NO753209L - - Google Patents

Description

"Analogifremgangsmåte for fremstilling av

terapeutisk aktivt acylert orgotein".

Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktivt acylert orgotein.

Foreliggende oppfinnelse gjelder fremstilling av acylert orgotein.;

Orgotein er det ikke-beskyttede navn som United States Adopted Name Council har gitt en familie av likeartede, vannløselige proteiner i i hovedsak ren, injiserbar form, det vil si i hovedsak fri fra andre proteiner som er blandet eller forbundet med dem i kildene for dem. US-PS 3.758.682 beskytter farmasøytiske preparater som omfatter orgotein.

Orgotein-metallproteinene er medlemmer av en familie av likéartede proteiner som har en karakteristisk kombinasjon av fysikalske, kjemiske, biologiske og. fårmakody-namiske egenskaper. Hver av disse medlemmer er fysikalskkarakterisertVed å være den isolerte, i hovedsak rene form av et kuleformet, buffer- og vannløselig protein med en meget kompakt naturlig oppbygning som, selv om det er varme-labilt, er stabilt ved oppvarming i flere minutter ved 65°C, når det er oppløst 1 en buffer-løsning som inneholder et salt av et toverdig metall : som har en ioneradius på 0,60 til 1,00 A. og som ved gel-elektroforese gir et karakteristisk fler-bånds-mønster. Kjemisk er hvert av demkarakterisert vedat det inneholder alle utenom 0-2 av protein-aminosyrene, en liten prosentdel karbohydrat, ingen lipider, 0,1 til 1,0% metaller som foreligger i form av

1 til 5 gramatomer pr. mol av et eller flere chelaterte, toverd!-ge metaller med en ioneradius på 0,60 til'1,00 A, og i hoved-

sak ingen chelaterte, enverdige metaller eller slike som er celle-gifter i molekylet.

Aminosyresammehsetningen av orgotein-medlemmene

er bemerkelsesverdig ensartet uavhengig av hvilken kilde de isoleres fra.

Tabell I angir fordelingen av aminosyrerestené, beregnet for en molekylvekt på 32.500 for flere orgotein-medlemmer.

Det kan sees fra tabell I at orgotein-proteinehe har fra 20 til 26 og vanligvis 20-23 lysingrupper, av hvilke alle unntatt 1-3 har titrerbare (med trinitrobenzensulfonsyre)

e-aminogrupper. Foreliggende oppfinnelse gjelder orgoteinderi-vater hvori minst en del av orgotein-lysingruppene er acylert. Foreliggende oppfinnelse angår N-acyl-orgotein når det gjelder preparataspektet.

Foreliggende oppfinnelse gjelder dessuten farma-søytiske preparater som inneholder de nye acylerte orgoteiner ifølge oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse gjelder også behandling av betennelsestilstander medoet preparat ifølge oppfinnelsen.

Det native orgoteinproteinet har enestående høy superoksyddismutaseaktivitet. Se McCord&Fridovich, J.. Biol. Chem., 244, 6049 (1969); Keele, McCord og Fridovich, J. Biol. Chem., 245, 6176 (1970); ibid, 246, 2875 (1971). Denne aktivitet synker raskt ved acetylering av lysingruppene, for eksempel til 20-50% av det native proteinet. Overraskende påvirkes den anti-inflammatoriske aktiviteten for nativt protein uvesentlig ved acylering. Det acylerte proteinet er derfor nyttig på samme må-te som det native proteinet.for behandling av inflammatoriske tilstander hos pattedyr og andre dyr.

Atskillelsen av anti-inflammatoriske og SODase-aktiviteter tillater anti-inflammatorisk terapi med minskede

ancillære virkninger frembragt av SODasé-aktivitet. ' Som nevnt ovenfor inneholder orgoteinene fra 20-26 lysingrupper. Siden orgoteinmolekylet er dannet av to identiske peptidkjeder (under-enheter), foreligger halvparten av disse lysingrupper i hver kjede, som er fast men lkke-kovalent bundet sammen under moderate temperatur- og pH-betingelser. På

grunn av den romlige oppbygningen av orgoteinmolekylet er vanligvis e-aminogruppene hos noen få lysingrupper i; hver kjede

ikke titrerbare med trinitrobenzensulfonsyre (TNBS) og er således ikke lett tilgjengelig for acylering. Acylering av de ikke-titrerbare lysin-e-aminogrupper kan imidlertid gjennomføres ved å anvende et passende avyleringsmiddel, for eksempel eddiksyreanhydrid. Acyleringsgraden kan bestemmes ved minskningen i TNBS-reaktive amino-grupper, og det tas i betraktning at 1-3

av lysinene i det native orgoteinproteinet ikke kan titreres med TNBS. I orgotein fra hornkveg kan det eksempelvis påvises bare

18 av dets 20 til 22 lysingrupper.

Moderat aminogruppeacylering kan mengdebestemmes ved å telle ladningsforandringen som viser seg ved elektroforese. Under normale elektroforesebetingelser (pH 8,4 med tris-glycin-buffer) beveger utstrakt acylerte orgoteiner seg for raskt til at deres mønster kan skjelnes. Dette problem kan omgås ved å hybridisere det acylerte orgotein med nativt orgotein, som beskrevet senere, hvorved halvparten av acylgruppene i molekylet blir redusert, og underkaste det hybridiserte molekyl elektroforese.

Generelt sett kan opp til halvparten av lysinene lett acyleres, selv med de mildeste acyleringsmidler, for eksempel acetylsalicylsyre. Alle bortsett fra ca. en av de til-gjengelige (TNBS-titrerbare) lysingruppene i hver av orgotein-peptid-underenhetene kan acyleres ved å anvende sterkere acyl-eringsbetingelser, for eksempel overskudd eddiksyreanhydrid i iskald lm fosfatbuffer med pH 7,5.

Som det kunne ventes, når mindre enn alle titrerbare lysinaminogrupper er acylert, er fordelingen av acylgruppene på orgoteinmolekylet tilsynelatende tilfeldig, siden ingen av de titrerbare lysinaminogruppene later til å være unormalt lett acylerbare. Fordi orgoteinmolekylet er sammensatt av to identiske peptidkjeder vil acylgruppene hos et delvis acylert orgotein være fordelt mere eller mindre tilfeldig på hver peptid-underenhet, men mer eller mindre likt mellom de to kjeder. Siden det vanligvis anvendes et enkelt acyleringsmiddel vil alle acylgruppene være identiske. Det er imidlertid mulig å fremstille acylerte orgoteiner med to eller flere forskjellige acylgrupper i molekylet og selv inne hver kjede av det.

En måte å fremstille blandet acylorgotein er ved å acylere i trinn med forskjellige acyleringsmidler. En fraksjon av de titrerbare lysin-e-aminogrupper kan eksempelvis acyleres med lav konsentrasjon av et acyleringsmiddel, for eksempel 1 x 10 -3m eddiksyreanhydrid, en annen fraksjon av aminogruppene acyleres med en moderat konsentrasjon av et annet acyl--3

eringsmiddel, for eksempel 5 x 10 m ravsyreanhydrid og resten av de reaktive aminogruppene acyleres med en høy konsentrasjon av et acyleringsmiddel som er forskjellig fra de to hittil nevnte. Hva som menes med en lav eller høy konsentrasjon av acyl-

eringsmiddel vil avhenge av de relative reaksjonshastigheter med protein-aminogrupper og med løsningsmiddel og vil således avhenge av reaksjonens pH og acyleringsmidlet, og i mindre grad av buffer og temperatur.

En annen fremgangsmåte for fremstilling av blandet acyl-orgotein er ved hydridisering. Uttrykket hydridisering av orgotein refererer til dannelse av et blandet orgotein fra peptidkjeder i to forskjellige orgoteinmolekyler, for eksempel A2og B2, idet A og B er deres respektive peptidkjeder. (A2 + B2^i. 2AB). Ladningen for heterodimeren AB bør ved elektrodialyse være gjen-nomsnittet av ladningen for homodimerene A2og B2, forutsatt at

samme del av hver underenhet deltar i bindingen i alle tilfellene.

Acetylorgotein som er fremstilt ved acylering av det native orgoteinmolekylet i lm fosfatbuffer med pH 7,5 med

overskudd eddiksyreanhydrid, først i isvann i 2,8 timer og så i en time Ved romtemperatur, og suksinyl-orgotein som er fremstilt ved suksinylering av orgotein i 0,lm fosfatbuffer med pH 7,5 ved romtemperatur i 3,6 timer, kan begge hydridiseres med nativt orgotein ved å oppvarme dem med et lite overskudd av nativt orgotein ved 50°C i 4 timer. De resulterende heterodimerer elektro-foreserer hovedsakelig som et bånd hver med en ladning som til-svarer 10 acetyler for acetyl-orgotein/orgotein-hybriden og 9 suksinyler for suksinyl-orgotein/orgoteinhybriden. Siden hornkveg-orgotein bare inneholder 10 til 11 lysingrupper pr. under-enhet dannes hybridproduktene respektive fra en nativ orgotein-peptidunderenhet pluss en acetyl-orgoteinpeptid-underenhet, av hvilke alle lysin-e-aminogrupper er acetylaminogruppef, og fra en nativ orgotein-peptid-underehhet pluss en suksinylorgoteinpep-tid-underenhet, av hvilke alle unntatt en lysin-e-aminogruppene er suksinylaminogrupper.

Som det vil fremgå kan disse hybride semi-acylerte orgoteinmolekyler acylerés videre med et annet acyleringsmiddel slik at det oppnås et hybrid orgotein hvori acylgruppene i en peptidkjede er forskjellige fra acylgruppene i den andre kjeden.

N-acyl-orgoteinene ifølge oppfinnelsen synes å ha i hovedsak samme romlige form som det native orgoteinmolekylet. Chelaterte Cu<++->og Zn<++->(gramatomer pr. mol) innhold er om-trent de samme som for orgotein. Lik orgotein er de meget resi-stente overfor nedbrytning av Pronase og andre proteolytiske enzymer. Enzymatisk superoksyddismutaseaktivitet blir imidlertid markert.og økende redusert, for eksempel til ca. 20-50% av aktiviteten for orgotein, med økende acyleringsgrad, som vist i nedenstående tabell.

Den nøyaktige natur av N-acyigruppene så vel som antallet N-acylgrupper ,,er ikke kritisk så lenge som det er acylradikalen av en fysiologisk akseptabel syre. På grunn, av den høyere molekylvekt av orgoteinmolekylet, selv når oargoteinmole-kylet er fullstendig acylert med acylgrupper av moderat molekylvekt, for eksempel RCO-£160, er innvirkningen på hele den kjemiske forbindelsen relativt liten, det vil si mindre enn 10%. Åcyleringen av de frie aminpgruppene har naturligvis en kraftig virkning på det isoelektriske punktet og den resulterende elektro-foretiske bevegeligheten, men som diskutert nedenfor, har den ingen synlig signifikant effekt på den kompakte romlige form

hos molekylet og den resulterende stabiliteten, for eksempel overfor oppvarming i en time ved 60°C og overfor angrep av prete-olytiské enzymer.

Som det vil fremgå må acylgruppen også være oppnådd fra et acyleringsmiddel som er i stand til å acylere en aminogruppe i vann- eller bufferløsning, siden reaksjonen vanligvis utføres i slike løsninger. Slike acyleringsmidler omfatter frie syrer i; kombinasjon med en acyleringskatalysator som for eksempel vannløselige karbodiimider, syrehalogeriider, anhydrider, tibestere, ketenér, ketehdimerer>enolestere, enoltioestere og a-aminosyre-N-kårboksyanhydrider.

Mere spesielt gjelder op<p>fihnelsen N-acyl-orgotein hvori acylgruppen kommer fra en mono- eller di-basisk hydro-karbon-karboksylsyre med opp til 8 karbonatomer som for eksempel en monobasisk alkansyre, for eksempel maur-, eddik-, propion-, smør-, heksan-, dietyleddik-, trietyleddik-, enant- og oktansyre, en cyklisk syre, fortrinnsvis en isosmør, a-etylsmør-, valerian-, isovalerian-, a-etylvalerian-, trimetyleddik-, 2-metylsmør-, 3-etylsmør-, heksan-, dietyleddik-, trietyleddik, enant- og oktansyre, en cyklisk syre, fortrinnsvis en cykloalifatisk syre, for eksempel cyklopropylideneddik-, cyklobutylkarboksyl-, cyklo-pentylkarboksyl-, cyklopentyleddik-, B^-cyklopentylpropion-, cykloheksylkarbotøsyl- og cykloheksyleddiksyre, en karbocyklisk aryl-eller alkarylsyre, for eksempel benzo- og 2-, 3- eller 4-metyl-benzosyre eller en dibasisk alkansyre, for eksempel oksal-, malein-, fumar-, glutar, a-metylglutar-, 8-dimetylglutar-, adipin-, pimelin- og suberinsyre.

En foretrukket klasse acylgrupper er de fra line-ære eller forgrenede monobasiske alkansyrer, fortrinnsvis med 2-8 karbonatomer, for eksempel acetyl, propionyl, butyryl og isobutyryl av hvilke acetyl er mest foretrukket.

En annen foretrukket klasse acylgrupper er de fra en dibasisk syre, for eksempel alkan-oeller arylsyre, spesielt

de som er i stand til å danne et cyklisk anhydrid, for eksempel rav-, malon-, glutar- og ftalsyre, av hvilke ravsyre er foretrukket.

Siden den eksakte kjemiske natur av acylradikalen ikke er kritisk, så lenge den ikke er fysiologisk toksisk og

den kan dannes på lysin-e-aminogrupper beskrevet ovenfor, er de anvendte ekvivalenter til de ovenfor nevnte acylgrupper, dersom

de kan dannes, de som kan oppnås fra andre alifatiske og aro-matiske usubstituerte og substituerte og monobasiske, dibasiske og polybasiské karboksylsyrer med opp til 18 og fortrinnsvis

opp til 8 karbonatomer, for eksempel acylradikalen av undecyl-, palmitin-, B-cykloheksylpropion-, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4-, og 3,5-dimetylbenzo-, etylbenzo-, 2,4,6-trimetylbenzo-, kanel-, nafto-, 3-metyl-a-nafto-, $-fenylpropion-, difenyleddik-, bife-nyleddik- eller a-naftyleddiksyre, eller kan være acylradikalen av en karbaminsyre, for eksempel karbamin-, fenylkarbamin-, n-butylkarbamin-, dimetylkarbamin-, dietylkarbamin- og allofansyre, eller av en heterocyklisk syre, for eksempel 3-furylkarboksyl-, pyrrol-karboksyl, B-pyrrolidylpropion-, N-metyl-pyrrolidyl-2-karboksyl-, a-pikolin-, nikotin-, indol-2-^karboksyl-, 6-hydroksy-

indolyl-3-eddik- og N-metylmorfolyl-2-karboksyl- og pyrrolyl-2-karboksylsyre, eller av en sulfonsyre med 1-18, fortrinnsvis 1-12, karbonatomer, omfattende alkansulfon-, for eksempel raetan-og etansulfon- og arylsulfon-, for eksempel benzen- og p-toluensulfonsyre.

Slike anvendbare ekvivalenter kan også være acylradikalen av en syre med én, to eller flere substituenter i molekylet, for eksempel hydroksy, halogen, alkoksy, acyloksy, sulfon-yloksy, araido, sulfato, nitro, merkapto og cyano, for eksempel glykol-, melke-, sitron-, vin-, d-malein-, d-glycerin-, mahno-, glukon-og salicylsyrej av en aminosyre, for eksempel glycin, amino-propionsyre, diglykollaminsyre, triglukollaminsyre, metylglycin, dimetylglycin, dietylglycin, para-aminosalicylsyre, para-amino-benzosyre, etylmerkaptoeddiksyre, benzylmerkaptoeddiksyre, klor-eddiksyre, fluoreddiksyre, trikloreddiksyre, trifluoreddiksyre, tioglykollsyre, m-nitrobenzosyre, 2,3,4-trimetoksybenzosyre, fenoksyeddiksyre og ct-naf tooksyeddiksyre.

I tillegg til N-acetyl-nhornkveg,,-orgoteinene og N-suksinylorgoteinene i de etterfølgende eksempler, er andre

eksempler på N-acyl-orgoteiner fra hornkveg ifølge oppfinnelsen N-propionyl-orgotein, N-butyryl-orgotein, N-benzoyl-orgotein"; N-o-ftalyl-orgotein, hvor det i hvert tilfelle er 9 slike aayl-grupper i hver av de to under-enhetene i orgotein-molekylet og de tilsvarende orgoteiner hvor det er 1, 6 og 10 slike acyl-

grupper i hver under-enhet, respektive, og de tilsvarende menneske-, saue-, heste-, svine-, hunde-, kanin-, marsvin- og kyllingwari-

anter av hver av disse.

Av hensyn til enheten ved nomenklaturen ved be-

nevning av acylgruppene i N-acyl-orgoteinene oppnådd fra di-

basiske syrer, anvendes det divalent radikalnomenklatur, for eksempel suksinyl, malonyl, glutaryl og ftalyl. Som det imidler-

tid er selvklart er N-acylgruppen monovalent og en av de to acylgruppene er en fri karboksygruppe slik at acylgruppene mere

jf

presist er karboksysubstituerte acylgrupper, for eksempel B-karboksypropionyl, karboksyacetyl-, 2(?-?karboksybutyryl og o-karboksybenzoyl, respektive.

Det acylerte orgotein kan isoleres fra reaksjons-løsningen, fortrinnsvis etter dialyse for å fjerne uvedkommende ioner, ved konvensjonell lyofilisering, for eksempel på den måten som er beskrevet i US patent 3.758.682. Om ønsket eller nødvendig kan det acylerte orgotein først renses ved ione-vekslerharpikskromatografi, elektroforese og/eller gelfiltrering ved å anvende en polymer som virker som en molekylsikt.

Filtrering gjennom et mikroporefilter, for eksempel "Millipore", på konvensjonell måte over i sterile medisinglass, eventuelt etter justering av ionestyrken med NaCl og/eller natriumfosfat, for eksempel til isotonisitet, gir en steril løsning som er egnet for administesjon ved injeksjon.

De farmasøytiske preparatene ifølge oppfinnelsen omfatter et N-acyl-orgotein ifølge oppfinnelsen og en farma-søytisk akseptabel bærer. Formen og karakteren som denne bærer tar en naturligvis diktert av administrasjonsmåten.

Det farmasøytiske preparatet foreligger fortrinnsvis i form av et sterilt, injiserbart preparat, for eksempel som en steril, injiserbar vandig løsning. Løsningen kan sammensettes på kjent;måte ved å anvende de bærere som er nevnt ovenfor. Det sterile, injiserbare preparatet kan også være en steril, injiserbar løsning eller suspensjon i et ikke-toksisk, parenteralt akseptabelt fortynnings- eller løsnings-middel, for eksempel 1,3-butandiol.

Preparatene ifølge oppfinnelsen kombinerer en effektiv enhetsdoseringsmengde av N-acyl-orgotein, det vil si N-acyl-orgoteirret foreligger i en konsentrasjon som er effektiv til å fremskaffe den ønskede respons når en enhetsdose av preparatet administreres på den måte som passer for den spesielle farmasøytiske bærer. Flytende preparater, både topiske og injiserbare, inneholder eksempelvis vanligvis ca. 0,5 til 20 mg

N-acyl-orgotéin pr. 0,25 til 10 ml, fortrinnsvis ca. 0,5 til 5 ml, unntatt i.v.-infusjonsløsninger som også kan være mere fortynnet-, for eksempel 0,5 til 20 mg N-acyl-orgotein pr. 50-1000 ml, fortrinnsvis 100-500 ml infusjonsløsning. Tab-letter, kapsler og suppositoriér inneholder vanligvis 0,1 til 25 mg, fortrinnsvis 1 til 10 mg Nr-acyl-orgotein pr. enhet.

N-acyl-orgotein administreres vanligvis ved inn-drypping eller ved injeksjon, for eksempel intramuskulært,

subkutant, intravenøst eller intradermalt. I.M. foretrekkes, unntatt i tilfelle av sjokk hvor i.v. noen ganger foretrekkes for å oppnå raskere virkning, og i visse lokaliserte sykdommer, for eksempel utstråling og intersititial cystitt, hvor lokal

injeksjon ofte er mere effektiv. Enkeltdosene ligger vanligvis innen området 0,5 til 20 mg. Det foretrukne område for mennes-ker er ca. 0,5 til 4 mg, for hester ca. 5,0 til 10 mg. Den eksakte dose er ikke kritisk og avhenger av typen og alvoret av sykdommen.

N-acylorgotein er på samme måte som orgotein effektivt ved behandling av forskjellige betennelsestilstander, omfattende de hvor syntetiske anti-inflammatoriske midler har begrenset anvendelighet, for eksempel på grunn av toksiske bi-virkninger ved langtidsanvendelse.

Mere spesielt er N-acyl-orgotein effektivt ved

å bedre betennelsestilstander og lindre virkningene av dem, for eksempel de som innbefatter urinveiene og leddene hos forskjellige pattedyr. Det er nyttig når det gjelder å lindre symp-tomene på og de strukturelle deformitetene som er forbundet med post-traumatisk artritt, og reumatoide sykdommer, som for eksempel bursitt, tendonitt og osteoartritt.

For ytterligere detaljer når det gjelder iso-leringen av utgangsorgoteinene og hvordan N-acyl-orgoteinet ifølge oppfinnelsen skal brukes, omfattende administrasjons-metode, doseringsformer, doseringsregime og inflammatoriske og andre tilstander som er mottagelige for behandling med N-acyl-orgotein henvises til US patent 3.758.682.

Det antas at fagmannen uten videre bearbeidelse ved å anvende den forangående beskrivelse kan utnytte foreliggende oppfinnelse i sin helhet. De følgende foretrukne spesielle utførelsesformer skal derfor anses bare som illu-strerende og ikke på noen måte begrensende for resten av søknaden.

N- acetyl- orgotein.

Eksempel 1 - Med acetylsalicylsyre ( aspirin).

Inkubering av det native orgoteinmolekylet med aspirin under de betingelser som er angitt nedenfor gir en blanding av N-acetylerte orgoteiner (basert på elektrolyse-mønsteret).

Opp til et gjennomsnitt på 11 N-acetylgrupper kan innføres ved inkubering av orgotein med 0,05m aspirin ved pH 9, 37°C. Mere utstrakt acetylering kan oppnås med større overskudd aspirin og/eller forlengede reaksjonstider.

Eksempel 2 - Med N- acetylimidazol ( NAcIm).

a. 12 mg orgotein/ml 0,05m borat med pH 7,5 + 16 mg N-AcIm/2 ml 0,05 m borat med pH 7,5$ romstemperatur i 1 time. Føres gjennom en kolonne av "Sephadex G-25" for avsaltning og avslutning av reaksjonen. AOD<275nm>i vann ekvivalent med 0,7 acetylerte tyrosingrupper pr. molekyl.

Trinitrobenzensulfon-(TNBS)forsøk påviste 4 resterende titrerbare, frie aminogrupper.

b. 12 mg orgotein + 20 mg NAcIm/1 ml 0,05m borat med pH 7,5; romstemperatur i 1 time. Avsaltes som ovenfor. AOD i vann ekvivalent med 0,9 acetylerte tyrosingrupper

pr. molekyl.

c. 40 mg orgotein (uren prøve) + 32 mg NAcIm/1,0 ml borat med pG 7,5; romstemperatur i 1 time. Avsaltes som ovenfor, AOD i vann ekvivalent med 1,3 til 2,4 acetylerte tyrosingrupper pr. molekyl. (Høyere verdi kan forårsakes av tyrosin-acetylering av forurensning). d. 25 mg orgotein + 80 mg NAcIm/6 ml 0,05m borat med pH 7,5; romstemperatur i 1 time. Dialyseres, lyofiliseres, utbytte 21 mg (86% protein ved mikrobiuret)

AOD<275nm>i 7m guan.HCl ekvivalent med 1,3 acetylerte tyrosin-

grupper pr. molekyl.

N-acetylering: utstrakt (elektroforese)

1 fri aminogruppe igjen av 17,5 (TNBS-forsøk) Ungar bioforsøk: helt aktivt Metaller: Zn «1,8 Cu =2,1 gapm

Elektroforese: Orgotein = 1,3, ÅcORG » 16

SODase-aktivitet: 51% så aktiv som nativt orgotein i "Cytoch-rome C"-forsøk ved pH 7,5

d. 25 mg orgotein + 80 mg NAcIm/6 ml 0,05 m borat-buffer ved pH 7,5; romstemperatur i 2 timer. Elektroforese: ORG « 1,1, AcORG =13. e. Orgotein + NAcIm/pH 7,5 0,05m borat; romstemperatur i 3 timer.

Eksempel 3 - Med eddiksyreanhydrid.

A. Acetylering ved pH 6, 2 og 8.

Behandling av nativt orgotein i vandig buffer

med eddiksyreanhydrid gir en blanding av N-acetylerte orgoteiner. Den acetyleringsgrad som oppnås avhenger i hovedsak av løs-ningens pH og av mengden eddiksyreanhydrid som tilsettes pr. volum løsning, og delvis av bufferen og temperaturen.

B. Sukesssiv acetylering ved pH 7, 5 og is- vann-temperatur.

(1) 0,250 ml 4,08 mg/ml orgoteinløsning ble fortynnet med 2,00 mlwann. Eddiksyreanhydrid, i 6, 10, 14 og 20X porsjoner, ble tilsatt til denne orgoteinløsning med konstant omrøring. Reaksjonens pH ble holdt ved 7,5 ved tilsetning av 0,5m

NaOH fra en 2-ml "Gilmont" mikrobyrette. Når en porsjon av eddiksyreahhydridet var omsatt, noe som indikeres ved at pH var konstant ved 7,5 (uten tilsetning av NaOH), ble 100X av reaksjonsblandingen tatt ut av hovedmengden og ble tilsatt til 1,00 ml 0,0lm NaOAc for å stanse enhver videre reaksjon. Denne delvis acetylerte orgotein-løsning ble oppbevart ved 4°C for å bestemme acetyleringsgraden ved elektroforese senere. Elektro-forogrammer (EPG-er) av disse viste at acetyleringen av orgoteinmolekylet var nesten fullstendig etter at de første 6X eddiksyreanhydrid i 2 ml var forbrukt. (2) Tre 40 mkg/ml orgoteinløsninger ble fremstilt ved å tilsette 10X 4,08 mg/ml orgoteinløsning til tre, medisinglass som hver inneholdt 1,00 ml 0,05m fosfatbuffer med pH 7,5<v Til hver av disse løsninger ble det med kraftig om-røring ved .isvann-temperatur tilsatt 5X, 10X eller 30X 10%-ig Ac20 i 1,4 (v/v). Etter omrøring i 1 time ble hver a<y>disse reaksjonsblandingene undersøkt ved elektroforese. Reaksjonen var ikke fullstendig idet bånd av delvis acetylert orgotein vår tydelig i alle tre løsninger: C. Suksessiv acetylering ved 0°C og romstemperatur.

Ca. 20 mg orgotein ble oppløst i 2 ml lm fosfatbuffer med pH 7,5. Eddiksyreanhydrid ble så tilsatt lang-somt i 40X porsjoner under omrøring ved isvann- eller romstemperatur. Reaksjonsblandingens pH ble holdt ved 7,5 ved tilsetning av 6n NaOH fra en 2-ml "Gilmont" mikrobyrette. Når reaksjonsblandingens pH sluttet å falle under 7,5, en indikasjon på at den tilsatte porsjon eddiksyreanhydrid var forbrukt, ble reaksjonsblandingen undersøkt ved elektroforese for å bestemme acetyleringsgraden. Vanligvis ville en 40X porsjon eddiksyreanhydrid forbrukes på 1 til 2 timer ved isvann-temperatur og på 20 til 60 minutter ved romstemperatur, avhengig av hvor mye eddiksyreanhydrid som var tilsatt tid-ligere. Acetyleringen hadde frembragt maksimal økning i elektro-foresebevegelighet etter at ca. 160X eddiksyreanhydrid var forbrukt. Reaksjonsproduktet ble dialysert mot vann og så lyofili-sert.

Egenskapene for acetylert orgotein er opp-summert nedenfor.

Elektro foregram.

Protein-(amidosvart) flekk: Klebrig men relativt smalt bånd, som beveger seg ca. 17 ganger så langt som nativt orgotein ved pH 8,2.

Enzym- (NHT-riboflavin) flekk: Klebrig men relativt smalt bånd i3samme stilling som proteinbåndet.

TNBS- forsøk ( antall frie titrebare amlnogrupper).

Hydroksamat- forsøk ( antall 0- acetylgrupper).

UV- absorbsjon.

Absorbsjonen er meget lik absorbsjonen for nativ orgotein-protein. Sammenlikning av optisk

278

densitet (OD ) mellom acetylert og nativt orgotein viser at det ikke finnes tyrosin-K)-acetylgrupper i acetyl-orgoteinet fra eksemplene 3 Cd) og (2) .

Metalllnnhold ( ved atomabsorbsjon).

Dialyse av acetyl-orgotein mot 2,7 x 10 m EDTA ved pH 7,5 viste at bare ca. 5% av Zn og mindre enn dette av Cu ++kan fjernes fra proteinet.

Pronase- fordøyelighet.

Ingen merkbar forandring i elektroferogram (proteinflekk) ble observert etter at acetyl-orgotein var inkubert med pronase ved 37°C i 21 timer.

Cytokrom C- forsøk ( SODase- aktivitet).

Prosent aktivitet for eksempel 3 C(l) (basert på 100% aktivitet for nativt orgotein).

D« Fosfatbufferens virkning på acetyleringen.

Acetylering ble utført i 0,05m fosfat med pH 7,5 og tris-HCl-buffere Ved isvann-temperatur og romstemperatur. Ifølge elektroferogrammer var det ingen merkbar forskjell i acetyleringsreaksjonene i fosfat- og tris-HCl-buffere ved isvann-temperatur. Ved romstemperatur var acetyleringen i fosfatbuffer mere utstrakt enn i tris-HCl-buffer.

N- suksinyl- orgotein.

Eksempel 4 - Med ravsyreanhydrid ved pH 8 og isvann- temperatur.

A» Suksessiv suksinylerlng.

Fremgangsmåten for suksessiv suksinylerlng var lik den for suksessiv acetylering ifølge eksempel 3 B(l). Reaksjonene ble utført ved pH 8 og 7,5. SODase-aktiviteten for alikvoter av reaksjonsblandingen som ble tatt ut ved forskjellige reaksjonstrinn ble bestemt ved cytokrom C-forsøk ved pH 10,2. Aktiviteten i prosent (basert på 100% aktivitet for nativt orgotein) relativt molar del ravsyreanhydrid som etanol-løsning (5,15 mg/ml) til 2,35 ml av en vandig (5,16 mg/ml) orgotein-løsning, pH 8, 0°C, er vist nedenfor.

Ved å følge samme fremgangsmåte men tilsette ravsyreanhydridet som en 4,87 mg/ml etanolløsning til 2,25 ml

av en 10,453 mg/ml vandig løsning av orgotein oppnåddes en rask reduksjon av SODase-aktivitet til 60% av orgoteinets (etter tilsetning av mindre enn 0,1 ml) fulgt av en meget gradvis reduksjon til ca. 43% etter tilsetning av 0,6 ml.

B. Suksinyl- orgotein.

Fremgangsmåten var den samme sumt for fremstilling av acetyl-orgotein ifølge eksempel 3 C, bortsett fra at det ble anvendt mindre konsentrert fosfatbuffer med pH 7,5 (0,lm) og ravsyreanhydridet ble tilsatt i 4 mg (ved begynnelsen av reaksjonen) eller 8 mg (ved slutten av reaksjonen) porsjoner.

Egenskapene for suksinylert orgotein er opp-summert nedenfor.

Elektroforegram.

Protein- (amidosvart) flekk: Klebrig men relativt smalt bånd som beveger seg mot (+)-polen ca. 20 x lenger enn nativt orgotein ved pH 8,2.

Enzym- (NBT-riboflavin) flekk: Klebrig men relativt smalt bånd i samme stilling som protéin-båndet.

TNBS- forsøk ( antall frie titrerbare e- aminogrupper).

UV- absorbsjon.

Meget lik UV-absorbsjonen for nativt orgotein-278 protein. Sammenlikning mellom OD for suksinyl- og native orgoteiner viser åt det ikke forekommer tyrosin-O-suksinyl-grupper i suksinyl-orgoteinet.

Metallinnhold ( ved atomabsorbsjon).

-4 Dialyse av suksinyl-orgotein mot 2,7 x 10

EDTA ved pH 7,5 viste at bare ca. 5% av Zn++ og mindre av Cu++ kan fjernes fra proteinet.

Eksempel 5 - C- deka( N- acetyl)- orgotein, C- nona( N- suksinyl)-orgotein.

Hybridisering av acetyl-orgotein med nativt orgotein ble utført ved å oppvarme en ekvimolar blanding.av de to proteiner i løsning ved pH 7-8 ved 50°C i 4 timer. Elektroforese ved pH 8,2 av det resulterende hybrid viste at heterodimeren overveiende var i et bånd ved elektroforese med en ladning tilsvarende 10 acetylgrupper/heterodimer. Dette delvis acetylerte orgotein, C-deka(N-acetyl)-orgotein, skiller seg fra delvis acetylert orgotein oppnådd ved behandling av orgotein med lave konsentrasjoner av acetyleringsmiddel i at alle N-acetyl-grupper er på bare en av de to peptidkjedene, C, som danner orgoteinmolekylet, istedenfor å være fordelt på begge kjedene.

Hybridisering av suksinyl-orgotein med nativt orgotein ble utført på liknende måte som det som er nevnt ovenfor for acetyl-orgotein. Heterodimeren var igjeri overveiende et bånd ved elektroforese, men med en ladning tilsvarende 9 suksinylgrupper/heterodimer, det vil si C-nona-(N-suksinyl)-orgotein.

Hybridisering av to substituerte orgoteiner kan utføres på liknende måte. Ved å oppvarme acetyl-orgotein og suksinyl-orgotein sammen i løsning kan eksempelvis fremstilles C-deka(N-acetyl)-C'-nona(N-suksinyl)-orgotein.

Eksempel A.

Oppløs dekstrose til 5% vekt/volum i en løsning av et N-acyl-orgotein oppnådd ifølge et av eksemplene 1-5, steriliser den resulterende løsning ved "Millipore" mikropore-siltrering, sterilfiltrer over i forhånds-steriliserte ampuller eller medisinglass under sterile betingelser. Lyofiliser deretter til et sterilt pulver.

Eksempel B.

Sterilfyll 10 ml porsjoner av et rent eller i hovedsak rént N-acyl-orgotein fra et av de foregående eksempler 1-4 i sterilt vann eller steril isotonisk saltløsning (0,1 mg/10 ml) direkte over i sterile medisinglass med gummipropper. Kork og forsegl glassene. Frys for oppbevaring.

Eksempel C.

Følg fremgangsmåten fra eksempel B bortsett fra at innholdet av glassene steril-lyofiliseres før korking.

Eksempel D.

Femten deler av et isolert N-acyl-orgotein beskrevet i et av de foregående eksempler 1-5 og 30 deler sukrose veies og blandes. Blandingen oppløses i 30 deler avmineralisert vann som ér justert til pH 9,4 med gassfonnig ammoniakk. Løsningen filtreres så med et lite vakuum gjennom et 0,45u, forhånds-fuktet "Millipore" filter. Volumet, av filtratet måles og vekten av proteinet beregnes så som følger: 2 ml av filtratet blandes med 3 ml biuret-reagens og blandingen inkuberes i 15 minutter ved 37°C. Absorbsjoh ved 555 for blandingen måles mot vann-(buffer) blindprøve. Konsentrasjon i mg/ml be-

stemmes ved å multiplisere absorbsjonen ved 555 med 8,9.

De vandige prøvene skall-fryses for oppbevaring. Lyofilisering gir et fast N-acyl-orgotein-préparat som er lagringsstabilt ved romstemperatur og som, når det rekonstitueres med vann, er fritt for uløselig denaturert protein.

Eksempel E.

Fremgangsmåten fra eksemplene A, B, C eller D følges, bortsett fra at det tilsettes 0,25-0,5% fenol og 0,004-0,01% timerosal, 0,003-3% metylparåben, 0,05-0,2% natriumazid eller 0,05-0,2%.. benztylalkohol til saltløsningen som konser-veringsmiddel.

Eksempel F.

I en løsning av rent eller nesten rent N-acyl-orgotein, for eksempel fremstilt ifølge fremgangsmåten fra eksempel 3 C(2), oppløses sukrose til 5% vekt/volum. Løsningen steriliseres ved "Millipore"-filtrering og sterilfylles over i forhånds-steriliserte ampuller eller medisinglass i mengder som vil gi den ønskede mengde orgotein pr. ampull eller glass, for eksempel 0,1 - 5 mg for et enkeltdoseglass og 5-50 mg for et flerdose-glass. Medisinglassene lyofiliseres og forsegles eller løsningen lyofiliseres og forsegles.

Eksempel 6.

Fremgangsmåten fra eksempel F følges men sukrose erstattes med dekstrose i en mengde av 1-3 ganger mengden av N-acyl-orgoteinet.

Eksempel H.

Fremgangsmåten fra eksemplene A-F følges ved å anvende 0,1-5 mg av et N-acyl-orgotein fra et av eksemplene 1-5, men det tilsettes 50-150 mg av 21-natriumsuksinatesteren av hydrocortison, 5-25 mg av samme ester av 6-metylprednisolon, deksametason eller betametason, pr. 0,2-0,5 mg N-acyl-orgotein før sterilisering og lyofilisering. Før bruk rekonstitueres disse preparater med 1 ml eller mer av rent eller bufret vann pr. 0,2-0,5 mg N-acyl-orgotein.

Claims (24)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktivt N-acyl-orgotein hvor acylgruppen forekommer på minst en lysin-e-aminogruppe, karakterisert ved at orgoteinet omsettes med et acyleringsmiddel.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat orgoteinet acyleres i en vandig løsning.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at orgoteinet som anvendes er fra hornkveg.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at reaksjonen fortsettes inntil minst 10 N-acyl-grupper er innført i orgotein-molekylet.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at orgoteinet som anvendes er fra homkveg.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes et acyleringsmiddel der acylradikalen er alkanoyl med 2-6 karbonatomer.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes et acyleringsmiddel der acylradikalen er acetyl.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det som orgotein anvendes orgotein fra hornkveg.

9. Fremgangsmåte ifølje krav 6, karakterisert ved at reaksjonen fortsettes inntil minst 10 N-acyl-grupper er innført i orgoteinmolekylet.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes et acyleringsmiddel der acylradikalen er suksinyl.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at det som orgotein anvendes hornkveg-orgotein.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at reaksjonen fortsettes inntil minst 10 N-acylgrupper er innført i orgoteinmolekylet.

13. N-acyl-orgotein, karakterisert ve d at acylgruppen forekommer på minst en lysin-e-aminogruppe og er acylradikalen i en mono- eller dibasisk hydrokarbonkarbok-sylsyre med opp til 8 karbonatomer.

14.. N-acyl-orgotein ifølge krav 13, karakterisert ved at orgoteinet er hornkvegorgotein.

15. N-acyl-orgotein ifølge krav 13, karakterisert ved at det har minst 10 N-acylgrupper pr. molekyl.

16. N-acyl-orgotein ifølge krav 15, karakterisert ved at orgoteinet er hornk <y> eg-orgotein.

17. N-acyl-orgotein ifølge kravil3, karakterisert ved at acylradikalen er alkanoyl med 2-6 karbonatomer.

18. N-acyl-orgotein ifølge krav 13, karakterisert ved åt acylradikalen er acetyl.

19. H-acyl-orgotein ifølge krav 17, karakterisert ved at orgoteinet er hornkveg-orgotein.

20. N-acyl-orgotein ifølge krav 17, karakterisert ved a <*> t det har minst 10 N-acyl-grupper pr. molekyl.

21. H-acyl-orgotein ifølge krav 13, karakterisert ved at acylradikalen er suksinyl.

22. N-acyl-orgotein ifølge krav 21, karakterisert ved at orgoteinet er hornkvegorgotein.

23. N-acyl-orgotein ifølge krav 21, karakterisert ved at det har minst 10 N-acylgrupper pr. molekyl.

24. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en effektiv énhetsdoseringsmengde av et N-acyl-orgotein ifølge krav 1, blandet med en farmasøytisk akseptabel bærer.