NO810340L - Ultrafoelsom enzymatisk radiommunoproevingsmetode - Google Patents

Description

Ul traf ølsom enzymatisk radio immunop røverne to de Oppfinnelsens bakgrunn.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte

for kvantitativt å måle en irnmunosys temreaktant, spesielt et antigen eller et antilegeme. Mere spesielt er den foreliggende fremgangsmåte en ultrafølsom enzymatisk radio-immunoprøvemetode.

Det er kjent forskjellige måter for kvantitativt og kvalitativt å måle antigener og antilegemer i komplekse.blandinger og oppløsninger slik som kroppsvæsker fra mennesker og andre dyr, og laboratorie- og omgivelses-prøver. Antigener kan inkludere vira, bakterier, parasitter, hormoner, toxiner, tumor markører, legemidler og lignende. Målingene er brukbare for diagnose, prognose-, epidemiologiske-og eksperimentelle formål.

Det er i teknikken kjent fastfase-radioimmunp-prøvemetoder. Disse prøver har vært spesielt brukbare for påvisning av irnmunosystemreaktanter.' -Generelt omfatter en radioimmunoprøving å preparere et fast substrat, selektivt å koble irnmunosystemreaktanten til substratet for deretter å koble et radioaktivt merket antilegeme til reaktanten.

Etter bortvasking av ikke-koblede radioaktivt merkede antilegemer, blir radioaktiviteten i det koblede antilegeme målt ved radioaktive tellemetoder, for eksempel, gamma- eller scintillasjonstelling. Tellingen gir en kvantitativ bestemmelse av mengden imminosystemreaktanten som er bundet til det faste substrat. Generelt blir det radioaktivt merkede anti-

' 131 12 5

legeme merket med radioisotopen jod : ' eller jod Generelt kan radioimmunoprøving, RIA, måle ned til 10<-1>2gram

per milliliter material det undersøkes med henblikk på.

RIA er offer for visse mangler. Fordi det

aktuelle antilegemet blir radioaktivt merket må enten opp-løsningen lages kort før bruk, eller det må være tilgjengelig en stor mengde diverse forskjellige oppløsninger. Den korte halveringstid for isotopene som benyttes begrenser reagentenes 131 12 5 levetid. Det er kjent at jod og jod utsetter brukere

av RIA til en viss biorisiko. Radioaktivt jod er kostbart. Den radioaktive merking av en hvilken som helst forbindelse kan forårsake et antall sekundærforandringer i forbindelsen som kan påvirke egenskapene på oppførselen i et prøvesystem. Hvis den radioaktive kjerne som benyttes for merking .er en isotop av et element som allerede ér tilstede i det opprinnelige ikke merkede molekyl og hvis merkingen kun med-fører å erstatte en ikke radioaktiv isotop med en radioaktiv isotop kan den merkede forbindelse antas å ha ikke-identisk like kjemisk og immunologiske egenskaper som det ikke merkede molekylet. Imidlertid er denne ideelle situa-sjon sjelden å finne.

Nedbrytningen av.den radioaktive merking frigjør en viss mengde energi som er meget høyere enn den energi som er involvert i de kjemiske bindinger som opprettholder molekyl-strukturen i forbindelsen. Derfor kan den radioaktive ned.-.. brytning lett forårsake brudd av nærliggende bindinger og forårsake disintegrering av molekyls;tr.ukturen. Når i tillegg et nytt element dannes fra nedbrytningen av den radioaktive merking kan strukturen i de opprinnelige molekyler forandres i en slik grad at molekylet, disintegreres eller ikke lengere tjener det forønskede formål. Hvis det merkede molekyl kun inneholder et enkelt radioaktivt atom, oppstår det problem at molekylet som er tilbake etter en nedbryt-ningsprosess ikke vil være i stedet for ytterligere ned-, brytning etterlater dette molekyl umerket og således ikke målbart. Således er den brukbare periode for et materiale kortere enn det man skulle forvente .fra den rene halveringstid for den radioaktive isotop alene.

Hvis det er nødvendig å gjennomføre merking ved innføring av en radioaktiv isotop sonv-ikke er en vanlig komponent i det ikke-merkede materialet, vil ikke bare strålingen forandre materiale, men den kjemiske sammenset-ning av det radioaktivt merkede materiale kan være forskjellig fra det ikke-merkede materiale. Det har vært vist at jodering som sådan kan påvirke potenten for biologisk aktivt materiale. I tillegg kan de kjemiske egenskaper for radioaktivt merket materiale forandres ikke bare ved nærvær av et radioaktivt element.som ikke,er en vanlig bestanddel av det opprinnelige molekyl, men også ved prosedyrene som benyttes for å innføre den radioaktive merking inn i forbindelsen. Således lider RIA under et antall mangler.

Enzymimmunoprøver (også'kjent som EIA og som enzymbundet immunosorbentprøver eller ELISA) er utviklet i et forsøk på å overvinne de mangler som følger med RIA.'ELISA tilsvarer i oppsett fastfasé RIA slik som beskrevet ovenfor, bortsett fra at det benyttes et enzym som antilegememarkør i stedet for den radioaktive isotop. Dette enzym-antilegeme-konjugat bindes til fastfasesubstratet ved hjelp av en serie antilegeme-antigenreaksjoner og benyttes til å omdanne et indikatormateriale til å gi en synlig farve. Denne farve måles spektrofotometrisk. Det faktum at et enkelt enzym-molekyl er i stand til å reagere med et stort antall indika-tormolekyler gir en forsterkning av resultatene og gir således en høy følsomhetsgrad. Et eksempel på et egnet enzym er alkalisk fosfatase som kan benyttes sammen med p-nitrofenylfosfat som, ved hydrolysering, frigjør et gult p-nitro-fenolat som måles i et spektrofotometer ved 400 nanometer. ELISA har den fordel i forhold til RIA at reagensene som benyttes, nemlig det enzyme-konjugerte antilegeme har en lengere levetid, ikke lider under radioaktive nedbrytnings-virkninger og ikke gir noen biorisiko- for laboratoriearbei-derne .

I praksis er imidlertid følsomheten for ELISA ikke vesentlig større enn den for RIA; Spesielt kan ELISA

-13

gi resultater ned til 10 gram per milliliter materiale som prøves..

Gjenstand for og oppsummering av oppfinnelsen

Det er en gjenstand for foreliggende oppfinnelse å frembringe en prøvemetode for en irnmunosystemreaktant (antigen eller antilegeme) som er mere følsom enn både ELISA og RIA.

Det er videre en gjenstand for oppfinnelsen å gi en immunoprøvemetode som oppviser mindre biorisiko for laboratoriearbeidere og som er mindre kostbar enn RIA.

En ytterligere gjenstand for oppfinnelsen er å frembringe et immunoprøvesystem som.er enkelt å bruke.

Ytterligere en gjenstand for oppfinnelsen er å frembringe en radioaktivimmunoprøvemetode som har en lavere sannsynlighet for radioaktiv nedbrytning av den radioaktive merking, noe som gir mere nøyaktige .'resultater cg en lengere levetid.

Ytterligere en gjenstand for oppfinnelsen er å frembringe en fremgangsmåte som kan^benyttes for et stort spektrum av prøver på kvantitativ og kvalitativ måling av antigener, f.eks. vira, bakterier, parasitter, hormoner, tixiner, tumormarkører, legemidler, osv. og antilegemer i komplekse blandinger og oppløsninger, slik som kroppsvæsker og omgivelsesprøver for diagnose, prognose/epidemiologiske og experimentelle formål.-

Foreliggende oppfinnelse er en metode for kvantitativ måling av konsentrasjonen av en irnmunosystemreaktant, og denne omfatter: preparering av et fast substrat; selektiv kobling av irnmunosystemreaktanten til det faste substrat; kobling av et enzym-konjugert antilegeme til reaktanten; omsetning av en radioaktivt merket indikator med det enzym-konjugerte antilegeme for derved å gi et radioaktivt merket produkt; separering av de radioaktivt merkede produkter og ikke omsatt indikator; og måling av graden av reaksjonen ved radioaktiv telling av det radioaktivt merkede produkt, og hvorved tellingen gir et kvantitativt mål på• reaktantkonsentrasjonene. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan brukes når irnmunosystemreaktanterr er et antigen eller et antilegeme.

Når irnmunosystemreaktanten'er et antigen,kan

det direkte bindes til substratet ved adsorbsjon, elektrostatisk binding, kovalent binding eller lignende. Fortrinnsvis kobles antigenet til substratet ved bruk av et antigen-

reaktivt antilegeme. Det antigen-reaktive antilegeme adheres til substratet ved bruk av adsorbsjon, elektrostatisk binding, kovalent binding og lignende. Det antigene-reaktive antilegemet er spesifikt for det spesielle antigen som måles. Antigenet som måles reageres med det adherte antilegemet og kobler således antigenet til substratet..

Koblingen av det enzym-konjugerte antilegeme til antigenet kan være enten direkte eller indirekte. Når koblingen er direkte blir det enzymkonjugerte antilegemet valgt for å være spesifikt for antigenet som måles, og koblingen skjer ved direkte omsetning :av det enzymkonjugerte antilegeme med det koblede antigen... Når koblingen er indirekte blir et ikke-konjugert antigenspesifikt antilegeme omsatt til det koblede antigen. Det ik.ke-konjugerte antilegeme er fra en annen animalsk kilde enn antilegemet som fortrinnsvis adheres til substratet. Det enzym-konjugerte antilegeme omsettes med det ukonjugerte antilegeme bundet til antigenet. Det enzymkonjugerte antilegeme er i dette - tilfelle valgt fra gruppen antilegemer som er, rettet mot immunoglobulin underklassen av den animalske kilde for ukonjugert antilegeme. Således virker det koblede" antigen og.ukonjugerte antilegeme som et kombinert antigen for det enzym-konjugerte antilegeme. Underklassene av immunoglobulin som kan benyttes er IgG, IgM, IgA, IgE og IgD.. Den foretrukne metode velger det enzym-konjugerte antilegeme fra gruppen som er rettet mot IgG underklassen av den animalske kilde for ukonjugert antilegeme. Fordi således det enzym-konjugerte antilegeme er rettet mot den brede klassestruktur av det ukonjugerte antilegeme som er spesifikt til det spesielle antigen som måles, er det nødvendig med et mindre antall tidligere fremstilte reagens-oppløsninger på lageret. For eksempel" kan spesifikke animal-antilegemer fremstilles for spesifikke antigener, slik som marsvin anti-koleratoksin, esel anti-koleratoksin, geite-anti-rotavirus osv. Disse antilegemer er spesifikke for spesifikke antigener. På samme' måte kan mere generelle anti-immunoglobulin underklasseantilegemer fremstilles.

For eksempel kunne disse omfatte saueanti-kaninglobulin, geite anti-marsvin IgG og lignende. Disse sera/antilegemer er vel kjente i denne teknikk.

Som angitt ovenfor og med henblikk på den direkte binding av det enzym-konjugerte antilegeme til antigenet kan ved den indirekte metode, antigenet bindes til substratet ved omsetning med et antigene-reaktivt antilegeme som er spesifikt for antigenen som er adhert til substratet. Adhering av det antigene-reaktive kbblingsantilegeme til substratet kan skje ved adsorbsjon, elektrostatisk binding, kovalent binding eller lignende. De. spesielle metoder for adhering av det, antigen-reaktive. antilegeme til substratet er velkjent i denne teknikk.

I tillegg kan fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen også benyttes når irnmunos<y>stemreaktanten som måles er et enkelt spesifikt antigenereaktivt antilegeme fra en spesiell animalsk kilde. For denne spesielle anvendelse kobles et antigen til substratet, enten ved. direkte kobling eller via et antilegeme som adherer til substratet.• Det spesielle antigen er spesifikt for det spesielle antilegeme som måles. En oppløsning eller et serum inneholdende antilegemet som skal måles omsettes med det koblede.antigen og adherer derved antilegemet som skal måles til det koblede antigen.

Et enzymkonjugert antilegeme omsettes med det adherte antilegemet som måles. Det enzym-konjugerte antilegemet er valgt blant gruppen rettet mot immunoglobulinunderklassen av den animalske kilde for antilegemet som måles. Således kobles det enzymkonjugerte antilegeme til dét adherte antilegemet som måles. Denne metode er generelt; kjent i teknikken som en bindingsprøve. Mange forskjellige radioaktive indikator-enzymsysterner vil lett være åpenbare for fagmannen med vanlig kjennskap til denne teknikk-. "Kravene til disse systemer er at den radioaktive indikator må være stabil, enzymet må være enkelt og lett å binde til et antilegeme, systemet må ha høy aktivitet og høy renhet. Reaksjonsproduktene mellom den radioaktive indikator og enzymet bør være lett å separere ved bruk av konvensjonelle teknikker. Et foretrukket enzym-radioaktiv indikatorsystem ifølge oppfinnelsen er alkalisk fbsfatase-adenosin-5<1->monofosfat.

Ved reaksjonen splittes adenosin-5<1->monofosfatet til adenosin og fosfat. Andre egnede systemer inkluderer alkalisk fosfatase og p-nitrofenylfosfat, fosfatase og uricylfosfat, peroksydase og o-fenylendiamin-, peroksydase og N,N,N',N'-tetrametylbenzyden, peroksydase og 3,3<1->diaminobenzyldin-tetraklorid, ribonuklease og RNA, beta-glukuronidase og o-aminofenyl-beta-z-glukuronid, og beta-glukuronidase og p-nitrofenyl-glukuronid. Et eksempel på en hyppig benyttet metode for kovalent binding av enzymet med det spesielt ønskede antilegeme er kjent i denne,teknikk, og for eksempel beskrevet i "First International Symposium on Immuno-Enzymatic Techniques", av Engvall, et al. utgitt av

G. Feldman (North Holland Publishing, Company, Amsterdam) .

Den spesielle radioaktive merking av den radioaktive indikator vil også lett være åpenbar for den vanlige fagmann. Når det gjelder den-spesielt foretrukne radioaktive indikator adenosin-5<1->monofosfat, kan adenosin-delen av molekylet lett merkes med H 3 (tritium) og/eller

14 3 2

karbon eller monofosf atdelen merkes., med fosfat . Det spesielle valg av merker og merkemetoden avhenger av det benyttede system. Tritium er lettere tilgjengelig og

3 2

oppviser mindre biorisiko. Fosfor har en kortere halveringstid og vil være mere følsom fordi adenosin-5'-mono-

32

fosfat med fosfor vil være mere følsomt overfor sintila-sjonstelling. De radioaktivt merkede indikatorer er kommersielt tilgjengelig og kan renses før bruk ved vanlige teknikker. Disse.forbindelser har fordelen fremfor de radioaktive produkter som benyttes i RIA, idet de har meget lengere lagringstider og de er -mindre utsatt for radioaktiv nedbryning. I tillegg er de mindre kostbare.

Den, spesielle merking av de andre ovenfor angitte enzym-indikatorsysterner vil være åpenbare for fagmannen på basis av den her gitte beskrivelse.

Separeringstrinnet ifølge.oppfinnelsen for å separere ikke-omsatt indikator fra det radioaktivt merkede reaksjonsprodukt mellom radioaktiv indikator og det enzym-konjugerte antilegeme vil også være åpenbar for en vanlig fagmann tatt i betraktning den her gitte beskrivelse. Eksempler på mulige metoder omfatter filtrering, differensi-alutfelling, fordampning, kromatografi osv. Et eksempel og en hyppig foretrukket separeringsmetode er kromatografi og'mere spesielt væskekromatograf i.': Væskekromatografi omfatter fortrinnsvis føring av radioaktivt merket og ikke-merket produkt gjennom en selektivt "adsorberende ioneutbytter-kolonne. Ionebytterkolonnen kan være pakket med et kryss-bundet polymerisert dextran som ionebyttemateriale, f.eks. "Sephadex DEAE A-25". Ionebyttematerialet kan være positivt eller negativt ladet. Man benytter den foretrukket radioaktive indikator, adenosin-51-monofosfat, måles ikke omsatt adenosin-5'-monofosfat og fosfat som har negativ ladninger tilbake på den positivt ladde kolonne,- mens adenosin fra reaksjonen fritt strømmer gjennom harpiksen. Hvis adenosin-et er merket med tritium og/eller karbon 14, kan det plaseres direkte i. en scintillasjonsvial for scintillasjonstelling. Ved å forandre ionestyrken i eluatet, kan fosfatet anbringes

i scintillasjonskyvetter for scintillasjonstelling. Andre separeringskromatografier kan benyttes slik som f.eks. tynnskiktkromatografi, høytrykkskromatografi, papirkromato-grafi, og lignende.

Den optimale fortynning for.reagensene som benyttes ved fremgangsmåten.ifølge oppfinnelsen bestemmes ved sjakkbrett titrering., slik som f.eks . beskrevet i en artikkel av Voller, et al. i "The Bulletin of W.H.O.", 53, side 55-58, (1976).

Foreliggende oppfinnelse gir det overraskende resultat at det er tusen ganger mere følsomt enn RIA eller ELISA med henblikk på å detektere spesifikke antigener. Foreliggende oppfinnelse har vist seg^ å være brukbar til å -17

måle antigene konsentrasjoner helt ned til 10 gram per milliliter antigen. Som bemerket i et av de spesifikke

eksempler som følger, er det laveste nivå for koleratoksin detektering for ELISA for en 1000 minutters inkuberingsperi-— 18 —<1>3

ode 10 mol eller 10 gram per milliliter, mens det laveste nivå for foreliggende oppfinnelse var 10 -. 17 gram

-22

per milliliter eller 10 mol. Et tilsvarende resultat uttrykt ved følsomheten ble funnet'for foreliggende oppfinnelse mot ELISA og RIA i en sammenligning av prøver for humanrotavirus, en viktig årsak til infantilgastroenteritis.

To av hovedårsakene for diaretisk sykdommer i mennesker er rotavirus og de enterotoksigene stammer av Escherichia coli.' Det varmelabile itoksin som fremstilles avE.coli kryssreagerer i utstrakt grad med koleratoksin-. Fordi spebarn og barn er spesielt følsomme overfor komplika-sjoner slik som dehydratisering . som :er sekundær til den akutte enteritis forårsaket av disse, stoffer, er midler for hurtig diagnostisering klinisk viktige. ELISA og RIA har vært benyttet tidligere for dette formål. Foreliggende oppfinnelse er en forbedret"fremgangsmåte for hurtig diagnostisering som er flere størrelsesordner mere følsom enn ELISA eller RIA. I tillegg vil foreliggende oppfinnelse også understøtte diagnostisering av.andre virusstoffer, slik som herpesvira, hepatitisvirus■o.1.

Foreliggende oppfinnelse har avgjorte fordeler

i forhold til RIA og ELISA.. Denne tusen ganger økning i følsomheten vil være av spesiell viktighet ikke-bare i tidligdiagnostisering av de ovenfor angitte sykdommer, men også ved prøving på antigenet slik som carcinogen-DNA-addukter og på hormonfrigivende faktorer som kan være tilstede i picogram- og fematogrammengder. I disse to angitte tilfeller gir ELISA og Ria ikke noen resultater, mens foreliggende oppfinnelse har den nødvendige følsomhet.

Når det gjelder infektiøse stoffer og toksiner, vil den økede følsomhet være brukbar ved påvisning av lave konsentrasjoner av disse midler som kan finnes i prøver fra omgivelsene. Dette ville tillate epidemiologiske over-våkninger og studier der det ikke var mulig tidligere.

Den radioaktive biorisiko som medfølger foreliggende oppfinnelse med tritium og/eller karbon merkede radioaktive indikatorer er mindre enn den for RIA som generelt benytter radioaktiv jod. Mens omkostninger<p>g utstyr som er nødvendige for gjennomføringen av foreliggende oppfinnelse er større enn det som er nødvendig for ELISA, er de på den annen side mindre enn for RIA. Foreliggende oppfinnelse kan benyttes både i kliniske laboratorier og forsøkslabpratorier for å måle antigener, f.eks. vira, bakterier, parasitter, toksiner, legemidler, tumor markører, hormoner osv., i oppløsninger og blandinger slik som blod, serum, avføring, spytt, urin og prøver fra omgivelsene.

Kort beskrivelse av tegningene.

Fordeler og trekk ved foreliggende oppfinnelse

vil fremgå klarere fra den følgende generelle beskrivelse og de detaljerte eksempler, tatt i forbindelse med de ledsagende tegninger der:

Figur 1 er en di agr aromatisk illustrasjon av de prinsipielle metodetrinn for en indirekte prøvemetode for antigenemåling ifølge oppfinnelsen; Figur 2 er en diagrammatisk illustrasjon av metodetrinnene for direkte prøving for antigenemåling ifølge oppfinnelsen; Figur 3 er en diagrammatisk illustrasjon av metodetrinnene for antilegememåling (bindingsprøve) ifølge oppfinnelsen; Figur 4a er et diagram som viser prosentandel adenosin-5'-monofosfat omdannet ved .alkalisk fosfatase IgG-konjugat til adenosin; Figur 4b er et diagram- av- den dobbelt resiproke oppføring av Michalis-Menten-ligriingen for den alkaliske fosfataseprøve i figur 4a; Figur 5 er et diagram som viser bestemmelse av følsomheten for prøven ifølge foreliggende oppfinnelse;

Figur 6 er et diagram av tidsforløpet for alkal-

isk fosfatase-igG—konjugatreaksjonen ifølge oppfinnelsen.

Detaljert beskrivelse av generelle og spesielle eksempler.

Figur 1 viser i fem trinn et generelt eksempel på trinnene ved den indirekte prøvemetode ifølge oppfinnelsen i en prøve på et spesifikt antigen. I trinn 1, blir et antigen-reaktivt antilegeme, Ab^, adhert til et fast substrat slik som bunnen av en mikrotiterplate. Alt ikke-adhert antilegeme vaskes vekk. I trinn 2, blir prøvematerialet tilsatt. Dette kan omfatte prøver fra en prøvepasient

eller et prøvedyr, en oppløst omgivélsesprøve eller lignende. Antigene, vist som en sirkel, vil adhere til antilegemet for belegg. Antigen-negativt materiale, vist i ruterform, vaskes vekk ved den etterfølgende vasking... Ikke omsatt materiale

vaskes vekk. I trinn 3, blir- ikke-konjugert antigenereaktivt antilegeme (Ab2) fra en annen kilde enn Ab^, tilsatt. Dette reagerer med antigenet som er adhert. til Ab^. Ikke-omsatt ikke-konjugert antigenereaktivt antilegeme. Ab^ vaskes bort.

I trinn 4, tilsettes enzymmerket antilegeme rettet mot en

av immunoglobulin underklassene for den.animalske kilde for & i>2' Fortrinnsvis er dette en av IgG globulin underklassene fordi den er den mest spesifikke av. immunoglobulinene. Imidlertid kan IgM, IgA, IgD eller IgE .benyttes i stedet. Dette er den indirekte binding mellom det enzymkonjugerte antilegeme og antigenet. Ikke-omsatt enzymkonjugert antilegeme vaskes bort. I trinn- 5 tilsettes en radioaktiv indikator. Enzymet adhert til bunnen omdanner indikatoren til et eller flere radioaktive produkter, som deretter separeres fra ikke-omsatt indikator ved.kromatografi. Det eller de separerte radioaktivt merket produkt eller produkter anbringes i en scintillasjonskyvette med en flytende scintillator dg telles. Mengden radioaktivt produkt eller produkter er proporsjonal med mengden* "antigen i det opprinnelige prøvemateriale. ;Figur 2 viser metodetrinnene for den direkte prøving på antigenmåling i henhold tii oppfinnelsen. I trinn 1 blir et antigen-reaktivt antilegeme (Ab^) adhert til det faste substrat slik som brønnen i en mikrotiterplate. ;Ik.ke-adh.ert antilegeme vaskes bort.. I trinn 2 blir prøve-materialet, slik som en prøve fra en pasient eller et dyr eller en oppløst omgivélsesprøve tilsatt. Hvis den er antigene-positiv (antigene vist som en sirkel) vil antigenet adhere til antilegemet forbelegge. Antigene-negativt material, vist i ruterform, vaskes.bort. Det antigene negative materiale vaskes bort. I trinn 3 blir et andre antigene-reaktivt antilegeme, Ab, konjugert med et spesielt enzym, tilsatt. Dette antilegemet.kan stamme fra den samme vertsdyrkilde som Ab^og er spesifikt mot antigenet. Dette reagerer med antigenet som tilsettes til Ab^. Denne metode er generelt mere kostbar enn ,den . indirekte metode fordi det enzymkonjugerte antilegemet generelt kun er tilgjengelig i små mengder på grunn av spesifisiteten overfor spesielle antigener. Det oppstår tap ved konjugeringsreak-sjonen som gjør reagensene meget kostbare. Som tidligere nevnt er den indirekte metode, enzym-konjugert anti-Ab2lettere tilgjengelig. Ikke-omsatt-énzym-konjugert antilegeme vaskes bort. I trinn 4 tilsettes en radioaktivindikator. Enzymet adh.<y>rt til brønnen omdanner indikatoren til ett eller flere radioaktive produkter. Disse separeres deretter fra ikke-omsatt indikator. Radioaktive produkter plaseres i en scintillasjonskyvette med en flytende scintilator og telles'. Mengden radioaktive produkter som indikeres ved tellingen er proporsjonal med mengden av antigen i det opprinnelige prøvemater-iale. ;I figur 3 er det vist en' fremgangsmåte for prøving av antilegemer ifølge oppfinnelsen (en bindeprøve). ;I trinn 1 blir et-antilegeme (Ab-^) til én antigen adhert;til det faste substrat vist som eri mikrotiterbrønn. Oversiden av antilegemet vaskes bort.* I trinn 2 blir det kjente antigen tilsatt,her vist som en sirkel). Det kobler med. det antigene-reaktive antilegeme. som allerede er adhert til substratet. Tilstedeværende ikké-antigent materiale, vist i ruterform, vil fjernes ved etterfølgende vasking. Ikke-antigent materiale vaskes vekk. I trinn 3 tilsettes

det serum fluid som skal prøves. Hvis det inneholder det antigene-reaktive antilegeme (^ >2^ : det prøves med henblikk på vil dette Ab2adhere til antigenet. Overskytende fluid vaskes bort. I trinn 4 blir det tilsatt enzym-konjugert antilegeme rettet mot immunoglobuiinunderklassen (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE) for den animalske vertskilde for Ab2- Dette enzym-konjugerte antilegeme kobler således til kombinasjonen av Ab2^antigen og Ab^. Ab2 virker.som antigen overfor dette enzymkoblede antilegeme. Overskytende fluid vaskes bort.

I trinn 5 blir en radioaktiv-indikator tilsatt. Enzymet adhert gjennom koblingen med Ab2omdanner den radioaktive indikator til ett eller flere radioaktivt merkede produkter. Disse separeres fra ikke-omsatt indikator. Det radioaktivt merkede produkt anbringes i en scintillasjonskyvette med en' flytende scintillator og telles.,, Mengden av radioaktivt-merket produkt som indikert ved tellingen er proporsjonal med mengden av antilegeme det ble undersøkt med henblikk på

i det opprinnelige prøvemateriale. - Eksempel I Rensing av tritium-merkét adenosin-5'-monofosfat.

Adenosin-5<1->monofosfatet merket med tritium H<3>

ble oppnådd kommersielt. Radioaktiviteten for dette materiale var omtrent 15 Ci per millimol.' Det ble renset ved kolonnekromatografi med et ionebyttemateriale, "DEAE Sephadex". et dryss-bundet polysakkariddekstran. Rensingen ble gjennomført på trinnvis måte. To millicurier av det tritium-merkede adenosin-5'-monofosfat i 0,2. ml destillert vann ble påført på en engangs kolonne inneholdende 2 ml "DEAE Sephadex" Det forurensede tritium-merkede adenosin ble eluert med destillert vann og kassert. Det tritium-merkede adenosin-5'-mono-fosfat ble eluert med 0,2 mol ammoniiimkarbonat og etter lyofylisering for å fjerne ammoniumkårbonatet ble det tritium-merkede adenosin-5'-monofosfat oppløst i 50% etanol. Det således rensede tritium-merkede adenosin-5<1->monofosfat inneholdt mindre enn 0,2% tritium-adenosin og var stabilt ved -20°C i minst tre måneder.

Eksempel II. Bestemmelse av optimale prøvebetingelser.

For å bestemme enzym-kinetikken for alkalisk fosfattase-IgG (geite-anti-kanin) konjugat, ble forskjellige konsentrasjoner av adenosin-5'-monofosfat:tilsatt til en 10^ fortynning av enzym-IgG konjug.atet. Figur-4a viser prosentandelen adenosin-S^monofosfat (AMP), omdannet ved alkalisk fosfatase IgG konjugat tii'adenosinet. Alkaliske fosfatase konjugat (2 x 10 — 8 milligram per milliliter) ble tilsatt til 10 mM dietanolaminbuffer med en pH på 9,8, og inneholdende forskjellige konsentrasjoner av AMP. Reaksjons-blandingene ble inkubert ved 37°C .i '30 minutter. Frigitt tritium-merket adenosin ble bestemt ,ved kolonnekromatografi ved bruk av "DEAE Sephadex" ved å bringe en 0,05 milliliters andel av reaksjonsblandingen til en kplonne pakket med 1,5 milliliter $DEAE Sephadex A-25" fuljgt av eluering med tiIsammen 4,5 milliliter 0,01 M dietanolaminbuffer med en pH-yerdi på 9,8, inneholdende 0,1 mM umerket adenosin i to fraksjoner. 20 ml av en flytende scin-tillator, "Aquasol", ble tilsatt til hver fraksjon og tritiummerket adenosin ble målt i en flytende scintillasjonsteller. Km-verdien ble beregnet til å være omtrent 4 mM ved .en. dobbel resiprok oppføring av Michalis-Menton-ligningen som er vist i figur 4 b. Når fraksjonen av tritium-merket AMP omdannet til tritium-merket adenosin ble oppført mot konsentrasjonen av tritium-AMP (Figur 4a), så man enhøyere prosentandel tritium-AMP omdannet til tritium-adenosin ved de laveste konsentrasjoner av radioaktiv.indikator. Basert på disse resultater ble en tritium-AMP konsentrasjon på ca. 1 mikro-mol (3 x 10<6>DPM) benyttet ved de følgende forsøk. Tellingen for den foreliggende scintillasjonsteller ble justert i henhold til standard teknikker for å ."oppnå DPM-verdien, disintegreringer per minutt. Varierende konsentrasjoner av dietanolaminbuffer og MgC^ ble prøvet. Tilsetningen av MgCl2til blandingen øket den ikke-enzymatiske hydrolyse

for tritium-AMP. Enzymaktiviteten for alkalisk fosfatase sank med dietanolaminkonsentrasjoner på 1 nM eller mindre.

Eksempel III. Bestemmelse av følsomheten for prøven.

Forskjellige fortynninger av alkalisk fosfatase

-17 -21

(10 til 10 mol) ble innarbeidet i 0,1 ml reaksjons-volumer av 10 mM dietanolaminbuffer ved pH 9 inneholdende 100 picamoler tritium-AMP som radioåktiv-indikator. Produk-tene ble isolert som ovenfor ved "DEAE Sephadex" kblonne-kromatografi. Aktiviteten uttrykkes som adenosin (DPM) frigitt i 90 minutter. Som vist i.figur 2, kan metoden påvise enzymnivåer på 10 -12 milligram per milliliter, -20 ;

dvs. 10. mol alkaliske fosfatase. , Frigjøringen av tritium--17 adenosin var lineære for enzym-konsentrasjoner fra 10

til 10 -20mol i et inkuberingsvolum på 0,1 ml i løpet av en 90 minutters prøve.. Ved disse enzymkonsentrasjoner ble tilsvarende resultater oppnådd når pH—verdien i reåksjons-blandingen var enten 9,0 eller 9,8... ;

Eksempel IV. Tidsforløpstudium av alkaliske fosfatase-IgG-konjugatreaksjonen.

Triplikater av prøveblandingen inneholdende

— 8

100 pikamol tritium-AMP og> 10 . milligram enzymkonjugat i 0,1 milliliter 10 mM buffer med en pH-verdi på 9,0 ble inkubert ved 37°C fra 0 til 48 timer-.- Mengder på 50 mikroliter av reaksjonsblandingen ble.trukket av for bestemmelse av enzymaktiviteten etter. 0,5, 1,5, 4,5, 24 og 48 timer. Resultatene av disse prøver er vist i figur 6. Enzymaktiviteten var noe nær lineær i 90 minutter ved omtrent 2% tritium-AMPhydrolysert til" tritium-adenosin og fosfat. Ved 24 og 48 timer ble enzymreaksjonene langsommere. Fordi tritium-AMP radioaktivindikatox fremdeles var i over-skudd kunne reduksjonen av enzymaktiviteten være sekundære til enzymnedbrytning og/eller produktinhibering. For å bestemme virkningene av reaksjonsproduktene på prøven ble enten fosfat (2 eller 20 pikamol) eller adenosin (20 pikamol) tilsatt til prøveblandingene. 2 og 20 pikamolfosfat- , ihhiberte alkalisk fosfatase aktivitet ved 8 h.h.v. 90%.

20 pikamol adenosin forårsaket ingen; påvisbar virkning på aktiviteten av adenosinfosfatase. Variasjonen i triplikat- prøvene var små. For reaksjonstider på mindre enn 5 timer var variasjonen i enten duplikat- eller triplikatprøvene mindre enn 10% av middelverdien.

Eksempel V. Fremstilling av alkalisk fosfatase-konjugert anti-sera.

Som et eksempel på generelt brukte konjugerings-metoder benyttes den følgende prosedyre for å fremstille geite-antimarsvinsera. Fosfat-buffered saltoppløsning (PBS; pH 7,4) i en mengde på 1,0 milliliter tilsettes til 1,0 milliliter anti-serum. Til denne blanding tilsettes 2,0 milliliter 36%-ig Na2S04. Denne blanding omrøres langsomt i 30 minutter ved romtemperatur. Blandingen sentrifugeres ved 3000 x g i 10 minutter. Overstående væske kasseres. Precipitatet vaskes to ganger i 18%<->i.g Na2S04oppløsning. Precipitatet etter vasking sentrifugeres igjen og overstående væske kasseres. Precipitatet oppløses i 0,8 ml PBS.

En like stor mengde 24%-ig Na^O^-oppløsning tilsettes. Dette sentrifugeres ved 3000 xg i 10 minutter. Det resulterende precipitat ble vasket med 12% Na2S04> Precipitatet gjenoppløses i 1,0 ml PBS og overføres til en dialyse-pose. Den dialyseres i 3~dager ved-+ 4°C mot PBS. For å fjerne uoppløselig stoff kan oppløsningen etter dialyse sentrifugeres ved 5000 omdreininger pr. minutt i 10 minutter. Precipitatet kasseres og overstående væske merkes for senere bruk. Proteinkonsentrasjonen kan bestemmes ved optisk densitets adsorbsjon ved 280 nm. Således er anti-serumet ferdig for konjugering. ■

Den alkaliske fosfatase er kommersielt tilgjengelig. Den kan være tilgjengelig fra kalveslikhinner, Sigma type VII, med en spesifik aktivitet på 300-1100 enheter pr. mg. Enzymsuspensjonen sentrifugeres "dg-overstående væske kasseres. 2 milligram av det ovenfor fremstilte anti-serum ■ i 1.milliliter PBS tilsettes til 5 milligram enzym. Dette blandes ved romtemperatur. Blandingen dialyseres ekstensivt med +4°C med flere forandringer, av PBS. Den dialyserte oppløsning hadde 2 5% glutaraldehyd addert til seg og det ga en sluttkonsentrasjon på 0,2%. Denne, inkuberes i 1 til 2 timer ved romtemperatur og dialyseres derfor igjen ved +4°C mot tre utbyttinger av PBS. Dialyserøret overføres til en . 0,05 molar tris-(hydroksymetyl)-aminometanbuffer med en pH-verdi på 8,0. Dialysen fortsettes ekstensivt ved +4°C med tre utskiftninger av buffer. Det således fremstilte konjugat fortynnes til 4,0 ml med trisbuffer inneholdende 1,0% kalvefosterserum og 0,02% natriumazid. Dette lagres i mørket ved + 4°C. På ovenfor angitt måte fremstilles det enzym-konjugerte antilegeme.

Eksempel VI. Måling av koleratoksin.

Ifølge oppfinnelsen ble .koleratoksin målt som følger: Rundbuede mikrotiter-plater av polyvinyl ble belagt med en 0,1 ml mengde av esel-antikoleratoksin fortynnet til 1:10.000 i 0,06 M.karbonatbuffer ved en pH verdi på 9,8 i 14 timer ved 4°C. Denne prosedyre adherte eselanti-kolera antilegemet til det faste substrat. Brønnene, i platene ble vasket 5 ganger i fosfatbuffered saltoppløsning (PBS;

pH 7,4) inneholdende 0,5 ml av et vaskemiddel "Tween 20", per liter (PBS-Tween) . En" 0,1 ml mengde av enten kolera-toksinfortynning eller oppløsningsmiddel (for negativ kontroll) ble tilsatt i duplikat til brønnene. De negative kontroller bestod av 5 filtrater av stammer av E. coli som ikke gir påvisbart toksin. Platene ble inkubert i 14 timer, ved 4°C. Deretter ble et antigene koblet til det faste substrat..

Etter en ytterligere vasking som ovenfor med PBS-Tween, ble en 0,1 ml mengde av marsvinanti-koleratoksin fortynnet 1:400 i PBS-tween inneholdende 1% normalt hesteserum tilsatt.. Det normale hesteserum tilsettes til for-tynningen både for å mette ikke-bundede punkter i brønnen, og for å minimalisere kryss-reaktiviteten med eselserum-bindingen til veggen. Platene ble inkubert i 1 time ved 37°C. Således var et ikkekonjugert antilegeme fra en animalsk kilde forskjellig fra det adherte antilegeme omsatt med det koblede antigene.

Etter en ytterligere vaskingsprosedyre som oven-form med. PBS-Tween, ble 0,1 milliliters andeler av alkalisk fosfatase konjugert geite-anti-mars.vin IgG, (fortynnet 1:800, fremstillet som i eksempel V) tilsatt til hver brønn. Det enzym-konjugerte antilegeme reagerer, med det adherte ikke-konjugerte antilegeme og antigen.

Etter en ytterligere vaskeprosedyre ble 0,1 ml mengder tritium-adenosin-5'-monofosfat (tritium-AMP) (3 x IO<6>CPM; 1,0 x IO<-10>mol) fortynnet i 0,01 mM dietanolamin, pH 9,0, tilsatt til hver brønn.

Etter 10, 100 eller 1.000 minutter ble det tritiumadenosin som ble dannet ved reaksjonen mellom det alkaliske fosfotase IgG konjugat buhdet til antigenet med tritium-AMP-radioaktivindikator separert ved å tilføre en 0,05 ml andel av reaksjonsblandingen .til en kolonne pakket med 1,5 ml ionebytteharpiks "DEAE Sephadex A-25" (kryss-bundet ved polysakkariddekstran). Dette ble fulgt av eluering med tilsammen 4,5 ml 0,1 M- dietanolamin buffer med pH-verdi 9,8 og inneholdende 0,1 mM'adenosin i to fraksjoner. 20 ml flytende scintillator "Aquasol", ble tilsatt til hver fraksjon og tritiumadenosin ble målt -i en flytende scintil-las jonsteller. Som alkalisk fosfatase negativ kontroll ble 0,1 ml mengde tritium-AMP inkubert ved 37°C uten enzym-kon jugatet i samme tidsrom som prøvene. 0,05 ml av de negative kontroller ble ført gjennom DEAE ionebyttekolonnen for å bestemme mengden tritium-adenosln som var dannet i fravær av enzymet. Den enzym-spesifikke aktivitet ble bestemt ved å subtrahere denne verdi fra den■som ble oppnådd for prøven. I tillegg ble fem filtrater fra ikke-koleratoksin produserende mikroorganismer ( E. coli) kjørt i hver prøve.

Én prøvebrønn ble ansett positiv for koleratoksin hvis den ga en enzymspesifikk aktivitet som var to standardavvik større enn den midlere toksin-frie kontrollvérdi. Prøvene ole kjørt i dubl.ikat og variasjonen mellom duplikatene var mindre enn 5%. Resultatene er vist i tabell 1.

Eksempel VII- ELISA-måling av koleratoksin.

Måleprøvene for koleratoksin ved bruk av ELISA ble gjennomført identisk med eksempel VI med det unntak at tritium-AMP ikke ble brukt som indikator for den alkaliske fosfatase. Istedet ble p-nitrofenyl-fosfat benyttet fortynnet 1 milligram per milliliter i .0,1 mM dietanolamin-buf f er med pH 9,8, inneholdende 0,01 mM MgCl2- Graden av enzymatisk reaksjon ble bestemt ved å måle dannelsen av. gulfarvet produkt ved 405 nm i et spektrofotometer. Dette ble gjennomført i generell overensstemmelse med de metoder som skissert i Yolken, et al., "Journal of Clinical Microbiology", vol. 6, Nr. '5, nov. 1977, sidene 439-444 og Engvall, et al., "Journal of Immunology", vol. 109, 1972, sidene 129-13 5. Resultatene for denne prøve er angitt i sammenligning med det som ble oppnådd ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse i tabell 1.

Sammenligningen mellom ELISA og foreliggende oppfinnelse for påvisning av koleratoksin er vist i tabell 1. Ved bruk av en reaksjonstid på 1000' minutter kan ELISA påvise

-13 10 gram, dvs. ca. 6 x 10 molekyler: koleratoksin. Foreliggende oppfinnelse kan overraskendeipåvise 10 ganger lavere mengder toksin med en kortere inkuberingstid på 10 minutter. Ved sammenlignbar inkuberingstid på 1000 minutter kan 10 gram, dvs. 6 x 10 2molekyler toksin påvises ved fremgangs-'måten ifølge oppfinnelsen. Denne tusenganger økning i følsomhet er ekstremt uventet.

Det vil være åpenbart for fagmannen at foreliggende fremgangsmåte kan benyttes i blokkeringsprøver som velkjent i denne teknikk.

Eksempel VIII. Måling av rotavirus.

Rotavirus, et 70 nm virus som også kalles humant reovirus-lignende middel (HRVLA), duovirus og infantilt gastorenteritis virus, er en.viktig årsakt til gastroenteritis i spebarn og små barn i flere deler av verden. En diagnostisering av rotavirus gastroenteritis har vært hemmet fordi middelet ikke gror godt i vev-kulturer. Direkte påvisning av negativt flekkede virus-partikler ved elektronmikroskopi har vist seg å være et pålitelig middel for diagnostisering såvel som ved radio-aktiveimmunoprøver (RIA) og ELISA.' Foreliggende oppfinnelse gir også en spesifikk prøve på rotavirus.

Målingen av rotavirus 'ble gjennomført på samme måte som i eksempel VI ovenfor med det unntak at geite-rotavirus-serum ble benyttet i stedet for burro anti-koleratoksin, marsvin anti-rotavirus serum ble benyttet i stedet for marsvin anti-koleratoksin og vanlig geite-serum ble benyttet i stedet for vanlig hesteserum.i fortynningstrinnet. Prøvene ble fremstillet ved å benytte en standardkjent teknikk som for eksempel ifølge Yolken, et al., i "The Lancet", 6.august 19.77, sidene 263-268 samt Yolken, et al. "Science", vol. 201', 21. juli 1978, sidene 259-262. Fem avføringsprøver fra vanlige barn ble tilført til hver prøve som negativ kontroll/ En fortynning av

et standardfiltrat ble ansett positiv med henblikk på rotavirus hvis den hadde en verdi på- to standardavvik større enn den midlere av fem kontroller. Resultatene av disse prøver er angitt i tabell 2..

Eksempel IX. Måling' av rotavirus ved bruk av ELISA.

De samme prøver som undersøkt i eksempel VIII ble prøvet ved bruk av ELISA ifølge"Yolken, et al. i

"The Lancet", 6. august 1977, sidene 263-268. Prinsippielt benyttet ELISA i steden for tritium-AMP, som radioaktiv indikator på alkalisk fosfatase p-nitrofenylfosfat fortynnet 1 milligram per milliliter i 0,1 mM dietanolaminbuffer,

pH 9,8, inneholdende 0,01 mM MgCl2. Hastigheten for den

enzymatiske reaksjon ble bestemt ved måling av dannelsen av gulfarvet produkt ved 405 nm i et spektrofotometer. Resultatene er oppført i tabell 2.

Eksempel X. Måling av rotavirus ved bruk av RIA.

De samme prøver som ble undersøkt i eksemplene VIII og IX ble også prøvet ved å bruke radioimmunoprøver, RIA-teknikker på samme måte som beskrevet av Greenberg, et al. i "Infection and Immunity", vol. 17, nr. 3, september 1977, sidene 541-545. I prinsippet ble renset marsvin anti-rotavirus IgG merket med jod 12 5(ca. 20 mikrocurie/ mikrogram protein). Det merkede■immunoglobulin ble fortynnet i 1:1 i kalvefosterserum og,lagret ved 4°C. En fastfasemikrotiter-prøve ble benyttet. Polyvinylmikro-titerplater ble forbelagt med geite ;anti-rotavirusserum fortynnet i PBS. Den optimale fortynning av anti-serum ble bestemt ved sjakkbrett-titrering. Etter inkubering ble brønnene vasket med PBS. 50 mikroliter av prøvene ble tilsatt til brønnene og tillatt inkubering ved romtemperatur. Brønnene ble. deretter vasket med PBS og 12 5 50 mikroliter jod -merket marsvin-antirotavirusserum ble tilsatt til hver brønn. Etter inkubering ble platene igjen vasket og skåret opp med sakser. De separate brønner ble plasert i gamma-tellerør for analyse. Resultatene ble uttrykt som et forhold mellom resttellinger i prøvebrønnen og det midlere av resttellingen i kontroll-brønner. Et positivt/negativt (P/N)- forhold på 1,7 eller større ble ansett å være positiv,med henblikk på rotavirus. Resultatene er vist i tabell 2.

I tabell 2, ble foreliggende oppfinnelse sammen-lignet med både RIA og ELISA med henblikk på påvisning av virus. Som det lett kan sees er metoden ifølge foreliggende oppfinnelse ett hundre ganger mere følsom enn ELISA og ett tusen ganger mere følsom enn RIA.<:>

Således er det åpenbart at foreliggende oppfinnelse er egnet for kvalitative og kvantitative målinger av immunosystreaktanter, slik som antilegemer eller antigener, for eksempel, vira, bakterier, parasitter, hormoner, toksiner, tumormarkører, legemidler osv. i kompleksblanding-er og oppløsninger slik som kroppsvæsker og omgivelsesprøver for diagnose-, prognose-, epidemiologiske og eksperimentelle formål. Den overraskende økning i følsomheten er vist.

Claims (20)

1. Fremgangsmåte for kvantitativ måling av konsentrasjonen av en irnmunosystemreaktant, karakterisert ved at den omfatter: a) å preparere et fast substrat; b) selektivt å koble irnmunosystemreaktanten til substratet; c) kobling av et enzym-konjugert antilegeme til reaktanten; d) omsetning av en radioaktivt merket indikator med det enzymkonjugerte antilegemet for derved å gi et radioaktivt merket produkt og et ikke-merket produkt; e) å separere radioaktivt merket produkt fra ikke-omsatt indikator; og f) måle graden av reaksjon ved radioaktiv telling av radioaktivt merket produkt, idet tellingen gir et kvantitativt mål på konsentrasjonen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at irnmunosystemreaktanten som måles er et spesifikt antigen.

3. Fremgangsmåte ifølge -krav 1, der irnmunosys temreaktanten som måles er et enkelt spesifikt antigen-reaktivt antilegeme fra en spesiell animalsk kilde, karakterisert ved at trinn a) omfatter kobling av et antigen til substratet, idet antigenet er spesifikt for antilegemet som måles;" trinn b) omfatter omsetning av antilegemet med det, koblede antigen, for derved å adhere antilegemet til det koblede antigen; og trinn c) omfatter omsetning av det enzymkonjugerte antilegemet med det adherte antilegeme, idet det enzymkonjugerte antilegeme er valgt fra gruppen rettet mot immunoglobulinunderklassen av den animalske kilde for det adherte antilegemet, for derved å koble det enzym-konjugerte antilegeme til det adherte antilegemet.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at trinn a) omfatter å adhere et antigen-reaktivt antilegeme til substratet, idet det antigenreaktive antilegeme er spesifikt for antigenet og trinn b) omfatter omsetning av antigenet med det adherte antilegeme.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det enzym-konjugerte antilegeme er spesifikt for antigenet og trinn c) omfatter omsetning av det enzym-konjugerte antilegeme direkte med det koblede antigen.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at trinn c) omfatter omsetning av et ikke-konjugert antigene-spesifikt antilegeme med det koblede antigen, idet det ikke-konjugerte antilegeme er fra en animalsk kilde forskjellig fra det adherte antilegeme, og omsetning av det enzym-konjugerte antilegeme med ikke-konjugerte antilegeme, idet det enzymkonjugerte antilegeme er valgt fra gruppen rettet mot immunoglobulinunderklassen av den animalske kilde for det ikke-konjugerte antilegeme, for derved å koble det enzym-konjugerte antilegeme til antigenet.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved a.t trinn a) omfatter adhering av et antigene-reaktivt antilegeme til substratet, idet det antigenereaktive antilegeme er spesifikt for antigenet og trinn b) omfatter omsetning av antigenet med det adherte antilegeme.

8. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7, karakterisert ved at det som radioaktivt merket indikator benyttes radioaktivt merket adenosin-5'-monofosfat.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at'ådenosin-5'-monofosfat er merket med H <3> og/eller karbon14 '

10. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at adenosin-5 <1-> monofos-32 fat er merket med p

11. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7, karakterisert ved at det enzym-konjugerte antilegeme er et, antilegeme konjugert med alkalisk fosfatase.

12 . Fremgangsmåte ifølge, krav 11, karakterisert ved . at det som antilegeme benyttes IgG globulin.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at trinn e) gjennomføres ved hjelp av kromatografi.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert veda;t det som kromatograf i-metode benyttes væskekromatografi:

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at nevnte væskekromatografi omfatter å føre nevnte radioaktivt merkede og ikke-merkede produkter gjennom en selektrivt adsorberende ionebyttekolonne.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved . at ionebyttekolonnen er pakket med kryss-bundet polymerisert dekstan ionebyttemateriale.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at det som kromatografi benyttes tynnskikt-kromatografi.

18. Fremgangsmåte iføige krav 14, karakterisert vedat det som kromatografi benyttes høytrykkskromatografi.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 6 eller 7, karakterisert vedat antigenet er koleratoksin.

20 Fremgangsmåte ifølg krav 6 eller 7, karakterisert ved at antigenet er humanrotavirus. Forandrede krav (mottatt av det internationale byrå 4. november 1980) 1. Fremgangsmåte for kvantitativ måling av konsentrasjonen av en irnmunosystemreaktant, karakterisert ved at den omfatter: a) å preparere et fast substrat; b) selektiv adhering av irnmunosystemreaktanten til substratet; c) binding av et enzym-konjugert antilegeme til reaktanten; d) omsetning av en radioaktivt merket indikator med det enzymkonjugerte antilegeme for derved å gi et radioaktivt merket produkt og ét ikke-merket produkt; e) å separere radioaktivt merket produkt fra ikke-omsatt indikator; og f måle graden av reaksjon ved radioaktiv telling av radioaktivt merket produkt, idet tellingen gir et kvantitativt mål på konsentrasjonen. •

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at irnmunosystemreaktanten som måles er et spesifikt antigen. -

3. Fremgangsmåte ifølge' krav 1, der irnmunosys temreaktanten som måles er et enkelt spesifikt antigen-reaktivt antilegeme fra en spesiell animalsk kilde, karakterisert ved at trinn a) omfatter adhering av et antigen til substratet, idet antigenet er spesifikt for antilegemet som måles;.trinn b) omfatter omsetning av antilegemet med det adherte antigen, for derved å binde antilegemet til det adherte antigen; og trinn c) omfatter omsetning av det enzymkonjugerte antilegeme med det adherte antilegeme, idet enzymkonjugerte antilegeme er valgt fra gruppen rettet mot immunoglobulin underklassen av den animalske kilde for det adherte antilegemet, for derved å binde det enzym-konjugerte antilegeme til det adherte antilegeme.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert vedat trinn a) omfatter å adhere et angigen-reaktivt antilegeme til substratet, idet det antigen-reaktive antilegeme er spesifikt for antigenet og trinn b) omfatter omsetning av antigenet med et adhert antilegeme.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det anzym-konjugerte antilegeme er spesifikt for antigenet og trinn c) omfatter omsetning av det enzym-konjugerte antilegeme direkte med det adherte antigen.

6. Fremgangsmåte ifølge-krav 2, karakterisert ved at trinn c) omfatter omsetning av et ikke-konjugert antigene-spesifikt.antilegeme med det adherte antigen, idet det ikke-konjugerte antilegeme er fra en animalsk kilde forskjellig fra det adherte antilegeme, og omsetning av det enzym-konjugerte antilegeme med ikke-konjugerte antilegeme, idet det enzymkonjugerte antilegeme er valgt fra gruppen rettet mot immunoglobulinunderklassen av den animalske kilde for det ikke-konjugerte antilegeme, for derved å binde det enzym-konjugerte antilegeme til antigenet.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at trinn a) omfatter adhering av et antigene-reaktivt antilegeme til substratet, idet det antigenreaktive antilegeme er spesifikt for antigenet og trinn b) omfatter' omsetning av antigenet med det adherte antilegeme. ■8. Fremgangsmåte ifølge.et hvilket som helst av kravene 1-7, karakterisert vedat det som radioaktivt merket indikator benyttes radioaktivt merket adenosin-5 <1-> monofosfat.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at adenosin-5 <1-> monofosfat er merket med H og/eller karbon .

10. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at adenosin-5'-monofosfat er merket med p <32>

11. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7, karakterisert ved at det enzym-konjugerte antilegemet er et antilegeme konjugert med alkalisk fosfatase.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at det som antilegeme benyttes IgG globulin.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at trinn e) gjennomføres ved hjelp av kromatografi.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at det som kromatografimetode benyttes væskekromatografi.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at nevnte væskekromatografi omfatter å føre nevnte radioaktivt merkede og ikke-merkede produkter gjennom en selektivt adsorberende ionebyttekolonne.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at ionebyttekoionnen er pakket med kryss-bundet polymerisert dekstran ionebyttemateriale.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at det som kromatografi benyttes tynnskikt-kromatografi.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at det som kromatografi benyttes høytrykkskromatografi.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 6 eller 7, karakterisert ved at antigenet er koleratoksin.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 6 eller 7, karakterisert ved at.antigenet er humanrotavirus.