NO833641L - Medikamenter som omfatter minst ett immunotoksin og minst en enverdig karboksylisk ionofor - Google Patents

Abstract

Legemidler som er sammensatt av minst ett immunotoksin og minst én enverdig karboksylisk ionofor.

Description

Oppfinnelsen vedrører nye legemidler som har bundet til seg minst ett immunotoksin og minst én enverdig karboksylisk ionofor.

I de tidligere innleverte franske patentsøknader, spesielt

nr. 78 27 838, 79 24 655, 81 07 596 og 81 21 836, er det beskrevet fremstilling av anticanserforbindelser som er konjugerte, oppnådd ved kobling, ved hjelp av kovalent binding, av A-kjeden i ricin med antistoffer eller fragmenter av antistoffer som er dirigert mot et antigen som bæres av en destruksjons-

celle. Forbindelsene av denne type betegnes i denne beskrivelse med det generiske navn immuno-toksiner.

I fransk patentsøknad nr. 81 21 836 er. det ellers beskrevet ammoniumionenes egenskap (i form av hvilket som helst av deres salter og spesielt kloridet) med hensyn til å potensialisere på effektiv måte den cytotoksiske virkning av disse immunotoksiner.

Egenskapen ved ammoniumsaltene med hensyn til å potensialisere den selektive cytotoksiske aktivitet hos immunotoksinene presenterer tallrike fordeler i to situasjonstyper: a) Hver gang et immunotoksin anvendes som selektivt cytotoksisk middel in vitro for destruksjon av målcellene.

Når det gjelder terapeutisk anvendelse, påtreffes denne situasjon særlig når immunotoksinet benyttes som cytotoksisk middel ved behandling av benmargen hos leukemiske pasienter hvor benmargen som således behandles, til sist vil bli trans-plantert, slik det er beskrevet i søkerens franske patentsøknad nr. 81 21 836.

b) Når immunotoksinet benyttes in vivo som terapeutisk middel hos mennesker hver gang det er mulig å administrere preven-tivt, samtidig eller senere til pasienten et ammoniumsalt

som sikrer potensialisering av immunotoksinets effekt, slik dette er beskrevet i ovennevnte patentsøknad.

Allikevel, i det sistnevnte tilfelle for benyttelse in vivo

av immunotoksinet har anvendelsen, likeledes in vivo, av et ammoniumsalt for å nyttiggjøre den potensialiserende effekt,

visse iboende begrensninger for den rette toksisitet for ammonium-ionene, og faktisk er det relativt brysomt på varig vis å holde en tilstrekkelig konsentrasjon av ammoniumioner i pasientens biologiske væsker.

Foreliggende oppfinnelse har som formål fremstilling av kraftige cytotoksiske legemidler hvor man benytter seg av potensialisering av de selektive cytotoksiske effekter hos de immunotoksiner som er beskrevet i de ovenfor omtalte, tidligere innleverte patentsøknader.

Etter at tallrike substanser er studert uten hell, er det funnet at de enverdige karboksyliske ionoforer representerer en gruppe av substanser som er spesielt interessante for å potensialisere immunotoksinenes cytotoksiske effekt.

Med karboksyliske ionoforer menes naturlige substanser som er isolert fra stammer av Streptomyces som bærer et lineært hydrokarbonskjellett hvor det er inkludert oksygen-heterosykler. Ved en ende av kjeden er det alltid en karboksylsyrefunsjon mens det ved den annen ende er en eller flere alkoholfunksjoner.

[se B.C. Pressman : Annual Review of Biochemistry 4_5, 501-530,

(1976)]..

Disse forbindelser har den egenskap å danne fettløselige komplekser med tallrike kationer, hvilket gjør det mulig for disse ioner å krysse lepidiske barrierer. De som danner slike komplekser med de enverdige kationer utgjør familien av enverdige karboksyliske ionoforer hvis representanter som er mest kjent er monensin, nigericin, grisorixin og lasalocid.

Disse enverdige karboksyliske ionoforer er i besittelse av forskjellige biologiske egenskaper og særlig antibiotiske og antiparasittiske egenskaper. Dessuten anvendes f.eks. monensin som hjelpestoff ved foring av kveg og som coccidiostatisk middel for fjærkre.

Det er likeledes angitt [B. Ray og H.C. Wu, Molecular and Cellular Bidlogy 1, 552-559, (1981)] at monensin og nigericin forsterker cytotoksisiteten til ricin overfor visse cellelinjer. Denne forsterkning er allikevel beskjeden, av størrelsesorden faktor 10.

I og med foreliggende oppfinnelse er det funnet, på over-raskende måte, at de enverdige karboksyliske ionoforer som benyttes i doser hvor de selv ikke oppviser noen riktig cytotoksisitet for de studerte linjer, på ekstremt betydelig måte (faktorer på 7.000 til 55.000) potensialiserer cytotoksisiteten som er spesifikk for immunotoksiner.

Det følgende eksempel, som ikke er begrensende, letter forståelsen av oppfinnelsen.

EKSEMPEL

Dette eksempel viser potensialisering av selektiv cytotoksisitet for immunotoksinet anti-T-65 (slik som beskrevet i søkerens franske patentsøknad nr. 81 21 836) i forhold til human-T-lymfoblastoidceller fra linjen CEM som bærer antigenet T-65.

I disse forsøk er cytotoksisiteten vurdert ved hjelp av inkorporering av lausin-"^C ved cellene etter 24 h inkubering ved 37°C i nærvær av kjente mengder av det studerte immunotoksin, eller cytotoksiske referansesubstanser, i fravær eller nærvær av de ionoforer som skulle testes. L- Potensialisering av den cytotoksiske effekt ved ionoforene.

Resultatene fra disse forsøk er presentert i form av dose/ effekt-kurver som på ordinaten viser den cytotoksiske effektivitet bestemt som angitt ovenfor ved inkorporering av markøren, beregnet i % av den verdi som ble oppnådd på kontrollcellene uten cytotoksisk substans, og på abscissen molkonsentrasjonene i toksisk underenhet for de studerte cytotoksiske substanser. Monensin og grisorixin ble testet i en konsentrasjon av 50 nmol, nigericin i en konsentrasjon av 10 nmol og lasalocid i en konsentrasjon av 1 mmol. Det ble foreløpig bekreftet at disse substanser ikke er spontant cytotoksiske for de anvendte celler, i de angitte konsentrasjoner.

Figur 1 viser effekten av monensin på den rette cytotoksisitet for ricin (R) og dets isolerte kjede (A), tatt som referansesubstanser. Verdiene av molkonsentrasjonene (CI 50) som tilsvarer 50% inhibering av inkorporering av markøren, er angitt i Tabell I. De fire kurver som er oppstilt, gjelder henholdsvis: A-kjeden for ricin (A), en blanding av A-kjeden for ricin og monensin (A)+M, ricin (R) og en blanding av ricin og monensin (R)+M.

Disse resultater viser en viss potensialiserende effekt hos monensin på cytotoksiteten til ricin (potensialiseringsfaktor 7) og A-kjeden (potensialiseringsfaktor 47).

Figurene 2 og 3 viser den potensialiserende effekt sammen-lignet NH4<+->ion (10 mM), for monensin (50 nM), for nigericin

(10 nM), for grisorixin (50 nM) og lasalocid (1 pM), på cytotoksisiteten til immunotoksinet anti-T-65 overfor cellelinjene CEM. Verdiene av molkonsentrasjonene (CI 50) som tilsvarer

50% inhibering av inkorporering av markøren er gjengitt i Tabell II.

På disse figurer viser de forskjellige kurver henholdsvis resultater oppnådd med: A-kjeden i ricin (A), A-kjeden i ricin blandet med monensin (A)+(M), den konjugerte anti-T-65 (AT65)

og den konjugerte AT65 tilsatt nigericin (AT65N), monensin (AT65M) , ammoniumklorid (AT65C), grisorixin (AT65G)"og lasalocid (AT6 5L).

Disse resultater viser at den potensialiserende effekt for nigericin er svært nær effekten for ammoniumionet og av en størrelsesorden faktor 700 0, mens den for monensin er klart høyere, av størrelsesorden 55.000. Grisorixin og lasalocid har en mellomstilling med potensialiserende effekter av størrel-sesorden henholdsvis 27.000 og 36.000. Disse faktorer er betydelig høyere enn dem som observeres med ricin eller den isolerte A-kjede. Man må også bemerke at, i nærvær særlig av monensin, immunotoksinet anti-T-65 er et cytotoksisk middel nær 10 ganger så kraftig som ricin selv, idet det oppviser

(i motsetning til ricin) en betydelig selektivitetsfaktor for de enkelte målceller.

2 - Akselerering av den cytotoksiske kinetikk ved hjelp av ionoforene.

Effekten av ionoforene begrenser seg ikke til i betydelig

grad å forsterke immunotoksinenes cytotoksiske aktivitet.

Disse substanser tillater også på meget betydelig måte å aksele-rere immunotoksinenes cytotoksisitet-kinetikk, hvilket de føl-gende forsøk viser: I disse forsøk er det - i likhet med ovenfor - målt inkorporering av radioaktiv markør i cellene, men denne gang som funksjon av inkubasjonstid for cellen med immunotoksinet,

i fravær og i nærvær av 50 nM monensin som potensialisator.

Dette forsøk er utført på to cellemodeller ved anvendelse av immunotoksinene med tilsvarende specificiteter, dvs.:

Human-CEM-lymfoblastoidlinjen med immunotoksinet anti-T-65

i en konsentrasjon av 50 nM. Resultatene er vist. i'Figur 4.

På denne figur gjelder kurvene henholdsvis anti-T-65 (AT65) og blandingen av anti-T-65 og monensin (AT65M).

Lymfomlinjen fra WEHI 7 mus med immunotoksinet anti-Thy 1.2 (som beskrevet i søkerens franske patentsøknad nr. 79 24655) i en konsentrasjon av 50 nM. Resultatene er vist i Figur 5. På denne figur gjelder kurvene henholdsvis den konjugerte forbind-else anti-Thy 1.2 (AT12) og blandingen av denne konjugerte for-bindelse og monensin (AT12.M).

For CEM-linjen viser det seg at i fravær av potensiali-

sering er kinetikken ved cytotoksisiteten svært langsom, som vist i kurve a. Andre forsøk under de samme betingelser har vist at den nødvendige tid for å oppnå 5 0% reduksjon av inkorporering av markøren var av størrelsesorden 20 timer. Derimot,

i nærvær av monensin, manifesterer det seg en bemerkelsesverdig akselerering av kinetikken (kurve b) siden den tid som er nød-vendig for å oppnå 50% inhibering av inkorporeringen er av størrelsesorden bare 3. timer.

For linjen WEHI 7 er resultatene analoge siden de nødvendige tider for oppnåelse av 50% inhibering av inkorporeringen er henholdsvis, i fravær og i nærvær av nonensin: 10 timer og 1,5 timer.

En slik akselerasjonseffekt er av den største betydning

for alle anvendelser av immunotoksiner og spesielt for de tera-peutiske anvendelser in vivo, da hurtigheten av legemidlets virkning alltid er en svært gunstig faktor for behandlingens

effektivitet.

Forøvrig har vi studert toksisiteten til dé enverdige karboksyliske ionoforer, alene og i tilknytning til A-kjeden i ricin.

Ifølge J.W. Westley [Advances in Applied Microbiology,

22, 177, (1977)] er de letale doser 50% (DL 50) hos mus administrert intraperitonealt henholdsvis : 16,8 mg/kg for monensin, 65 mg/kg for nigericin, 15 mg/kg for grisorixin og

64 mg/kg for lasalocid.

Disse resultater er bekreftet av våre egne forsøk. Således er den skarpe toksisitet for monensin ved unik administrering ad intraperitoneal vei til musen Charles River France CDlkarakterisert veden 50% letal dose på 340 ug pr. mus, 17 mg/kg av kroppsvekt.

Forøvrig som det er vist ovenfor at monensin. potensialiserer den cytotoksiske aktivitet for A-kjeden i ricin noe for dyrkningscellene, var det viktig å bekrefte på dette modellsys-tem for ikke-spesifikt cytotoksisitet, som hadde global toksi-kologisk anslag med denne egenskap på hele dyret. Vi har derfor bestemt den 50% letale dose for A-kjeden i ricirt administrert ad intraperitoneal vei til musen Charles River France CDl, i fravær eller med samtidig administrering av 10 ug eller 20 ug av monensin pr. mus, ad intraperitoneal vei.

De verdier som ble funnet er som følger:

Disse resultater viser en lett økning av toksisiteten for A-kjeden når den administreres samtidig med monensin. Denne økning av toksisiteten med en faktor på bare 2,5 (for den sterk-este dose av monensin som er forsøkt) utgjør ikke en begrensning i anvendelsen av ionoforene in vivo under hensyntagen til de meget viktige potensialiserende og akselererende effekter i forhold til immunotoksinenes spesifikke cytotoksisitet, slik dette er vist ovenfor.

Man kan altså som legemidler for human-terapi, anvende den sammenstilling som består av et immunotoksin og en enverdig karboksylisk ionofor. De kan anvendes for behandling av kanser-øse og andre lidelser som ville være ømfintlige overfor antistoffer som benyttes for fremstilling av immunotoksinet.

Med tanke på å eliminere alle kreftceller må behandlingen utføres med en tilstrekkelig dose av immunotoksin knyttet til en mengde av enverdig karboksylisk ionofor som kan variere mellom 1 og 100 mg for hver administrering av immunotoksin. Behandlingens varighet vil måtte bestemmes i hvert tilfelle avhengig av tilfellet og naturen av den lidelse som skal behandles.

De nye legemidler som fremstilles i henhold til oppfinnelsen er tilpasset for anvendelse ved injeksjon og fortrinnsvis intravenøst.

Bestanddelene i det sammensatte preparat vil bli oppbevart separat, og blandes umiddelbart før bruk, i sprøyten eller i perfusjonsløsningsmidlet.

Claims (4)

1. Legemidler, karakterisert ved at de omfatter en sammensetning av minst ett immunotoksin og minst én enverdig karboksylisk ionofor.

2. Legemidler som angitt i krav 1, karakterisert ved at immunotoksinet er immunotoksinet anti-T-65 og at ionoforen er valgt blant monensin, nigericin, grisorixin og lasalocid.

3. Legemidler som angitt i krav 1, karakterisert ved at immunotoksinet er immunotoksinet anti-Thy 1.2 og at ionoforen er valgt blant monensin, nigericin, grisorixin og lasalocid.

4. Legemiddel som angitt i hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at det er tilpasset for injeksjon, fortrinnsvis ad intravenøs vei.