevnte P k antigen-determinanter, eller alle anti-CEA antistoffer modifisert på en slik måte at andre antistoffpunkter enn anti. -P k'ene er deri blitt fullstendig eller i det vesentlige mettet med spesifikke antigen-determinanter overfor dem.

Overalt i foreliggende beskrivelse betyr uttrykket antistoff (er) immunoglobuliner og immunoglobulin-fragmenter og kan også bety det tilsvarende antiserum.

Videre, med mindre annet er angitt, betyr uttrykket antistoff et polyklonalt antistoff; når et monoklonalt antistoff er ment, er dette angitt.

To alternative fremgangsmåter tilveiebringes ved foreliggende oppfinnelse for fremstilling av anti-K antistoffer overfor K antigen-determinantene.

Ifølge én fremgangsmåte fremstilles anti-K antistoffer ved å absorbere antistoffer fremstilt mot en blanding av K og P<k>antigen-determinanter med P<n>eller P<k>antigen-determinanter slik at de P k immunologiske bindingspunkter mettes på antistoffene. Ifølge den andre fremgangsmåte fremstilles anti-K antistoffer ved: 1) immunisering av dyr med P n eller P k antigen-determi- n k nanter under dannelse av anti-P eller anti-P antistoffer; 2) ' rensning av en blanding av antigen-determinanter K og P<k>ved hjelp av anti-P<n>eller anti-P^ antistoffer fremstilt ifølge 1), under dannelse av K antigen-determinanter; og I.. I 3) immunisering av dyr med K antigen-determinanter erholdt ifølge 2) .

Oppfinnelsen omfatter i tillegg til de anti-K spesifikke antistoffer som erholdes ved de to forannevnte alternative fremgangsmåter, også K antigen-determinantene fremstilt ifølge trinn 2) av den andre alternative beskrevne fremgangsmåte ovenfor, og videre P k og P n antigen-determinan-k n

tene og anti-P og anti-P antistoffer som er spesifikke for dem, hvilke inngår i de ovennevnte fremgangsmåter.

Også de markerte former, f.eks. radiomarkerte, enzym-markerte eller fluorescens-markerte former av de ovenfor nevnte

kn'

K7P og P antigen-determinanter og av de tilsvarende anti-k n

K, anti-P og anti-P antistoffer omfattes av rammen av foreliggende oppfinnelse.

Ifølge den første forut beskrevne metode for fremstilling av anti-K antistoffer, injiseres blandingen av antigen-determinanter K og P i et dyr, f.eks. en geit, en sau eller en kanin, etterfulgt av de vanlige og kjente immuniserings-metoder, f.eks. i form av en emulsjon i Freund's adjuvant, hvilke gi anti-K/P k antiserum. Dette fjernes ved å la dyret blø ved vanlige teknikker og absorberes deretter, f.eks. gjennom inkubasjon med P n eller P k antigen-determinanter. Inkubasjon utføres generelt mellom romtemperatur og ca.

50°C, fortrinnsvis ca. 37°C, over et tidsrom varierende fra 1 til 5 dager, fortrinnsvis i ca. 3 dager. Normalt menneskeplasma kan brukes i stedet for Pn antigen-determinanter da som allerede nevnt normalt menneskeplasma inneholder P<n>antigen-determinanter. Indikerende kan f.eks. 0,1 ml geiteserum inkuberes ved 37°C i 3 dager med 324 ml av

n k

en PBS-løsning inneholdende P eller P antigen-determinanter ved en konsentrasjon på ca. 50 y/ ml eller alternativt, med ca. 50 ml normalt menneskeplasma. På slutten av inku-basjonen sentrifugeres materialet og supernatanten anvendes som sådan, eller eventuelt, etter ytterligere fortyn-j ning/rensning/stabiliseringsbehandlinger, som det anti-K

spesifikke antistoff. Ifølge den andre ovenfor beskrevne metode for fremstilling av anti-K antistoff eller antisera,

n k

injiseres P eller P antigen-determinanter, f.eks. i form av en emulsjon i Freund's adjuvant, i et dyr, f.eks. en geit, en sau, eller en kanin, etterfulgt av vanlige immu-niseringsmetoder, under dannelse av anti-P n eller anti-P<k>antisera, som gjenvinnes ved blodtapping av dyret på vanlig måte også.

Immunoglobuliner ekstraheres fra antiserummet; hvis ønsket, ved kjente metoder.

Rensningen av K og P kantigen-determinantblandingen ved

n k

hjelp av anti-P eller anti-P 'antistoffer som gir K antigen-determinantene kan utføres ifølge kjente metoder. En anvendelig teknikk kan f.eks. være immunoaffinitet eller bioabsprpsjon, kromatografi som er basert på den immunologiske reaksjon mellom et antigen og et antistoff bundet til en inert bærer.

Således elueres f.eks. en løsning, f.eks. en PBS-løsning av K og P k antigen-blandingen gjennom en harpiks, f.eks.

k "Sepharose 4B", hvortil er bundet anti-P eller anti-P antistoffer. K antigen-determinantene gjenvinnes således i den ikke-bundne fraksjon.

Anti-K antiserum produseres så ved å injisere de således erholdte K antigen-determinanter i et dyr, f.eks. av de ovenfor angitte arter ifølge vanlige metoder, f.eks. slike som er forut beskrevet i denne beskrivelse.

Blandingen av antigen-determinantene K og P som anvendes ifølge de ovenfor beskrevne fremgangsmåter for fremstilling av anti-K antistoffer erholdes ved ekstraksjon fra primære eller metastatiske adenocarcinoma-vev, f.eks.

fra hepatiske metastaser, eller fra biologiske væsker av pasienter med adenocarcinoma.

I

Ekstraksjon kan utføres ved kjente metoder og, hvis adeno-' carcinoma-vev brukes, krever disse homogenisering forut;

generelt oppnås homogenisering med X Press (LKB).

Ekstraksjon kan så utføres med alle egnete løsningsmidler, fortrinnsvis et glykoproteinløsningsmiddel, som f.eks. kan være perklorsyre, trikloreddiksyre, fosfowolfram-syre, et alkalimetallhalogenid, f.eks. kaliumklorid; feno1-etanol-blandinger; nøytrale, kationiske eller anioniske detergen-ser som f.eks. SDS, DOC, CPC, Triton X 100, Nonidet P4Q, og lignende.

Fortrinnsvis anvendes ekstraksjonsløsningsmidlet i samme

volum som homogenisatet eller biologisk væskevolum, og det " er fortrinnsvis konsentrert syre, f.eks. med en konsentrasjon fra ca. 0,5 N til ca. 2 N:2N perklorsyre er et spesielt foretrukket ekstraksjonsmiddel. Alle temperaturer under værelsestemperatur er velegnet for ekstraksjonsproses-sen selv om en temperatur, f.eks. på ca. 4°C, generelt fo-retrekkes. Ekstraksjonstidene varierer normalt fra ca. 10 minutter til ca. 1 time.

Etter ekstraksjon frafiltreres presipitatet eller sentrifugeres og supernatanten kan dialyseres og renses. Mange ' kjente rensesystemer kan tilpasses basert på forskjellige prinsipper. Således kan f.eks., avhengig av de elektriske ladningsforskjeller, ionebytterharpikser, såsom f.eks. "DEAE Sephadex", "Sephacel" eller CM cellulose, eller "QAE Sephadex", eller "SP Sephadex" brukes for rensning.

På grunnlag av molekylvekt og hydrodynamiske volumforskjel-ler, kan kromatografiske teknikker, såsom f.eks. gelfiltrering og HPLC følge.

Høyere renhetsgrader kan oppnås på basis av forskjellene i den elektroforetiske vandring og i det isoelektriske punkt: Således kan elektroforeseteknikker anvendes såsom f.eks. preparativ elektroforese på inert bærer, f.eks. "Sephadex" polyakrylamidgel og lignende, eller plate- eller kolonne-isoelektrofokusering.

På basis av det glycidiske innhold kan en ytterligere ren-hetsgrad oppnås ved bruk av forskjellige lektiner bundet til harpiksene, f.eks. "Sepharose 4B".

P<n>antigen-determinantene som skal brukes i de ovenfor beskrevne fremgangsmåter for å fremstille anti-K antistoffer, kan erholdes fra normalt menneskeplasma ifølge konvensjo-nelle ekstraksjons- og rensemetoder.

Således kan f.eks. normalt menneskeplasma ekstraheres med, f.eks. samme volum perklorsyre eller med ethvert annet egnet løsningsmiddel, såsom f.eks. ett av de ovenfor angitte for ekstraksjonen av K/P antigen-blandingen fra adenocarcinoma-vev,og lignende ekstraksjonstemperatur og tid kan også brukes. Ekstraksjonsproduktet kan deretter dialyseres på vanlig måte og renses ved kjente teknikker, f.eks. ved immunoaffinitet med antistoffer spesifikke overfor P<n>determinantene, f.eks. ved immunoaffinitetkromatografi mot anti-K/P k antistoffer eller mot anti-P k antistoffer eller mot anti-P<n>antistoffer. Antigen-determinantene P<n>er slik bundet til antistoffene og løsnes fra disse ved kjente metoder, f.eks. ved anvendelse av tiocyanat eller urea eller propionsyre, ifølge vanlige metoder [J.W. Eveleigh, D.E. Levy, J. of Solid Phase Biochemistry, 2, 45, 1977].

P k antigen-determinantene som, om ønsket, kan inngå i de ovennevnte prosesser for fremstilling av anti-K antistoffer kan-f.eks. erholdes fra blandingen av antigen-determinantene K og P . Denne blanding ekstrahert f.eks. fra adenocarcinoma-vev som forut beskrevet, kan f.eks. bioabsorpsjons-kromatograferes ved eluering, f.eks. en løsning derav, f. eks. en PBS løsning, gjennom en harpiks, f.eks. "Sepharose 4B" hvortil anti-P<n>antistoffer er bundet.

P k antigen-determinantene blir som en følge av deres kryssreaksjon med P<n>antigen-determinantene bundet til harpiksen som bærer anti-P<n>antistoffer og løsnes så fra denne på vanlig måte,f.eks. ved hjelp av tiocyanat eller urea ifølge vanlige metoder som ovenfor beskrevet.

Innholdene eller rensningsgraden av antigénmaterialet, dvs.

kn k

K, P og P antigen-determinantene og K/P antigenblandinger styres enten radioimmunologisk eller immunokjemisk på

k n

basis av deres K og P eller T immunologiske aktivitet, ifølge vanlige metoder. Således kan f.eks. en radioimmunologisk kontroll av K-determinantinnholdene til en antigen-materiale utføres ved måling av den inhibering som dannes av dette materiale mot bindingskapasiteten til et RIA

]_25 125 k I-K—*> anti-K system. Analog kontroll mot et RIA I-P —kanti-pk" system eller henholdsvis mot et RIA -^2^i-pn—> an-ti-P<11>system gjør det mulig å måle Pk eller henholdsvis P<n>innholdene av et antigen-materiale.

Anti-P n antistoffene og anti-P kantistoffene oppnåes ved kjente immuniseringsteknikker, f.eks. det som forut beskre-iv

vet for fremstilling av anti-K/P antiserum og antistoffer.

Ifølge oppfinnelsen kan monoklonalt anti-K, anti-P og an-ti-P<11>antistoffer fremstilles mot en enkelt K, P^ eller P<n>antigen-determinant ved å følge kjente fremgangsmåter som generelt brukes for å fremstille monoklonale antistoffer, f. eks. den kjente hybridoma-teknikk som f. eks., er beskrevet av Kohler C. and Milstein Ci Nature 256 , 495-497, 1975 . Ifølge oppfinnelsen kan alle kjente metoder for bestemmelse av et antigen, f.eks. enhver immunologisk målemetode, f. eks. radioimmunologisk måling (RIA), eller enzymatisk immunologisk måling (EIA) eller immunofluorescens eller immu-noluminescence , eller immunodiffisjon eller immunoelektro-forese anvendes for å vise eller kvantifisere antigen-determinantene K som er spesifikk overfor adenocarci-nornas eller om ønsket antigen-determinantene P ksom er knyt-ji tet til K determinantene på adenocarcinomas.

i<-1>J

Anvendelsen av en eller flere antigen-determinanter K, P<k>og K/P k antigenblandinger enten ikke markert eller i deres markerte form, og av de tilsvarende enten ikke markerte eller markerte antistoffer i hvilken som helst av de ovenfor nevnte kjente metoder gjør det mulig å stille en tidlig diagnose av slike tumorale patologier hos mennesker som er kjent som adenocarcinomas.

Et markert antigen, eller antigen-determinant eller antigenblanding eller antistoff er henholdsvis et antigen eller antigen-determinant eller antigenblanding eller antistoff som er blitt markert ved hvilket som helst markerings-system, og dette kan f.eks. være en radioisotop , et enzym eller en fluorescerende eller luminescerende substans. For markeringen kan alle kjente og vanlige beskrevne fremgangsmåter, f.eks. for markering av antigener^ følges.

For å markere f.eks. med 125 I eller<131>I radioisotoper kan kloramin T eller laktoperoksydase (LPO) teknikker [Nature 194, 495, 1962 og henh. Bioch. Bioph. Acta 251, 363, 1971] eller modifikasjoner derav følges, og alternativt Bolton og Hunter's reagens [Biochem. J. 133, 529 , 1973] kan også brukes.

For å markere f.eks. med et enzym kan de teknikker som er beskrevet i FEBS Letter 95, 311, 19 78 eller i J. Histochem. Cytochem. 22, 1084, 1974 brukes.

Når en radioimmunologisk målemetode (RIA) brukes,for diagnosen av adenocarcinomas kan enhver kjent RIA teknikk [se f.eks. Clin. Chem. 19: 146, 1973] anvendes. Således kan f. eks. antigen-determinantene K som er spesifikke overfor adenocarcinomas eller antigen-determinantene P k som har tilknytning til dem på adenocarcinomas kvantifiseres i f.eks. en biologisk væske eller vevsekstrakt ved å få dem til å konkurrere med en kjent mengde radioisotop-markert, f.eks.

<125>I eller<131>I radiojodert, K eller henholdsvis P<k>anti<g>en-j. determinanter eller K/P antigenblanding, for reaksjon med

en begrenset mengde av anti-K eller henholdsvis anti-Pk antistoffer. Konkurransereaksjonen kan utføres på vanlig måte, f.eks. ved inkubering ved en temperatur fra ca. 4°C til ca. 40°C, -fortrinnsvis ved romtemperatur, i et tidsrom varierende omtrent fra 6 til 90 timer, fortrinnsvis i ca. 15-16 timer.

Antigenfraksjonen bundet til antistoffene skilles så fra den ikke-bundne fraksjon, og radioaktiviteten måles i den bundne og/eller ikke-bundne fraksjon.

Adskillelsen av den bundne antigenfraksjon fra den ikke-bundne kan utføres ved kjente metoder, f.eks. ved anvendelsen av. spesifikke antistoffer overfor immuncglobulinene av de arter hvor de første antistoffer;dvs. anti-K eller anti-P<k>antistoffer er blitt dannet. Radioaktiviteten i den bundne og ikke-bundne fraksjon kan måles ved hjelp av en stan-dardkurve merket f.eks. med standard K eller standard P , eller direkte måle det eventuelle fall i bindingsevnen til det radioaktivt markerte K eller P k eller K/P k med anti-K eller anti-P k antistoffene, og således,f.eks. en reduksj•on av radioaktivitet målt på den bundne fraksjon er proporsjonal med K eller P konsentrasjonen til prøven.

Når en enzymatisk immunologisk målemetode brukes for diagnosen av adenocarcinomas kan enhver kjent immunologisk metode som anvender en enzymmarkering anvendes, f.eks. metodene beskrevet i J. Immunology 109, 129, 1972.

Skjønt mange enzymer kan brukes med hell som markører, er spesielt foretrukne enzymer f.eks. peroksydase, 3~galaktosidase, alkalifosfatase og glukoseoksydase.

Således kan f.eks. ifølge en mulig enzymatisk immunologisk målemetode antigen-determinantene K eller P i en prøve fra biologiske væsker eller vevekstrakter kvantifiseres

ved en EIA sandwich-type metode hvor prøven bringes til å

: ! rk eagere, f.eks. ved inkubering med anti-K eller henh. aInti-P antistoffer som enten er kjemisk bundet eller passiyt

absorbert på en fast bærer, f.eks. polystyrenkulerV Etter eliminering av overskuddsreagens ved vasking, tilsettes

jv enzymmarkert anti-K eller henholdsvis anti-P antistoffer såsom f. eks. (3-galaktosidase markerte antistoffer fremstilt ifølge fremgangsmåten som er beskrevet i FEBS Letters 95, 311-313, 1978. Etter ytterligere vaskinger tilsettes det riktige enzymatiske substrat, f.eks. o-nitro-feny 1-galaktopyranosid hvis (3-galaktosidase brukes som enzymmarkør, og fargen som dannes måles, idet dens inten-sitet er proporsjonal med konsentrasjonen av K eller

•henholdsvis P k antigen-determinantene i prøven.

For den histokjemiske applikasjon kan enhver kjent immunohistokjemisk metode [Human Pathology 12, 590-596, 1981] brukes for å lokalisere nærværet av antigen-determinantene K eller P på de histologiske preparater ved hjelp av anti-K eller anti-P spesifikke antistoffer ifølge oppfinnelsen. Den histologiske bestemmelse kan utføres på frosne eller rutinemessig fikserte og innstøpte vevsnitt ifølge vanlige metoder.

Således kan f.eks. snitt inkuberes ved romtemperatur i en vandig puffer med anti-K eller henholdsvis anti-P<k>. antistoffer slik at anti-K eller henholdsvis anti-P antistoffene vil feste seg til de punkter hvor K eller henholdsvis P v antigen-deter inantene foreligger. De bundne antistoffer måles så ved påfølgende reaksjon, f.eks. inkubering med markerte antistoffer som er spesifikke overfor immunoglobulinene til de arter hvor anti-K eller an-ti-P første antistoffer er blitt dannet.

De markerte antistoffer kan fremstilles ifølge kjente metoder som bruker kjente markører såsom f.eks. enzymer, f.eks. peroksidase, 3-galaktosidase, alkalisk fosfatase, glukoseoksi-dase, enzym-antienzymkomplekser, f.eks. PAP peroksidase-antiperoksidasekompleks; fluorescente molekyler, f.eks. fluorescein eller rodamin; eller Biotin-Avidin systemer hvor Avidin igjen er bundet til et enzym eller til en fluorescerende substans, f.eks. av den ovenfor nevnte art.

Den avsluttende mikroskopiske analyse av det histologiske preparat vil vise de punkter hvor de ettersøkte K eller P<k>antigendeterminanter er tilstede, og fluorescerende punkter vil observeres når en fluorescerende markør inngår, mens fargepunkter vil observeres når en enzymmarkør og et kromogent substrat som er spesifikt for dette brukes i bestemmelsen.

Et spesielt anvendelige system for den histokjemiske påvisning av K eller P k antigendeterminanter på vevsnitt innebefatter 3-galaktosidaseenzymet som markør og et indolyl-galaktosid, f.eks. 5-brom-4-klor-indolyl-galaktosid som det enzymatiske kromogene substrat, og immuno-galaktosidase-teknikken som er beskrevet f.eks. i Histochemistry 76, 153-158, 1982, kan f.eks. følges for sådann bestemmelse.

Som tidligere nevnt imidlertid kan ved siden av det ovenfor omtalte immunologiske målemetoder/enhver annen immunologisk metode brukes ifølge oppfinnelsen for å påvise nærvær av adenocarcinome spesifikke K antigendeterminanter eller til-knyttede P antigendeterminanter i biologiske væsker eller vevsekstrakter eller snitt.

Som allerede nevnt tilveiebringer oppfinnelsen i tillegg

til diagnosemetodene for menneskeadenocarsinomer også reagenssystemer for utførelse av disse metoder.

Selv om forskjellige reagenssystemer tilveiebringes for I forskjellige analytiske metoder, inneholder et reagenssystem :for påvisning av K-antigendeterminanter alltid som essensiell bestanddel et anti-K spesifikt antistoff, et reagenssystem for påvisningen av P antigendeterminantene inneholder som en vesentlig bestanddel et anti-P antistoff. Hver av disse reagenssysterner inneholder i tillegg andre bestanddeler som kan variere fra et reagenssystem til et annet avhengig av den analytiske metode reagenssystemet er tiltenkt for,

og disse ytterligere bestanddeler kan f.eks. velges fra markerte K eller P k antigendeterminanter, markerte K/P k antigenblandinger, markerte anti-K eller anti-P kantistoffer eller markerte antistoffer som er spesifikke for immunoglobuliner av de typer hvor anti-K eller anti-P kantistoffene har oppstått.

Videre kan andre bestanddeler, enten fakultative eller ikke,, ""foreligge i reagenssystemet ifølge oppfinnelsen såsom f.eks. et bindingsfritt separasjonssystem, kontroller, standarder, puffere, stabiliseringsmidler, antimikrobielle midler, tensioaktive substanser, enzymsubstrater og aktivatorer.

Således kan f.eks. for en radioimmunologisk målemetode for påvisning av K eller P jv antigendeterminanter i biologiske væsker eller vevsekstrakter ifølge RIA fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor i denne oppfinnelse et anvendelig reagenssystem være et sett hovedsakelig inneholdende: 1) anti-K elier henholdsvis anti-P k antistoff; 2) radioaktivt markert K eller henholdsvis P antigendeterminanter eller, som alternativ, en radioaktivt markert K/P antigenblanding;

3) kontroller; og

4) puffere.

Dette sett kan ytterligere inneholde et annet antistoff spesifikt overfor immunoglobulinene av de arter hvori anti-K eller henholdsvis anti-P kantistoffer til bestanddelen 1) er blitt dannet, og eventuelt tensioaktive substanser og/.

eller stabiliserings- eller antimikrobielle midler.

k k

De radioaktivt markerte K eller P eller K/P i sett kom-

k k ponent 2) kan f.eks. være K eller P eller K/P markert med "*"2^J eller "'"^"'"J radioisotop.

Kontrollene 3) innebefatter minst en negativ kontroll og

en positiv kontroll og pufferene 4) kan inneholde enhver puffer med f.eks. en pH mellom ca. 6,5 og 8, fortrinnsvis ca. 7,2.

Tensioaktive substanser kan f.eks. være "Tween 20" eller "80" "Nonidet P4Q", "Triton X100" o.l. --Stabiliseringsmidler kan f.eks. være kvegserumalbumin, gelatin o.l.

Et antimikrobielt middel kan f.eks. være natriumazid.

Puffere kan f.eks. være fosfatpuffere, eventuelt blandet med uorganiske salter såsom f.eks. natriumklorid.

I et spesielt foretrukket trekk inneholder et sett for

RIA påvisning av K eller<pk>antigendeterminanter:

1) et anti-K eller anti-p'c antistoff dannet i geit, korrekt fortynnet i en blanding av - f osf atpuf f er med en pl-l mellom ca. 6, 5 og 8 , fortrinnsvis ca. 7,2, en molarkonsentrasjon mellom ca. 20 imM og ca. 150 mM, fortrinnsvis 70 mM; - natriumklorid i en molar konsentrasjon mellom ca. 20 mM og 150 mM, fortrinnsvis ca. 70 mM;

- EDTA dinatriumsalt i en'molar konsentrasjon mellom ca.

25 mM og ca. 50 mM, fortrinnsvis ca. 33 mM;

i, i natriumazid i en molar konsentrasjon mellom ca. 15 mMj og

ca. 50 mM, fortrinnsvis ca. 31 mM, og

- geitenormalserum med en volum:volum konsentrasjon mellom

ca. 0,05% og 0,5%, fortrinnsvis ca. 0,1%; 2) en referansepuffer (som skal brukes for å bestemme den maksimale bindingskapasiteten til antistoff til radioaktivt markert antigensystem) omfattende:

- fosfatpuffer med pH mellom ca. 6,5 og 8, fortrinnsvis

ca. 7,2, og en molar konsentrasjon mellom ca. 20 mM og

150 mM, fortrinnsvis ca. 70 mM;

- natriumklorid ved en molarkonsentrasjon mellom ca. 20 mM

og ca. 150 mM, fortrinnsvis ca. 70- mM;

- natriumazid i en molar konsentrasjon mellom ca. 15 mM og

50 mM, fortrinnsvis ca. 31 mM; og

- kvegserumalbumin i en vekt til volumkonsentrasjon mellom ca. 0,1% og 1%, fortrinnsvis ca. 0,4%;

3) en markert tracer omfattende:

12 5 k k J radiojodert K eller P antigendeterminanter eller K/P antigenblanding, fortynnet i referansepufferen 2) til en konsentrasjon på 1,5 mg/ml med en spesifikk aktivitet på ca. 60 mCi/mg 4) et utfellende antiserum anti-geit-immunoglobulin, riktig fortynnet i referansepufferen 2); 5) en negativ kontroll: menneskeplasma negativt overfor forsøket dvs. normalt menneskeplasma; og 6) en positiv kontroll: menneskeplasma positivt overfor prøven, dvs. menneskeplasma fra en pasient med adenocarcinoma eller normalt menneskeplasma hvortil en kjent mengde

k k

K eller P antigendeterminanter eller K/P antigen-blanding i er tilsatt.

i i

For en enzymatisk immunologisk målemetode for påvisning av K eller P k antigendeterminantene i biologiske væsker eller vevsekstrakt ifølge EIA sandwich-type metoden som foran er beskrevet i denne beskrivelse, kan ét reagenssystem brukes hovedsakelig inneholdende f.eks.: 1) anti-K eller henholdsvis anti-P antistoffer bundet til en fast fase; 2) enzym konjugert anti-K eller henholdsvis anti-P antistoffer; 3) et enzymatisk substrat;

~4) kontroller; og

5) puffere.

Det ovenfor nevnte reagenssystem kan ytterligere inneholde andre bestanddeler såsom f.eks. et blokkeringsmiddel for den enzymatiske reaksjon cg videre som allerede nevnt tensioaktive substanser, stabiliseringsmidler, antimikrobielle midler, enzymaktivatorer o.l.

Anti-K eller anti-P antistoffene i bestanddelen 1) kan f.eks. absorberes på polystyrenkuler.

Enzymkonjugatbestanddel 2) kan f.eks. være anti-K eller

]v

anti-P antistoffer konjugert med 3-galaktosidaseenzymet ifølge kjente fremgangsmåter som tidligere angitt i foreliggende beskrivelse.

Den enzymatiske substratbestanddel 3) kan f.eks. være et hvert kromogent substrat som er spesifikt overfor enzymet i bestanddelen 2); hvis 3-galaktosidase brukes som enzym kan et egnet kromogent substrat f.eks. være o-nitrofenyl-galaktopyranosid.

■ Kontrollene 4) og pufferene 5) kan være som tidligere anjgitt

I

for RIA settet.

Det fakultative blokkeringsmiddel for den enzymatiske reaksjon kan f.eks. når (3-galaktosidase brukes som enzym, være et alkalimetallkarbonat, f.eks. natriumkarbonat.

I en spesielt foretrukket form omfatter et sett for ovenfor nevnte EIA sandwich-type påvisning av typen K eller P k antigendeterminanter: 1) anti-K eller henholdsvis anti-P k antistoffer absorbert på polystyrenkuler;

2) en fortynningspuffer inneholdende:

- en fosfatpuffer med pH mellom ca. 6,5 og 8, fortrinnsvis ca. 7,2, og en molar konsentrasjon mellom ca. 50 mM og ca. 150 mM, fortrinnsvis ca. 70 mM; - natriiimklorid i en molar konsentrasjon mellom ca. 50 mM og 150 mM, fortrinnsvis- ca. 70 mM; - natriumazid i en molar konsentrasjon mellom ca. 15 mM og 50 mM, fortrinnsvis ca. 31 mM; og

- kvegalbumin i en vekt til volum konsentrasjon mellom

ca. 0,5% og ca. 3%, fortrinnsvis ca. 1%;

3) 3-galaktosidase konjugert anti-K eller henholdsvis anti-k

P antistoffer, korrekt fortynnet i pufferen 2);

4) et enzymatisk substrat inneholdende:

- o-nitro-fenylgalaktopyranosid i en molar konsentrasjon mellom ca. 2 mM og 4 mM, fortrinnsvis ca. 2,3 mM; og - en fosfatpuffer med en pH mellom ca. 6,5 og 8, fortrinnsvis ca. 7,2, og en molar konsentrasjon mellom ca. 10 mM og 30 mM, fortrinnsvis ca. 15 mM; 5) et blokkeringsmiddel for den enzymatiske reaksjon inneholdende natriumkarbonat ved en molar konsehtrasjon mellom ca. 0,25 M og 2 M, fortrinnsvis ca. 1 M; 6) en negativ kontroll: menneskeplasma negativt i prøven, dvs. normalt menneskeplasma; og 7) en positiv kontroll: menneskeplasma positivt i prøven, dvs. menneskeplasma fra en pasient med adenocarcinom eller normalt menneskeplasma hvortil en kjent mengde K eller P<k>antigendeterminanter eller K/P kantigenblanding er tilsatt.

For den histokjemiske måling av K eller P<k>" antigendeterminanter på vevssnitt ifølge den forut beskrevne fremgangsmåte i denne beskrivelse, kan et reagenssystem brukes, f.eks. et sett hovedsakelig inneholdende: 1) anti-K eller henholdsvis anti-P antistoffer;

2) enzym-markerte antistoffer spesifikke overfor immuno-

k globuliner av artene hvori anti-K eller henholdsvis anti-P antistoffene til bestanddelen 1) er dannet;

3) et enzymatisk substrat; og

4) puffere.

Ander bestanddeler kan inngå i det ovennevnte sett såsom f.eks. et blokkeringsmiddel for å eliminere eventuelle forstyrrende ikke spesifikke komplikasjoner, et kontrastfargemiddel (for kjernen) og videre som allerede nevnt tensioaktive substanser, stabiliseringsmidler, antimikrobielle midler, enzymaktivatorer o.l.

I det ovennevnte reagenssystem kan anti-K eller anti-P antistoffene f.eks. stamme fra geit og da vil antistoffene fra bestanddelen 2) være anti-geit-immunoglobulinanti-stoffer og vil f.eks. dannes i esler.

De enzymmarkerte antistoffer fra bestanddelen 2) kan f.eks. være 3-galaktosidase markerte antistoffer fremstilt ved kjente teknikker som tidligere nevnt.

Den enzymatiske substratkomponent 3) kan være et hvert substrat som er spesifikk overfor enzymet til komponenten 2) og som er i stand til å gi et farget og uoppløselig produkt ved virkning på enzymet: hvis 3-galaktosidase brukes som enzym kan et anvendelig kromogent substrat f.eks. være et indolyl-galaktosid, spesielt 5-brom-4-klor^-indolyl-galaktosid.

Pufferene kan f.eks. være fosfat eller Tris puffere med en pH mellom ca. 6,5 og 8, fortrinnsvis ca. 7,3.

Det eventuelt nødvendige blokkeringsmiddel for å eliminere forstyrrelser fra ikke spesifikke komplikasjoner kan f.eks. være normalt eselserum i det tilfellet at bestanddelen 2) antistoffer er oppstått i esel.

Kontrastfargemiddelet kan f.eks. inneholde karbaminsyre.

Ifølge et spesielt foretrukket trekk inneholder et sett for den histokjemiske påvisning av K eller P k antigendeterminan1-ter på vevssnitt:

1) en vaskepuffer omfattende:

- Tris eller fosfat puffer med en pH mellom ca. 6,5 og 8, fortrinnsvis ca. 7,3 og en molar konsentrasjon mellom ca. 5 mM og ca. 100 mM, fortrinnsvis ca. 10 mM; og - natriumklorid i en molar konsentrasjon mellom ca. 50 mM og 200 mM, fortrinnsvis ca. 150 mM; 2) en blokkeringspuffer omfattende de samme komponenter av. vaskepufferen ifølge 1) ovenfor, og i tillegg, normalt esel-!serum i en volum til volum konsentrasjon mellom ca. 1 og 5 ; %', fortrinnsvis ca.3%; J k I 3) anti-K eller henholdsvis anti-P antistoffer dannet i geit, korrekt fortynnet i pufferen 1) ovenfor; 4) (3-galaktosidase konjugerte anti-geit immunoglobulin-antistoffer dannet i esel, korrekt fortynnet i pufferen 1) ovenfor;

5) et enzymatisk substrat inneholdende:

- en fosfatpuffer med en pH mellom ca. 7 og 8, fortrinnsvis ca. 7,4 og en molar konsentrasjon mellom ca. 5 mM og ca. 50 mM, fortrinnsvis ca. 10 mM;

- natriumklorid i en molar konsentrasjon mellom ca. 5 mM

og ca. 50 mM, fortrinnsvis ca. 10 mM;

- magnesiumklorid i en molar konsentrasjon mellom ca.

0,1 mM og ca. 2 mM, fortrinnsvis ca. 1 mM; - 5-brom-4-klor-indolylgalaktosid i en molar konsentrasjon mellom ca. 0,5 mM og ca. 5 mM, fortrinnsvis ca. 1 mM;

- kaliumferrocyanid i en molar konsentrasjon mellom ca.

3 mM og ca. 10 mM, fortrinnsvis ca. 6 mM; og

- kaliumferrocyanid i en molar konsentrasjon mellom ca.

3 mM og ca. 10 mM, fortrinnsvis ca. 6 mM;

6) et kontrastfargemiddel inneholdende:

- karminsyre i en vekt til volum konsentrasjon mellom ca.

1 g/l og. 10 g/l, fortrinnsvis ca. 2,5 g/l; og

- aluminiumkaliumsulfat i en molar konsentrasjon mellom ca.

25 mM og 150 mM, fortrinnsvis ca. 50 mM.

I de foretrukne trekk beskrevet ovenfor for reagenssystemene

.ifølge oppfinnelsen angir konsentrasjonene de konsentrasjonér ! pr. liter som foreligger av hver bestanddel i løsningenj J

eller blandingen som anvendes for utførelsen av prøven.

Bruken av reagenssystemene ifølge oppfinnelsen i de kjente analytiske metoder for påvisning av antigenene innebefattet væskefaseimmunologiske målemetoder og fastfase immunologiske, målemetoder i histokjemiske bestemmelser, gjør det mulig på en relevant måte å forbedre muligheten for å diagnostisere menneskeadenocarcinomer.

Muligheten for ifølge oppfinnelsen å påvise bare slike antigendeterminanter (K) som er spesifikke overfor adenocarcinomas uten innblanding som skyldes antigendeterminan-

n k tene P eller alternativt slike antigendeterminanter (P )

som har tilknytning til K determinantene på adenocarcinomas "gjør det mulig å oppnå bedre diagnostiske resultater enn

■dem som oppnås med kjente sett i handelen for CEA bestemmelse; med metodene og reagensene ifølge oppfinnelsen observeres faktisk et sterkt redusert antall falske positive resultater .

Resultatene som oppnås fra ekperimentet utført med metodene og reagensene ifølge foreliggende oppfinnelse på tallrike tilfeller av ikke-neoplastiske patologier, innebefatter mange inflammatorisk-degenerative patologier, og også neoplastiske patologier, blekarakterisert vedprosent-

deler av falske positive resultater, og henholdsvis falske negative resultater som var lavere enn slike som observertes i tilfeller når kjente sett for CEA ved anvendelse ay anti-CEA antistoffer, (f.eks. CEA Roche test og Liso-fase CEA sett) brukes.

Spesielt når sammenlignende eksperimentering ble utført

ved analyse av histologiske preparater med reagensene ifølge oppfinnelsen og med sett som er i handelen, f.eks. DAKO PAP KIT og-IMMULOK HISTO SET, ble det observert at selv om

kjente sett gir positiv reaksjon også på noen normale celler med en spesielt høy feil, f.eks. i tilfeller av!analyse av benmargsvev, viser reagensene ifølge oppfinnelser utelukkende adenocarcinommetastatiske celler uten falskej

positive resultater overhodet, dvs. uten noen positiv farging av de normale celler, f.eks. -ranulocytter, i tydelig motsetning til de sammenlignede sett i handelen.

De nye, enten polyklonale eller monoklonale anti-K antistoffer eller, alternativt, anti-P kantistoffer ifølge oppfinnelsen, samt anti-K eller anti-P antistoff-fragmenter, f.eks. Fab<1>eller F(ab')2" fragmenter, kan brukes som tracere i f.eks. nukleær medisin og radiologisk immunologisk kjemi. Således kan f.eks. disse antistoffer eller antistoff-fragmenter markeres med radioaktive isotoper, f.eks.<131>J, og de. således erholdte radioaktivt markerte tracere kan injiseres i det minste i legemet for å gjøre synlig og lokalisere mulige adenocarcinomaceller eller masser. Synliggjøringen av traceren kan utføres ved kjente^metoder ved bruk av spesielle instrumenter, f.eks. ved ^-kamera-undersøkelse.

En videre applikasjon av.de nye, enten polyklonale eller monoklonale anti-K antistoffer, eller anti-P kantistoffer eller fragmenter derav ifølge foreliggende oppfinnelse,

er for terapi av de menneskelige adenocarcinomas. Muligheten for å bruke spesifikke anti-K antistoffer eller henholdsvis anti-P antistoffer som kan gjenkjenne utelukkende de adenocarcinome celler uten å gjenkjenne de normale celler, gjør det mulig å utøve en tumorkjemoterapi som er spesifikt og utelukkende rettet mot tumormassene.

For dette formål kan de ovenfor nevnte nye antistoffer eller antistoff-fragmenter konjugeres med anti-tumordrug midler eller andre cytotoksiske midler, og injiseres i pasienten slik at legemidlet eller det cytotoksiske middel spesifikt transporteres med antistoffbæreren bare til tumorcellene eller massene.

Anti-tumorlegemidler kan f.eks. være daunorubicin, doksorubicin, epirubicin og metotreksat.

Et cytotoksisk middel kan f.eks. være ricin..

Konjugeringen av antitumor-legemiddelet eller det cytotoksiske middel, f.eks. et av de ovenfor nevnte, med et poly-

k

klonalt eller monoklonalt anti-K eller anti-P antistoff ifølge oppfinnelsen kan utføres ifølge kjente fremgangsmåter, f.eks. sådanne beskrevet i J. Immun. Methods 59, 129-143 (1983) Konjugatene mellom antitumorlegemidlet eller det cytotoksiske middel, f.eks. et av de tidligere angitte, dg et polyklonalt

k

eller monoklonalt anti-K eller anti-P antistoff er en videre gjenstand for oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer derfor også en forbedret fremgangsmåte for en spesifikk og rettet kjemo-terapi på humane adenocarcinomas, hvor legemiddeletfekten utelukkende er rettet på tumorcellene og de normale cellene ""Overhodet ikke påvirkes av legemidlet. I denne beskrivelse står forkortelsene EDTA, Tris, PBS, PEG, HPLC, IgG., mCi,

mM, W/V, V/V, DEAE, SDS, DOC, CPC henholdsvis for etylendiaminc tetra-eddiksyre, tris-(hydroksymetyl)-aminometan, fosfatpuf-ret salin, polyetylenglykol, "high performance liquid chromatography", immunoglobulin(er), milliCurie, milli-molar, vekt til volum, volum til volum, dietylaminoetyl-cellulose, natriumdodecylsulfat, natriumdeoksycholat og cetyl-pyridiniumklorid.

De følgende eksempler illustrerer men begrenser på ingen måte oppfinnelsen.

Eksempel 1

Tykktarmsadenocarcinome hepatiske metastaser (100 g) ble frosset til -80°C i 24 timer og deretter homogenisert under høytrykk med X-presse LKB instrument. Homogenisatet ble tatt opp med 3 volumdeler av en 0,025 M vandig løsning av sakkarose og deretter ble samme volum 2N HCIO^tilsatt.

Etter sentrifugering (10.000 x g x 20 min. ved 4°C)

og dialyse av supernatanten mot destillert vann, ble ut-felling utført med 3M KCl i 24 timer ved 4°C under røring. Blandingen ble igjen sentrifugert (100.000 x g x 1 time ved 4°C) og supernatanten deretter dialysert mot pH 6,75 0,005

M fosfatpuffer.

""Ekstraktet, ble kontrollert ved RIA på basis av den inhibering 125

man fikk av bindingskapasiteten til et I-K«-»anti-K eller 12 5 k

I-K/P < >anti-K RIA system og deretter kromatografert

på en DEAE-cellulose kolonne (1,6 x 5 cm) forut ekvilibrert med pH 6,75 0,005M fosfatpuffer. Elueringer utføres sukses-sivt ved pH 6,75 0,025M fosfatpuffer (40 ml), ved pH

6,75 0,05M fosfatpuffer (40 ml), og deretter med pH 6,75 0,1M fosfatpuffer (40 ml). Hver eluert fraksjon ble kontrollert med RIA som forut beskrevet, og deretter konsentrert til 5 ml. 0,025M og 0,05M fraksjonene ble videre renset ved gelfiltrering (4 ml/timer) gjennom en "Sephadex" G 200 kolonne (0 = 1,6 cm; time = 100 cm) pufret til pH 4,65 med en vandig løsning inneholdende 0,05M NaH2P04og 0,9% ' NaCl. To topper ble således eluert og hver av dem ble igjen kontrollert ved RIA som ovenfor angitt, og så med et I-Pk<—»anti-P k system, for å kjenne K og P k antigenaktivitetinnholdene. Begge topper ble bekreftet å være en blanding av K og P<k>antigendeterminanter med en K konsentrasjon høyere i den første toppen enn i den andre toppen.

I

Eksempel 2

Normalt humanplasma (5 1) ble sentrifugert (5.000 x g x

15 minutter ved 4°C), og deretter ble supernatanten ekstrahert med samme volum 1,2N HClO^.

Ekstraktet ble dialysert mot rennende vann i 24 timer og deretter mot dobbeltdestillert vann i ytterligere 24 timer.

Etter 10 til 20 gangers konsentrasjon med Amicon celle

og dialysen mot pH 7,2 PBS, ble 0,5% Tween 8 0 satt til ekstraktet (for å unngå ikke spesifikke forstyrrelser), og.dett ble så kromatografert på en "Sepharose" 4B bioabsorpsjonskolonne med anti-P<n>antistoffer bundet til harpiksen.

Fraksjonen blir bundet til harpiksen under elueringspro-sessen (P<n>antigendeterminanter), ble deretter løsgjort fra selve harpiksen ved hjelp av en 3M PBS-løsning av ammoniumtiocyanat ifølge fremgangsmåten beskrevet i J. av Solid-

Phase Biochemistry 2, 45, 1977.

Det erholdte produkt ble dialysert mot destillert vann og

mot pH 7,2 PBS, og deretter kontrollert ved RIA ved måling

av inhiberingen av bindingskapasiteten til et

125I-Pn< >-anti-Pn RIA system.

Innholdene ble således bekreftet å være P<n>antigendeterminanter med en konsentrasjon på 50 y/ml, målt ved Lowry metoden.

Eksempel 3

En pH 7,2 PBS-løsning inneholdende Tween 80 (0,5%) og K/P -blandingen (1 mg/ml) fremstilt i eksempel 1 (første eluerte topp) , ble kromatografert på en "Sepharose"' 4B bioapsorpsjonskolonne som binder til anti-P k-antistoffer.

Den ikke-bundede fraksjon inneholdende K-antigendeterminanter ble konsentrert til et lite volum og kontrollert ved RIA ved måling av inhiberingen av bindingskapasiteten til et 125J-K anti-K RIA system.

Den ikke-bundede fraksjon ble således bekreftet å inneholde K-antigendeterminanter i en konsentrasjon på 0,1 "mg/ml i PBS-Tween-blandingen.

Den bundede fraksjon, dvs. den fraksjon som blir bundet til kolonne-anti-P -antistoffene, ble løsgjort ved eluering med en 311 PBS-løsning av ammoniumtiocyanat ifølge fremgangsmåten fra eksempel 2. Eluatet ble deretter dialysert mot dobbeltdestillert vann og så mot PBS, og dets innhold ble kontrollert ved RIA på basis av inhiberingen av bindingskapasiteten til et 12 5 J-P k 4—>anti-P k" RIA system. Den eluerte fraksjon ble således bekreftet å inneholde P -antigendeterminanter i en konsentrasjon på

0,15 mg/ml.

Den samme overnevnte fremganasmåte ble gjentatt ved bruk av en "Seoharose" 4B bioabsorpsjonskolonne som binder.til anti-P n -antistoffer. Under elueringen av K/P k-antigen-blandingen blir P k-antigendeterminantene bundet ved kryssreaksjon til kolonne-anti-P<n->antistoffer, og dette ble bevist ved at P k-antigendeterminanter i en konsentrasjon på 0,15 mg/ml ble gjenvunnet fra den bundede fraksjon, p k-innholdskontroller ble igjen utført ved RIA som oven-125 k k for beskrevet mot et J-P <—> anti-P RIA system.

Eksempel 4

En PBS-løsning av K/P jv-antigenblandingen fremstilt ifølge eksempel 1 i en 1 mg/ml konsentrasjon ble emulgert med samme volum av en fullstendig Freund's adjuvantsuspensjon. Den fremstilte blanding ble brukt til å foreta 4 sub-kutane injeksjoner på 4 forskjellige punkter i ryggen til en tibetansk geit. Injeksjonene ble gjentatt 3 ganger med mellomrom på 15 dager. Etter den tredje injeksjonen ble den immunologiske reaksjon kontrollert: dyret ble tappet for blod og seruminnholdét ble kontrollert som følger. Seriefortynninger av serum ble inkubert natten over ved 37°C med 100 pl av en PBS-løsning inneholdende 1,5 ng/ml 125

J radiojodert K-antigendeterminanter eller, i en alter-"nativ fremgangsmåte, j radiojodert K/P -antigenblanding.

Etter inkubering ble 0,1 ml av en 1/10 PBS-løsning av anti-geit immunoglobuliner dannet i kanin og 0,1 ml av en 1/1000 PBS-løsnincr fra normalt geiteserum tilsatt. Blandingen ble så sentrifugert (5.000 x g x 15 minutter ved 4°C), supernatanten ble fjernet og radioaktiviteten ble målt ved gammatelling på presipitatet. Innholdet av antiserumet ble beregnet som den antistoff-fortynning som er i stand til å binde 50% av det totale markerte antigen. Det erholdte anti-K/P k-antiserum ble funnet å ha en gjennomsnittsstyrke på 1/50.000.

Ved analog fremgangsmåte, men i stedet for å bruke K/P jv-antigenblan■ ding, bruke K-antigendeterminant eller P k-antigendeterminanter erholdt ifølge eksempel 3, eller P<n->antigendeterminanter erholdt ifølge eksempel 2,fikk man anti-K-antiserum, anti-P k -antiserum og anti-P n-antiserum henholdsvis.

Eksempel 5

Anti-K/P -antiserum (1 ml) fremstilt i eksempel 4, ble behandlet med en 14% PEG 6.000 løsning i pH 8,6 0,IM verohalpuffer (9 ml). J Det oppnådde presipitat ble tatt opp med den minimale mengde 0,02M fosfatpuffer med pH 8, og renset på DEAE-cellulose.

Proteinene eluert i utgangspufferen (5 ml) ble igjen ut-felt med. 20% PEG 6.000 løsning i pH 8,6 0, IM veronal-puffer (45 ml). Utfellingen ble opptatt med PBS og 0,5% Tween 80 (1 ml) og ytterligere renset på en "Sephadex"

4B bioabsorpsjonskoldnne hvortil K/P k-antigener var bundet.

Anti-K/P jv-immunoglobulinene som forble bundet til kolonnen ble så fjernet ved eluering med ammoniumtiocyanat ifølge den metode som er beskrevet i eksempel 2 og ga anti-K/P k-antistoffer.

k

Ved analog fremgangsmåte utfra anti-K, anti-P og anti-p<n->antisera fremstilt i eksempel 4, fikk man anti-K, anti-k n

P og anti-P -antistoffer henholdsvis.

Eksempel 6

Anti-K/P jv-antiserumet fremstilt ifølge eksempel 4 (0,1 ml) ble inkubert i 24 timer ved 37°C med normalt menneskeplasma (8 ml) og blandingen ble sentrifugert (5000 x g x 15 minutter ved 4°C). 0,1 ml av supernatanten ble inkubert igjen i 24 timer ved 37°C med 4 ml normalt menneskeplasma, og igjen sentrifugert under de ovenfor angitte betingelser.

Supernatanten ble skilt fra og dens iinmunologiske aktivitet ble kontrollert på basis av dens evne til å i samme grad

125 k • binde en J radiologisk markert K/P -antigenblanding både med og uten normalt menneskeplasma. Mangelen på kryss-reaksjonen med normalt menneskeplasma, dvs. med P<n->antigen-determinanter, viste at det erholdte antiserum var anti-K-antiserum.

Det erholdte serum ble fortynnet passende og brukt for^immunologiske bestemmelser av K-antigendeterminanter pa menneskeplasma eller andre biologiske væsker eller vevs- ' ekstrakter.

Eksempel 7

Anti-K/P -antiserum fremstilt som i eksempel 4 (0,1 ml) ble inkubert i 24 timer ved 37°C med en 50 y/ ml PBS-løs-ning av P<n->antigendeterminanter fremstilt ifølge fremgangsmåten i eksempel 2 (1,8 ml). Etter inkubering ble blandingen sentrifugert (5000 x g x 15 minutter ved 4°C).

0,1 ml av supernatanten ble igjen reinkubert i 24 timer ved 37°C med 50 y/ml PBS-løsning av P<n->antigendeterminanter (1,8 ml). Etter sentrifugering under de ovenfor "'nevnte betingelser ble supernatanten fortynnet passende og brukt som anti-K-antiserum for de immunohistokjemiske bestemmelser.

Den anti-K-immunologiske aktiviteten til antiserumet ble kontrollert på grunnlag av dets evne til å vise adenocarcinome celler men ikke normale celler, på histologiske snitt: for prøven ble peroksidasefargingsmetoden fulgt som beskrevet av Sternberger L.A. i Immunocytochemistry - 2nd Edition - John Wiley and Sons - New York, 1979.

Eksempel 8

BALB/c-mus, 8 uker gamle ble immunisert ved intraperitoneal injeksjon av den emulsjonen man fikk ved å blande K-antigendeterminanter fremstilt ifølge eksempel 3 (100 ug), med samme volum fullstendig Freund's adjuvant.

Etter 30 dager ble injeksjoner gjentatt intraperitonealt med lavere mengder av K-antigendeterminanter. Kontroll av de immunologiske reaksjoner ble utført på dyrene som beskrevet i eksempel 4.

Ved så å bruke positive dyr overfor kontrollen ble somatislt 'hybridisering med murin myeloma-celler utført ifølge fzjem- gangsmåten beskrevet i Nature 256, 495-497, 1975.

Spesifiteten til de fremstilte produkter ble målt ved

125 RIA-prøve gjennom måling av bindingsevnen til J-Kantigen.

Hybridene som viste seg positive i prøven ble så isolert og klonet.

Store mengder anti-K-monoklonalt antistoff erholdtes ved intraperitoneal injeksjon i BALB/c-mus fra celler som utskilte monoklonalt anti-K-antistoff.

Veksten av tumoren som skyldtes de injiserte celler viste"*seg ved dannelse av en ascitisk væske inneholdende opptil

20 mg/ml monoklonale anti-K-antistoffer. Ved å gå frem på ■ lignende måter, men ved immuniseringen å bruke P eller P<n->antigendeterminanter i stedet for K-antigendeterminanter, erholdtes henholdsvis anti-P -monoklonale antistoffer og anti-P<n->monoklbnale antistoffer.

Eksempel 9

En løsning av K-antigendeterminanter fremstilt ifølge fremgangsmåten i eksempel 3 (10 ug) i pH 7,2 PBS (20 pl) ble behandlet i 5 minutter i et isbad med en løsning avNa<125>J (1 mCi) i PBS (10 pl) og en løsning (20 pl) inneholdende kloramin-T i PBS i en konsentrasjon på 0,5 mg/ml.

Så ble 20 pl av en løsning inneholdende natriummetabi-sulfit i PBS i en konsentrasjon på 2 mg/ml, og 20 pl av en løsning inneholdende kaliumjodid i PBS ved en konsentrasjon på 20 mg/ml satt til blandingen. Reaksjonsproduktet ble renset ved HPLC for å fjerne fritt<125>J, og således

125

fikk man kvantitativt J radiojodert K-antigendetermi-12 5

nanter ( J-K).

Ved analog fremgangsmåte fremstiltes radiojoderte P -anti-igendeterminanter ( 125 J-P k ) og rad<i>ojoderte K/P k -antigen■<->blandinger (<125>J-K/P<k>). '

Eksempel 10

Menneskeserumprøver fra 335 hospitaliserte pasienter med ikke-neoplastiske sykdommer ble undersøkt ved hjelp av anti-K-antiserum fremstilt i eksempel 6, ved bruk av reagenser og analytisk metode som nedenfor angitt.

Reagenser

(1) Referansepuffere inneholdene:

- pH 7,2 fosfatpuffer 70 mM; -natriumklorid 70 mM;

- natriumazid 31 mM; og

- kvegalbumin 0,4% vekt/volum.

(2) Anti-K-antiserum fremstilt i eksempel 6, passende fortynnet 1:50.000 i: - pH 7,2 fosfatpuffer 70 mfl; - natriumklorid 70 mM; - EDTA-dinatriumsalt 33 mM;

- natriumazid 31 mM; og

- normalt geiteserum 0,1 volum-%.

125 k (3) Radiojodert markør inneholdende J-K/P -antigen-blanding fortynnet i puffer (1) til en konsentrasjon på 1,5 ng/ml og en spesifik aktivitet på 60 mCi/mg. (4) Andre antiserum: antiserum som utfeller geiteimmuno-globuliner, dannet i kanin og passende fortynnet i puffer (1).

(5) Negativ kontroll: normalt menneskeplasma.

(6) Positiv kontroll: normalt menneskeplasma som er tilsatt en kjent mengde K/P k-antigenblanding.

I

Analytisk fremgangsmåte

Beregning: den P.I. positive index ble beregnet ved å måle prøvenes radioaktivitet og henholdsvis kontrollenes i forhold til radioaktiviteten til "null" ifølge de følgende formler:

En P.I. indexverdi høyere enn 15 ble ansett å indikere nærvær av adenocarcinoma, mens en P.I.indexverdi lavere enn 15 ble ansett som en negativ indikasjon på adenocarcinoma.

De ovenfor nevnte 355 prøver ble også undersøkt paralelt ved å bruke to handelssett for påvisning av menneske-CEA, nemlig GEA Roche Test, og Liso-phase CEA-sett fra Lepetit.

I

De erholdte resultater er sammenfattet i den følgende tabell:

Eksempel 11

Menneskeserumprøver fra 8 4 pasienter med fasts låtte adenocarcinomas ble analysert ved bruk av reagenser og analytisk metode beskrevet i eksempel 10 og, paralelt, ved bruk av de to handelssett nevnt i eksempel 10.

Resultatene er sammenfattet i den følgende tabell:

I

Eksempel 12

De samme menneskeplasmaprøver fra eksemplene 10 og 11 ble også undersøkt ved bruk av reagensene og den alternative analytiske metode angitt nedenunder.

Reagenser

(1) Anti-K-antistoffer fremstilt ifølge fremgangsmåten beskrevet i eksemplene 5 oa 6, absorbert på polystyrenkuler.

(2) Fortynningspuffer inneholdende:

- pH 7,2 fosfatpuffer 70 mM; - natriumklorid 70 mM;

- natriumazid 31 mM; og

- kvegalbumin 1% (vekt/volum).

(3) Enzymatisk konjugat inneholdende anti-K-antistoffer i likhet med dem i reagens (1) ovenfor, konjugert til (3-galactosidase (ifølge • fremgangsmåten beskrevet i FEBS Letters 95, 311, 1978) og<p>assende fortynnet i puffer (2). (4) Enzymatisk substrat inneholdende: - pH 7,0 fosfatpuffer 15 mM; og J — o-nitrofenylgalactosid 2,3 mM.

(5) Blokkeringsmiddel: IM natriumkarbonat.

(6) Negativ kontroll: normalt menneskeplasma.

(7) Positiv kontroll: normalt menneskeplasma som var tilsatt en kjent mengde K/P k-antigenblanding.

Analytisk metode

Beregning

Positivitets.indexen P.I. ble beregnet i forhold til den ,optiske densitet (O.D.) av "null" ifølge uttrykket j

En positiv indexverdi høyere enn 3 ble ansett å være en indikasjon på nærvær av adenocarcinoma, mens en positiv index lavere enrc 3 ble ansett å være en indikasjon på manglende adenocarcinoma.

Lignende resultater som de ovenfor nevnte i eksemplene 10 og 11 ble observert.

Eksempel 13

Formalin fiksert og parafin innstøpt vevsnitt fra menneske-tykktarm-adenocarcinoma, menneskebryst-adenocarcinoma og fra benmargen til pasienter med bryst-adenocarcinoma ble undersøkt ved bruk av reagensene og den analytiske metode angitt nedenunder:

Reagenser

(1) Vaskepuffer inneholdende:

- pH 7,3 fosfatpuffer 10 mfl; og

- natriumklorid 150 mM.

(2) Blokkeringspuffer inneholdende:

-.pH 7,3 fosfatpuffer 10 mM;

- natriumklorid 150 mfl; og .

- normalt eselserum 3% (v/v).

(3) Enzymatisk konjugat inneholdende anti-geit immunoglobulin-antistof f er dannet i esel, markert med (3-galactosidase (ifølge fremgangsmåten beskrevet i FEBS Letters 95, 311, 1978) og passende fortynnet i puffer (1). (4) Enzymatisk substrat inneholdende: - pH 7,4 fosfatpuffer 10 mfl; - natriumklorid 10 mM; - magnesiumklorid 1 mM; - 5 brom-4-klor-indolylgalactosid 1 mM;

- kaliumferrocyanid 6 mM; og

- kaliumferricyanid 6 mM.

(5) Kontrastfargemiddel inneholdende:

- aluminiumkaliumfosfat; og

-carminsyre.

(6) Anti-K-antistoffer dannet i geit, fremstilt ifølge fremgangsmåten i eksempel 7, og passende fortynnet i puffer (1) ovenfor.

Analytisk metode

Snitt ble befridd for voks i xylen, i 100% til 50% etyl-alkoholseriene, og så i vaskepufferen (1). Ethvert reagens ble tilsatt i en slik mengde at hele snittet ble dekket. Alternativt ble overnevnte analytiske metode fulgt idet in-kuberinger natten over ble utført ved romtemperatur i fuktig kammer, bortsett fra inkuberingen med enzymsubstratet (4), hvilket ble utført i 1 time ved romtemperatur i fuktig kammer.

Alltid som et alternativ i overnevnte metode ble etter den endelige vask i rennende vann og før undersøkelsen med mikroskop, snittene først gjort klare ved passasjer gjennom vaskepuffer (1), 50% til 100% etylalkoholserier og xylen, og deretter montert i "Eukitt".

"* Den mikroskopiske analyse av snittene viste en intens blåfarging utelukkende lokalisert til cytoplasmaet og membranen til tumorcellene uten noen positiv fargereak-sjon i cellene til det tilstøtende normale vev, såsom f.eks. granulocyter.

Disse resultatene ble funnet å stå i tydelig kontrast til de man fikk ved å analysere de samme preparater ved bruk av handelssettene for den histokjemiske påvisning av CEA-komplekset med anti-CEA-antistoffer, nemlig DAKO PAP KIT

og IMMUNOLOK HISTOSET KIT.

Disse handelsreagenser viste faktisk meget lav spesifitet ved at de ble funnet ikke bare å farge tumorcellene men også i varierende grad de normale vevsceller med en spesi-ell stor feil i tilfelle analyse av benmargsvev.

Den samme overnevnte fremgangsmåte ble fulgt for analyse av frosne vevsnitt og analoge resultater erholdtes.

Eksempel 14

Doksorubicin ble konjugert til anti-K-antistoffene ved en kovalent bindingsmetode.

' ! I

En løsning av doksorubicin (40 mg/ml) i pH 7,0 0,015 M fosfatpuffersaltvann ble blandet med et lite overskudd 0,1 M NaJO^og inkubert 1 time ved romtemperatur i mørket.

■ På slutten av inkuberingen ble IM glycerin tilsatt'opp til en 0,05M sluttkonsentrasjon.

Løsningen av oksydert oksorubicin ble blandet med 1 ml anti-K-antistoffløsning (20 mg/ml) i pH 9,5 0,15M kalium-karbonatpuffer og inkubert i 1 time ved romtemperatur.

Ved slutten av inkuberingen ble NaBH^tilsatt opp til en sluttkonsentrasjon på 0,3 mg/ml og reaksjonen fikk for-løpe i 2 timer ved 3 7°C.

På slutten av reaksjonen ble blandingen kromatografert på en gelfiltreringskølonne (15 x 1,5 cm) av "Bio-gel" p 100 ekvilibrert i PBS.

Fraksjonene i det ekskluderte volum inneholdt det antistof f bundende legemiddel fritt for ikke-konjuaert legemiddel.

Claims (19)

1. Fremgangsmåte for bruk i diagnose av et menneskeadeno-carcinom ved bestemmelse av adenocarcinom-beslektet antigenmateriale i en prøve tatt fra en menneskepasient, karakterisert ved at anvendelse av (a) anti-K-antistoff eller (b) anti-P -antistoff, og materialet i prøven måles med hensyn til henholdsvis (a <1> ) utelukkende slike antigendeterminanter K som er spesifike overfor adenocarcinomas eller (b') slike antigendeterminanter P som er knyttet til K-determinantene på adenocar cinomaene. •

2. Midler for utførelse av fremgangsmåten ifølge krav 1, karakterisert ved at de er anti-K-antistoffer spesifike overfor antigendeterminanter, anti-P k-antistoffer spesifike overfor P ' Jv-antigendeterminantene, anti-P <n-> antistoffer spesifike overfor P <n-> antigendeterminantene.

3. Fremgangsmåte ved fremstilling av anti-K-antistoffene ifølge krav 2, karakterisert ved at man absorberer antistoffer dannet mot en blanding av K og k n k P -antigendeterminanter med P eller P -antigendeterminanter slik at de P ]v-immunologiske bindingspunkter på antistoffene mettes, idet man n k 1) immuniserer de méd P eller P -antigendetermi- n k nanter under dannelse av anti-P eller anti-P - antistoffer; 2) renser en blanding av antigendeterminanter K og k n k P ved hjelp av anti-P eller anti-P antistoffer dannet ifølge 1) og erholder K-antigendeterminanter; og 3) immuniserer dyr med K-antigendeterminanter fremstilt ifølge 2).

4. Fremgangsmåte ved fremstilling av anti-P -antistoffer ifølge krav 3, karakterisert ved at man immuniserer dyr med P -antigendeterminanter.

5. Fremgangsmåte ved fremstilling av anti-Pn-antistoffer ifølge krav 2, karakterisert ved at man immuniserer dyr med P <n-> antigendeterminanter.

6. Antigendeterminanter spesifike overfor menneskeadenocarcinomas, antigendeterminanter P khvilke er antigen-determinanter i forbindelse med K-antigendeterminantene på menneskeadenocarcinomas, antiaendeterminanter P <n> hvilke antigendeterminanter P <n> er slike antigendeterminanter som foreligger i normalplasma eller serum og kryssreagerer med ~* P k-antigendeterminantene.

7. Fremgangsmåte ved. fremstilling av K-antigendeterminantene ifølge krav 6, karakterisert ved at man renser en blanding av antigendeterminanter.K og P ved n k hjelp av anti-P eller anti-P -antistoffer.

8. Fremgangsmåte ved fremstilling åv P k-antigendeterminantene ifølge krav 6, karakterisert ved at man renser en blanding av antigendeterminanter K og P ved hjelp av anti-P <n-> antistoffer.

9. Fremgangsmåte ved fremstilling av P <n-> antigendeterminanter ifølge krav 6 , karakterisert ved at man ekstraherer fra normalplasma eller serum og deretter renser ved immunoaffinitet med antistoffer som er spesifike overfor disse.

10. Monoklonale anti-K-antistoffer spesifike overfor enkle K-antigendeterminanter, monoklonale anti-P -antistoffer spesifike overfor enkle P -antigendeterminanter, monoklonale anti-P <n-> antistoffer spesifike overfor enkle P <n-> antigendeterminanter. i

11. Fremgangsmåter ved fremstilling av de monoklonale antistoffer ifølge krav 10, karakterisert ved at de monoklonale antistoffer fremstilles ved hybridomateknikken.

12. Reagenssystem for bruk i diagnosemetoden for menneskeadenocarcinomas ifølge krav 1, karakterisert ved at det som essensiell bestanddel inneholder monoklonale eller polyklonale anti-K-antistoffer spesifike overfor antigendeterminanter K.

13. Reagenssystem for bruk i en radioimmunologisk diagnose-metode for menneskeadenocarcinomas ifølge krav 1, karakterisert ved at den i det vesentlige inneholder: 1) anti-K eller henholdsvis anti-P ir-antistoff; 2) radiologisk markert K eller henholdsvis P -antigen-determinanter eller, i alternativet, en radioaktivt markert K/P -antigenblanding, hvor den radioaktivt 125 125 k markerte bestanddel er J-K eller J-P eller 125J-K/P k; 3) kontroller; og 4) puffere.

14. Reagenssystem ifølge krav 13, karakterisert ved at det som en ytterligere bestanddel inneholder et andre antistoff spesifikt overfor immunoglobulinene til de arter hvori anti-K eller henholdsvis anti-P -antistoffet til komponenten 1) er blitt dannet.

15. Reagenssystem for bruk i en enzymatisk immunologisk målemetocte for diagnose av menneskeadenocarcinomas ifølge krav 1, karakterisert ved at den hovedsakelig inneholder: 1) anti-K eller henholdsvis anti-P k-antistoffer bundet til en fast fase; 2) (3-galactosidase konjugert anti-K eller henholdsvis anti-P k-antistoffer; 3) o-nitrofenylgalactopyranosid; 4) kontroller; og 5) puffere.

16. Reagenssystem for bruk i en immunohistokjemisk diagnose-metode for menneskeadenocarcinomas ifølge krav 1, """ karakterisert ved at den hovedsakelig inneholder: 1) anti-K eller henholdsvis anti-P -antistoffer; 2) (3-galactosidase markert og antistoffer spesifike overfor immunoglobuliner av de arter hvori anti-K eller henholdsvis anti-P -antistoffer av bestanddelen 1) er blitt dannet; 3) 5-brom-4-klorindolylgalactosid; og 4) puffere.

17. Markerte, fortrinnsvis radioaktivt markerte eller k n enzymmarkerte K, P og P -antigendeterminanter eller markerte anti-K, anti-P k og anti-P n-polyklonale eller monoklonale antistoffer.

18. Polyklonale eller monoklonale anti-K eller anti-P jv-antistoffer for bruk som bærere i anti-tumor medikamenter eller cytotoksiske medikamenter for terapi av mennekse-adenocarcinomas. ! I

19. Konjugater mellom et polyklonalt eller monoklonalt anti-K eller anti-P jv-antistoff og et anti-tumor middel valgt fra daunorubicin, doksorubicin, epirubicin og metotreksat eller ricin som cytotoksisk middel.