NO821287L - Fremgangsmaate for fremstilling av et enzym (angiokinase) - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et kar-fibrinolytisk aktivt prinsipp benevnt angiokinase-enzym ved å gå ut fra rikt vaskula^

risert pattedyr-bindevev og det særegne ved fremgangs-

måten i henhold til oppfinnelsen er at det nevnte vev avfettes, tørkes og pulveriseres, pulveret underkastes pan-kreatin-lysis ved å danne en vandig suspensjon av det ved omtrent nøytral pH, det tilsettes omtrent 1

vekt% pan-kreatin i forhold til vekten av det anvendte pulver, en temperatur på 45-50°C opprettholdes i omtrent 2 4 timer for å oppnå et lysat,

lysatet surgjøres med fortynnet mineralsyre og væsken separeres fra det resulterende bunnfall,

en tilstrekkelig mengde ammoniumsulfat tilsettes til den nøytraliserte oppløsning for å oppnå en ammoniumsulfat-konsentrasjon med omtrent 35% metning for å utfelle den aktive del av lysatet,

bunnfallet samles og det dannes en vandig suspensjon av dette ved nøytral pH,

lysat-suspensjonen renses ved selektive fraksjoneringsoperasjoner bestående av absorpsjonsoperasjoner,

fraksjonene inneholdende den nevnte angiokinase samles ved måling av deres fibrinolyseaktivitet for oppnåelse av et produkt med et protein-nitrogeninnhold på 0,2 milli-gram/ml og en midlere molekylvekt på omtrent 18 000 Dalton.

Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patent-kravene.

Oppfinnelsen vedrører således en ekstraksjonsprosess for fremstilling av et blodkar-firbinolytisk aktivt prinsipp ved å gå ut fra pattedyr-bindevev, såvel som det spesi-

fikke enzymatiske produkt på denne måte, benevnt "angiokinase".

Produktet kan anvendes i farmasøytiske preparater for forhindring og behandling av sykdommer bevirket ved unormal fibrin- og tromme-dannelse i forskjellige områder og steder.

Formålet for oppfinnelsen er å tilveiebringe et nytt naturlig ekstraktivt prinsipp av enzymatisk type med fibrinolytisk virkning in vivo, både direkte og ved plasminogen-aktivering. Da det nevnte prinsipp oppnås fra det høyt vaskulariserte bindevev i kjøttdyr, kan det enkelt og utvetydig benevnes "angiokinase" i analogi med uro-kinase, den proteolytiske plasminogen-plasmin-aktivator som isoleres fra urinen av menn, se USA-patentskrifter 2.961.382, 2.983.647, 2.989.440, 3.081.236, samt White et al, Biochemistry, 5, 2160 (1966). Et annet analogt navn er "streptokinase" som er en annen plasminogen-aktivator isolert fra hemolytiske streptokokk-kulturer (se US-patentskrift 3.016.337, 3.042.586, 3.063.913, 3.063.914, 3.107.203, 3.138.542 og 3.276.304).

Betydningen og de mer spesielle trekk ved oppfinnelsen såvel som anvendelsen ved forhindring og helbredelse av venal og aterial trombose i mennesker vil lettere for-stås etter en kort drøftelse av det for tiden aksepterte og ålment kjente syn at mammal-blodkarvegger har fibrinolytisk virkning. Denne virkning involverer produksjon av prinsipper spesifikke for denne aktivitet, nemlig kjent som plasminogen-aktivatorer. Tidligere synspunkter var at den fibrinolytiske aktivitet av karveggen overveiende ville involvere venene og de små kar, men senere ble aktiviteten også iakttatt i store kar, spesielt i aorta-veggen. Forskning har vist at blodkarveggene i mennesker drept ved ulykker (etter kanylering av femoral-arterien og venen) inneholdt en betraktelig mengde av såkalte "plasminogen-aktivatorerV.

Der var ingen effektiv konklusjon for de ovennevnte undersøkelser med hensyn til isolering ved kjemisk-fysikalsk ekstraksjon av et spesielt aktivt prinsipp fra karveggen og fra andre høyt vaskulariserte bindevev. Den foreliggende oppfinnelse foreslår derfor isolering

og karakterisering av det aktive fibrinolytiske prinsipp fra blodkar generelt og fra aorta spesielt, benevnt "angiokinase" som tidligere ikke har vært kjent.

Produktet kan anvendes for klinisk bruk for terapeutiske indikasjoner som et generelt antitrombotisk middel og også innenfor visse grenser som et blodplate-anti-aggregasjonsmiddel. Nærværet av angio-kinase etter begynnende fibrinolytisk aktivitet overfor veggene og deretter blodet tilveiebringer et første motstandsnivå

mot trombosebetingelser i varmblodige dyr inklusive mennesker. Substansen angiokinase, isolert og beskrevet heri, er det fibrinolytiske prinsipp i karvegger generelt, og i aorta spesielt og som kan tilføres på nytt til sirkulerende blod for å gi dette blodet et fibrinolytisk potensial.

Angiokinase viser den viktige egenskap at den virker både som en aktivator (plasminogeh-plasmin) og som et aktuelt plasmin. Denne konklusjon er godt dokumentert, som beskrevet i det følgende i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse, og er av betraktelig teoretisk som praktisk betydning. Hittil har alle undersøkelser av den fibrinolytiske aktivitet i karveggene bare vist de enkle akti-veringsvirkninger av forhåndsdannet plasminogen i sirkulasjonen. Angiokinase virker imidlertid også direkte på nøyaktig den samme måte som plasmin.

De nærmere detaljer ved oppfinnelsen skal drøftes mer detaljert i det følgende.

Som kjent er et forhold av særlig betydning i sirkulasjons-patologien, både på det venale og arteriale område, den endovasale avsetning av fibrin, idet denne fører både til stenose av kar-lumen og til okklusjon (trombose).

FibrinTavsetning spiller også en særlig viktig rolle

i dannelsen av hvite blodplatetromber, da det er nød-vendig for adhesjon av platene til karveggen og for plateaggregasjonen såvel som stabiliséring av plate-aggregatet.

En viktig og fundamental prosess innen fysiopatologien

er å holde grenseflaten mellom blod og karvegg fri.

Det er også vel kjent at opptreden av endovasal okklusjon (stenose og trombose) er en uomgjengelig og bestemmende faktor for at en klinisk ikke-påvisbar blodkar-betingelse skal bli synlig ved sine symptomer og således bli en klinisk manifest sykdom.

Dette er ganske hyppig tilfellet med den athero-arteriosklerotiske prosess som i seg selv er klinisk usynlig men blir synlig først i det kliniske trinn (eller hovedsakelig) når den endovasale stenoseprosess aksentueres eller går over til aktuell okklusjon.

For både forhindring og terapi er det derfor av primær viktighet på den ene side å blokkere og forhindre dannelse og aksentuering av fibrin-avsetninger og på den annen side å oppløse disse avsetninger når de dannes.

Som det er vel kjent må terapien for dette institueres for å oppløse fibrin som dannes og de allerede dannede fibrin-avsetninger.

Denne terapi involverer således de kjente produkter med fibrinolytisk aktivitet.

Blant medisinere er det fullstendig enighet med hensyn til betydningen og viktigheten av fibrinolytisk terapi og denne antar en primær rolle innen sirkulasjons-patologien.

Disse er de to betingelser som ligger under den fibrinolytiske terapi, nemlig den første som nevnt ovenfor, med at fibrin er en bestemmende faktor i stenose og endovasal okklusjon.

Den annen er at en mangel på fibrinolytisk aktivitet i blodkarsystemet er en patogenetisk faktor av primær viktighet ikke bare for å behandle stenose- og kar-okklusjonsprosessen men også ved den samme behandling for arteriosklerotiske lidelser.

For liten kapasitet med hensyn til fremstilling eller frigivning av fibrinolytisk aktivitet av karveggen er en viktig faktor ved å bestemme den atherosklerotiske prosess generelt og spesielt den endovasale okklusjons-prosess. En mangel på blodkar-fibrinolytisk kapasitet har derfor betraktelig betydning for apthogenesen av athero-sklerotiske lidelser såvel som for bestemmelsen av dens mest alvorlige komplikasjon, nemlig trombosen.

Det er også kjent at vev som er rike på blodkar, arteriale og venale, er istand til å produsere og frigi plasminogenaktivatorer og således å vise fibrinolytisk aktivitet. Med en vev-aktivator av plasminogen menes da fremstilling av fibrinolytisk aktivator innen både vev- og karområdet.

Under anvendelse av metoder med vev-ekstraksjon, histo-kjemi og in vitro-vevkulturer, er vev- og vaskular-fibrinolytisk aktivitet påvist og omfattende bekreftet og endog målt ved naturlige innhold. Det er kjent at vev-aktivatorer kan isoleres fra hjerte, lunge, ovarier, prostata, uterus, etc, og disse vevaktivatorer er hittil kjent som "TA".

Plasminogenaktivatoren, som spiller den viktigste rolle ved intravaskular fibrinolyse, antas å være den som synte-tiseres av de endo-teliale celler som topper blodkarene.

b

Da dette enzym ikke er blitt isolert ogkarakterisert,

har det ikke vært mulig å identifisere denne vaskulare aktivitet med aktiviteten av vev-aktivatoren, selv om disse aktiviteter faktisk kan være de samme.

Den vaskulare og endo-theliale aktivator har vært

formål for tallrike undersøkelser, og er blitt erkjent og påvist såvel som endog isolert, fra synspunkter med eksperimentell medisin og biologisk aktivitet. Plasminogenaktivatoren er blitt isolert og demonstrert fra de vaskulare vev i human-lik.

Det bemerkes imidlertid at under den trombotiske tilstand

er kapasiteten for fibrinolytisk fremstilling, både arterielt og venøst, nedsatt og ufullstendig.

Et annet betydningsfullt forhold som må betraktes er

grunnen til at dette holdes for å være meget viktig ikke bare for de trombotiske komplikasjoner som oppstår under forløpet av vaskulopatier (f.eks. athero-arteriosklerotiske og varikose komplikasjoner) men også for deres patogenese, som allerede nevnt for nærværet av en fibrinolytisk mangel i karveggen.. Mangel på plasminogen-aktivatorer karakteriserte den atherosklerotiske lidelse.

Et betydningsfullt forhold er bemerket mellom redusert fibrinolytisk aktivitet av karveggen og risikoen for atherosklerose. En nedsatt aktivitet er funnet å være direkte proporsjonal med større og mer alvorlig utsatthet og følsomhet for eksperimentelt-induserte atheromatøse prosesser.

Tilførsel av antifibrinolytiske midler vil videre for-sterke den atheromatøse prosess mens tilførsel av fibrinolytiske midler vil svekke den.

Tilførsel av antifibrinolytiske medisiner øker likeledes faren for trombotisk komplikasjon og faren for systemiske trombotiske komplikasjoner på tas i betraktning ved tilførsel

av anti-fibrinolytiske medisiner.

På det kliniske området er en mangel på fibrinolytisk aktivitet også blitt vist ved athero-sklerotiske lidelser og som hovedsakelig kunne forbindes med en manglende produksjon og frigivning av plasminogenaktivatorer av kar-veggen og spesielt dens endoterium.

Ved atherosklerotiske vaskularbetingelser er det blitt funnet en reell utilstrekkelig og redusert evne til fibrinolytisk respons av karveggen.

Et annet spesielt viktig funn har vært en manglende lokal fibrinolytisk aktivitet, eller snarere en mangel overveiende tilsvarende de vaskulare regioner påvirket av den atherosklerotiske prosess i sammenligning med mindre påvirkede eller uskadede områder.

Med hensyn til det humane myokardium etter opptreden av en infarkt (ekstrakter fra myokardialvev tatt hurtig etter en infarkt), er det funnet en tydelig reduksjon eller fravær av fibrinolytisk aktivitet. Myokardialvev-ekstrakter fra infarkt-områder ved fibrose- og binde-vevreparasjonsfasen viser imidlertid en slik aktivitet.

Analoge resultater ble funnet ved eksperimentelt-indusert myokardialinfarkt: Den fibrinolytiske aktivitet som tidligere manglet ble da funnet i skadede områder som under-gikk reparasjon, på grunn av plasminogenaktivatorene i de nylig dannede blodkar.

Et,annet betydningsfullt funn er en fibrinolytisk kompro-misering i okklusive venale betingelser. Fibrinolytisk aktivitet reduseres og kompromiseres i veggen av den trombe-affiserte vene. Lav fibrinolytisk aktivitet i karveggen er funnet å være forbundet med en økning i tendensen til å utvikle trombose i de dype vener.

En stor prosentandel av en lang rekke pasienter med alvorlige tromboembolisk lidelse viste således nedsatt fibrinolytisk aktivitet i karveggen.

Forholdet mellom lav fibrinolytisk aktivitet i karveggen

og blodet på den ene side og forekomsten av trombose eller pre-trombotiske betingelser på den annen side er blitt bekreftet ved flere undersøkelser.

Diabetes melitis, spesielt i kombinasjon med fedme,

er b litt forbundet med redusert vaskular- og/eller blod fibrinolyse på grunn av stasis.

Det er også kjent at fedme øker pre-disposisjon for diabetikere for vaskulare okklusjoner.

Med hensyn til en annen situasjon som begunstiger trombose-utvikling, er nedsatt fibrinolytisk aktivitet i karveggen og/eller redusert frigivning av fibrinolyse-aktivatorer i karveggen, funnet å være et regulært post-operasjonsfenomen, og som er funnet å være spesielt redusert for de pasienter som utviklet trombose.

Også umiddelbart etter større operasjoner kan ikke det vaskulære endotelium reagere på stasis som det kunne før operasjonen. Betegnelsen "endothelial dekompensasjon" er blitt foreslått for å forklare nedsettelsen i fibrinolytisk aktivering i den post-operative periode.

Redusert vev-fibrinolyse tenkes å være implisert i detæ post-trombotiske syndrom, med følgelig utilstrekkelig blodforsyning til huden og ulcerasjon.

Disse kliniske og eksperimentelle data viser at parietal-plasmominogen-aktivator nedsettes i: sterk grad ved trombinogenese og denne iakttagelse foreslår at disse midler forbrukes i forsøket på å avhjelpe trombosen.

Videre bevis for den anti-trombotiske virkning av den vaskulære plasminogen-aktivator ble oppnådd da det ble funnet at den største fare for eksperimentelt-indusert okklusjon (f.eks. under de første 11 døgn etter en operasjon) generelt falt sammen med redusert eller endog fraværende fibrinolytisk aktivitet i kar-

veggen.

Alle de kjente data på dette området har overbevist eksperter på området at adekvat fibrinolytisk behandling er en viktig del av human-terapien i de indikerte tilfeller.

Fordelene i forhold til tidligere kjent teknikk beskrives i det følgende. Tidligere tilgjengelige fibrinolytiske aktivatorer er vel kjent å være enten av den indirekte eller direkte type.

a) Indirekte midler

Disse er ikke del av det aktuelle fibrinolytiske system,

men stimulerer snarere vevene (f.eks. karveggen) til fremstilling av fibrinolytiske aktivatorer (f.eks. stanazolol, etyl-etrenol, penformin) eller kan mobilisere de allerede frembragte aktivatorer fra veggen (f.eks. nikotinsyre og dens derivater, acetylcholin, etc).

Den første viser mer kontinuerlig fibrinolytisk aktivitet som imidlertid er ganske beskjeden og noe sakte - enkelte ganger trenges måneders behandling før noen virkninger sees.

Den siste viser hurtigere og uttalt virkning men denne

er fullstendig forbigående og etterfølges av perioder med redusert fibrinolytisk aktivitet hvorunder organismen er mer utsatt for trombose.

b) Direkte midler

Disse danner del av selve det fibrinolytiske system og

involverer både STK (streptokinase) og US (urokinase)

nevnt tidligere. Disse er de midler som faktisk nesten alltid anvendes.

Det skal bemerkes at mens disse midler kan utvikle

prompt- og kontinuerlig fibrinolytisk aktivering er de fremdeles langt fra å tilfredsstille fysiopatologiske og kliniske krav. Spesielt lider STK av mangelen på anti-stoff-inaktivering. Videre tilveiebringer både STK

og UK fibrinolytisk aktivering som fører til plasmin-dannelse som i sin tur inaktiveres av antiplasminer.

Den fibrinolytiske aktivering indusert av STK og UK,

og således den derav følgende plasmin-dannelse (den essensielle betingelse for deres effektive virkning) mot-virker faktisk den inhibering som bevirkes av anti-plasminene i sirkulasjonen og spesielt av det hurtigvirkende alfa2~antiplasmin. Dette faktum fører til nøytralisering av en gitt del av disse aktivatorer og således nødvendigvis til bruken av forhøyede doser for å overvinne denne inhibering med derav følgende fare for hemorrhage.

Videre er UK forskjellig fra vev-aktivatoren og således

fra den vaskulære plasminogen-aktivator ved at den danner en del av det fibrin-fri urinsystem og fører således ikke til blodkar-r-regionene. UK viser derfor lave'affinitet for fibrin, til forskjell fra den vaskulære plasminogen-aktivator med sin ganske uttalte aktivitet i dette henseendet. Syntetisert av nyrene og isolert fra urinen er UK lokalisert i urinveis-systemet hvor den ikke har noen virkning på intra-vaskulær fibrinolyse.

Formålet for oppfinnelsen er som tidligere nevnt isolering og preparering i terapeutisk egnet form, av en vev-plasminogenaktivator oppnådd ved hjelp en ekstraksjonsprosess fra rikt vaskulariserte pattedyrorganer og vev.

Ut fra dens aktivitet av enzymtypen er aktivatoren blitt benevnt "angiokinase" i analogi med urokinase og streptokinase.

Vev-plasminogenaktivatoren, inklusive den som kommer fra karveggen (også kjent som "endothelial aktivator", da den frembringes av vaskulær endothelia) er forskjellig fra urokinase og streptokinase i sin affinitet for fibrin. Dette forhold ble anvendt for dens isolering som beskrevet

i det følgende:

Endothelial plasminogenaktivator absorberes lett på fibrinoverflaten og letter plasminogen-aktivering på dette sted. Plasminogenaktivatoren tilstede i blodet er høyst sannsynlig identisk med den vaskulære plasminogen-aktivator som tilsvarer oppfinnelsen. I sin tur er plasminogenåkti^vatorene i vevene sannsynlig meget like eller identiske med blod- og vaskular-aktivatoren.

Tidligere har vev-aktivator (endothelial) ikke vært tilgjengelig for terapien selv om den rent hypotetisk kunne antas å være den mest effektive.

Vaskulær plasminogen-aktivator absorberes sterkt av fibrinet. Det fibrinsted som fibrerer plasminogenet er det samme som det fikserer den vaskulære aktivator. På denne måte dannes en enkel blanding av plasminogen, dets aktivator og fibrinet til å danne plasmin på innsiden av tromben.

På denne måte blir det plasmin sted som fikserer den hurtig opptatt av fibrinet slik at dette beskyttes mot inhibering av alfa2-antiplasmin. STK og UK er imidlertid, som nevnt ovenfor, utsatt for anti-plasmin inhibering.

Det er således klart at det er ganske viktig å ha tilgjengelig for terapien den korrekte form av vev-plasminogen-aktivatoren i samsvar med oppfinnelsen, spesielt den vaskulære eller endo-theliale aktivator.

Det aktive fibrinolytiske prinsipp i samsvar med oppfinnelsen var tidligere kjent vare i begrenset grad basert på dets antatte eksistens basert på sine biologiske virkninger. Det ble benevnt "angiokinase" siden det kommer fra karveggen eller i alle fall fra rikt vaskularisert vev. Prinsippets utvilsomme biologiske aktivitet er blitt bekreftet basert på en virkningsmekanisme spesielt egnet for dets fysiopatologiske og terapeutiske formål.

Det aktive prinsipp i samsvar med oppfinnelsen frembyr følgende fordeler fremfor tidligere praksis; dvs. bruk av STK og UK. 1. Nøyaktig, hurtig og betydelig fibrinolytisk aktivitet. 2. Denne fibrinolytiske aktivitet er påvist å være av den binære type, da det aktive prinsipp viser både aktivatortype og plasmintype-aktivitet. 3. Den resulterende plasmin-aktivering er ufølsom overfor plasma-antifibrinolytiske midler og spesielt overfor alfa2-antiplasmin.

4. Ingen antigen-effekt.

5. Høy fibrin-affinitet.

6. Ingen fare for hemorrhage innenfor et stort doserings-område og således utmerket toleranse. 7. Nøyaktige målinger i fibrinolytiske aktivitetsenheter.

I den etterfølgende Tabell I sammenlignes den terapeutiske bruk av STK og UK på den ene side med angiokinase (AK)

på den annen side.

Det bemerkes at .den binære fibrinolytiske virkning av angiokinase frembyr en betraktelig fordel både absolutt og relativt (til STK og UK) idet den tillater fibrino-< lytisk aktivitet endog i mangel av eller fravær av plasminogen, dvs. i situasjoner hvor bare en aktivator er ineffektiv.

I sin tur garanterer fravær av inhibering av plasmatiske inhibitorer en tilfredsstillende sammenheng og proporsjo-nalitet mellom dosering og den resulterende .virkning.

Det er klart at tilveiebringelsen av dette vev (vaskular)-fibrinolytiske aktive prinsipp, nemlig av angio-kinase, representerer viktig og ekte fremskritt innenfor området av fibrinolytisk og trombolytisk terapi. Dette fremskritt tillater bruk av det samme fibrinolytiske prinsipp direkte involvert i koagulerings-homeostase i blodkarene.

Som utgangsmaterial anvendes rikt vaskularisert bindevev fra pattedyr, spesielt aorta fra dyr som kveg og griser.

Det oppløste lysat overføres til et bunnfall som så fjernes fra oppløsningen, foretrukket ved en filtrerings-^prosess.

Den selektive fraksjonering av lysatsuspensjonen kan fore-gå på forskjellige måter, f.eks. ved selektiv eluering av en gelkolonne etterfulgt av rensing via selektiv fraksjonering ved hjelp av kromatografering, eller ved eluering under anvendelse av et stort volum gel i forhold til den væske som skal renses,og som fører til en fortynnet oppløsning av det aktive prinsipp som så konsentreres ved å fjerne noe av vannet.

Som nevnt har det kar-fibrinolytiske aktive prinsipp benevnt angiokinase i samsvar med oppfinnelsen et protein-N-innhold på 0,2 mikrogram/ml og en midlere molekylvekt på omtrent 18.000 Dalton.

Angiokinasen kan anvendes i humanterapien for profylakse

og behandling av unormal fibrin-dannelse og trombedannelse i deres forskjellige manifestasjoner.

Fremgangsmåten for fremstilling av det aktive prinsipp er således basert på valget av utgangsmaterialer bestående av rikt vaskulariserte bindevev for oppnåelse av et produkt inneholdende det aktive prinsipp i høyt konsentrert form, sammen med hovedsakelig protein-forurensninger. Trinnvis rensing er således nødvendig for å fjerne de uønskede forurensninger.

Oppfinnelsen skal nærmere illustreres ved hjelp av de vedføyde tegninger hvori: Fig. 1 er et diagram som viser den fibrinolytiske aktivitet av fraksjonene oppnådd fra lysatet under den første rensefase under anvendelse av adsorpsjons-kromatografering. Fig. 2 er et diagram som viser den fibrinolytiske aktivitet av fraksjonene oppnådd fra lysatet under den annen rensefase under anvendelse av adsorpsjonskromatografering. Fig. 3 er et spektrum anvendt for å kontrollere adsorpsjons-kromatograferingsrensingen av lysatet. Fig. 4 viser den fibrinolytiske aktivitet av fraksjonene oppnådd fra lysatet i den annen rensefase under anvendelse av ione-bytter-kromatografering. Fig. 5 og 6 er diagrammer som viser angio-kinasen plasminogenaktivering ved forsøk med korte, henhv. lange inkubasjonsperioder.

Utgangsmaterialet for angiénase-ekstraksjonen består av forskjellige pattedyrorganer, spesielt organer og bindevev fra kveg og griser som har en høy andel av vaskularisert vev.

Ved oppfinnelsen ble angiokinase isolert og identifisert både fra arterie- og vene-karvev og fra høyt vaskulariserte organer og vev hvori det var tilstede i mengder tilstrekkelig for ekstraksjon.

Eksempler på organer og vev anvendt for angiokinaseeks-traksjon inkluderer aorta, hjerte, lunge, milt, lever, pancreas, selv og aorta foretrekkes.

Utgangsmaterialet behandles først for å fjerne fettstoffer, f.eks. ved ekstraksjon med et løsningsmiddel som aceton,

og tørkes deretter, findeles til pulver og underkastes pancreatin-lyse. Lysen gjennomføres ved å suspendere det tørkede organ på nytt i en vandig oppløsning ved nøytral pH, f.eks. pH 7,4 fosfatbuffer, og tilsette industrielt pancreatin i en mengde tilsvarende omtrent 1 vekt% av organet i suspensjon. Lysen gjennomføres ved oppslutning ved en temperatur på 45-50°C, foretrukket med konstant omrøring, i omtrent 24 timer.

Etter oppslutningen fjernes de oppløselige deler ved sentrifugering og væsken samles og surgjøres til pH 2,5, foretrukket med fortynnet saltsyre, inntil det dannes et bunnfall. Bunnfallet separeres på nytt ved sentrifugering og væsken som samles nøytraliseres til pH 7 ved tilsetning av fortynnet NaOH.

Den aktive komponent separeres fra denne nøytraliserte væske ved tilsetning av ammoniumsulf at (NH4).2'S04). inntil konsentrasjonen utgjør 35% av total metning. På denne måte dannes et bunnfall som inneholder den aktive fibrinolytiske komponent i organ-lysatet.

Bunnfallet samles ved sentrifugering og væsken kastes. Bunnfallet oppslemmes deretter på nytt i et lite volum fosfatbuffer ved pH 7,4.

Den resulterende suspensjon er allerede en konsentrert ekstrakt av det aktive prinsipp angiokinase.

Forskjellige reproduserbare industrielle metoder kan anvendes for å gjennomføre denne rensing, og de følgende to nevnes som eksempler.

Den første metode involverer en 2-trinns rensing, det første trinn ved gel-filtrering til å gi en delvis rensning og det annet ved fraksjonering vedo hjelp av adsorpsjons- eller ionebytter-kromatografering.

Den annen metode består i en operasjon analog med det første trinn ovenfor, men ved å anvende høyere forhold mellom gel og produkt som skal renses slik at det oppnås bedre rensing i et eneste trinn. Det resulterende produkt er da meget fortynnet og krever sterk konsentrasjon ved fjernelse av overskuddsvannet.

For å beskrive oppfinnelsen mer detaljert, beskriver de følgende eksempler de operasjoner som ble gjennomført for rensing av lysatet fremstilt som beskrevet i det foregående.

Eksempel I Første delvis rensetrinn for lysatet under

anvendelse av "Sephadex g-25" filtreringsgel.

Dette er en enkel og hurtig metode for delvis rensing av store mengder lysat fremstilt som beskrevet i det foregående, og fører til god fraksjonering av proteinene basert på deres molekylvekt. Sammen med andre store molekyler blir det aktive prinsipp fullstendig ekskludert av gelen og blir således øyeblikkelig eluert, mens kuleformede globuler under den høyeste fraksjoneringsgrense (fra 1000 til 5000 Dalton for "Sephadex G-25" anvendt i dette eksempel) elueres senere.

Denne metode vil også avsalte lysatene, ved kombinasjon

med bufferen.

Fordelen med denne metode er at den tillater filtrering

av store volumer idet volumene av substans som elueres kan være opp til 30% av volumet av gelen. For eksempel kan omtrent 300 ml av organ-lysatet anvendes for hver liter gel.

De følgende forsøksbetingelser ble anvendt:

10 ml bovin aorta-lysat anbringes i en kolonne (2,6x40 cm) sammen med "Sephadex G-25" (60 ml gel, 33 ml/time strømnings-takt, omtrent 5 ml hver 9 minutter) i 0,1M TRISS buffer (trihydroksymetylaminometan) behandlet med 0,02M CaCl2 ved pH 8,2.

Elueringsmidlet samles i 5 ml fraksjon. Fraksjonene inneholdende det aktive prinsipp kontrolleres ved å

måle deres fibrinolyseaktivitet under anvendelse av metoden beskrevet i det følgende. Under disse forsøks-betingelser elueres det aktive prinsipp i de første 8 fraksjoner.

Fig. 1 er en grafisk fremstilling av det typiske forløp av denne første delvise rensning av organ-lysatet.

I fig. 1 angis fraksjonsantallet langs ordinaten mens lysisarealet i mm 2 angis langs abscissen (målt som beskrevet senere).

Under anvendelse av samme metodikk med en annen buffer oppnås en analog delvis rensing, f.eks. ved anvendelse av fosfat istedet for TRIS-bnffer ( på nytt ved pH 8,2 ), eller 0,1M natriumacetatbuffer (ved en annen pH 4,5). Disse og andre variasjoner er vel kjent for den sakkyndige på området. Før det annet trinn gjennom-føres for å oppnå en høy renhetsgrad av det aktive prinsipp må først en dialyse-prosess gjennomføres.

Som nevnt tidligere, etter det første delvise rensnings-trinn, kan angiokinasen fremstilles under anvendelse av forskjellige rensemetoder. De følgende eksempler gjengir bare metodene som gir spesielt fordelaktige resultater, selv om andre metoder selvfølgelig kan anvendes.

Eksempel II Annet trinn - total rensning av angio-kinase under anvendelse av adsorpsjons-kromatografering.

Enzymet angiokinase kan renses ved hjelp av adsorpsjons-kromatografering under anvendelse av forskjellige kromatografiske substanser, f.eks.: A) Soyabønne-trypsin inhibitor (SBTI) bundet til "Sepharose"

B) p-Aminobenzamidin (p-ABM) bundet til "Sepharose".

II - A) Anqiokinasé- rensning ved hjelp av adsorpsjons-kromatografering med sovabønnetrypsin- inhibltor ( SBTI) bundet til " Sepharose".

Ved adsorpsjonskromatografering har substratet "Sepharose"

(velkjent produkt fremstilt av Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) her bundet til SBTI, affinitet for

det tilsiktede produkt, nemlig angiokinase. Dette skyldes den kovalente binding som dannes mellom det aktiverte substrat og det:enzymatiske protein som således absorberes fra oppløsningen.

Produktet blir så desorbert ved å variere pH, ione-

styrken av mediet, etter at inært ubundet material er eluert.

Fremstilling av SBTI-" Sepharose"

7,5 g "Sepharose 4B" vaskes på glassull med 0,001 M

NaCl oppløsning (pH 8,3).

Den vaskede del suspenderes i den ovennevnte buffer,

og omføres forsiktig i omtrent 2 timer ved 4°C. Overskudd av bindemiddel fjernes ved vekselvise vaskinger ved høye pH (0,1 M TRIS + 1,0M NaCl; pH 8,0)og lavere pH (0,1M NaAcetat + 1,0M NaCl; pH 4,0) buffere. Til slutt oppnås gelen i den mer sure buffer klar for bruk.

Fig. 2 gir en grafisk fremstilling av adsorpsjonskromatograferingen av 10 ml aktive bovin aorta-lysatfraksjoner (delvis renset som beskrevet ovenfor med "Sephadex G-25"

i 0,1M + 0,02M CaCl 2 buffer, pH 8,2). FraksjonsantPallet er gjengitt langs abscissen mens lysis arealet i mm er angitt langs ordinatet (målt som beskrevet senere).

Forløpet av adsorpsjonskromatograferingen ble fulgt spektrofotometrisk ved 280 nanometer i dette tilfellet.

Den initiale buffer var den som er nevnt tidligere (pH 4,0). Når ekstinksjonskoeffisienten ved 280 nm nådde 0, ble bufferen erstattet med en buffer ved pH 2,0 (0,2 M KC1 + 0,2M HC1). Strømningstakten var omtrent 3-5 ml/5 minutter. Hvert testrør som ble samlet ble teste ved hjelp av.UV.

Som vist i fig. 2 oppnås en skarp proteintopp, som faller sammen med begynnelsen av den fibrinolytiske aktivitet, mellom 40.de og 48.de fraksjon, tilsvarende isoleringen av angiokinase.

Angiokinase kan også renses ved å gå direkte ut fra organ-lysatet uten den delvise rensning beskrevet i Eks.I. I dette tilfellet må imidlertid lysatet dialyseres med den samme buffer.

II - B) Angiokinase- rensninq ved adsorpsionskromato-qrafering med p-aminobenzamidin (p-ABM) bundet til " Sepharose".

Prinsippet er som beskrevet i eks.IIA.

Fremstilling av " Sepharose" med bundet p- ABM

6 g "Sepharose 4b" innveives og gelen vaskes på et glassfilter med 1000 ml 0,5M NaCl (reagens A). 90 mg N-etyl-N<*>-(3-dimetyl-aminopropyl)-karbodiimid-HC1 oppløses i 4 ml destillert vann og bringes til ;pH 3,9 med 1 ml 0,01 NC1 (reagens B) .;90 mg p-aminobenzamidin oppløses i 4 ml destillert vann ved pH 4,5 (reagens C). ;De tre reagenser (A,B,C), blandes sammen til å gi;en oppløsning med endelig pH omtrent 4,8 som deretter omrøres i 20 minutter ved romtemperatur. Harpiksen vaskes så 2 ganger med destillert vann. ;7 ml "Sepharose" bundet til PABM ekvilibreres med 4 til;5 volum 0, IM natriumfosfat ved pH 7,6 i en 1 cm diameter kolonne. Oppløsningen inneholdende angiokinaseenzymet anbringes så i kolonnen (100 ml delvis renset organlysat, bragt til pH 7,6 med 0,1M TRIS buffer, trenges for å mette en kolonne med 7 ml "Sepharose"-p-ABM). ;En del av lysatet settes til side for å måle aktiviteten . ;Aktiviteten måles før og etter at det delvis rensede lysat (eks. I) har passert gjennom det bundede harpiks ;(målt ved fibrinolyse eller kromogenese, som beskrevet;i det etterfølgende) til å vise når kolonnen er mettet,;dvs. når aktiviteten er uforandret.;Kolonnen vaskes så med 0,1M natriumfosfatbuffer;ved pH 7,6 inntil monitoren viser 5% transmisjon idet monitoren er et kontinuerlig registrerende spektro-fotometer innstilt ved 280 nanometer. ;Kolonnen elueres så med 0,1M benzamidin HCl oppløst i;den samme buffer.;Prøvene som samles (4-5 ml) er dem som ankommer umiddelbart etter at den optiske densitet (O.D.) av benzamidin-utstrømningen når den maksimale verdi på omtrent 90% adsorpsjon. ;Prøvene som samles dialyseres med 0,1M natriumfosfatbuffer ved pH 7,6 i et avkjølt kammer ved 4°c, med kontinuerlig omrøring i 24 timer, med hyppige endringer. ;På denne måte fjernes benzamidinet og de dialyserte;prøver fryses etter at aktiviteten er bestemt (som beskrevet i det følgende). ;Fig. 3 viser den spektrofotometriske kurve for kromatograferingskontrollen, med henvisning til det foreliggende eksempel. Prosent optisk densitet er angitt langs abscissen.og fraksjonsantallet langs dinaten. ;Eksempel III Annet trinn- fullstendig angiokinaserensning ;under anvendelse av ionebytter-kromatografering. ;Ved ionebytter-kromatografering inneholder gelen negativt eller positivt ladede grupper. Hvis gelen er positivt ladet (anion-bytter) adsorberes de negativt ladede komponenter av oppløsningen som skal renses. Ved å anvende en elueringsbuffer med høyere ionestyrke erstattes de proteiner som er adsorbert med negative ioner fra bufferen (salt-gradient). Hver type protein elueres selektivt ved sin spesifikke gradient. Denne metode tillater fullstendig rénsning av angiokinase i organlysatet behandlet som i eksempel I. ;"Sephadex CM-50" (Pharmacia Fine Chemicals) er blitt funnet å være den ideelle ionebytterharpiks for denne rensning. ;De aktive fraksjoner (fra det 6 til det 14 prøverør,;totalt 30 ml), av lysat delvis renset ved kolonne-kromatografering på "Sephadex G-25" (gel-filtrering som i eksempel I) kombineres og føres gjennom en 24 ganger 188 mm kolonne inneholdende "Sephadex CM-50" ;(60 ml) med 0,IM natriumacetatbuffer ved pH 5,0.;Hvis reaksjonene av lysat delvis renset på "Sephadex G-25" er i en pH 8,2 buffer, må de dialyseres og opptas i en pH 5,0 acetatbuffer. Dette er ikke nødvendig hvis den delvise rensning i samsvar med eksempel I er foretatt direkte ved pH 5,0. ;Strømmen reguleres til 16 ml/time og fraksjonene samles med 5 ml/testrør. Forløpet av kromatograferingen følges ved kontinuerlige spektrofotometriske avlesninger ved 280 nanometer såvel som ved å måle den fibrinolytiske aktivitet som beskrevet i det følgende. ;Gradienten fremstilles ved å blande 150 ml 0,1M natriumacetatbuffer med 150 ml 0,1M natriumacetat + 0,6M NaCl buffer. ;Fig. 4 gir en grafisk fremstilling av angiokinaserensningen ved hjelp av ionebytter-kromatografering, som beskrevet i dette eksempel. Fraksjonsantallet er gjengitt langs ordinaten og lysis-arealet i mm 2langs abscissen. ;Kurven viser en første skarp topp tilsvarende et lavaktivitets-produkt. Når adsorpsjonen har gått tilbake til 0 (fra 30. til 60. prøverør) økes molariteten av bufferen under anvendelse av den samme natriumacetatbuf f er inneholdende 0,6 m:.. NaCl (gradientanvendelse). På denne måte økes ionestyrken mens pH forblir fiksert ved 5,0. ;Under disse betingelser passerer annet proteinmaterial;(lav topp, flat adsorpsjon) tilsvarende en høy aktivitetstopp. Disse er fraksjonene inneholdende den rensede angiokinase. ;Eksempel IV Fullstendig angiokinaserensning i et eneste trinn, under anvendelse av kolonne-kromatografering med "Sephadex G-25". ;Denne metode er idémessig den samme som beskrevet i eksempel I, for den delvise rensning av organ-lysatet hvorfra angiokinase ekstraheres. ;Ved å variere forsøksbetingelsene, dvs. ved å variere forholdet mellom gel-volum og substans som skal kromato-graferes, kan enzymet som skal isoleres renses ytterligere. Med andre ord, ved i sterk grad å øke gelvolumet.i forhold til volumet i eksempel I, og ved å redusere strømnings-takten, kan de forskjellige fraksjoner som elueres separeres mer nøyaktig til å gi fraksjoner av angio- ;kinase med høy renhetsgrad.;Denne operasjon må imidlertid etterfølges av en operasjon hvori disse aktive fraksjoner konsentreres, f.eks. ved hjelp av frysetørking, inndampning ved redusert trykk e.l., idet enzymet samles fra kolonnen i en sterkt fortynnet opp-løsning. ;Etter at det rensede enzym er fremstilt under anvendelse av metodene beskrevet i det foregående, blir det identifisert ogkarakterisert. ;En foretrukket, eksempelvis utførelse av denne prosess foretas med et renset lysat fra bovin arterievegg, fremstilt ved hjelp av pancreatin-lyse i samsvar med oppfinnelsen. ;De følgende materialer ble anvendt for å bedømme produktet, under anvendelse av metodene beskrevet i det følgende: Svineplasmin, aktivert med trypsin ("Lysofibrin", Novo Laboratories, København); 2 enheter av dette produkt oppløst i 0,15 M NaCl umiddelbart før bruk; human-plasminogen, renset kromatografisk fra plasma (levert av KABI Company, Stockholm, med 15 U/mg spesifikk aktivitet; ;human-fibrinogen, fremstilt fra Cohn fraksjon I (levert av KABI Company, Stockholm) oppløst i 0,1M Tris buffer, ;pH 7,8; ;trombin ("Topostasin", Roche, Basel), oppløst i 0,15 M NaCl umiddelbart før bruk; ;"Sephadex", CM-50, G-75 og G-100, levert av Pharmacia Fine Chemicals Company, Uppsala, Sverige. ;Resultatene ble sammenlignet med et tidligere kjent fibrinolytisk middel: Urokinase, levert av Leo Company, København, i injiserbar form, i ampuller på hver 7100 CTA-enheter, oppløst i 0,15M NaCl umiddelbart før bruk. ;Følgende metoder ble anvendt for databestemmelser:;1) Fibrinolytisk aktivitet ble målt under anvendelse av Astrup og Mtlllertz<*>fibrinplatemetode, modifisert som beskrevet i det følgende (se avsnittet om titrering). Plasminogenrike og plasminogenfri fibrinplater ble anvendt. Fibrinogenet i de plasminogenfri plater ble koagulert med plasminogenfritt trombin. 2) Proteininnholdet ble målt under anvendelse av metoden til Lowry et al. 3) Molekylvekten ble bestemt under anvendelse av 2,5 ganger 100 cm "Sephadex G-100" kolonner, kalibrert med Dertrane Blue (Vo) og K2Cr04(Vt). Cytokrom C, ovoalbumin, bovinserum-albumin og transferrin ble anvendt som kontroller. 4) Elektroforese på polyakrylamidgel: natrium-dodecylsulfatgel og buffere ble fremstilt i henhold til Weber og Osborn (1969) med og uten beta-merkaptoetanol.

Akrylamidkonsentrasjonen i gelen var 10%. Gelene ble farget for proteiner med Camassie Blue, eller kuttet opp i l,0mm tykke skiver ved hjelp av en skive-kutter.

Skivene ble testet for fibrinolytisk aktivitet ved å anbringe dem direkte på fibrinplatene. 5) Metode for å detektere mulig plasminogenaktivering av den rensede ekstrakt: 1.6 mg plasminogen oppløses i 2 ml destillert vann og dialyseres i 12 timer med 0,01M natriumfosfatbuffer (pH 7,0). En liten mengde uoppløst material fjernes ved sentrifugering ved 4000 g ved en temperatur på +4°C

i 20 minutter. Plasminogenoppløsningen fortynnes med fosfatbuffer til et endelig volum på 2 ml. 1 ml renset ekstrakt (angiokinase, 0,025 ekstinksjon) dialyseres

analogt samtidig.

En ampulle av urokinase oppløses i fosfatbuffer til

den ønskede konsentrasjon.

Plasminogenet inkuberes så med den rensede ekstrakt

av urokinase i følgende forhold:

0,3 mg plasminogen-oppløsning + 0,1 ml angiokinase oppløsning

0,3 ml plasminogen-oppløsning + 0,1 ml urokinaseopp-løsning

0,3 ml plasminogen-oppløsning + 0,1 ml buffer.

Inkubasjonsperioden er 2 timer ved 37°C. Reaksjonen stanses ved å tilsette en liten mengde natriumdodecyl-sulfat og 2 mikrolitere beta-merkaptoetanol i hvert prøverør. 100 mikrolitere av hver av disse oppløsninger undersøkes så med elektroforese på polyakrylamidgel.

Alternativt kan testoppløsningen inkuberes som følger:

0,3 ml plasminogenoppløsning + 0,1 ml glycerol + 0,1 ml

AK.

0,3 ml plasminogenoppløsning + 0,1 ml glycerol + 0,1 ml

UK.

0,3 ml plasminogenoppløsning + 0,1 ml glycerol + 0,1 ml buffer.

Inkubasjonsperioden er 30 minutter hvoretter oppløsningene undersøkes som tidligere beskrevet.

De følgende resultater ble oppnådd fra målingene beskrevet i det foregående: 1) Det rensede enzym (angiokinase) er aktivt både på plasminogenrike og plasminogenfri plater

2) Proteininnholdet i det rensede enzym (ionebytting) er

N = 0,2 mikrogram/ml.

3) Den midlere molekylvekt av angiokinase-proteiner er omtrent 18.000 Dalton. 4) Elektroforeseresultatene samsvarer med resultatene for direkte fibrinolytisk aktivitet. 5) Da både utgangsekstrakten og det rensede prinsipp var aktive på fibrinplatene både med og uten plasminogen, ble det aktive prinsipp testet for å bestemme om det bare hadde plasminaktivitet eller også en plasminogen-aktiverende effekt. En foreløpig test hvori plasminogen ble inkubert i økende konsentrasjoner i nærvær av renset ekstrakt viste at den fibrinolytiske aktivitet økte med plasminogenkonsentrasjonen. Dette viser at angiokinase har en plasminogen-aktiverende effekt.

Data fra dette forsøk er gjengitt i Tabell II.

Som vist i tabellen, viser renset angiokinase økende fibrinolytisk aktivitet ettersom plasminogenkonsentrasjonen øker. Den samme buffer uten noe angiokinase viser imidlertid nesten ingen aktivitet, uavhengig av plasminogen-konsentrasj onen.

Angiokinasens plasminogenaktivering bekreftes ved polyakrylamid-gelinkubasjonen og elektroforeseforsøkene beskrevet under avsnitt 4). Fig. 5 viser resultatene av forsøk med den plasminogen-aktiverende virkning av den rensede ekstrakt, med korte inkubasjonsperioder og i nærvær av 20% glycerol (7,5% polyakrylamid i gelen). I fig. 5 viser gel A plasminogenet inkubert med bare glycerol. Under disse betingelser var der ingen spontan aktivering. Plasminogenet er tilstede som en proteinkjede med en molekylvekt på omtrent 90.000 Dalton. Endringene i molekylet etter inkubering med uro-kinase er vist ved gel D. Tre molekylære komponenter (piler) kan iakttas med molekylvekter på 60.000, 20.000 og 10.000 Dalton. Gel C viser endringene i plasminogenmolekylet etter inkubasjon med det rensede ekstrakt oppnådd i samsvar med oppfinnelsen. Der er en klar forskjell fra gel A, med bare plasminogen. I alle fall forblir en betraktelig del av plasminogenet uforandret etter inkubasjon i 30 minutter. Fig. 6 gjengir resultatene av analoge forsøk med lange inkubasjonsperioder. I denne figur viser gel 1 plasminogen inkubert ved 4°C i 2 timer. Bare proteinkjeden av det native plasminogen vises.

Gel 2 viser plasminogen inkubert i 2 timer ved 37°C. Plasminogenet ble delvis omdannet til plasmin. De tre bånd tilsvarende molekylvekter på\90.000 (plasminogen), 60.000 (lange plasminkjeder) og 20.000 Dalton (mindre plasminkjeder) vises.

Gel 3 tilsvarende urokinase inkubert med plasminogen under de samme betingelser viser fullstendig aktivering. Der er andre bånd som viser autokatalytisk aktivitet av det dannede plasmin.

Gel 4 viser plasminogen inkubert med det aktive prinsipp oppnådd i samsvar med oppfinnelsen. Resultatet er tilsvarende som for urokinase og aktivering er mer fullstendig enn for Gel 2, (plasminogen auto-aktivering). Proteinmengdene av urokinase og renset.angiokinase-ekstrakt var så små at de ikke ga noe bånd i den elektro-foretiske gel (Gel 5).

Disse resultater viser at det aktive prinsipp i angio-kinaseekstrakten oppnådd i samsvar med oppfinnelsen an-griper plasminogen med etablering av plasminaktivitet.

Mens de molekylære modifikasjoner som induseres er lignende til dem som bevirkes av urokinase, er reaksjonen saktere.

Plasminogen-autoaktivering foregår hurtigere i nærvær av renset angiokinaseekstrakt.

Den tidligere beskrivelse av fremstillingsmetoden nevnte en metode for å måle den fibrinolytiske aktivitet av de ekstraherte fraksjoner, som en indikator på nærværet av angiokinaseekstrakt i fraksjonen.

Titreringen av den fibrinolytiske substans isolert under anvendelse av den foregående metode, gjennomføres som i det følgende, basert på den fibrdnolytiske aktivitet på fibrinplater.

Titrerinq av renset angiokinase

Materiale

Sterile plastplater, indre diameter 93 mm,

human fibrinogen (Immuno) fremstilt ved fraksjonering i samsvar med Cohn,

TRIS buffer, pH 7,8,

trombin ("Topostasin", Roche).

Metode

17 ml. 0,1% human fibrinogenoppløsning i pH 7,8 TRIS

buffer anbringes på en plate og koagulere med 0,04 ml trombin (15 NIHU/ml av fysiologisk saltløsning).

Under disse betingelser dannes en 2,5 mm tykk film av fibrin (2,503).

Aktiviteten av den isolerte og rensede angiokinase ble målt ved å trekke 30 mikroliter med en presisjonspipette og anbringe den på overflaten av fibrinfilmen for inkubasjon i 16 timer ved 37°C i en termostat, under overholdelse av perfekt horisontal orientering.

En fibrinolytisk enhet (angiokinase-enhet, AU), defineres som den mengde enzym som bevirker et sirkulært glysis-område 3,908 mm diameter på plater av humanfibrin etter 16 timers inkubasjon ved 37°C.

Denne grad av lysis uttrykt som volum tilsvarer opp-

løsning av en fibrinklump 0,1% volum sammenlignet med de 30 mikroliters volum tilsvarende volumet av renset angiokinase-ekstrakt anbragt i kontakt med fibrinet.

En annen utbredt test er euglobulin lysis-tiden som kan anvendes for å bestemme konsentrasjonen av den modifiserte angiokinaseekstrakt. Den nevnte euglobulin-lysistid kan jevnføres med AU-verdien som definert for den foregående t itreringsmetode.

Euqlobulin- lysistid

Materialer_oq_ metoder

Det anvendes Wistar hannrotter som veide 200 + 5g.

Blodprøver ble trukket ut fra åpnet hjerte under

mild eterbedøvelse i silisiumglassrør eller plastrør.

3,8% natriumcitrat ble anvendt som antikoagulant i forhold 1:9 til blodet. Så snart blodet var trukket ut ble det sentrifugert ved 2000 omdreininger pr. minutt i 15 minutter i en avkjølt sentrifuge slik at temperaturen ble holdt under +5°C.

Det således oppnådde plasma ble fortynnet med destillert vann ved +5°Cii følgende mengdeforhold:

0,5 ml plasma

9,0 ml destillert vann

0.1 ml 1% eddiksyre

Blandingen ble holdt ved +4°C i 30 minutter og ble så sentrifugert med 2000 omdreininger pr. minutt i 5 minutter i en avkjølt sentrifuge. Etter fjernelse av supernatanten ble resten opptatt i 1 ml pH 7,8 fosfatbuffer og anbragt i en trombo-elastografisk cuvette.

Det ble anvendt Triple Hartert-Hellige tromboelasto-graf-cuvetter hvori det i hver ble innført 0,3 ml euglobulin-oppløsning under anvendelse av en presisjonspipette. Nøyaktig 1 minutt deretter ble koagulering initiert med 0,06 ml 1,29 % kalsiumklorid. Stemplet ble med en gang senket ned i hver cuvette, og koagulatet ble dekket med et lag av flytende parafin for opptegnelse av elasto-gram.

Ved slutten av kurven beregnes lysis-tiden langs lengde-aksen, fra det punkt hvor grenene divergerer 1 mm inntil det punkt hvor de konvergerer 1 mm. Denne måling overføres så til minutter basert på skjema-fremføringshastigheten.

Dyrene ble behandlet intreperitonealt 30 minutter før intrakardial-prøvetagningen.

Resultatene av testene er gjengitt i den etterfølgende Tabell III i forhold til enheter av angiokinase.

På basis av de oppnådde resultater kan den rensede angiokinaseekstrakt, dvs. av angiokinase-enzymet, anvendes ved parenteral (f.eks. intravenøs, intraarterial og intra-muskulære ampuller), og enterale farmasøytiske preparater (f.eks. gelatinkapsler eller for oral tilførsel).

Tilførsel av angiokinase ved humanterapi er blitt vist

å være fri for lokale eller systemiske bivirkninger.

Pga. av dens utmerkede toleranse kan angiokinase også

gis in loco, mens den orale tilførsel bør anvendes foretrukke for prevensjon eller bevaring av resultater oppnådd via andre metoder.

Angiokinase-anvendes klinisk for prevensjon av alle tilstander med unormal fibrindannelse og trombe-

dannelse på forskjellige steder og punkter. De følgende eksempler illustrerer slike anvendelser,

Athe_o_a_ter_o_k_ero.se i forskjellige grader (cerebral, koronar, periferisk) og beslektede trombosefenomener

(cerebral, koronar, periferisk)

Myocardial_infarkt

Cerebral_infarkt_

Diabet_ske_vasku 1 op at ie r

Arterioskler<_>t<_>sk og_d_abe t i_k_ret_n oj_t_; trombose av forskjellige retinaer

Venøs, trombosej_ tr_mbo_h_ebiti_

Post-operativ trombose

Tr<_>mbo_emb<_>l<_>sk _ykdgm_ _u_m_n_r_embgl_sme

Med hensyn til de forskjellige terapeutiske doseringer, varierer posologien for angiokinase av bruken (profylaktisk eller terapeutisk) og de ovennevnte indikasjoner, i henhold til et generelt eksempel vist skjema som følger:

A) Pro fylakse

Fra 10.000 til 50.000 AU daglig, avhengig av tilfellet

B) _Atheroskle.ro.ti.sk _ykdgm_i de forskjellige lokaliseringer Diabetisk retionp_åti_

Fra 50.000 til 200.000 AU daglig, oppdelt i forskjellige doser i løpet av dagen.

C) _T_ombo.se gg_tromb_emb_l_smer under utvikling

Fra 200.000 til 1-2 millioner AU daglig, oppdelt i forskjellige doser i løpet av dagen.

I tilfellene angitt under A og B ovenfor, kan behandling fortsettes av legen, uten nødvendigvis behov for blod-koaguleringskontroll.

I tilfellene angitt under C, bør imidlertid behandlingsperioden begrenses som en funksjon av fremskrittet i det enkelte tilfellet og legens bedømmelse. Blod-koaguleringskontroller anbefales.

Eksempel V Kliniske forsøk med angiokinase.

70 pasienter med athero-arteriosklerotisk lidelse ble behandlet: 26 koronar-tilfeller, 18 cerebraltilfeller,

10 retinaltilfeller og 20 periferale tilfeller

(benene). Behandlingsperioden var generelt 30 til 35 påfølgende dager og angiokinase (AK) ble anvendt i daglige doser på 90.000 AU.

Koronare_vasku_o_a_ier_

Uttalt og ofte hurtig lindring av smertefull symptoma-

tologi ble iakttatt i et betraktelig antall tilfeller, inklusive steno-kardial smerte og spenningsindusert dyspnea. Arbeidskapasitet og fysiske treningsmuligheter ble klart forbedret.

Av den objektive symptomatologi ble det notert en

sterk nedsettelse av arythmia, opp til at denne forsvant. Elektro-kardiografmodifikasjoner ble iakttatt og førte til forbedret koronarirrigasjon (f.eks. svekkelse eller forsvinning av S-T-trakt dys-nivå og ekstrasystoliske fenomener).

I de tilfeller hvor spenningstester før behandling førte

til tilsynekomst eller forverring av tegn på koronar ischemia og arrytmia førte behandling med AK til en markert reduksjon eller endog forsvinning av disse fenomener.

Cerebrale vaskulopatier:

På området med subjektiv symptomatologi var de iakttatte modifikasjoner spesielt tydelige både med hensyn til

grad og konsistens.

En generelt hurtig forbedring ble bemerket i opp-

førsel og humør med markert svekkelse eller forsvinning av følelsen av desorientering, søvnighet og hodepine,

med forbedret hukommelse og arbeidskapasitet.

For den objektive symptomatologi viste tilfeller med

nylig eller forholdsvis nylig motorisk deficit eller sensitive forstyrrelser en reduksjon eller endog full-

stendig forsvinning av de nevnte manifestasjoner med en årsak-følge-sammenheng.

Ateriosklerotisk retotinopati:

Undersøkelse av okkular-grunnen ved slutten av

behandlingen viste uttalt forbedring i retina-tilstanden

(mer klar og fullstendig i de helt nylige tilfeller)

med forsvinning av mikrotrombose, absorpsjon av eksudater og fornyelse av synsevnen til et fullstendig tilfredsstillende nivå.

Peri_ere_vasku_o_atier_

Skarp regresjon, endog opp til fullstendig forsvinning,

av halting ble iakttatt ved slutten av behandlingen.

Denne fullstendige forsvinning ble alltid iakttatt i

tilfeller med annet trinn.

Av den objektive symptomatologi ble det iakttatt for-

bedret sirkulasjon i de affekterte områder i et betraktelig antall tilfeller. Mer rimelig farge og temperatur gjen-oppstod i det nevnte område med merkbar forbedring eller regresjon av eventuelle trofiske forstyrrelser (sårdannelser, turbide sår) og enkelte ganger med tilbakevendt puls i pedal-arterien.

Eksempel VI Laboratorie- og instrument-tester i de

kliniske forsøk.

De følgende laboratorie-testresultater ble oppnådd

for tilfellene behandlet og iakttatt i eksempel V.

Kolesterol- og lipid-konsentrasjoner ble bare svakt påvirket i en ubetydelig grad.

Blodkoaguleringen viste imidlertid konstant en skarp

og tydelig modifikasjon pga.:

a) Reduksjonen eller forsvinningen av den trombofile tilstand med vanligvis uviktig forlengelse av koa-gulasjonstider.

b) Normalisering av den delvise trombo-plastiske tid

c) Betraktelig avkortning av lysistiden (fortynnet blod-lysistid, euglobulin-lysistid).

Før behandling var disse tider mer eller mindre merk-

bart forlenget. Behandling med AK bragte dem tilbake til de normale verdier eller endog forkortet dem.

I nesten alle tilfeller hvor de ble målt, viste oscillograf-resultatene skarp forbedring, endog opp til normaliserings-punktet for oscillasjons-amplityden.

Akutt trombose_

AK ble også studert i tilfeller med akutte tromboseangrep, dvs. i 10 tilfeller med akutt myokardial infarkt, i 5 tilfeller med cerebral trombose og i 3 tilfeller med periferal trombose (se moralområdet).

Fremskritt i alle disse tilfeller av spesiell doktrinal

og praktisk interesse viste klart den effektive lysisaktivitet, med fordelaktige modifikasjoner i blod-koaguleringsevnen og i den kliniske tilstand.

I disse tilfeller med akutt trombose var posologien for

AK riktignok høyere enn den som ble anvendt i eksempel V, fra et minimum på 25 0.000 AU til et maksimum på en million AU daglig, avhengig av tilfellet og fremskrittet. AK ble tilført intravenøst eller ved hjelp av flebo-clysis.

Akutt myokardial infarkt:

Uttalt og hurtig forbedring ble bemerket i den kliniske tilstand og smertesymptomatologien, med regresjon av kollapstilstanden og hurtig forsvinning eller markert reduksjon av arythmia-fenomenene.

Fremskritt i de behandlede tilfeller var fullstendig tilfredsstillende, med tydelig og hurtig modifikasjon i elektrokardiograf-tilstanden, spesielt med hensyn til S-T-delen, Q-bølgen, og den terminale T-bølge. Mer nøy-aktig ble det iakttatt en regresjon i dys-nivået for ST-delen. Dette er vel kjent som et uttrykk for skade-potensial i de myokardiale fibre i det perinfarkterte område. Tydelige regresjoner ble også iakttatt i de karakteristiske endringer av QRS-komplekset og i nega-tiviteten av T-bølgen.

Med hensyn til enzymatisk aktivitet (transaminase, kreatin-fosforkinase) ble den hurtige svekkelse eller forsvinning iakttatt.

Med hensyn til det kliniske, instrumentelle og laboratoriemessige fremskritt iakttatt i disse tilfeller med akutt myokardial infarkt behandlet med AK, bør det legges vekt på at dette fremskritt vanligvis ikke iakttas med terapier som tidligere var tilgjengelige.

Cerebral_trombgse: I to tilfeller ga behandling med

AK en hurtig returnering til normal tilstand med motilitet og sensisivitet i det affiserte område. Returen begynte 24-28 timer etter begynnelsen av behandlingen og utviklet seg i løpet av 1 uke.

De andre 3 tilfeller viste en tilfredsstillende men

dog ufullstendig regresjon av effektene av den involverte hemisfære.

Perif_era_ trgmbose_ femoral. trombose:

Alle 3 tilfeller viste fullstendig forsvinning av okklusjonssymptomene i løpet av 24-48 timer, med retur til normal sirkulasjon i de ischemiserte områder, med returnert puls og oscillasjoner.

Det bemerkes at ingen av tilfellene behandlet med midlene tilveiebragt i samsvar med oppfinnelsen viste noen tegn på hemorrhage, i injeksjonsstedet eller andre steder. Dette inkluderer de initialt akutte tilfeller som mottok den høyeste dosering (1 million AU daglig).

Regulær urinanalyse viste ingen hematuria. Tester på kar-fragilitet viste ingen patologiske variasjoner.

Basert på de kliniske og laboratoriemessige resultater for alle tilfellene behandlet med angiokinase, endog den med den høyeste dose, var det derfor ikke bare initiert en markert anti-trombofil tilstand, men en tilfredsstillende tilstand av blod-koagulerende homeo-stasis ble også opprettholdt. Ingen hemorrhagiske situasjoner oppstod overhodet.

Disse resultater sammen med den udiskutable anti-trombotiske aktivitet, gode håndterbarhet og terapeutisk pålitelighet, bekrefter brukbarheten av den nye substans angiokinase i sammenligning med tidligere kjente terapier. En slik sammenligning må dog over-lates hver praktiserende lege fra tilfelle til tilfelle for avgjørelse om ny eller gammel terapi skal anvendes.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for fremstillin av et kar-fibrinolytisk aktivt prinsipp benevnt angiokinase-enzym ved å gå ut fra rikt vaskularisert pattedyr-bindevev, karakterisert ved operasjonene med: avfetting, tørking og pulverisering av vevet, pulveret underkastet pankreatinlys ved å danne en vandig suspensjon av pulveret ved omtrent nøytral pH,. omtrent 1 vekt% pankreatin tilsettes i forhold til vekten av anvendt pulver og det opprettholdes en temperatur på 45 til 50°C i omtrent 24 timer for å fremstille et lysat,. lysatet surgjøres med fortynnet mineralsyre og væsken separeres fra det resulterende bunnfall, en tilstrekkelig mengde ammoniumsulfat tilsettes til den på nytt nøytraliserte oppløsning for å oppnå en ammoniumsulf atkonsentrasj on på omtrent 35% metning, slik at den aktive del av lysatet utfelles, bunnfallet samles og det dannes en vandig suspensjon av bunnfallet ved nøytral pH, lysat-suspensjonen' renses ved selektive fraksjonerings^ operasjoner bestående av adsorpsjonsoperasjoner, fraksjonene inneholdende angiokinasen samles ved måling av deres fibrinolytiske aktivitet, idet produktet har et protein N-innhold på 0,2 milligram/ml og en midlere mole-kyl-vekt på omtrent 18.000 Dalton.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at avrettingen gjennomføres ved ekstraksjon av fettstoffene med aceton som løsningsmiddel.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at en pH på 7,4 opprettholdes under pankreatin-lysisoperasjonen under anvendelse av fosfatbuffer.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, k.<ia:„r akterisert ved at pankreatinlysis gjennomføres under konstant omrøring.

5. Fremgangsmåte som.;angitt i krav 1, karakterisert ved at surgjøringen av lysatet gjennomføres ved tilsetning av HCl til pH 2,5.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den væske som oppnås ved surgjøringsoperasjonen nøytraliseres ved å tilsettes fortynnet NaOH.

7. Fremgangsmåte som.iangitt i krav 1-6, karakterisert ved at lysat-reriseoperasjonen inkluderer et første trinn med delvis rensning innbefattende en fraksjonering av proteinene basert på deres molekylvekt ved hjelp av selektiv eluering fra en gel-kolonne, etterfulgt av et annet rensetrinn innbefattende selektiv fraksjonering ved hjelp av kromatografering, foretrukket via ionebytter-kromatografering.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at det annet trinn innbefatter selektiv fraksjonering basert på absorpsjons-kromatografering under anvendelse substanser, foretrukket soya-bønnetrypsin-inhibitor eller p-aminobenzamidin.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at lysat-rense-operasj onen innbefatter selektiv eluering av lysatet på en gel-kolonne, med et forholdsvis høyt forhold mellom gel-volum og urent lysatvolum, etterfulgt av konsen-trering ved å fjerne en del av overskuddsvannet.

10. Kar-fibrinolytisk aktivt prinsipp som kan betegnes angio-kinase-enzym, isolert som en kjemisk substans ved ekstraksjon av vaskulært og rikt vaskularisert bindevev fra pattedyr, ved enzymatisk lysis, karakterisert ved at det har et protein n-nivå på 0,2 mikrogram/ml målt ved hjelp av Lowry's metode, såvel som midlere molekylvekt på omtrent 18.000 Dalton, idet substansen har en fibrinolytisk virkning på fibrin både i nærvær av og fravær av plasminogen, idet den fibrinolytiske aktivitet er slik at 30 mikrolitere angiokinaseekstrakt danner et sirkulært lysis-areal 3,908 mm diameter på plater av humanfibrin med tykkelse 2,503 mm etter 16 timers inkubasjon ved 37°C.