NO820403L - Cytoreseptor-maalemetode. - Google Patents
Cytoreseptor-maalemetode.Info
- Publication number
- NO820403L NO820403L NO820403A NO820403A NO820403L NO 820403 L NO820403 L NO 820403L NO 820403 A NO820403 A NO 820403A NO 820403 A NO820403 A NO 820403A NO 820403 L NO820403 L NO 820403L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- analyte
- cells
- labeled
- liquid
- medium
- Prior art date
Links
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 title description 4
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims abstract description 55
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 66
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 8
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 6
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 claims description 4
- 102000002572 Alpha-Globulins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010068307 Alpha-Globulins Proteins 0.000 claims description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims description 3
- ZGLHBRQAEXKACO-XJRQOBMKSA-N 1alpha,25-dihydroxyvitamin D2 Chemical group C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](\C=C\[C@H](C)C(C)(C)O)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)C[C@H](O)C1=C ZGLHBRQAEXKACO-XJRQOBMKSA-N 0.000 claims description 2
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 claims description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 2
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 239000000538 analytical sample Substances 0.000 claims 1
- 230000009172 bursting Effects 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 abstract description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- GMRQFYUYWCNGIN-ZVUFCXRFSA-N 1,25-dihydroxy vitamin D3 Chemical compound C1([C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(C)(C)O)C)=CC=C1C[C@@H](O)C[C@H](O)C1=C GMRQFYUYWCNGIN-ZVUFCXRFSA-N 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 229930003316 Vitamin D Natural products 0.000 description 2
- QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N Vitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 235000019166 vitamin D Nutrition 0.000 description 2
- 239000011710 vitamin D Substances 0.000 description 2
- 150000003710 vitamin D derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 229940046008 vitamin d Drugs 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- SVUOLADPCWQTTE-UHFFFAOYSA-N 1h-1,2-benzodiazepine Chemical class N1N=CC=CC2=CC=CC=C12 SVUOLADPCWQTTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- XADCESSVHJOZHK-UHFFFAOYSA-N Meperidine Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(C(=O)OCC)CCN(C)CC1 XADCESSVHJOZHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000050760 Vitamin D-binding protein Human genes 0.000 description 1
- 108700021020 Vitamin D-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Chemical class 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 229940127240 opiate Drugs 0.000 description 1
- 229960000482 pethidine Drugs 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000004885 piperazines Chemical class 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229940035024 thioglycerol Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/82—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving vitamins or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
I løpet av det siste tiår har forskning omkring vitamin
D ført til erkjennelse av- at vitamin D er forløperen til et
nytt steroid hormon, nemlig 1,25-dihydroksyvitamin D. Dette er'det stoff som kontrollerer' bevegelsen av kalsium gjennom celler i tarm, ben og nyrer. Forsøk på å måle dette .hormonet har støtt på vanskeligheter, på grunn av dets ustabilitet, lave konsentrasjon (normalt nivå 0-40 pg/ml) og, av større betydning, på grunn av -nødvendigheten av å adskille det fra andre vitamin D-metabolitter av lignende struktur, som sirkulerer i meget større konsentrasjoner, (25(OH)D^- normalt nivå 20-40 ng/ml; 24,25(OH)2D3~normalt nivå 2-5 ng/ml).
Selv om det er utviklet analysemetoder, har de vist seg å være arbeidskrevende, kostbare og tidkrevende, og de har krevet kostbart utstyr og høyt utdannet personell. Derfor er disse analysemetoder ikke blitt akseptert, bortsett fra i noen få forskningssentre.
Fremgangsmåter for å måle 1,25-dihydroksyvitamin D^ beskrives i Brumbaugh' et al., Biochem. 1974; 13:4091-4097; Clemens et al., Clin.Sci.Mol.Med. 197.8; 54:329-332; Schaefer and Goldsmith, i Norman, et al., Eds. Vitamin D'Basic Research and Its Clinical Application, New York, Walter deGruyter, 1979 side 205-212. .1 oppfinnelsen brukes celler som har cytoreseptorer for et
■bestemt stoff som det skal analyseres med hensyn på (analytt),
i målemetoder for analytten. Analysen utføres ved å blande cellene, analyseprøven og merket analytt, radioaktivt merket på vanlig' måte, i et egnet analyse-med-ium og inkubere det i et tilstrekkelig tidsrom til at en del av analytten bindes til cellene. Cellene blir deretter skilt fra, og mengden av merking i den supernatante væsken eller bunnfallet bestemt og ' sammenlignet med en standard, der målemetoden er blitt utført med en kjent mengde analytt.
Cellene som benyttes har et cytoreseptor-protein som gjør det mulig å skille mellom den interessante analytten og andre forbindelser som. måtte være til stede i analysemediet. De to vesentlige bestanddeler i målemetoden er cellene og den merkede analytten.
Cellene som brukes er spesifikke for en forbindelse i den betydning at andre forbindelser som er til stede, ikke vil på-virke den mengden av analytt som går inn i cellene. Cytoreseptoren kan skjelne den interessante analytten fra nært beslektede forbindelser. Cytoreseptoren kan være på celleoverflaten, som en del av membranen- eller i cytosolen. Der cytoreseptoren er i cytosolen, kan membranen samarbeide med cytoreseptoren'når det gjelder å ta hensyn til ønsket transport av den interessante analytt gjennom membranen,- sammenlignet med transport av nært-, beslektede.
Hensiktsmessig kan svulstceller fra pattedyr brukes, disse kan lett dyrkes in vitro. Ved å oppnå en egnet celle-lirije som er istand til å dyrkes iri vitro, kan deønskede celler dyrkes
■kontinuerlig. Avhengig av cellenes natur, kan melanomer, sarcomer, carcinomer og lignende benyttes.
Analytten kan .være et hvilket som helst hapten eller protein som det finnes en cytoreseptor for. Forbindelser av spesiell interesse inkluderer hormoner, steroider, både hormonale og ikke-hormonale, peptider, eller et hvilket som helst medikament som det kan finnes eller utvikles en cytoreseptor for.
Ettersom mange forbindelser av fysiologisk interesse virker som effektorer ved binding til en posisjon på celleoverflaten, kan en hvilken som helst.forbindelse som kan bindes til en cytoreseptor analyseres. Derfor kan-naturlig forekommende forbindelser analyseres,, såsom et stort utvalg av peptider og proteiner, såvel som modifiserte analoge til naturlig forekommende forbindelser, såsom avledete eller kjemisk modifiserte steroider,.antibiotika og fysiologisk etterlignede analoge, såsom opiater, meperidin, catecholamin, benzdiazepiner, dibenzazepiner og.barbitaler.
Særlig er hormonet 1,25-dihydroksyvitamin.D^ av interesse.
For dette hormonet kan benceller brukes som cytoreseptor, særlig osteogene sarcom-celler.
Når det gjelder den merkede analytt, kan. en-hvilken som helst merking som ikke vil interferere med-' bindingen av merket til cytoreseptoren, benyttes. Der cytoreseptoren er på overflaten eller i membranen, må merkingen ikke interferere med binding av analytten til tilknyttings-posisjonen. Der resep-toren er i cytosolen, må merkingen ikke interferere med gjennom-gangen- av den merkede analytt gjennom, membranen for å trenge inn i cellen.
Merkinger av spesiell interesse er radioaktive merkinger, såsom H, I, P og.lignende. Den spesielle radioaktive merking, vil variere i samsvar med.analyttens egenskaper og syntetisk bekvemmelighet når det gjelder å merke analytten. Den måten .hvorpå radioaktive merkinger bindes til forskjellige ana-lytter, er rikt beskrevet i litteraturen, konvensjonell, og trenger ikke beskrives her..
Ved utførelsen av analysen, blandes analyseprøven, cellene og den merkede.analytt i et egnet analysemedium.. Mediet bufres vanligvis til en pH i området 5 til 10, mer vanlig rundt 6 til 9, og en rekke forskjellige buffere kan benyttes. Illustrerende buffere omfatter karbonater, fosfater, tris, p.iperazin-salter etc. Bufferkonsentrasjonen vil vanligvis variere fra rundt 0,05M til 0,5M, avhengig av den ønskede ionestyrke, analyse-prøvens natur, den nødvendige grad av bufring og lignende.- Andre tilsetningsstoffer som kan inkluderes, er celle-vekst-hindrende midler, stabiliseringsmidler, nøytrale salter, næringsmidler og lignende.
Analysemediet må være et protei.nholdig medium for å opprett-holde cellenes levedyktighet. Hensiktsmessig brukes et "minimum essential"-medium eller andre vanlige næringsmedier. Andre tilsetningsstoffer kan også tilsettes, såsom et kalvefoster-serum, alfa-globulin Fraksjon IV fra mennesker (som er rikt på vitamin D-bindende proteiner) eller lignende. Det spesielle medium er ikke kritisk og kan varieres i samsvar med cellenes natur.
Den spesielle rekkefølge når det gjelder blandingen av - komponentene, er ikke viktig, bortsett fra at den merkede analytt. ikke må blandes med cellene før cellene er, kommet i kontakt med
analyseprøven. Derfor bør cellene og analyseprøven.blandes .først, fulgt av tilsetning av den merkede analytt, eller alterna-tivt, analyseprøven og den merkede analytt blandes, samtidig som eller før tilsetning av cellene.
Inkubasjonstemperaturen vil vanligvis være fra rundt 20 til 50°, vanligvis fra rundt 25 til 40°C, fortrinnsvis fra rundt.
30 til 45°C Inkubasjonstiden med cellene vil vanligvis variere
fra rundt 5 minutter til 24 timer, vanligere fra 0,5 timer til
6 timer. Tiden vil være avhengig av analysens følsomhet, analyttens konsentrasjon og egenskaper, hastigheten som som analytten bindes til og/eller går inn i cellene med, og lignende. Hovedsaklig vil tiden velges empirisk for å sikre en til
strekkelig differensiering i signal over analyttens interesse-område. Under inkubasjonen ristes mediet svakt for å hindre bunnfelling av cellene.
Den radioaktivt merkede analytt er. generelt ikke mer enn fem ganger, vanligere ikke mer enn omtrent lik minimumsko.nsen-trasjonen av analytt av interesse i analysemediet og kan være
-3
10 eller mindre enn den konsentrasjonen. Valget vil avhenge
av den merking som benyttes, evnen til å måle forskjeller i mengden av merking, konsentrasjonen av analytt i interesseområdet og lignende.
Antall celler som brukes, vil vanligvis bestemmes empirisk basert på den spesielle analytt, tidsløpet for analysen, trans-mijsjonsgraden for analytten gjennom membranen inn i cellen, såvel som andre faktorer som påvirker analysens følsomhet.
Med 1,25 (OH)-D-.,. bør antall celler ikke være mindre enn rundt 10 3 , vanligvis 10 4 ganger antall picogram'1,25 (OH)2D^ i den øvre enden av det interessante konsentrasjonsområdet, og ikke mer enn rundt 10 8 , vanligvis ikke mer enn rundt 10 7 ganger antallet picogram i det lavere interesseområdet. Den spesielle mengden som velges, vil variere mellom disse ekstremverdiene.
Analysevolumet bør være så lite som det er hensiktsmessig for manipulering, uten å bidra med signifikante mekaniske feil. Vanligvis er analysevolumet minst rundt 0,1 ml, mer vanlig minst 0,2 ml og overskrider ikke rundt 1 ml. Mengden av fysiologisk væske er under 1 ml, vanligvis i området, fra rundt. 0,05 ml til omkring 0,6 ml, avhengig av stoffet som det analyseres med hensyn på. Den fysiologiske væsken kan være plasma, serum, urin,■ spinalvæske, spytt eller lignende.
Etter inkubering, kan cellene skilles fra på mekanisk måte, mild sentrifugering, eller på annen måte, såsom immunologisk, binding til en overflate, eller bruk av en markør som tillater separer ing, f . eks. en celle-sorterer..
Etter at cellene er adskilt fra det flytende mediet, blir cellene vanligvis vasket for å fjerne eventuell ikke-spesifikk binding. Mest hensiktsmessig benyttes en isotonisk oppløsning som inneholder en liten mengde av et intert protein,, f. eks. albumin, vanligvis rundt 0,1 til 5 mg/ml, mest brukt 0,5 til 2 mg/ml. Cellene blir deretter sonifisert i en egnet, mildt reduserende hypertonisk buffer, sentrifugert, og væskefasen analyseres med hensyn på merkestoff.
De følgende eksempler fremlegges som illustrasjon og ikke
som begrensninger..
Osteogen.e sarcom-celler (Martin et al. Cl in . Ortop. Rel. Res .
■ 1979; 140: 247.-25-4) ble subkultivert (Manolagas, et al.; J.-Biol.Chem. 1980; 255:4414-4417) (Nylig opptinte DMSO frosne celler reagerte identisk med friske celler). Sammenflytende celler, frigjort ved trypsinering, suspenderes i "minimum esséntial"-medium med Hanks salt, 25rtuM Hepes og 2 % kalvefoster-serum.i en konsentrasjon på 3,3x10^ celler/ml. (Alfa-globulin. Fraksjon IV fra mennesker, 4 mg/ml, kan erstatte kalvefoster-serum).
Omtrent 5 000 cpm (20 pg) 3[H]1,25-(OH)(NEN, 160 Ci/ mmol) i etanol pipetteres i polykarbonat-rør, alene og med varierende mengder umerket l,25(OH)2D3 (4-128 pg), og etanolen fjernes med en forsiktig strøm av tørr N2. Til hvert rør tilsettes deretter 0,3 ml (0,15 ml kan også brukes, og tellingene dobles) cellesuspensjon (1x10^ celler) og mediet inkuberes i 1 time ved 37°C,; mens rørene beveges på en- hvirvlende' plattform for å hindre bunnfelling.
Når inkuberingen er fullført, kjøles rørene på is, og cellene pelletisert ved sentrifugering (RC3 Sorvall sentrifuge 5 min., 2. 000 rpm). Mediet suges så av, og cellene vaskes en gang med 3,5 ml isotonisk buffer (0,25M sukrose, 0,025M KCl, 0,005MMgCl2, 0,00IM EDTA, 0,012M tioglyserol og 0,05MTris-HC1,. pH 7,4; det er ønskelig at 1 ml/ml okseserum-albumin tilsettes). Etter tilsetning av 1 ml hyperto.nisk buffer (0,3M. KCl, 0,005M ditiothreitol0,0015M EDTA og. 0,01M Tris-HCl, pH 7,4) til hvert rør, sonifiseres cellene med 1x5 sekund serier av en soni-fiserende celleknuser (Heat Systems-Ultrasonic Inc.). Etter sentrifugering i 0,5 timer ved 40 000 RCF i en RC-2B Sorvall sentrifuge (SM-24-rotor) (En RC-3 Sorvall sentrifuge ved 3 500 rpm .i 1 time ble funnet tilfredsstillende) overføres væskefasen til telleampuller og telles med 10 ml scintillasjonsvæske.
En tilfredsstillende standardkurve ble oppnådd over konsentrasjonsområdet nevnt ovenfor, med antall cpm omkring 1290
ved 0 pg umerket 1,25(OH)2D3 og omkring 690 ved 128 pg umerket 1,25 (OH) 2D3..
■ T samsvar med denne oppfinnelse er det frembrakt en ualminnelig følsom analyse for å bestemme fysiologiske forbindelser i nærvær av beslektede'forbindelser. Ved å ta i bruk svulst-celler som kan dyrkes iri vitro og er spesifikke for et bredt spekter av fysiologisk, aktive forbindelser, kan cellenes
naturlige bindingsaffinitet brukes til å. analysere meget.lave konsentrasjoner av stoffene av'interesse.
Selv om den foregående oppfinnelse er blitt beskrevet nokså detaljert ved hjelp av illustrasjoner og eksempler, med klarhet og forståelse som hensikt, er det klart at visse endringer og modifikasjoner kan foretas.
Claims (14)
1. Fremgangsmåte for å bestemme en analytt som er istand til å bindes spesifikt til en cellereseptor, den nevnte fremgangsmåte omfatter: blanding.i et flytende analysemedium som opprettholder
■cellenes levedyktighet, av en analyseprøve som mistenkes for å inneholde den nevnte analytt, celler som har en spesifikk reseptor for .den nevnte analytt, og merket analytt, der merkingen frembringer et påviselig signal; etter tilstrekkelig tid for nevnte•analytt og merkede analytt til å forbinde seg med de. nevnte celler, separasjon av de nevnte celler fra det nevnte flytende analysemedium, vesentlig fri fra ikke-spesifikt bundet merket analytt; og bestemmelse av den mengde merket analytt som er bundet til de nevnte celler, ved hjelp av. de nevnte påviselige signaler, sammenlignet med den mengde merket analytt som er bestemt i en analyse med en kjent mengde analytt.
2. En fremgangsmåte i henhold til krav 1, der nevnte merking er en radioaktiv isotop.
3. En fremgangsmåte i henhold til krav 1 eller 2, der den. nevnte spesifikke reseptor er cytosolet i de nevnte celler.
4. En fremgangsmåte i henhold til krav 1 eller 2, der nevnte spesifikke reseptor er på overflaten til de nevnte celler.
5. En fremgangsmåte i henhold til krav 1, der den nevnte binding av den nevnte analytt og merkede analytt til de nevnte celler, skjer ved en temperatur i området fra rundt 20 til 50°C.
6. Fremgangsmåte for bestemmelse av en analytt som er istand til å bindes spesifikt til en cellereseptor, nevnte måte omfatter : blanding i et bufret flytende næringsanalysemedium som opprettholder cellenes levedyktighet, av en analyseprøve som mistenkes å inneholde den nevnte analytt, celler som har en spesifik reseptor for den nevnte analytt og analytt merket med en radioaktiv isotop; inkubasjon av den nevnte blanding ved en temperatur i .'området rundt 30 til 45° i et tidsrom tilstrekkelig for analytt og merket analytt å bindes til de nevnte celler;. separasjon av.de nevnte celler vesentlig fri for ikke-spesifikt bundet merket analytt fra nevnte flytende medium; sprenging av de nevnte celler i flytende medium og ad-skillelse av de resulterende cellebrokker fra nevnte flytende medium for å frembringe en supernatant væske.; og
bestemmelse av mengden radioisotop i den supernatante væske sammenlignet med en supernatant væske fremkommet ved en kjent mengde analytt.
7. Fremgangsmåte i henhold til krav 6, der nevnte celler er celler fra en svulst.
8. Fremgangsmåte i henhold til krav 7, der nevnte celler er osteogene sarcom-celler.
9. ' Fremgangsmåte i henhold til . krav. 6 eller 8,•der nevnte analytt er 1,25-dihydroksyvitamin D-. og 1,25-dihydroksyvitamin<D>2.
10. Fremgang.småte i henhold til krav 9, der nevnte flytende analysemedium inkluderer alfa-globulin Fraksjon IV.
11. En analysesammensetning til bruk i en fremgangsmåte i henhold til krav 1 eller krav 6, som omfatter:, (a) celler som har en spesifikk reseptor for en analytt; og (b) merket analytt.
12. En analysesammensetning i henhold til krav 11.; der nevnte analytt er 1,25-dihydroksyvitamin . .
13. En analysesammensetning i henhold til krav 11, der nevnte analytt er 1,25-dihydroksyvitamin D2•
14. En analysesammensetning i henhold til noen av kravene 11, 12 eller 13, der nevnte merking er en radionukleide.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/161,462 US4375459A (en) | 1980-06-20 | 1980-06-20 | Cytoreceptor assay |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO820403L true NO820403L (no) | 1982-02-11 |
Family
ID=22581269
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO820403A NO820403L (no) | 1980-06-20 | 1982-02-11 | Cytoreseptor-maalemetode. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4375459A (no) |
| EP (1) | EP0042673B1 (no) |
| JP (1) | JPS5728257A (no) |
| AT (1) | ATE18805T1 (no) |
| CA (1) | CA1155373A (no) |
| DE (1) | DE3174170D1 (no) |
| DK (1) | DK72082A (no) |
| NO (1) | NO820403L (no) |
| WO (1) | WO1982000059A1 (no) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4544629A (en) * | 1982-11-19 | 1985-10-01 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Receptor-based histamine assay |
| US4497791A (en) * | 1983-02-10 | 1985-02-05 | Vestar Research Incorporated | Method for labeling phagocytic cells |
| US5100774A (en) * | 1988-04-22 | 1992-03-31 | The Wistar Institute Of Anatomy & Biology | Methods for detecting growth factor receptor expression |
| US5759774A (en) * | 1988-05-18 | 1998-06-02 | Cobe Laboratories, Inc. | Method of detecting circulating antibody types using dried or lyophilized cells |
| CA1335707C (en) * | 1989-08-15 | 1995-05-30 | Pyare Khanna | Drug screening assay |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1039649A (en) * | 1973-08-30 | 1978-10-03 | General Electric Company | Method of forming multilayer immunologically complexed films |
| US4247536A (en) * | 1978-03-20 | 1981-01-27 | American Hospital Supply Corporation | Method of preparing C3-sensitized erythrocytes |
| NZ190452A (en) * | 1978-05-19 | 1981-04-24 | Becton Dickinson Co | Solid phase assay receptor contacted with analyte and then with labeled analyte |
| FR2415303A1 (fr) * | 1978-05-31 | 1979-08-17 | Ferrosan As | Procede pour la determination de la concentration de benzodiazepines dans un fluide de l'organisme |
| US4282315A (en) * | 1979-09-13 | 1981-08-04 | Corning Glass Works | Preparation of enriched whole virus radioligand |
-
1980
- 1980-06-20 US US06/161,462 patent/US4375459A/en not_active Expired - Lifetime
-
1981
- 1981-05-20 CA CA000377922A patent/CA1155373A/en not_active Expired
- 1981-06-01 AT AT81302400T patent/ATE18805T1/de not_active IP Right Cessation
- 1981-06-01 EP EP81302400A patent/EP0042673B1/en not_active Expired
- 1981-06-01 DE DE8181302400T patent/DE3174170D1/de not_active Expired
- 1981-06-19 WO PCT/US1981/000833 patent/WO1982000059A1/en not_active Ceased
- 1981-06-19 JP JP9411681A patent/JPS5728257A/ja active Pending
-
1982
- 1982-02-11 NO NO820403A patent/NO820403L/no unknown
- 1982-02-19 DK DK72082A patent/DK72082A/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK72082A (da) | 1982-02-19 |
| EP0042673A1 (en) | 1981-12-30 |
| CA1155373A (en) | 1983-10-18 |
| US4375459A (en) | 1983-03-01 |
| DE3174170D1 (en) | 1986-04-30 |
| JPS5728257A (en) | 1982-02-15 |
| ATE18805T1 (de) | 1986-04-15 |
| WO1982000059A1 (en) | 1982-01-07 |
| EP0042673B1 (en) | 1986-03-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6787660B1 (en) | Functional vitamin D derivatives and a method for determining 25-hydroxy-vitamin D and 1α, dihydroxy-vitamin D | |
| US8133694B2 (en) | Functional vitamin D derivatives and method of determining 25-hydroxy- and 1α, 25-dihydroxy vitamin D | |
| US4146602A (en) | Simultaneous radioassay of folate and vitamin B12 | |
| KR940009957B1 (ko) | 1,25-디하이드록시 비타민 d의 분석방법 | |
| US4279859A (en) | Simultaneous radioassay of folate and vitamin B12 | |
| CN109187971A (zh) | 神经元特异性烯醇化酶化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 | |
| US5814461A (en) | Method for the determination of anti-TSH receptor autoantibodies | |
| NO820403L (no) | Cytoreseptor-maalemetode. | |
| US4355018A (en) | Assay for vitamin B12 | |
| Zhou et al. | A new sensitive method for the detection of chloramphenicol in food using time-resolved fluoroimmunoassay | |
| KR20160126055A (ko) | 당쇄를 포함하는 표적 물질의 검출용 시약, 검출 방법, 및 당쇄를 포함하는 표적 물질을 검출하기 위해서 이용되는 담체 및 그 제조 방법 | |
| FI78787B (fi) | Immunometrisk metod foer bestaemning av en hapten. | |
| US7279283B1 (en) | Cobalamin assay | |
| US4300907A (en) | Serum vitamin B12 assay and kit therefor | |
| US20020132256A1 (en) | Method for the detection and measurement of hapten-conjugated biological binding entities by western and dot-blot using anti-hapten antibodies | |
| US5437981A (en) | Method for the immunological determination of ligands | |
| Joshi et al. | Penicillinase as a marker in enzyme-linked immunosorbent assays for steroid hormones | |
| CA1098015A (en) | Simultaneous radioassay of folate and vitamin b in12 xx | |
| US4399228A (en) | Polate competitive protein binding assay | |
| EP1257830B1 (en) | Assay for measuring holo-transcobalamin and folate | |
| CA2034922A1 (en) | Method for the immunological determination of ligands | |
| AU2003203209B2 (en) | Cobalamin assay | |
| Gutcho et al. | Simultaneous radioassay of folate and vitamin B12 | |
| ZA200101937B (en) | Cobalamin assay. | |
| HU202322B (en) | Method for radioimmunological determination of 3'-asido-3'-desoxi-thymidine content of biological samples |