NO812336L - Fremgangsmaate til immobilisering av kuleformede bakterieceller ved adhesjon til en fast baerer - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for immobilisering av kuleformede bakterieceller i form av et jevnt sjikt på en fast bærer ved adsorbsjon av metallioner på den faste bærer og/eller bakteriecellene.

Oppfinnelsen angår også det således oppnådde sjikt eller lag av bakterieceller.

Det er kjent fremgangsmåter for immobilisering av bakterieceller ved hjelp av fiksering på en bærer, dannel-

se av fnokker eller inneslutning i en matrise. Immobiliseringen ved fiksering, også betegnet adsorbsjon eller adhesjon, på en fast bærer viser i forhold til andre fremgangsmåter den fordel at man kan opprettholde en direkte kontakt mellom hele bakteriepopulasjonen og det væskeformige miljø og føl-gelig redusere begrensningen, ved diffusjonsfenomener, av transporten av næringsstoffer eller stoffene som produseres av mikroorganismene. Denne fremgangsmåte har også den fordel at det tilveiebringes et system hvis geometri ikke hin-dres i løpet av anvendelsen.

Fremgangsmåten i U.S. patent nr. 3.821.086 tillater dannelse av fnokker av mikrobeceller under innvirkning av polyelektrolytter. Fremgangsmåten i belgisk patent nr. 804.502 angår oppnåelse av fnokker ved dannelse av chelater mellom mikrobecellene og metallhydroksyder.

Disse fremgangsmåter er forbundet med den ulempe

at man ikke kan opprettholde en direkte kontakt mellom hele den immobiliserte bakterie- eller mikrobepopulasjon og det væskeformige medium.

Fremgangsmåten i U.S. patent nr. 4.115.198 som hovedsakelig viser immobilisering av enzymer, men som nevner muligheten av å immobilisere cellene i sin helhet ved hjelp av en belegging av en bærer ved utfelling på sistnevnte av et hydratisert metalloksyd. Fiksering av biologisk aktive stoffer skyldes dannelsen av chelater.

Denne fremgangsmåte har den ulempe at man nødven-digvis må danne bunnfall og dette krever en regulering av egenskapene til disse utfellinger.

Det er likeledes kjent å behandle en organisk bærer med overgangsmetaller, deretter foreta tørkingcdgl føre den i kontakt under omrørte forhold med cellene (AnmrN.Y. Acad. Sei. 1979, 326, 249-54). Denne fremgangsmåte h~åf? den ulempe at den. er begrenset til en organisk bærer hvilkestt nødven-diggjør en tørking og dette er en lang og kostbeg: operasjon, og den gir ikke opphav til et jevnt belegg på- bærrerens overflate.

Et formål med foreliggende oppfinnelseå]er å til-veiebringe en fremgangsmåte for immobilisering aivg kuleformede bakterieceller ved hjelp av en enkel og effekt i\ p metode som ikke nødvendiggjør kompliserte operasjoner. >r Foreliggende oppfinnelse som er baser&j på adsorb-. sjon av metallioner på bakteriecellene. og/ellean<Elen faste bæreren, har som formål å fiksere et eneste- eeiLlfelag som er fordelt jevnt over hele bærerens overflate og -adherer kraf-tig til denne.

De ifølge foreliggende oppfinnelse immobiliserte celler utviser en forøket grad av levedyktighet!, dvs. at en større del av cellene bevarer evnen til å gjennomgå blant annet enzymatiske reaksjoner og til å reprodusere seg i et egnet miljø.. •.

Et annet formål.med oppfinnelsen- er. rå? ''oppnå stabile komplekser dannet av et enkelt cellelag og'bæreren, og som kan anvendes direkte i reaktorer, f.eks. fermenteringsreak-torer. Med stabile komplekser menes også kompletkser av for-skjellig beskaffenhet (bærer og/eller celle) sonnif .eks. kan kombineres og anvendes i form av flere lamellforeirede lag. Man kan f.eks. anbringe ovenpå hverandre på samitte bærer immobiliserte cellelag av forskjellige mikroor-galnismer, eller anbringe ovenpå hverandre en rekke komplekser hver be-stående av en bærer på hvilken det er fiksert ^e.t£ icellelag, idet mikroorganismene er like eller forskjelliger^fra ett lag til et annet eller -innen det samme lag. Alle kombinasjoner er mulige så lenge man ikke går'Utenfor oppfinnelsens ramme.

Oppfinnelsen er kjennetegnet ved at.'den omfatter behandling, forut for? immobiliseringen, av cellene og/eller bæreren med oppløsninger inneholdende enkle metallioner og/ eller polynukleære metallioner dannet ved forbindelse mellom flere metallatomer, av oksygen og hydrogen. Disse enkle ioner og/eller polynukleære ioner adsorberes på de behandlede materialer.

Bindingen mellom cellene og bæreren forklares gjennom gunstige gjensidige påvirkninger på grenseflatene celle-oppløsning, bærer-oppløsning og celle-bærer. Blant disse gjensidige påvirkninger kan man skille mellom elektrostatiske virkninger (ladning-ladning og ladning-dipol), Van der Waals krefter, hydrogenbindinger. Ut fra viktig-heten av disse elektrostatiske ladning-ladning-virkninger er det faktum at de adsorberte ioner minsker ladningen på bæreren eller cellen, eller gir dén enes ladning motsatt fortegn til den andres ladning, meget gunstig.

For å forklare hvordan systemene virker og valget av operasjonsbetingelser, må man ta hensyn til ionenes kjemiske egenskaper som en funksjon av pH-verdien.

De faste bærerne som anvendes i foreliggende oppfinnelse omfatter faste mineralske og organiske materialer. Den benyttede bærer kan være porøs eller ikke-porøs; for visse anvendelser kan det være foretrukket å anvende en ikke-porøs bærer og en bærer som ikke har hull i overflaten, slik at alle de immobiliserte cellene kan bli direkte eksponert for en væskestrøm. Blant de mineralske materialer skal nevnes anvendelsen av silisium, silikater og aluminiumsilikat-er, metalliske oksyder, metaller og deres legeringer osv. Man kan f.eks. benytte glass, et keramisk materiale, slagg, sand. Blant de organiske materialer kan nevnes anvendelse av syntetiske polymerer og/eller kopolymerer, f.eks. poly-amider, polyestere, polyolefiner, vinylsammensetninger.

De nevnte mineralske og organiske materialer er bare eksempler på bærere som kan benyttes i foreliggende oppfinnelse og skal ikke være begrensende. For valg av bærer må man ta hensyn til fysikalske og mekaniske, økonomiske og driftsmessige forhold.

De benyttede bærere kan ha meget forskjellige for-mer, f.eks. granulater, pulver, kuler, plater, rør, filmer,

membraner, vevnader, strikkede strukturer, tråder, fibre,

alle typer profiler.

Med kuleformede bakterieceller forstås encellede mikroorganismer og mikroorganismesamlinger av typen slik som f.eks. gjær, bakterier, mikrosopp.

Med cellelag eller -sjikt forstås et encellelag eller monolag som på overflaten av bæreren utviser tilnærmel-sesvis en celleavsetning som kan karakteriseres ved et antall celler pr. flateenhet, definert ved de immobiliserte cellers tetthet.

De vandige oppløsninger inneholdende de enkle

eller polynukleære metallioner som benyttes i foreliggende oppfinnelse oppnås fra metallsalter, f.eks. klorid, nitrat, sulfat av magnesium og jordalkalimetaller, av aluminium, overgangsmetaller, særlig Cr, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, idet disse eksempler er ikke-begrensende.

For oppnåelse av oppløsningene med enkle metallioner, bør deres konsentrasjon være tilstrekkelig lav, deres

pH-verdi tilstrekkelig lav og temperaturen tilstrekkelig lav

i for at reaksjonen til metallionene med oksygen og hydrogen under operasjonsbetingelsene ikke forårsaker dannelse av polynukleære ioner eller bunnfall.

De polynukleære metallioner dannes ved forbindelse mellom flere like eller forskjellige metallatomer av oksygen, hydrogen og eventuelt andre elementer.

For oppnåelse av oppløsninger av polynukleære metallioner, bør konsentrasjonen, pH-verdien, temperaturen og alderen på oppløsningene være slik at reaksjonen til metall-atomene med oksygen og hydroksyl og andre anioner som even-

I tuelt er tilstede i oppløsningen, forårsaker dannelse av polynukleære ioner, men ikke utfellinger. En fagmann kan vari-ere typen av metall, typen av anion, konsentrasjon, pH-verdi, temperatur og alderen til oppløsningene og tilsette reagen-ser, f.eks. kompleksdannende midler, som kan virke på de kjemiske prosesser som omfatter metallelementene.

Man kan også benyttes oppløsninger inneholdende samtidig enkle og polynukleære metallioner.

Ifølge en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse blir de kuleformede mikrobeceller behandlet med vandige oppløsninger inneholdende enkle metallioner. Denne behandling oppnås f.eks. på følgende måte: Man innfører samtidig 10 ml åv en suspensjon av Saccharomyces cerevisiae i en konsentrasjon på omkring 500.10 celler/ml og 10 ml av en aluminiumnitratoppløsning i en konsentrasjon på 2 - 200 mg Al/l i et glassrør med en kapasitet på 30 ml. Det lukkede røret rystes i 24 timer ved 25°C. pH-verdien til suspen-sjonene varierer i området 3,6 - 3,9 ifølge deres sammensetning. Cellene separeres fra oppløsningen ved sentrifugering og aluminiumet som er tilbake i den ovenstående væske bestemmes ved hjelp av atomabsorbsjon, og mengden av fiksert aluminium bestemmes ved hjelp av forskjellsberegning.

De oppnådde resultater viser at mengden av aluminium som er fiksert av cellene stiger til 1,5.10 p ioner Al pr. celle når aluminiumkonsentrasjonen i den ovenstående væske øker fra 0 til 2 mg/l. Mengden av fiksert aluminium for-blir lik 1,5.10 g ioner Al pr. celle når konsentrasjonen av aluminium i den ovenstående væske varierer fra 2 - 100 mg/l. Cellenes fiksering av aluminium svarer således til karak-teristikker til en spesifikk adsorbsjon.

Ifølge en annen utførelsesform blir de faste bærerne behandlet med oppløsninger inneholdende enkle metallioner. Denne behandling oppnås f.eks. ved å nedsenke den faste bæreren i en vandig oppløsning inneholdende ionene; volumet og konsentrasjonen av oppløsningen velges på en slik måte at det absorberes en tilstrekkelig mengde ioner på bærerens overflate.

Ifølge en annen variant av oppfinnelsen behandler man samtidig cellene og bæreren med oppløsninger inneholdende enkle metallioner. I dette tilfelle opererer man som ovenfor for hver av behandlingene og man bevirker deretter immobilisering av cellene på bæreren.

Ifølge en ytterligere utførelsesform av oppfinnelsen blir de kuleformede mikrobeceller og/eller den faste bæreren behandlet med oppløsninger av polynukleære metall ioner. Behandlingen er hovedsakelig lik den som anvendes for den ovenfor angitte første utførelsesform.

Oppfinnelsen omfatter også behandling av celler med oppløsninger inneholdende enkle metallioner og av den faste bærer med oppløsninger inneholdende polynukleære metallioner og omvendt. Alle kombinasjonsformer er mulige uten å gå utenfor oppfinnelsens ramme.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det ikke nød-vendig at bæreren innehar organiske grupper som kan danne chelater med ionene. Det er ikke nødvendig å tørke bæreren etter dens behandling med ioner. Ved hjelp av en korrekt sammensetning kan man behandle cellene med ioner.

De fordeler som oppnås ved hjelp av foreliggende oppfinnelse er tilveiebringelsen av et enkelt sjikt av celler som er helt fiksert på bæreren, av en forhøyet mengde immobiliserte celler pr. enhet av bærerens overflate, av en jevn fordeling av celler på bærerens overflate, av en sterk adhesjon av celler på bæreren. Immobiliseringen av celler i et enkelt sjikt og jevn sterk adhesjon på bæreren gir for-delen av å kunne eliminere diffusjonen gjennom et lag av celler av næringsstoffer og metabolittprodukter i nærheten av disse, videre tillate anvendelse av en øket væskestrøm i kontakt med cellene og således en reduksjon av begrens-ninger på grunn av diffusjon, tillate en homogen regenerer-ing av hele den immobiliserte populasjon, og tillate anvendelse av immobiliserte celler på bæreren like godt i et agi-tert sjikt som i et fast sjikt. Disse fordeler er spesielt verdifulle for visse anvendelser av nevnte immobiliserte celler, slik som assimilasjon eller produksjon av stoffer med høy molekylvekt, tilveiebringelse av en anordning for kontinuerlig innpodning eller tilveiebringelse av en anordning som tillater innhøstning av celler av første generasjon som ikke har formert seg. Dét faktum at man ikke innfører et kjemisk middel annet enn bæreren i kontakt med cellene og anvendelse av en kjemisk inert bærer, er en stor fordel for visse anvendelser av immobiliserte celler.

Foreliggende oppfinnelse forklares bedre under hen-

visning til de nedenstående eksempler.

Eksempel 1

Man innfører samtidig 10 ml av en suspensjon av Saccharomyces cerevisiae i en konsentrasjon på omkring 500.10^ celler/ml og 10 ml av en vandig oppløsning av aluminiumnitrat i en konsentrasjon på 2 - 50 mg Al/l i et glass-rør med en kapasitet på 30 ml. Det lukkede rør rystés i 15 minutter ved 25°C. Suspensjonens pH-verdi er mindre enn 3,9; aluminiumionene som er oppløst i suspensjonen er således enkle ioner. Deretter tømmes suspensjonen i en beholder hvor det befinner seg en glassplate. Høyden på suspensjonen er 0,5 cm over platens nivå. Etter omkring 5 minutter vaskes glassplaten i løpet av 20 minutter med en laminær vannstrøm med en tykkelse på 4 mm og en hastighet på omkring 8 cm/sek. Platene undersøkes i et optisk mikroskop og de immobiliserte celler telles.

De immobiliserte celler er fordelt på en regelmessig måte og danner et homogent cellelag med en tetthet på 40.000 celler/mm 2. Test med metylenblått indikerer at 90 - 99% av de immobiliserte celler har bevart evnen til å redusere dette fargestoff spontant.

Et sammenligningsfor søk er utført under de samme betingelser som angitt ovenfor, men uten behandling av bæreren og cellene med aluminiumioner; de oppnådde resultater viser at tettheten på de immobiliserte celler er under 600 celler/mm 2. Cellene er fordelt på en uregelmessig måte og danner ikke et homogent cellelag.

Eksempel 2

Fremgangsmåten i eksempel 1 gjentas med unntagelse av at glassbæreren erstattes med en bærer av polykarbonat.

Man oppnår også her et regelmessig cellelag med adherende celler på bæreren og som er motstandsdyktig over-for de vaskebetingelser som er beskrevet i eksempel 1, og med en tetthet på omkring 40.000 celler/mm 2.

Eksempel 3

Fremgangsmåten i eksempel 1 gjentas med unntagelse av at suspensjonen av celler i den vandige oppløsning av aluminiumnitrat sentrifugeres ved 2000 g i 5 minutter og at cellene på nytt suspenderes i vann, idet denne suspensjon anbringes på glassplaten.

Man oppnår også her et regelmessig cellelag av celler som adherer til bæreren og er motstandsdyktig mot de i eksempel 1 angitte vaskebetingelser, og med en tetthet på omkring 40.000 celler/mm 2.

Eksempel 4

Man blander i beholdere av plast, f.eks. polypro-pylen, 20 ml av en suspensjon av Saccharomyces cerevisiae i en konsentrasjon på ca. 400.10 celler/ml og 20 ml av en vandig oppløsning av friskt fremstilt ferrinitrat i en konsentrasjon på 50 - 200 mg Fe/l.

pH-verdien lar man enten være som den er, eller den reguleres til 3 med HNO^. Beholderne lukkes og rystes i 1 time ved omgivelsestemperatur; ved dette trinn der de oppløste ferri-ioner enkle ioner. Deretter blir cellesus-pensjonene som inneholder et overskudd av ioner, anbragt i en beholder i hvilken det befinner seg glassplater. Høyden på oppløsningen er 1 cm over glassoverflaten. Etter 4 timer, som er det øyeblikk da oppløsningen inneholder både enkle ioner og polynukleære ioner, blir platene vasket i 30 minutter av en strøm med vann av en tykkelse på 4 mm og en midlere hastighet på 8 cm/sek. Platene undersøkes ved optisk mikroskopi og de immobiliserte celler telles.

I alle tilfellene er de immobiliserte celler fordelt regelmessig og danner et homogent cellelag hvis tetthet er angitt i tabell I.

Det skal understrekes at det ikke dannes noe bunnfall av jernmaterialet under de benyttede operasjonsbetingelser.

Testen med metylenblått indikerer at 90 - 99% av de immobiliserte celler bevarer evnen til spontan reduksjon av fargestoffet. De immobiliserte celler bevarer evnen til å formere seg.

Eksempel 5

I beholdere av plast blandes 20 ml av en suspensjon av Saccharomyces cerevisiae i en konsentrasjon på omkring 400.IO<6>celler/ml og 20 ml av.en oppløsning av friskt fremstilt ferrinitrat i en konsentrasjon på 200 mg Fe/l. pH-verdien innstilles til 3 med HNO^. Beholderne lukkes og rystes i 15 timer ved omgivelsestemperatur. Deretter sentrifugeres cellesuspensjonen ved 2000 g i 5 minutter; den ovenstående væske fjernes og cellene suspenderes på nytt i vann. Denne suspensjon anbringes på glassplater som beskrevet i eksempel 4; og platene vaskes og undersøkes som beskervet i eksempel 1.

Man oppnår et enkelt regelmessig lag av celler som adherer til bæreren og har en tetthet på 35.000 celler/mm .

De fysikalsk-kjemiske (konsentrasjon, pH, alder) betingelser på ferri-oppløsningen i kontakt med cellene, er slik at den inneholder polynukleære elementer (ioner). Dess-uten inneholder den intet bunnfall av jernmaterialet, og dette representerer en fordel når det gjelder å oppnå en meget regelmessig avsetning med sterk adhesjon til bæreren.

Eksempel 6

Glassplater neddyppes i en gitt tid i friskt frem-stilte vandige oppløsninger av ferrinitrat i en konsentrasjon på 100 mg Fe/l og variabel pH-verdi. Varigheten av neddyppingen og oppløsningens pH-verdi er gitt i nedenstående tabell II; og i alle tilfellene er de pysikals-kjemiske betingelser (konsentrasjon, pH, alder) for oppløsningen ved slutten av behandlingen slik at den inneholder polynukleære ioner; og den inneholder intet bunnfall av jernmateriale.

De således behandlede plater skylles med vann og anbringes i en beholder hvori man anbringer 50 ml av en cel-lesuspensjon av Saccharomyces cerevisiae i en konsentrasjon på omkring 250.10 6celler/ml. Etter 4 timer vaskes platene i 30 minutter med en laminær vannstrøm med en tykkelse på 4 mm og en midlere hastighet på 8 cm/sek. Platene under-søkes ved optisk mikroskopi og de immobiliserte celler telles.

I alle tilfellene er de immobiliserte celler fordelt regelmessig og danner et homogent cellelag hvis tetthet er som angitt i tabell II.

Resultatene fra testen med metylenblått og testen for cellemultiplikasjon er de samme som i eksempel 4.

Eksempel 7

Man blander 20 ml av en suspensjon av Saccharomyces cerevisiae med 20 ml av en friskt fremstilt vandig oppløsning av ferrinitrat. De sluttelige konsentrasjoner er 200.10 celler/ml og 100 mg/l av jern.Blandingen rystes i 1 time ved omgivelsestemperatur, cellene skilles deretter fra opp- løsningen ved sentrifugering ved 2000 g i 5 minutter, og suspenderes på nytt i 40 ml vann eller en oppløsning av HNO^ ved pH 3.

Glassplatene neddyppes i en friskt fremstilt vandig oppløsning av ferrinitrat ved en konsentrasjon på 100 mg Fe/l. Varigheten av neddyppingen er enten 1 time eller 2 dager. Deretter skylles platene med vann.

De fuktige glassplatene som på denne måten er behandlet med metallioner, anbringes i en beholder i hvilken man tømmer cellesuspensjonen hvis celler er behandlet med metallioner.

Man kan således stille opp følgende:

- platene holdes i 2 dager i kontakt med ferri-oppløsningen og de behandlede celler og suspenderes på nytt i vann, eller - platene holdes i 2 dager kontakt med ferriopp-løsningen og de behandlede celler og suspenderes på nytt ved pH 3, eller - platene holdes i 1 time i kontakt med ferri-oppløsningen og de behandlede celler og suspenderes på nytt i vann.

Det hele hensettes i 4 timer og deretter vaskes platene i 20 minutter med en laminær vannstrøm med en tykkelse på 4 mm og midlere hastighet på 8 cm/sek. Platene undersøkes ved optisk mikroskopi og de immobiliserte cellene telles.

I alle tilfellene er de immobiliserte celler fordelt på en regelmessig måte og danner et homogent cellelag hvis tetthet er omkring 40.000 celler/mm 2.

Claims (9)

1. Fremgangsmåte for immobilisering av kuleformede mikrobeceller på en fast bærer, karakterisert ved at man forut for immobiliseringen behandler cellene og/eller den faste bæreren med oppløsninger inneholdende enkle og/eller polynukleære metallioner.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at oppløsningene inneholdende de enkle eller polynukleære metallioner er oppnådd ved oppløsning av ett eller flere metallsalter.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at metallsaltene som gir opphav til enkle metallioner velges blant kloridet, sulfatet og nitratet av magnesium og jordalkalimetaller, aluminium og overgangsmetaller.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1-3, karakterisert ved at metallsaltene som gir opphav til polynukleære metallioner velges blant kloridet, sulfatet og nitratet av aluminium og overgangsmetaller.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1-4, karakterisert ved at den faste bæreren velges blant mineralske og organiske forbindelser.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1-5, karakterisert ved at den faste bæreren er et fast silisium-materiale eller en syntetisk polymer.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1-6, karakterisert ved at de kuleformede mikrobeceller utgjøres av celler av Saccharomuces cerevisiae.

8. Kuleformede mikrobeceller immobilisert på en fast bærer, karakterisert ved at de er oppnådd ifølge fremgangsmåtene i kravene 1-7.

9. Stabilt kompleks av et lag av kuleformede celler fordelt ensartet på en fast bærer, karakterisert ved at det er oppnådd ved anvendelse av fremgangsmåten ifølge kravene 1-8.